nghiên cứu công nghệ chế tạo kit chẩn đoán nhanh hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (prrs) trên lợn

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI




ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC



BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH HỘI
CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRS) TRÊN LỢN”


Mã số: 05/2009- ĐTĐL
Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Lan








8980

Hà Nội- 2011

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI



ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC


BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH HỘI
CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRS) TRÊN LỢN”

Mã số: 05/2009- ĐTĐL

Chủ nhiệm đề tài Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội






TS. Nguyễn Thị Lan

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và công nghệ

Hà Nội- 2011
 1
TRƯỜNG ĐH NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Hà nội, ngày tháng năm 2011


BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài:
“Nghiên cứu công nghệ chế tạo Kit chẩn đoán nhanh hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) trên lợn”
Mã số đề tài: 05/2009 – ĐTĐL
Thuộc lĩnh vực khoa học và công nghệ: Công nghệ sinh học
2. Chủ nhiệm đề tài
Họ và tên: Nguyễn Thị Lan
Ngày, tháng, năm sinh: 10/05/1974 Nam/Nữ: Nữ
Học hàm, học vị
: Tiến sỹ
Chức danh khoa học: Giảng viên chính
Chức vụ: Phó bộ môn bệnh lý – Khoa Thú y - ĐH Nông nghiệp Hà Nội
Điện thoại:

Tổ chức: 046762584
Nhà riêng: 0437589499
Mobile: 0903238487
Email:
Tên tổ chức đang công tác: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
Địa chỉ tổ chức: Trâu Quỳ - Gia Lâm – Hà Nội
 2
Địa chỉ nhà riêng: 31-C2 Ciputra- Tây Hồ - Hà Nội
3. Tổ chức chủ trì đề tài
Tên tổ chức chủ trì đề tài: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội
Điện thoại: 043 8276 346 Fax: 043 8276 554
Email:
Website: www.hua.edu.vn
Địa chỉ: Trâu Quỳ - Gia Lâm – Hà Nội
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS. Trần Đức Viên
Số tài khoản: 30101001
Ngân hàng: Kho bạc nhà nước Gia Lâm
Tên cơ quan chủ trì đề tài: Bộ Giáo dục và đào tạo
II. TỔ CHỨC THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài
- Theo hợp đồng đã ký kết: từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 12 năm 2011
- Thực tế thực hiện: từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 12 năm 2011.
- Được gia hạn (nếu có): Không
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 3.505 tr.đ, trong đó:
+ Kinh phí hỗ trợ từ NSKH: 3.505tr.đ
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0
Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án/ đề tài (nếu có): Không
b) Tình hình cấ
p và sử dụng kinh phí từ nguồn NSKH:

 3
STT Theo kế hoạch Thực tế đạt được

Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Ghi chú
(Số đề
nghị quyết
toán
1 2009 1400 2009 1272 1272
2 2010 1536 2010 1664 1664
3 2011 569 2011 569 569

Tổng 3505

3505 3505
c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi
Đối với đề tài:
Đơn vị tính: triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số

TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng NSKH
Nguồn
khác
Tổng NSKH
Nguồn
khác
1
Trả công lao động
(Khoa học, phổ thông)
1.155 1.155 0 1.155 1.155 0
2
Nguyên, vật liệu, năng
lượng
1.500 1.500 0 1.500 1.500 0
3 Thiết bị, máy móc 400 400 400 400
4 Xây dựng, sửa chữa nhỏ 0 0 0 0
5 Chi khác 450 450 450 450

Tổng cộng 3.505 3.505
0 3.505 3.505 0
- Lý do thay đổi (nếu có)
3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài
(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác
định nhiệm vụ, xét chọn phê duyệt kinh phí, hợp đồng điều chỉnh (thời gian, nội
dung, kinh phí thực hiện… nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án
(đơn, kiến nghị điều chỉnh… nế
u có).

 4
Số
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản Ghi chú
1
Số 1060/QĐ-
BKHCN, Ngày
10/6/2008
Quyết định về việc thành lập Hội
đồng khoa học và công nghệ xét
duyệt thuyết minh đề tài độc lập cấp
nhà nước tuyển chọn bắt đầu thực
hiện trong kế hoạch 2009

2
Số 1412/QĐ-
BKHCN, Ngày
9/7/2008
Quyết định của Bộ trưởng Bộ KH và
CN về việc phê duyệt tổ chức và cá
nhân chủ trì đề tài độc lập cấp nhà
nước năm 2009

3
Số 1989/QĐ-

BKHCN, Ngày
12/9/2008
Quyết định của Bộ trưởng Bộ KH và
CN về việc phê duyệt kinh phí đề tài
độc lập cấp nhà nước năm 2009

4
Số: 880/NNH-
KH&QT
, ngày 31/07/2009
CÔNG VĂN
V/v Điều chỉnh kinh phí thực hiện
đề tài 05/2009 – ĐTĐL

5
Số: 2190/BKHCN-
KHCNN
, ngày 4/9/2009
CÔNG VĂN
V/v điều chỉnh kinh phí thực hiện đề
tài độc lập cấp nhà nước mã số
05/2009-ĐTĐL

6
Số 3247/BKHCN-
KHCNN, ngày 23
/12 /2009
CÔNG VĂN
V/v xin điều chỉnh kinh phí năm
2009

7
Số 1410/NNH-KH
& QT,05 /12/2009
CÔNG VĂN
V/v Điều chỉnh kinh phí thực hiện
Đề tài năm 2010

8
Số: 1872/BKHCN –
CNN, ngày
02/8/2010
CÔNG VĂN
V/v xin điều chỉnh kinh phí trong
các khoản chi của đề tài độc lập cấp
nhà nước
Mã số 05/2009 - ĐTĐL

 5
9
Số 4314/BGDĐT-
KHCNMT, ngày
22/7 /2010
CÔNG VĂN
V/v Điều chỉnh kinh phí trong các
khoản chi của đề tài độc lập cấp Nhà
nước

10
Số: 720/NNH-

KH&QT, ngày 01/
07 /2010
CÔNG VĂN
V/v điều chỉnh kinh phí thực hiện
Đề tài 05/2009-ĐTĐL

11
Số: 26/TTr-QTTB,
ngày 20 /07/ 2010
TỜ TRÌNH
Xin phê duyệt Hồ sơ mời thầu gói
thầu: “KIT và hóa chất phục vụ đề
tài nghiên cứu công nghệ chế tạo
KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên
lợn”

12
Số: 1173/QĐ-NNH,
ngày 20/ 07/ 2010
QUYẾT ĐỊNH
V/v thành lập Tổ chuyên gia xét
thầu cho gói thầu: “KIT và hóa chất
phục vụ đề tài nghiên cứu công nghệ
chế tạo KIT chẩn đoán nhanh PRRS
trên lợn” thực hiện năm 2010 của
trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

13
Số: 1174/QĐ-NNH
ngày 20/ 07/ 2010

QUYẾT ĐỊNH
V/v phê duyệt Hồ sơ mời thầu gói
thầu: “ KIT và hóa chất phục vụ đề
tài nghiên cứu công nghệ chế tạo
KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên
lợn” thuộc Đề tài “Nghiên cứu công
nghệ chế tạo KIT chẩn đoán nhanh
hội chứng rối loạn sinh sản và hô
hấp (PRRS) trên lợn”

14
Số: 511/TTr-NNH
, ngày 20/ 05/ 2010
TỜ TRÌNH
Phê duyệt Kế hoạch đấu thầu và Hồ
sơ mời thầu cho các gói thấu thuộc
Đề tài độc lập cấp nhà nước:

 6
“Nghiên cứu công nghệ chế tạo KIT
chẩn đoán nhanh hội chứng Rối loạn
sinh sản và Hô hấp (PRRS) trên lợn”
năm 2010
15
Số: 2828/QĐ-
BGDĐT
, ngày 12/ 07/ 2010
QUYẾT ĐỊNH
Về việc phê duyệt Kế hoạch đấu
thầu cho gói thầu thuộc Đề tài độc

lập cấp Nhà nước: “Nghiên cứu
công nghệ chế tạo KIT chẩn đoán
nhanh hội chứng rối loạn sinh sản và
hô hấp (PRRS) trên lợn” năm 2010
của Trường Đại học Nông nghiệp
Hà Nội

4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án
STT Tên tổ chức
đăng ký
theo thuyết
minh
Tên tổ chức
đã tham gia
thực hiện
Nội dung tham gia chủ
yếu
Sản phẩm
chủ yếu
đạt được
Ghi
chú
1 Cục thú y,
Bộ Nông
nghiệp và
Phát triển
nông thôn
Cục thú y, Bộ
Nông nghiệp
và Phát triển

nông thôn
- Thu thập trao đổi các
thông tin tài liệu về tình
hình dịch bệnh tai xanh
ở Việt Nam
- Giúp thu thập mẫu và
chẩn đoán các mẫu
dương tính.
- Tư vấn và giúp đỡ
một số kỹ thuật và chẩn
đoán nghiên cứu.
- Phân lập virus PRRS.
- Thử nghiệm sản xuất
Kit
- Chẩn
đoán 10
mẫ
u
PRRSV
bằng kỹ
thuật RT-
PCR.
- Phân lập
10 chủng
virus
PRRS

2 Công ty
TNHH một
Công ty

TNHH một
- Thu thập mẫu
- Thử nghiệm sản xuất

 7
thành viên
thuốc thú y
-
NAVETCO
thành viên
thuốc thú y -
NAVETCO
Kit.
- Đánh giá chất lượng
Kit chẩn đoán trên diện
rộng
- Lý do thay đổi (nếu có):
5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối
hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)
SốT
T
Tên cá nhân đăng
ký theo thuyết minh
Tên cá nhân đã
tham gia thực
hiện
Nội dung tham gia
chủ yếu
Sản phẩm

chủ yếu đạt
được
Ghi
chú
1 TS. Nguyễn Thị Lan
TS. Nguyễn Thị
Lan
Chủ trì đề tài, phân
lập, chẩn đoán hóa
miễn dịch, xác định
đặc tính sinh học phân
tử, sản xuất kháng thể,
chế tạo kit, đánh giá
chung.
-Các chủng
virus PRRS
phân lập
được
- Đặc tính
sinh học
virus PRRS
- Kit chẩn
đoán


2
TS. Nguyễn Hữu
Nam
TS. Nguyễn Hữu
Nam

Thu thập mẫu, làm hóa
miễn dịch bệnh lý, thử
nghiệm kit.
- Các mẫu
bệnh phẩm,
các kết quả
chẩn đoán
3
TS. Nguyễn Bá Hiên
TS. Nguyễn Bá
Hiên
Thu thập mẫu, phân
lập virus, chế tạo
kháng thể, cấu trúc
phân tử của virus
- Các chủng
virus PRRS,
Các loại
kháng thể
4
TS. Phạm Văn Tự TS. Phạm Văn Tự
Thu thập mẫu, thử
nghiệm kit
- Kết quả thử
nghiệm Kit
5
TS. Lê Huỳnh
Thanh Phương
TS. Lê Huỳnh
Thanh Phương

Thu thập mẫu, xác
định đặc tính sinh học
của virus
- Đặc tính
sinh học của
các chủng
virus PRRS
6
TS. Bùi Trần Anh
Đào
TS. Bùi Trần Anh
Đào
Thư ký, thu thập mẫu,
tham gia chẩn đoán
bệnh bằng các kỹ thuật
bệnh lý.
- Kết quả
chẩn đoán
PRRS
7
GVC. Lê Văn Lãnh
GVC. Lê Văn
Lãnh
Phân lập virus, thử
nghiệm kit
- Kết quả
phân lập
 8
virus PRRS
8

TS. Tô Long Thành
TS. Tô Long
Thành
Thu thập mẫu, chế tạo
kháng thể, đánh giá
chất lượng kit.
9
TS. Trần Xuân Hạnh
TS. Trần Xuân
Hạnh
Thu thập mẫu, thử
nghiệm kit.
- Lý do thay đổi (nếu có):
6. Tình hình hợp tác quốc tế
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm, tên tổ chức hợp tác,
số đoàn, số lượng người tham
gia)
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm, tên tổ chức hợp tác,
số đoàn, số lượng người tham
gia)
Ghi
chú
1 Trường Đại học Miyazaki
(Nhật Bản)

2 Trường đại học Chulalongkorn
(Thái Lan)

3 Trường đại học Putra
(Malaysia)

4 Trường đại học Chonbuk,
Chungbuk, Seoul (Hàn Quốc)

5 Trường đại học Tokyo (Nhật
Bản)

6 Công ty Adotech (Nhật Bản)
- Một đoàn ra Nhật Bản 07
người, tháng 7 năm 2010.
Kinh Phí 240 triệu.


7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm)
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm)
Ghi
chú

1 Hội thảo về PRRS, năm 2011,
kinh phí 7 triệu, địa điểm Khoa
Thú y
Hội thảo Khoa học Khoa thú
Y, tháng 10 năm 2011

2 Hội thảo bệnh lý Thú y,
Indonesia, tháng 11 năm 2011

- Lý do thay đổi (nếu có):
 9
8. Tóm tắt các nội dung công việc chủ yếu
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: hội thảo khoa học, điều
tra, khảo sát trong nước và ngoài nước)

Thời gian
(bắt đầu, kết thúc
– tháng… năm)
Số
TT
Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc đánh giá chủ yếu
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
Người, cơ quan
thực hiện
1

Thu thập mẫu bệnh phẩm
(Trên các vùng dịch, các
giống lợn, tuổi lợn, cơ
quan lấy mẫu bệnh phẩm)
Tháng
1/2009 đến
tháng
5/2010
Tháng 1/2009
đến tháng
5/2010
Bùi Trần Anh Đào
Huỳnh Thị Mỹ Lệ
Nguyễn Thị Lan
Tô Long Thành
Trần Xuân Hạnh
Cục thú y, Công ty
Navetco
ĐHNN- HN
2
Phân lập virus PRRS trên
môi trường tế bào
4/2009 đến
7/2010
4/2009 đến
7/2010
Nguyễn Thị Lan
Nguyễn Bá Hiên
ĐHNN- HN
3

Nghiên cứu đặc tính sinh
học của các chủng PRRSV
phân lập được
4/2009 đến
7/2010
4/2009 đến
7/2010
Lê Huỳnh Thanh
Phương
Lê Văn Lãnh
ĐHNN- HN
4
Nghiên cứu các đặc tính
sinh học phân tử của các
chủng PRRSV phân lập
được
1/2010 đến
10/2010
1/2010 đến
10/2010
Nguyễn Thị Lan
Phạm Văn Tự
Nguyên Hữu Nam
Bùi Trần Anh Đào
ĐHNN- HN
5
Nghiên cứu chọn lọc chủng
giống PRRSV phù hợp để
làm kháng nguyên
5/2010 đến

8/2010
5/2010 đến
8/2010
Lê Huỳnh Thanh
Phương
Nguyễn Thị La
ĐHNN- HN
6
Nghiên cứu quy trình sản
xuất kháng thể đặc hiệu (cả
kháng thể đơn dòng và
5/2010 đến
10/2010
5/2010 đến
10/2010
Tô Long Thành
Nguyễn Thị Lan
Nguyễn Bá Hiên
 10
kháng thể đa dòng) Nguyễn Hữu Nam
ĐHNN- HN
Cục Thú y
7
Chế tạo KIT chẩn đoán
nhanh hội chứng PRRS
11/2010
đến 4/2011
11/2010 đến
4/2011
Nguyễn Hữu Nam

Nguyễn Thị Lan
Lê Huỳnh Thanh
Phương
ĐHNN- HN
8
Đánh giá thử nghiệm bộ
KIT sản xuất
4/2011 đến
5/2011
4/2011 đến
5/2011
Huỳnh Thị Mỹ Lệ
Tô Long Thành
Nguyễn Bá Hiên
ĐHNN- HN
Cục thú y
9
Thử nghiệm đánh giá trên
diện hẹp
4/2011 đến
8/2011
4/2011 đến
8/2011
Phạm Văn Tự
Lê Văn Lãnh
Nguyễn Hữu Nam
Trần Văn Hạnh
Tô Long Thành
ĐHNN- HN
Cục thú y

Công ty Navetco
10
Thử nghiệm đánh giá đại
trà trong sản xuất.
8/2011 đến
10/2011
8/2011 đến
10/2011
Phạm Văn Tự
Nguyễn Bá Hiên
Nguyễn Hữu Nam
Trần Văn Hạnh
ĐHNN- HN
Cục thú y
Công ty Navetco
11
Nghiên cứu các yêu cầu
của sản phẩm để có thể đủ
điều kiện thương mại hóa.
11/2011 11/2011
Nguyễn Thị Lan
Nguyễn Hữu Nam
ĐHNN- HN

 11
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN
1. Sản phẩm KH & CN đã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:
STT
Tên sản phẩm và

chỉ tiêu chất
lượng chủ yếu
Đơn vị đo Số lượng
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
1
Kit chẩn đoán
nhanh hội chứng
rối loạn sinh sản
và hô hấp. Chẩn
đoán nhanh, chính
xác mẫu bệnh
phẩm từ 3-10
phút.
Chiếc 10.000
10.000 10.000
b) Sản phẩm dạng II:
Yêu cầu khoa học cần đạt
STT Tên sản phẩm
Theo kế hoạch Thực tế đạt
được
Ghi chú
1 Các thông tin về đặc
tính sinh học và sinh
học phân tử của các
chủng virus phân lập
tại Việt Nam
Có các thông

tin chính xác
và tin cậy
- xây dựng
được đường
biểu diễn sự
nhân lên 10
chủng virus
- Đăng ký 6
đoạn gen trên
ngân hàng gen

2 Quy trình công nghệ
chế tạo kit
Tạo kit có độ
nhạy và độ đặc
hiệu cao có thể
chuyển giao
vào sản xuất
kinh doanh
- Tạo Kit có độ
nhạy và độ đặc
hiệu trên 90%.
- Nghiên cứu
đặc các điều
kiện để thương
mại hóa
Được cấp có
thẩm quyền
đánh giá và
nghiệm thu.

c) Sản phẩm dạng III:
 12
Yêu cầu khoa học cần đạt STT Tên sản phẩm
Theo kế hoạch Thực tế đạt
được
Số lượng, nơi
công bố
(tạp chí, nhà
xuất bản)
1
Bài báo 1: Một số đặc
điểm bệnh lý của lợn
nái mắc Hội chứng
rối loạn hô hấp và
sinh sản
Bài báo 2: Ứng dụng
một số kỹ thuật trong
chẩn đoán và phân
lập virus gây hội
chứng rối loạn sinh
sản và hô hấp trên
lợn nái

01 02
Tạp chí
KHKT Nông
nghiệp
d) Kết quả đào tạo
Số lượng

STT Cấp đào tạo, chuyên
ngành đào tạo
Theo kế hoạch Thực tế đạt
được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1 Bác sỹ thú y, chuyên
ngành thú y
02 04 2009 và 2010
2 Tham gia đào tạo
Thạc sỹ, chuyên
ngành thú y hoặc vi
sinh vật
1 02 2010 và 2011
3 Tham gia đào tạo
Tiến sỹ, chuyên
ngành thú y hoặc vi
sinh vật
1 01 2011
đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với
giống cây trồng:
 13

Kết quả
STT Tên sản phẩm đăng
ký
Theo kế hoạch Thực tế đạt
được
Ghi chú

(Thời gian kết
thúc)
1
2
e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế
STT Tên kết quả đã
được ứng dụng
Thời gian Địa điểm
(ghi rõ tên, địa chỉ
nơi ứng dụng)
Kết quả sơ bộ
1 Quy trình nhuộm
hóa tổ chức miễn
dịch
2010 Khoa Thú y, Trường
ĐH Nông nghiệp Hà
Nội
tốt
2 Quy trình chẩn
đoán PRRS bằng
kỹ thuật RT-PCR
2010 Khoa Thú y, Trường
ĐH Nông nghiệp Hà
Nội
tốt
3 Quy trình sản xuất
kháng thể đa dòng
2010 Khoa Thú y, Trường
ĐH Nông nghiệp Hà
Nội

tốt
4 Quy trình sản xuất
kháng thể đơn dòng
2010 Khoa Thú y, Trường
ĐH Nông nghiệp Hà
Nội
tốt
2. Đánh giá về kết quả do đề tài, dự án mang lại
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với
trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…).
Yêu cầu phát triển của ngành chăn nuôi đòi hỏi ngành thú y phải đi trước
một bước để có thể sẵn sàng đáp ứng với tình hình dịch bệnh mới phát sinh hoặc
các b
ệnh nhập ngoại. Việc tạo ra đội ngũ cán bộ có khả năng ứng dụng, triển
khai khoa học công nghệ mới là điều cần thiết. Đề tài đã góp phần bồi dưỡng
một đội ngũ cán bộ và chuyên gia lành nghề.
b) Hiệu quả kinh tế xã hội:
 14
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so
với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…).
Thành công của việc chế tạo Kit chẩn đoán nhanh PRRS có ý nghĩa thực
tiễn vô cùng to lớn trong việc phát hiện sớm tiến tới ngăn ngừa và khống chế
dịch bệnh trong điều kiện diễn biến phức tạp. Phương pháp phát hiện nhanh cho
phép khoanh vùng dịch bệ
nh và có biện pháp xử lý kịp thời hạn chế lây lan và
thiệt hại.
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:
Số
TT

Nội dung Thời gian thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận
chính, người chủ trì…)
I Báo cáo định kỳ 2009 Từ tháng 1 đến tháng
12 năm 2009
Nguyễn Văn Liễu
Lần 1
Lần 2
II Kiểm tra định kỳ 2010 Từ tháng 1 đến tháng
12 năm 2010
Nguyễn Văn Liễu
Lần 1
Lần 2
III Kiểm tra định kỳ 2011 Từ tháng 1 đến tháng
12 năm 2011

IV Nghiệm thu cơ sở 12/2011
Chủ nhiệm đề tài


Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

i
MỤC LỤC

Phần I. MỞ ĐẦU 1
Phần II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI 10
2.1. Phương pháp quan sát, thống kê sinh học 10
2.2. Phương pháp mổ khám 11

2.3. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý 11
2.4. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch 13
2.5. Phương pháp tách chiết RNA 16
2.6. Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR 16
2.7. Phương pháp nuôi cấy tế bào 18
2.8. Phươ
ng pháp phân lập virus PRRS trên tế bào tổ chức 19
2.9. Phương pháp xác định TCID
50
20
2.10. Phương pháp xác định hiệu giá virus 21
2.11. Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus 21
2.12. Phương pháp giải trình tự gen 21
2.13. Phương pháp xử lý số liệu 23
2.14. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein. 23
2.15. Phương pháp chế tạo kháng thể đa dòng 24
2.16. Phương pháp ELISA 25
2.17. Phương pháp tinh chế kháng thể 26
2.18. Phương pháp chế tạo kháng thể đơ
n dòng 28
2.19. Phương pháp chế tạo KIT 29
2.20. Phương pháp đánh giá chất lượng KIT 35
Phần III. KẾT QUẢ 39
1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm 39
2. Phân lập virus PRRS 58

ii
3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng virus PRRS phân lập được62
3.1. Khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE-Cytopathogenic effect) của virus PRRS 62
3.2. Xác định hiệu giá của các chủng virus phân lập được 66

3.3. Quy luật nhân lên trên môi trường tế bào Marc145 của virus PRRS phân
lập được 68
4. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của các chủng PRRSV phân lập được 74
4.1. Kết quả phản ứng RT-PCR 74
4.2. Kết quả giải trình t
ự gen của các chủng virus PRRS nghiên cứu 75
4.3. Kết quả truy cập ngân hàng gen 76
4.3.1. Kết quả so sánh trình tự nucleotide 76
4.4. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử 80
5. Nghiên cứu chọn lọc chủng giống virus PRRS phù hợp để làm kháng nguyên82
5.1. Nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào qua 10 đời cấy chuyển 82
5.2. Hiệu giá virus ở các đời cấy truyền 84
6. Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng thể đặc hiệu 89
6.1. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS 89
6.2. Kết quả chế tạo kháng thể đa dòng 90
6.2.1. Gây tối miễn dịch cho chuột lang 90
6.3. Kết quả chế tạo kháng thể đơn dòng 97
6.3.1. Gây tối miễn dịch cho chuột bạch balb/c: 97
6.3.2. Thu tế bào lách và lai tế bào lách với tế bào Myeloma 98
7. Chế tạo KIT chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp 109
7.1. Chế tạo Gold particle: 109
7.2. Xác đị
nh pH và nồng độ protein phục vụ việc chế tạo conjugate 111
7.3. Nghiên cứu quy trình phân dải hấp phụ 115
7.4. Nghiên cứu lắp ghép các tiểu phần vào khuôn KIT 116
8. Đánh giá thử nghiệm bộ KIT sản xuất 118
8.1. Nghiên cứu lựa chọn mẫu huyết thanh âm tính và huyết thanh dương tính 118

iii
8.2. Nghiên cứu đánh giá độ nhạy của KIT 119

8.3. Nghiên cứu đánh giá độ đặc hiệu của KIT 121
8.4. Đánh giá giới hạn chẩn đoán của KIT 122
8.5. Nghiên cứu khả năng phát hiện chéo một số virus gây bệnh cho lợn 123
9. Thử nghiệm đánh giá KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên diện hẹp 124
9.1. Lựa chọn địa điểm thử nghiệm KIT và thử nghiệm KIT 124
9.2. Kết quả so sánh với các phương pháp chẩn đoán khác 125
10. Thử nghiệm đánh giá KIT chẩn đoán nhanh PRRS đại trà trong sản xuất 127
10.1. Lựa chọn địa điểm thử nghiệm KIT 127
10.2. Kết quả thử nghiệm 128
10.3. Kết quả so sánh với các phương pháp chẩn đoán khác 129
11. Nghiên cứu các yêu cầu của sản phẩm để có thể đủ điều kiện thương mại hoá 130
11.1. Chất lượng của KIT chẩn đoán 131
11.2. Giá thành của KIT 132
11.3. Tiện dụng trong sử
dụng và bảo quản, mẫu mã sản phẩm 134
11.4. Chiến lược Marketing tốt 134
Phần IV. KẾT LUẬN 136
Phần V. TÀI LIỆU THAM KHẢO 138
5.1. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 138
5.2. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 142


iv
DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được 39
Bảng 3.2. Bệnh tích đại thể của các lợn nghi mắc PRRS 43
Bảng 3.3. Số lượng các mẫu bệnh phẩm, block và slide dùng trong nghiên cứu . 47
Bảng 3.4. Một số biến đổi vi thể của các lợn nghi mắc PRRS 50
Bảng 3.5. Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS 53

Bảng 3.6. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch các mẫu lợ
n mắc PRRS 54
Bảng 3.7. Kết quả phân lập PRRSV trên môi trường tế bào Marc 145 58
Bảng 3.8. Các chủng virus PRRS phân lập được sơ bộ lựa chọn cho nghiên cứu 60
Bảng 3.9a. Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được.63
Bảng 3.9b Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được.64
Bảng 3.10. Hiệu giá của các chủng PRRSV phân lập được 66
Bảng 3.11. Các chủng virus PRRS được lựa chọn nghiên cứu đặ
c tính sinh học 67
Bảng 3.12. Hiệu giá virus của chủng virus 227-HY (lg TCID50) 68
Bảng 3.13. Kết quả xác định hiệu giá virus của chủng virus vacxin 69
Bảng 3.14. Hiệu giá virus và khả năng nhân lên của các chủng PRRS qua các đời73
Bảng 3.15. Các chủng virus PRRS lựa chọn nghiên cứu đặc tính sinh học
phân tử 74
Bảng 3.16. Mức độ tương đồng nucleotide và axit amin giữa các chủng virus
PRRS phân lập chủng vacxin %) 79
Bảng 3.17. Khả năng gây bệnh tích tế bào c
ủa các chủng virus qua các đời . 83
Bảng 3.18. Hiệu giá của các chủng virus qua các đời cấy truyền 84
Bảng 3.19. Kết quả hiệu giá virus của các chủng virus ở các thời điểm khác
nhau qua các đời cấy truyền 85
Bảng 3.20. Kết quả chọn chủng virus PRRS để chế kháng nguyên 88
Bảng 3.21. Kết quả tinh chế kháng nguyên virus PRRS 89

v
Bảng 3.22. Một số biến đổi bệnh lý đại thể của chuột được gây miễn dịch với
kháng nguyên virus PRRS 91
Bảng 3.23. Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng
PRRSV 92
Bảng 3.24. Nồng độ kháng thể kháng PRRSV sau khi tinh chế 94

Bảng 3.25. Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng
PRRSV 95
Bảng 3.26. Khả nă
ng phản ứng chéo của các chủng virus PRRS và kháng thể
đa dòng sản xuất ra 96
Bảng 3.27. Kết quả phản ứng ELISA đánh giá hiệu giá hỗn hợp kháng thể đa dòng .96
Bảng 3.28. Bố trí thí nghiệm tiêm chuột 97
Bảng 3.29a. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột
được gây miễn dịch với virus PRRS 227HY 99
Bảng 3.29b. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột
được gây mi
ễn dịch với virus PRRS 182NA 100
Bảng 3.29c. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột
được gây miễn dịch với virus PRRS 374HN 101
Bảng 3.29d. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột
được gây miễn dịch với virus PRRS CL2 102
Bảng 3.29e. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột được
gây miễn dịch với virus PRRS Amervac 103
Bảng 3.29f. Kết quả lai tế bào Myeloma với tế bào Lympho từ lách chuột
được gây mi
ễn dịch với virus PRRS MLV 104
Bảng 3.30. Kết quả tách dòng bằng phương pháp pha loãng kháng thể kháng PRRSV106
Bảng 3.31. Kết quả xác định nồng độ kháng thể đơn dòng sản xuất ra 107
Bảng 3.32. Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra khả năng kết hợp kháng thể đơn
dòng với kháng nguyên virus PRRS 109
Bảng 3.33. Nồng độ Sodium Citrate ảnh hưởng đến kích cỡ gold particle 110

vi
Bảng 3.34. Giá trị OD tương ứng với độ pH 111
Bảng 3.35. Xác định nồng độ protein phù hợp cho việc chế tạo conjugate .112

Bảng 3.36. Công thức chế tạo conjugate (Thể tích=60ml) 113
Bảng 3.37. Kết quả của phản ứng immunoblotting 114
Bảng 3.38. Thông tin về các lô conjugate chế tạo được 115
Bảng 3.39. Thông tin về các thành phần cần thiết cho chế tạo KIT 116
Bảng 3.40. Hồ sơ mẫu huyết thanh dương tính 118
Bảng 3.41. Hồ sơ
mẫu huyết thanh âm tính 119
Bảng 3.42. Kết quả đánh giá độ nhạy của KIT chẩn đoán PRRS 119
Bảng 3.43. Kết quả độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán PRRS 121
Bảng 3.44. Kết quả đánh giá giới hạn chẩn đoán của KIT chẩn đoán PRRS122
Bảng 3.45. Kết quả thử khả năng phát hiệ chéo một số virus gây bệnh cho lợn 123
Bảng 3.46. Địa điểm được lự
a chọn thử nghiệm trên diện hẹp 124
Bảng 3.47. Kết quả thử nghiệm KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên diện hẹp 125
Bảng 3.48. Kết quả so sánh các phương pháp thử nghiệm 126
Bảng 3.49. Địa điểm được lựa chọn thử nghiệm trên diện rộng 128
Bảng 3.50. Kết quả thử nghiệm KIT chẩn đoán nhanh PRRS trên diện rộng 128
Bảng 3.51. Kết quả so sánh các phương pháp thử nghiệm 130
Bảng 3.52. D
ự kiến giá thành KIT theo số lượng sản phẩm 132
Bảng 3.53. So sánh giá thành và thời gian cho kết quả của KIT và các phương
pháp chẩn đoán khác 133


vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Thuật ngữ viết tắt Thuật ngữ chi tiết
BCĐNTT Bạch cầu đa nhân trung tính
BSA
Bovine Serum Albumin

CPE
Cytophathogenic Effect
DAB 3,3-diaminobenzidine
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DNA Deoxyribonucleic acid
ĐTB Đại thực bào
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
FBS
Fetal Bovine Serum
HE Haematoxilin – Eosin
IHC
Immuno Histochemistry
KN-KT Kháng nguyên - Kháng thể
KTĐD Kháng thể đa dòng
LV Lelystad Virus
MLV Modifier Life Vacine
MOI
Multiplicity Of Infection
NC
Nitrocellulose Membrane
OD Optical Density
ORF Open Reading Frame
PBS Photphat Buffer Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PRRS
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
PRRSs Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Strain

PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus
PVA Polyvinyl Alcohol
RNA Ribonucleic acid
RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
TBP TATA-binding protein
TCID
50
Tissue Culture Infective Dose
TMB
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine

1
Phần I
MỞ ĐẦU

Bệnh tai xanh hay hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) là một bệnh truyền nhiễm
nguy hiểm trên lợn với mọi nòi giống, lứa tuổi [53]. PRRS gây ra do một loại
RNA virus với đích tấn công là các đại thực bào, dẫn đến hiện tượng suy giảm
miễn dịch ở lợn, tạo điều kiện cho các virus, vi khuẩn gây bệnh khác tấn công
[19]. Bệnh tai xanh gây thiệt hại nặ
ng nề đối với ngành chăn nuôi lợn. Đối với
lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng như: lợn con sơ sinh yếu ớt, giảm số
con sơ sinh/ổ, tình trạng bệnh kéo dài âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo
dài, chậm động dục trở lại [16]. Đối với đực giống, số lượng tinh dịch giảm,
chất lượng tinh dịch kém, ảnh hưởng đến t
ỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con.
Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Mỹ năm 1987 và lây lan nhanh. Năm 1988, bệnh
lan sang Canada và sau đó lan sang các nước Châu Âu. Năm 1998, bệnh được
phát hiện ở Hàn Quốc, Nhật Bản thuộc khu vực Châu Á. Từ năm 2005 trở lại

đây, bệnh lây lan khắp các nước trên toàn thế giới.
Ở Trung Quốc, trong vòng hơn 3 tháng của năm 2006, chủng virus gây
hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấ
p ở lợn có độc lực cao đã gây ra đại dịch
ở 10 tỉnh phía Nam, làm cho hơn hai triệu lợn ốm, trong đó chết khoảng
400.000 con. Tháng 7 năm 2007, dịch tiếp tục lan rộng ở các đàn lợn thuộc 25
tỉnh, thành phố với trên 180.000 lợn ốm; chết trên 45.000 con [51].
Tại Việt Nam, năm 1997, kiểm tra huyết thanh học cho biết 10/51 lợn
giống nhập từ Mỹ có huyết thanh dương tính với virus gây Hội chứng r
ối loạn
sinh sản và hô hấp (PRRSV) [3]. Tuy nhiên, sự bùng phát thành dịch và gây
tổn thất đáng báo động cho ngành chăn nuôi lợn bắt đầu vào tháng 3 năm
2007 [6]. Sau đó dịch lây lan nhanh và rộng khắp các tỉnh miền Bắc. Ngày
nay hội chứng PRRS đã lan ra khắp thế giới gây thiệt hại kinh tế cho ngành
công nghiệp chăn nuôi lợn [62].

2
Mục tiêu:
- Nghiên cứu được công nghệ chế tạo KIT chẩn đoán nhanh PRRS ở lợn.
- Tạo được sản phẩm có đủ điều kiện để thương mại hóa.
Đối tượng:
Lợn nghi mắc PRRS nuôi ở Việt Nam.
Các chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở Việt Nam.
Tính cấp thiết:
Genome của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV)
là một sợ
i đơn RNA và virus là thành viên của họ Arteriviridae thuộc lớp
Nidovirales [50]. Dựa trên phân tích về phát sinh loài virus phân lập khác
nhau trên thế giới [63] PRRSV có thể được phân biệt thành hai kiểu gen: loại
I, European genotype gồm virus thuộc dòng Châu Âu, đại diện là chủng

Lelystad (LV), gồm 3 subtyp đã được xác định và loại II: Northern American
genotype gồm những virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu là chủng virus Bắc
Mỹ ATCC - VR2332. PRRSV phân lập ở Trung Quốc được chỉ định là thành
viên của kiểu gen II [56,77]. Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấ
y rằng
PRRSV là rất khác nhau về kháng nguyên, độc lực và đa dạng trình tự
nucleotide [38,44]. Sợi đơn RNA của virus bao gồm một bộ gen có khoảng 15
kb, mã hóa 9 ORFs [59,61]. Bộ gen PRRSV bao gồm hai gen polymerase là
ORF1a và ORF1b và bảy gen cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6, và 7 [9].
ORF1a và ORF1b cấu thành khoảng 75% bộ gen của virus và được đặc trưng
bởi một quá trình khung ribosome chuyển dịch thành một polyprotein lớn mà
sự tự phân tách làm phát sinh các protein không cấu trúc (NSP) bao gồm cả
RNA phụ thuộc polymerase [68]. Các khung đọc mở ORF2a, 3, 4 và 5, tất cả
mã hóa cho các protein glycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4, GP5 tương
ứng
[42]. Các ORF2b mới được định nghĩa mã hóa các protein nhỏ nhất của các
hạt virus được chỉ định GP2b [43]. ORF7 mã hóa các protein nucleocapsid
không glycosyl hóa (N), chiếm 20-40% của hàm lượng protein của virion