Đánh giá tác dụng và sơ bộ cơ chế tác dụng của một số phân đoạn từ cao chiết n butannol từ lá chè đắng (ilex kudingcha c j tseng) trên mô hình ruồi giấm đột biết gen mang bệnh tự kỷ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ MINH

“ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG VÀ SƠ BỘ CƠ CHẾ
TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ PHÂN ĐOẠN TỪ CAO
CHIẾT N- BUTANOL TỪ LÁ CHÈ ĐẮNG (ILEX
KUDINGCHA C.J.TSENG) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI
GIẤM ĐỘT BIẾN GEN MANG BỆNH TỰ KỶ’’

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ MINH

“ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG VÀ SƠ BỘ CƠ CHẾ
TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ PHÂN ĐOẠN TỪ CAO
CHIẾT N- BUTANOL TỪ LÁ CHÈ ĐẮNG (ILEX
KUDINGCHA C.J.TSENG) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI

GIẤM ĐỘT BIẾN GEN MANG BỆNH TỰ KỶ’’
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HOÁ SINH DƯỢC
MÃ SỐ: 8720208
Người hướng dẫn khoa học :
1. PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng
2. PGS.TS Nguyễn Thị Lập

HÀ NỘI 2022


LỜI CẢM ƠN
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng, PGS.TS Nguyễn Thị Lập là giáo viên hướng dẫn
đã ln nhiệt tình giúp đỡ, hết lịng chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt thời
gian tôi thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị nghiên cứu viên của Khoa Dược lý
Sinh hố - Viện Dược liệu, các thầy cơ giáo trong bộ mơn Hóa sinh Dược - trường Đại
học Dược Hà Nội đã giúp đỡ cũng như tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn này.
Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể các thầy cô giáo cùng cán bộ trường
Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ mang lại cho tôi những kiến thức
và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau đại học và các phòng ban
khác trong trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là ThS. Chu Lê Mai đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi để tơi hồn thành chương trình đào tạo thạc sĩ đúng thời hạn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè
đã ln bên tơi, ủng hộ tơi và là chỗ dựa tinh thần của tôi khi gặp khó khăn trong học
tập cũng như trong cuộc sống.

Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2022
Học viên cao học

Đinh Thị Minh

i


MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................................... 3
1.1. BỆNH TỰ KỶ.......................................................................................................3
1.1.1. Sơ lược bệnh tự kỷ ..........................................................................................3
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di truyền học .............................................3
1.1.3. Tác động của stress oxy hoá đến ASD ...........................................................5
1.1.4. Thuốc điều trị tự kỷ ........................................................................................7
1.1.5. Một số mô hình nghiên cứu rối loạn tự kỷ .....................................................8
1.2. CHÈ ĐẮNG ........................................................................................................10
1.2.1. Tên gọi – vị trí phân loại...............................................................................10
1.2.2. Đặc điểm thực vật, phân bố ..........................................................................10
1.2.3. Thành phần hóa học ......................................................................................11
1.2.4. Một số nghiên cứu đã được thực hiện về cây Chè đắng ............................... 11
1.3. RUỒI GIẤM .......................................................................................................14
1.3.1. Đặc điểm .......................................................................................................14
1.3.2. Hệ gen của ruồi giấm ....................................................................................14
1.3.3. Chu kỳ vòng đời ...........................................................................................15
1.3.4. Cấu trúc thần kinh cơ của ruồi giấm ............................................................. 15

1.3.5. Mơ hình ruồi giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ ...........................17
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................. 18
2.1 . Đối tượng nghiên cứu (hoặc nguyên vật liệu) ...............................................18
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................18
2.1.2. Chủng ruồi giấm phục vụ nghiên cứu...........................................................18
2.2 . Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................20
2.2.1. Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu .....................21
2.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu đối với hành vi tương tác xã hội
bằng thử nghiệm tương tác cộng đồng (Social space assay): .................................23
2.3.3. Đánh giá ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu đối với trí nhớ ngắn hạn trên mơ
hình ruồi giấm tự kỷ................................................................................................ 24
2.3.4. Đánh giá ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu đối với khả năng vận động của ấu
trùng ruồi giấm........................................................................................................25

ii


2.3.5. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro của một số cao chiết
dưới phân đoạn n- butanol từ lá chè đắng .............................................................. 27
2.3.6. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một số cao chiết dưới
phân đoạn n- butanol từ lá chè đắng bằng thử nghiệm ex vivo trên dịch đồng thể
đầu ruồi giấm ..........................................................................................................28
2.3.7. Đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction NMJ) bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang .....................................31
2.3.8. Phân tích kết quả ...........................................................................................33
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................................... 34
3.1. Nội dung 1: Đánh giá tác dụng cải thiện bệnh tự kỷ của các cao chiết dưới phân
đoạn n- butanol lá chè đắng trên mơ hình ruồi giấm đột biến gen rugose.................34
3.1.1. Kết quả trên thử nghiệm hành vi tương tác cộng đồng ( Social Interaction)34
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm ( Odor- taste
learning) ..................................................................................................................37

3.1.3. Kết quả thử nghiệm trên hành vi bò của ấu trùng ( Crawling assay) ...........38
3.2.1. Hoạt tính khử gốc DPPH in vitro của các cao chiết dưới phân đoạn nbutanol lá chè đắng. ................................................................................................ 40
3.2.2. Hoạt tính khử gốc DPPH bằng thử nghiệm ex vivo trên dịch đồng thể đầu
ruồi giấm .................................................................................................................41
3.2.3. Kết quả định lượng MDA (Malondialdehyd) trong dịch đồng thể đầu ruồi
điều trị các cao chiết dưới phân đoạn n- butanol từ lá chè đắng. ...........................42
3.2.4. Kết quả đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular
junction - NMJ) bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang .....................43
Chương 4: BÀN LUẬN ................................................................................................ 47
4.1. Về mơ hình nghiên cứu .......................................................................................47
4.1.1.Về việc lựa chọn mơ hình ruồi giấm mang bệnh tự kỷ .................................47
4.1.2. Về việc lựa chọn cao chiết dược liệu nghiên cứu .........................................48
4.1.3. Về căn cứ lựa chọn mức liều nghiên cứu .....................................................49
4.1.4. Về không lựa chọn chứng dương trong nghiên cứu .....................................49
4.2. Về kết quả nghiên cứu.........................................................................................49
4.2.1. Đánh giá tác dụng cải thiện thiếu hụt hành vi tương tác cộng đồng của ruồi
giấm đột biến gen rugose mang bệnh tự kỷ............................................................ 49
4.2.2. Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm đột biến
gen rugose mang bệnh tự kỷ ...................................................................................50
4.2.3. Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi vận động trên ấu trùng ruồi giấm bậc ba
và ruồi giấm tự kỷ trưởng thành mang gen đột biến rugose...................................51
4.2.4. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa invitro của cao chiết dưới phân đoạn IB2
và IB5 từ lá chè đắng .............................................................................................. 52
iii


4.2.5. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo trên dịch đồng thể đầu ruồi ........53
4.2.6. Đánh giá sự thay đổi trong cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction NMJ) bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang .....................................54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 55

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
ASD
ADN
AM
ARN
BuOH
CantonS
CĐ
DCM
DLG
DPPH

Viết đầy đủ theo tiếng Anh

Viết đầy đủ theo tiếng Việt

Autism spectrum disorders

Rối loạn phổ tự kỷ

Deoxyribonucleic acid
n- amyl acetate
Ribonucleic acid
n- butanol

Acid deoxyribonucleic

n- amyl acetat
Acid ribonucleic
n- butanol
Ruồi giấm chủng hoang dại
Chè đắng
Dichloromethan
Kháng thể Discs-Large

Ilex kudingcha C.J.Tseng
Dichloromethane
Discs-Large
1,1-Diphenyl-2picrylhydrazyl

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

DPPH

1,1-Diphenyl-2
picrylhydrazyl

1,1-Diphenyl-2 picrylhydrazyl

FDA

Food and Drug
Administration

Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc
Hoa Kỳ

FICT

Fluorescein isothiocyanate

Fluorescein isothiocyanat

HL3

Hemolymph-like 3 saline

Dung dịch muối HL3

Learning Index
Malondialdehyd
Methanol
Neurobeachin
Neuromuscular junction
1-Octanol
Optical density
Phosphat buffer saline
Preference
Reactive oxygen species

Cao chiết dưới phân đoạn n-butanol từ
lá chè đắng
Chỉ số học tập
Malondialdehyd
Methanol
Gen Neurobeachin ( Rugose)
Cấu trúc thần kinh cơ

1-Octanol
Mật độ quang
Đệm phosphat
Chỉ số ưu tiên
Các gốc phản ứng oxy hoá

Social Interaction

Tương tác cộng đồng

Thiobarbituric acid

Acid thiobarbituric

IB
LI
MDA
MeOH
NBEA
NMJ
OCT
OD
PBS
PREF
ROS
Social
Interaction
TBA

v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .............................................................19
Bảng 2. 2. Dụng cụ và thiết bị trong nghiên cứu...........................................................19
Bảng 2. 3. Thành phần cho 500ml thức ăn ruồi giấm ...................................................21
Bảng 3. 1. Kết quả phân tích khoảng cách tương tác khơng gian của ruồi giấm ở các lô
ruồi giấm được sử dụng các cao chiết dưới phân đoạn n- butanol từ lá chè đắng IB1 IB11 trên hai nồng độ 0,8 mg/ml và 2 mg/ml. ..............................................................34

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Hình ảnh cây Chè đắng và lá Chè đắng khô (Ilex kudingcha C.J. Tseng) ...10
Hình 1. 2. Chu kỳ vịng đời của ruồi giấm ....................................................................15
Hình 1. 3. Cấu trúc thần kinh cơ ở ấu trùng ruồi giấm .................................................16
Hình 2. 1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu .............................................................................20
Hình 2. 2. Hình ảnh mơ phỏng thử nghiệm đánh giá khả năng tương tác xã hội của ruồi
giấm ...............................................................................................................................23
Hình 2. 3. Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng nhớ mùi của ấu trùng ruồi giấm .....25
Hình 2. 4. Hình ảnh mơ phỏng thử nghiệm và kết quả xử lý bằng phần mềm Image- J
để đánh giá khả năng vận động bằng hành vi bò trên ấu trùng ruồi giấm bậc 3 ...........26
Hình 2. 5. Phản ứng giữa DPPH và một chất chống oxy hóa ......................................27
Hình 2. 6. Phản ứng giữa MDA và TBA .......................................................................30
Hình 2. 7. Giải phẫu ấu trùng ruồi giấm bậc 3 ..............................................................32
Hình 3. 1. Tác dụng cải thiện hành vi giao tiếp xã hội được đánh giá bằng thử nghiệm
hành vi tương tác cộng đồng trên ruồi giấm rugose trưởng thành của cao chiết IB2 và
IB5. ................................................................................................................................36
Hình 3. 2. Tác dụng cải thiện trí nhớ ngắn hạn của cao chiết dưới phân đoạn IB2, IB5
trên ấu trùng bậc 3 ruồi giấm rugose .............................................................................37

Hình 3. 3. Hình ảnh đường đi của ấu trùng ruồi giấm bậc ba sau khi phân tích qua phần
mềm Image-J. ................................................................................................................38
Hình 3. 4. Tác dụng cải thiện khả năng vận động của cao chiết dưới phân đoạn IB2,
IB5 trên ấu trùng bậc 3 ruồi giấm rugose ......................................................................39
Hình 3. 5. Hoạt tính dọn gốc DPPH của các cao chiết ..................................................40
Hình 3. 6. Khả năng ức chế gốc tự do DPPH của đầu ruồi giấm ở các lơ khác nhau. ..41
Hình 3. 7.Nồng độ MDA trong dịch đồng thể đầu ruồi ở các lơ nghiên cứu. ..............43
Hình 3. 8. Kết quả phân tích cấu trúc thần kinh cơ (Neuromuscular junction-NMJ) tại
nhóm cơ số 4 của ấu trùng ruồi giấm bậc 3 bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh
quang. ............................................................................................................................45

vii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorders, ASD) là tình trạng rối loạn hành
vi trong nhóm các rối loạn phát triển lan tỏa, đặc trưng bởi sự suy giảm khả năng hòa
nhập xã hội, suy giảm khả năng giao tiếp, có những hành vi rập khn, lặp lại và những
quan tâm mang tính hạn hẹp. Bệnh xuất hiện liên quan đến các yếu tố di truyền, sinh
học, môi trường và sự tương tác giữa gen và môi trường. Hiện nay ASD được coi là căn
bệnh của xã hội hiện đại với tỷ lệ mắc tăng lên nhanh chóng ở tất cả các quốc gia. Số
lượng trẻ em mắc chứng tự kỷ trong cộng đồng đang ở mức báo động với tỷ lệ ước tính
rằng cứ 160 trẻ sẽ có 1 trẻ mắc tự kỷ, đặc biệt ở trẻ nhỏ, gây ảnh hưởng nhiều đến cuộc
sống của trẻ. Hiện nay vẫn chưa có phương pháp điều trị khỏi, các biện pháp chỉ giúp
cải thiện triệu chứng của bệnh. Vì vậy, bệnh trở thành gánh nặng đối với trẻ tự kỷ và gia
đình của trẻ, cũng như mối quan tâm của tồn xã hội.
Chè đắng có tên khoa học là Ilex kudingcha C.J.Tseng, là loài cây thân gỗ sống
lâu năm mọc trên các vùng núi đá vôi ở Việt Nam, phân bố chủ yếu ở một số tỉnh như
Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hịa Bình và Ninh Bình. Trong y học cổ truyền Việt
Nam, Chè đắng được sử dụng làm vị thuốc để loại bỏ các độc tố, kháng khuẩn, giảm

cơn khát và ho, ngứa mắt, mắt đỏ, đặc biệt là để tăng cường sự tập trung và cải thiện trí
nhớ. Triterpenoid, acid phenolic, flavonoid và tinh dầu là những chất chính của Chè
đắng và các thành phần này có tác dụng bảo vệ hệ thống mạch máu, điều hịa q trình
chuyển hóa lipid, và có tác dụng chống oxy hoá, hạ đường huyết và ức chế khối u [45].
Trong khn khổ đề tài cơ sở của nhóm nghiên cứu năm 2019: “Nghiên cứu
sàng lọc tác dụng của một số cao chiết dược liệu trên mơ hình ruồi giấm tự kỷ thực
nghiệm” cho thấy 3 cao chiết dược liệu: Rau đắng biển (nồng độ 4 và 6 mg/ml); Chè
đắng (2 mg/ml) và Ngũ gia bì hương (2 và 4 mg/ml) đều thể hiện tác dụng điều trị tự kỷ
trên mơ hình ruồi giấm thơng qua tiêu chí làm giảm khoảng cách tương tác giữa các cá
thể ruồi giấm; trên thử nghiệm đánh giá hành vi thức/ngủ, kết quả nghiên cứu bước đầu
trên mẫu cao chiết chè đắng (2 mg/ml) cho thấy có tác dụng kéo dài thời gian ngủ vào
ban đêm và buổi trưa; đồng thời đỉnh hoạt động mạnh nhất được xác định vào buổi sáng
(10 h) và buổi tối (20 h) [7]. Đến năm 2020, nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá tác dụng
cải thiện hội chứng tự kỷ của lá chè đắng trên mơ hình chuột nhắt tự kỷ gây bởi natri
valproat, kết luận rằng cao chiết lá chè đắng có khả năng cải thiện các hội chứng tự kỷ
như chống lo âu, tăng tương tác xã hội và cải thiện suy giảm trí nhớ/ nhận thức trên mô

1


hình chuột tự kỷ thực nghiệm [7]. Kết quả nghiên cứu đến thời điểm này của dự án
“Nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ngăn ngừa/ hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ
và cơ chế tác dụng” của nhóm nghiên cứu cho thấy cao chiết phân đoạn n- butanol lá
Chè đắng có tác dụng cải thiện triệu chứng tự kỷ thể hiện thông qua hành vi cải thiện
rối loạn giấc ngủ ngày đêm, cải thiện khả năng học tập ghi nhớ mùi.
Do đó, để tiếp tục làm rõ tác dụng của cao chiết phân đoạn n-butanol, chúng tôi
tiếp tục tiến hành nghiên cứu sâu hơn ở các cao chiết dưới phân đoạn n- butanol lá Chè
đắng nhằm giúp định hướng phân lập hoạt chất và có ý nghĩa trong ứng dụng, giúp dễ
dàng tiêu chuẩn hóa cao chiết và giảm liều dùng khi phát triển sản phẩm, chúng tôi thực
hiện đề tài: “Đánh giá tác dụng và sơ bộ cơ chế tác dụng của một số phân đoạn từ cao

chiết n- butanol từ lá chè đắng (Ilex kudingcha C.J.Tseng) trên mơ hình ruồi giấm đột
biến gen mang bệnh tự kỷ’’, với hai mục tiêu:
- Đánh giá được tác dụng cải thiện hành vi của các phân đoạn từ cao n- butanol
lá chè đắng trên mơ hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang bệnh tự kỷ.
- Bước đầu đánh giá tác dụng chống oxy hóa và sự thay đổi trong cấu trúc thần
kinh cơ (neuromuscular junction-NMJ) của ấu trùng ruồi giấm bậc 3 của một số phân
đoạn từ cao n- butanol lá chè đắng trên mơ hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang
bệnh tự kỷ.

2


Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. BỆNH TỰ KỶ
1.1.1. Sơ lược bệnh tự kỷ
Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một rối loạn phát triển thần kinh ở người đặc trưng
bởi tình trạng rối loạn thần kinh phức tạp bao gồm những khó khăn trong tương tác xã
hội, các vấn đề về giao tiếp bằng lời nói và khơng bằng lời nói, có các hành vi, sở thích,
hoạt động cứng nhắc lặp đi lặp lại và hạn chế[49]. ASD hiện được ước tính xảy ra với
tần suất 1% trong dân số nói chung khiến chúng trở thành một trong những rối loạn phát
triển thần kinh phổ biến nhất [30].
1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh và yếu tố di truyền học
Có nhiều giả thuyết khác nhau về nguyên nhân gây ra hội chứng rối loạn tự kỷ
như: dị ứng, di truyền, nhiễm độc thủy ngân, cấu tạo não bất thường, căn nguyên tâm
lý,… Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến yếu tố di truyền và gen. ASD có
nguyên nhân di truyền phức tạp, bao gồm biến đổi số lượng bản sao, đột biến gen đơn
lẻ, nghiên cứu liên kết gen trong tồn bộ genome và các ước tính hiện tại cho thấy các
yếu tố di truyền chiếm khoảng 10 - 20% trong số báo cáo các trường hợp ASD [16] .
Các rối loạn đơn gen nổi trội liên quan đến ASD là hội chứng nhiễm sắc thể X
dễ gãy, hội chứng Rett, sao chép MECP2, hội chứng Angelman [50].

Hội chứng nhiễm sắc thể X dễ gãy (Fragile X syndrome) được gây ra bởi sự đột
biến của bộ ba nucleotit CGG lặp lại ở vùng chưa được dịch mã đầu 5’ của gen FMR1
( Fragile X Mental Retardation gene 1), dẫn đến sự tăng cường q trình sao chép của
nó và đi kèm với sự ức chế phiên mã. Tỷ lệ hiện mắc ước tính của ASD là 30 ~ 60%
(chỉ dành cho nam) [50].
Hội chứng Rett là một rối loạn thần kinh tiến triển gây ra bởi đột biến mất chức
năng trong gen mã hóa protein-2-methyl-CpG (MECP2). MECP2 có chức năng như một
bộ điều hịa phiên mã tồn cầu trong cả việc ức chế và kích hoạt các gen mục tiêu, cũng
như một bộ điều chỉnh của quá trình tách ARN. Tỷ lệ mắc tự kỷ ước tính là 61% (chỉ
dành cho nữ). Sự nhân đôi của vùng Xq28 chứa gen MECP2 gây ra hội chứng sao chép
MECP2. Tỷ lệ tự kỷ ước tính là hơn 90% (chỉ nam giới) cho hội chứng này [50].
Hội chứng Angelman là một rối loạn đơn sinh với tỷ lệ mắc ASD ước tính là 34%
[50]. Nhiều trường hợp mắc hội chứng Angelman do đột biến mất chức năng ở alen mẹ

3


của gen Ubiquitin-protein ligase E3A (UBE3A). Chức năng của UBEA3A như một phức
hợp protein gắn ubiquitin ligase và như một protein đồng hoạt hóa phiên mã. Gen
UBE3A được biểu hiện ở các tế bào thần kinh, nhưng không phải là glia ở vùng đồi thị
và tiểu não của não. Các alen bình thường của UBE3A gốc bị mất biểu hiện kiểu hình
bởi RNA khơng mã hóa dài. Sự biểu hiện quá mức của UBE3A cũng làm tăng nguy cơ
mắc bệnh tự kỷ được gọi là hội chứng trùng lặp 15q [22].
Các nghiên cứu đột biến trong các hệ thống mô hình động vật đã cho thấy một số
protein được bảo tồn điều chỉnh cấu trúc và chức năng khớp thần kinh trong các kiểu
hình giống ASD. Trong một số trường hợp, người mắc ASD đã được chứng minh là có
sự gián đoạn trong các gen mã hóa các protein synap này [16], dẫn đến khả năng các
protein đó có thể đóng vai trị là mục tiêu điều trị. Các nghiên cứu di truyền gần đây đã
xác định neurobeachin (NBEA) là gen ứng cử viên cho ASD sau các báo cáo ban đầu
rằng gen NBEA bị phá vỡ dẫn đến chứng tự kỷ vô căn ở nam thanh thiếu niên [19].

Nghiên cứu này được tiếp tục thực hiện và có các báo cáo bổ sung về bệnh nhân ASD
bị xóa gen NBEA [41], [54]. Gen NBEA ở vị trí dễ gãy phổ biến FRA13A và mã hóa một
loại protein ban đầu được xác định là protein Kinase A protein neo (AKAP). Các nghiên
cứu trong các hệ thống mơ hình động vật đã chỉ ra rằng NBEA tham gia vào một loạt
các quá trình tế bào như tạo võng mạc, trao đổi màng tế bào và giải phóng chất dẫn
truyền thần kinh, củng cố trí nhớ ngắn hạn, và sự phát triển và chức năng tiểu cầu.
Ngoài ra, một lượng lớn dữ liệu cho thấy các yếu tố môi trường và biểu sinh đóng
góp đáng kể vào ngun nhân của kiểu hình ASD và được công nhận là yếu tố điều biến
[16]. Nhiều yếu tố môi trường tác động trước và trong q trình mang thai được cho là
có liên quan tới tự kỷ như bệnh đái tháo đường ở thai phụ, xuất huyết trong quá trình
thai nghén hay liên quan tới các trị liệu trong thời gian mang thai. Các tác nhân trong
thai kỳ và ngay sau quá trình sinh nở cũng có liên quan tới chứng tự kỷ như tai biến
nhau thai, các sang chấn trong quá trình chuyểnchu dạ, rọng lượng thai nhỏ dưới 2000g,
sinh non, xung đột nhóm máu ABO hay Rh,… Một trong số những tác nhân thuộc yếu
tố môi trường là trẻ phơi nhiễm với một số thuốc và chất gây độc như axit valproic,
ethanol, thalidomid, thủy ngân, chì,… cũng cho thấy liên quan tới bệnh tự kỷ. Tuy nhiên,
nguyên nhân chính xác và các yếu tố rủi ro đáng tin cậy cho ASD là khó nắm bắt [5],
[8].

4


1.1.3. Tác động của stress oxy hoá đến ASD
Sự mất cân bằng giữa việc tổng hợp các gốc oxy hoá và khả năng ngăn chặn tác
động có hại của cơ thể sống bằng cách sử dụng các hệ thống chống oxy hoá là nguyên
nhân gây ra stress oxy hoá. Bất thường ở ty thể và stress oxy hố đóng vai trị quan trọng
gây ra q trình lão hố và bệnh tật. Để chống lại tình trạng này, cơ thể cần một số cơ
chế giải độc để loại bỏ các hợp chất độc hại và trung hoà các gốc oxy, nitơ có trong mọi
tế bào. Superoxide (O2-) có thể được hình thành như một sản phẩm phụ của q trình
chuyển hố oxy bình thường. Tuy nhiên sự tích tụ superoxide có thể gây hại cho cấu

trúc tế bào, do thúc đẩy q trình oxy hố. Superoxide ngay lập tức được chuyển thành
hydrogen peroxide (H2O2) bởi enzym superoxide dismutases (SODs). Sự hiện diện của
H2O2 gây độc cho tế bào vì nó đi qua màng tế bào và làm hỏng ADN. Một số con đường
trung hoà đã được phát triển để loại bỏ hydrogen peroxide. Trong đó, enzym quan trọng
nhất là catalase và glutathion peroxidase (GPx), cả hai đều chuyển hoá H2O2 thành H2O.
Tripeptid glutathion là một trong những chất giải độc quan trọng nhất, đóng vai trị cơ
bản trong việc loại bỏ ROS. Ở dạng khử (GSH), glutathion cho H2O2 một điện tử trong
phản ứng được xúc tác bởi GPx và chuyển thành dạng oxy hố. GSH có thể được tái tạo
lại bởi enzym glutathion reductase, enzym này sử dụng NAD(P)H làm chất cho điện tử.
Glutathion cũng có thể hoạt động như một cơ chất của các enzym khác như GSH
transferase, giúp loại bỏ các phân tử độc hại khỏi tế bào. Não là một trong những cơ
quan chuyển hố chính của oxy, dó đó một lượng lớn ROS tích tụ ở một số vùng não.
Vì vậy, não có thể rất nhạy cảm với các gốc ROS [20], [42].Việc sản xuất ROS là đặc
điểm chính của rối loạn thần kinh. Các gốc oxy hố đã được chứng minh đóng một vai
trị quan trọng trong sinh lý bệnh, sự tiến triển và mức độ nghiêm trọng của bệnh
Alzheimer, Parkinson và Huntington, ASD và chứng xơ cứng teo cơ. Ngoài ra, bệnh
nhân ASD rất dễ bị stress oxy hoá và rất dễ bị tổn thương qua trung gian ROS và nhiễm
độc tế bào thần kinh. Vì vậy, một số nghiên cứu hiện nay đã liên kết ASD với việc tăng
nồng độ ROS và giảm khả năng chống oxy hố, khơng chỉ ở não mà cịn ở tồn cơ thể.
Một số báo cáo đã nghiên cứu các phân tử liên quan đến stress oxy hoá trong não của
những người bị ASD. Đặc biệt nồng độ glutathion bị oxy hoá tăng lên, glutathion giảm
thấp, và tỷ lệ oxy hoá khử glutathion giảm dần ở thái dương và tiểu não của bệnh nhân
ASD [20], [42].

5


Các thơng số liên quan đến stress oxy hố ở ngoại vi là những dấu ấn sinh học
tiềm năng để chẩn đoán sớm ASD. Hoạt động SOD trong hồng cầu ở trẻ ASD cao hơn
nhóm chứng. Gonzales-Fraguela và các đồng nghiệp đã chứng minh được ở bệnh nhân

tự kỷ, nồng độ malonyldialdehyd (MDA), 8-hydroxy-2-deoxyguanosin (8OHdG), GSH
giảm. Gần đây, vai trò sinh lý bệnh của ROS trong ASD đã được đánh giá trong một
nghiên cứu thuần tập ở Ai Cập. Mô hình phiên mã của 84 gen liên quan đến stress oxy
hoá được đo trong các tế bào máu đơn nhân ở ngoại vi (PBMC) được phân lập từ bệnh
nhân tự kỷ và nhóm chứng khoẻ mạnh. Tám gen mã hố cho các protein quan trọng liên
quan đến quá trình chuyển hoá ROS (GCLM, SOD2, NCF2, PRNP, PTGS2, TXN và
FTH1) giảm ở người tự kỷ. Các phân tử này là dấu ấn sinh học hữu ích để chẩn đốn và
điều trị bệnh sớm. Ngoài ra, rối loạn chức năng ty thể mãn tính liên quan đến chuỗi vận
chuyển điện tử (ETC), phức hợp I và III đã được xác định ở bệnh nhân ASD [20], [42].
Stress oxy hoá là một đặc điểm quan trọng ở bệnh nhân ASD. Nhiều nghiên cứu
được tiến hành để xem xét liệu các triệu chứng của ASD có được cải thiện sau khi dùng
các chất chống oxy hố hay khơng. Sự biểu hiện của các enzym chống oxy hố bị giảm
trong ASD. Ngồi ra, nồng độ các phân tử chống oxy hoá nội sinh giảm ở những người
mắc ASD so với những người khoẻ mạnh. Vì những lý do này, việc sử dụng các chất
chống oxy hố đưa vào trong cơ thể có thể thúc đẩy hệ thống dọn dẹp các ROS, chống
stress oxy hoá. Để việc điều trị ASD hiệu quả, chất chống oxy hoá phải qua được hàng
rào máu não và đi được vào nhu mơ não, tại đó chúng phải đạt được nồng độ điều trị tối
ưu. Coenzym Q10 (CoQ10) (ubiquinon) là một đồng yếu tố chống oxy hoá ty thể vượt
qua hàng rào máu não. Ở trẻ em ASD, việc sử dụng ubiquinol (dạng giảm hoạt tính của
coenzym Q10) đã dẫn đến sự cải thiện giao tiếp bằng lời. Một phân tử đầy hứa hẹn khác
là N-acetylcystein (NAC), một chất chống oxy hoá mạnh giúp tăng nồng độ glutathion.
NAC được coi là một nguồn cystein quan trọng. Tác dụng của NAC đối với các triệu
chứng ASD đã được nghiên cứu ở chuột trong mơ hình tự kỷ gây ra bởi acid valproic.
Các nghiên cứu chỉ ra rằng, ở những động vật này, NAC cải thiện hoạt động lặp đi lặp
lại theo khuôn mẫu, đồng thời làm giảm mức độ stress oxy hoá bằng cách tăng glutathion
và giảm malonidialdehyd so với nhóm đối chứng. Các lợi ích khi sử dụng NAC cho trẻ
em bị ASD cũng được ghi nhận. Đặc biệt, một nghiên cứu cho thấy thuốc được dung
nạp tốt và có thể làm giảm đáng kể tình trạng cáu gắt, hành vi rập khn, lặp lại. Một
chất chống oxy hố khác được thử nghiệm điều trị ASD là vitamin C. Khi bổ sung

6


vitamin C cho trẻ em ASD trong 30 tuần, quan sát thấy sự cải thiện đáng kể các hành vi
vận động. Nhiều thử nghiệm lâm sàng mù đơi, có đối chứng với giả dược sử dụng kết
hợp các chất chống oxy hoá như vitamin C, carnosin, kẽm, vitamin B6 và magie đã được
thực hiện. Điều trị ASD bằng vitamin C liều cao hoặc carnosin hoặc kết hợp vitamin B6
và magie đã cải thiện hành vi của những người bị ASD. Ở những bệnh nhân ASD, hàm
lượng magie trong máu thấp. Việc bổ sung magie làm cải thiện các triệu chứng như kém
tập trung và tăng động. Ngoài ra, nghiên cứu chỉ ra rằng ở chuột mẹ mang thai tiếp xúc
với valproat (VPA bao gồm acid valproic, natri valproat, dinatri valproat), điều trị bằng
acid folic liều cao, vitamin E và methionin (nguồn cung cấp methyl) có thể cải thiện
hoặc ngăn ngừa hầu hết các tác hại do VPA gây ra ở chuột con. Trong não, acid valproic
ức chế quá trình peroxyd hoá lipid và glutathion. Hormon melatonin cũng được chứng
minh hoạt động như một chất chống oxy hố mạnh. Melatonin có thể tìm thấy ở nồng
độ cao trong các loại thực vật, trái cây và thực phẩm. Vì vậy, trong vài năm gần đây,
nhiều liệu pháp dinh dưỡng đã được sử dụng để cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân
ASD. Do đó, các chất chống oxy hố và vitamin được dùng dưới dạng thực phẩm chức
năng hoặc thực phẩm giúp bệnh nhân ASD giảm bớt các triệu chứng bệnh một cách rõ
ràng [20], [42].
1.1.4. Thuốc điều trị tự kỷ
Điều trị rối loạn phổ tự kỷ bao gồm hai hướng: dùng thuốc và không dùng thuốc.
Với hướng điều trị không dùng thuốc, các phương pháp can thiệp đã được phát triển và
nghiên cứu để sử dụng cho trẻ nhỏ. Những can thiệp này có thể làm giảm các triệu
chứng, cải thiện khả năng nhận thức, kỹ năng sống hàng ngày và tối đa hóa khả năng
hoạt động và tham gia vào cộng đồng của trẻ. Liệu pháp quản lý hành vi cố gắng củng
cố các hành vi mong muốn và giảm các hành vi không mong muốn. Trị liệu hành vi
thường dựa trên phân tích hành vi ứng dụng (ABA). ABA đã được chấp nhận rộng rãi
giữa các chuyên gia chăm sóc sức khỏe và được sử dụng trong nhiều trường học và
phòng khám điều trị. Sự tiến bộ của trẻ được theo dõi và đo lường [25].

Các phướng pháp điều trị bằng thuốc thì hiện nay chưa có thuốc đặc trị rối loạn
phổ tự kỷ (ASD). Chỉ có 2 thuốc được FDA cấp phép nhằm giảm triệu chứng ở trẻ tự
kỷ đó là: Abilify và Risperdal.

7


Theo “Hướng dẫn quy trình can thiệp trẻ mắc rối loạn phổ tự kỷ” của Cục quản
lý khám chữa bệnh- Bộ Y tế, có thể sử dụng một số loại thuốc để làm tăng khả năng tập
trung, giảm các triệu chứng như tăng động, giảm sự chú ý, hành vi rập khn, hành vi
tự hủy hoại, hung tính, điều chỉnh hành vi, điều trị trầm cảm, lo âu, khó ngủ:
- Thuốc giảm tăng động: clonidin, methylphenidate (Ritalin)…
- Thuốc giảm kích động, hung tính, tự gây thương tích: haloperidol, risperidone,
olazapin, quetiapin, clozapine, ziprasidone, aripiprazol.
- Thuốc điều trị lo âu, trầm cảm phối hợp: fluoxetine, sertraline, venlafaxine,
Effexor...
- Thuốc tăng cường tuần hoàn não, cải thiện chuyển hóa tế bào thần kinh:
piracetam, centrophenoxine (lucidril)…
- Một số thuốc bổ hỗ trợ điều trị như magie B6, B12, calci.
1.1.5. Một số mơ hình nghiên cứu rối loạn tự kỷ
Trong thập kỷ qua, nhiều tiến bộ sâu rộng đã đạt được trong chẩn đoán phân tử
ASD và xác định được các gen liên quan đến ASD. Để tìm hiểu đặc tính chức năng của
các gen này, xác định các dấu ấn sinh học mới cho ASD và nghiên cứu bệnh lý phân tử,
một số mơ hình động vật bao gồm linh trưởng, chuột và ruồi giấm đã được sử dụng.
Nghiên cứu ASD trên chuột, nhìn chung có 2 loại mơ hình chính là mơ hình di
truyền và mơ hình khơng di truyền. Các mơ hình di truyền ASD gây ra ở chuột có thể
được thiết lập bằng cách nhắm các gen tương đồng của chuột với các gen có liên quan
tới ASD ở người như FMR1, NBEA, UBE3A, ... Cụ thể, chuột đực bị loại bỏ
gen FMR1 cho thấy sự thiếu hụt tương tác xã hội, sự hiếu động và suy giảm nhận thức,
tương đồng với các triệu chứng tự kỷ ở người. NBEA đơn bội có thể gây ra rối loạn chức

năng nhận thức và kiểu hình giống ASD, bao gồm những thiếu hụt trong hành vi xã hội,
phản ứng sợ hãi có điều kiện, học tập khơng gian và trí nhớ ở chuột. Chuột được gây im
lặng (knockout) gen UBE3A cũng cho thấy các tương tác xã hội bị suy giảm, hành vi lặp
đi lặp lại…[26], [52].
Bên cạnh đó, các mơ hình tự kỷ không di truyền trên chuột cũng được nhiều nhà
khoa học trên thế giới nghiên cứu. Các mơ hình động vật không di truyền của ASD được
8


gây ra do phơi nhiễm trước khi sinh với các tác nhân hóa học như axit valproic (VPA),
thalidomid và ethanol trong khi mang thai, nhiễm virus hoặc viêm. Trong số các yếu tố
này, phơi nhiễm VPA khi mang thai làm tăng đáng kể tỷ lệ ASD ở trẻ em. VPA là thuốc
chống động kinh và ổn định tâm trạng dùng cho bệnh nhân khi mang thai. Nghiên cứu
lâm sàng đã xác định các rủi ro liên quan đến việc sử dụng VPA, bao gồm dị tật bẩm
sinh, chậm phát triển, giảm chức năng nhận thức và tự kỷ. Bệnh tự kỷ do VPA có khả
năng gây ra bởi các khiếm khuyết trong sự phát triển tế bào thần kinh của tiểu não, hệ
thống limbic và thân não để gây ra sự gián đoạn trong kết nối synap. Mơ hình này có
thể đại diện tốt hơn cho nhiều trường hợp tự kỷ vơ căn có nguồn gốc mơi trường / biểu
sinh hơn so với các mơ hình đột biến gen mang đột biến trong các gen liên quan đến tự
kỷ [39].
Trong các năm gần đây, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu sử dụng ruồi
giấm làm sinh vật mô hình để mơ phỏng bệnh lý rối loạn tự kỷ ở người với mục tiêu xác
định được tác động của các yếu tố về gen, môi trường đến các hành vi, biểu hiện, khả
năng vận động, các thay đổi về nhịp sinh học và biến đổi trong cấu trúc thần kinh ruồi
giấm. Một số gen có liên quan và đã được sử dụng để gây mơ hình ruồi giấm tự kỷ trên
thế giới như: gen dABCA13, rugose, dUBE3A, dFMR1, … [52].
Trong đề tài cấp cơ sở 2019, chúng tôi cũng tiến hành đánh giá sàng lọc dược
liệu có tác dụng điều trị tự kỷ sử dụng mơ hình ruồi giấm đột biến gen neurobeachin.
Những chủng ruồi giấm đột biến gen này đều do GS Yamaguchi cung cấp. Để đánh giá
hành vi trên mơ hình ruồi giấm tự kỷ, các nhà khoa học cũng dùng tập hợp các bài kiểm

tra, đánh giá sự thay đổi hành vi tương tự với những thay đổi trên trẻ tự kỷ, cụ thể một
số hành vi như:
- Đánh giá hành vi vận động của ấu trùng và ruồi giấm trưởng thành thông qua
các thử nghiệm bò và trèo
- Đánh giá hành vi tương tác cộng đồng của ruồi giấm
- Đánh giá hành vi thức ngủ của ruồi giấm trưởng thành
- Đánh giá hành vi lẫn tránh mùi trên ruồi giấm trưởng thành và một số hành vi
khác nữa.

9


Việc tổng hợp nhiều dữ liệu nghiên cứu sử dụng mơ hình ruồi giấm biến đổi gen
cho bệnh tự kỷ cũng góp phần xác định được được vai trị của các nhóm gen liên quan,
làm sáng tỏ cơ chế phân tử của bệnh.
1.2. CHÈ ĐẮNG
1.2.1. Tên gọi – vị trí phân loại
Ở Việt Nam, tên khoa học của cây Chè đắng mọc ở vùng núi đá vôi thuộc tỉnh
Cao Bằng và một số địa phương khác là Ilex kudingcha C.J.Tseng (tên đồng nghĩa là
Ilex kaushue S.Y.Hu). Tên Việt Nam là Chè đắng, ché khôm (tiếng Tày-Nùng), khổ đinh
trà[2]. Chi Ilex thuộc họ Nhựa ruồi hay họ Bùi hay Trâm bùi (Aquifoliaceae, tên khác
là Ilicaaceae), bộ Celetrales phân lớp Rosidae (phân lớp hoa hồng), ngành Ngọc Lan.
1.2.2. Đặc điểm thực vật, phân bố
Cây thân gỗ, cao 6-20m, đường kính thân từ 20-60cm, có cây đường kính cao tới
1,2m ( Hình 1.1). Cành thơ, màu nâu xám, khơng có long, cành non hình trụ có nhiều
gờ nhỏ. Lá đơn mọc cách, mép lá có rang cưa nhỏ và tù. Phiến lá hình bầu dục đến thn
hoặc hình mác ngược. Ở cây trưởng thành lá thường dìa 12-17cm, rộng 5-6cm. Mặt trên
của lá màu lục sẫm và láng bóng, mặt dưới màu lục nhạt, cả hai mặt đều khơng có lơng.
Lá vị trong tay có mùi thơm mát, hơi hắc của tinh dầu. Hoa màu trắng ngà, đơn tính
khác gốc.

Chè đắng là loại cây mọc tự nhiên, phân bố tản mạn ở một số địa phương miền
núi phía bắc nước ta như Lào Cai, Lạng Sơn, Cao Bằng, Hịa Bình, Ninh Bình. Trong
đó, Cao Bằng là địa phương được xác định có 6/12 huyện có mật độ phát triển của cây
Chè đắng cao, chiếm 32% diện tích tồn tỉnh.

Hình 1. 1. Hình ảnh cây Chè đắng và lá Chè đắng khô (Ilex kudingcha C.J. Tseng)

10


1.2.3. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học chủ yếu của Chè đắng gồm các triterpenoid, các acid
phenolic, các flavonoid và các tinh dầu [33]. Một số saponin triterpenoid trong Chè
đắng: Các ursan triterpenoid với vịng lacton ở vị trí C20 và C28 được gọi là αkudinlacton, β-kudinlacton và γ-kudinlacton được xem là thành phần hóa học chính
trong các lồi Chè đắng.
Ở Việt Nam, đã phát hiện trong lá Chè đắng thu hái tại Cao Bằng cũng có saponin
triterpenoid tương tự như lá Chè đắng ở Trung Quốc. Ngoài ra, cịn có flavonoid , βcaroten, polysaccharid, coumarin, acid hữu cơ, acid amin [6], [9].
1.2.4. Một số nghiên cứu đã được thực hiện về cây Chè đắng
Sơ lược về lịch sử sử dụng cây Chè đắng làm thuốc:
Cây Chè đắng (Ilex kudingcha C . J . Tseng) đã được sử dụng làm thuốc và nước
uống ở miền nam Trung Quốc từ cách đây 2000 năm [24]. Theo kinh nghiệm, lá Chè
đắng được sử dụng trong nhân dân để làm thuốc kích thích hệ thần kinh trung ương,
tăng cường trí nhớ, thuốc tăng lực, kích thích tiêu hóa, kéo dài tuổi thọ. Ngồi ra, lá Chè
đắng cịn được sử dụng để giải độc, trị đau đầu, viêm mũi, viêm họng, viêm phế quản.
Trong vài năm qua, Chè đắng đã được sử dụng như một loại đồ uống giảm béo
dành cho người ăn kiêng và trở nên phổ biến với nhứng cái tên khác nhau như trà làm
đẹp giảm béo, trà lâu năm, trà xanh, trà thanh đạm,… Chè đắng đã được báo cáo về chất
chống oxy hóa rõ ràng, chống viêm, chuyển hóa lipid, bảo vệ gan và chống ung thư [34].
Uống Chè đắng thường xuyên như một loại trà thảo dược có vai trị tích cực trong
ngăn ngừa và điều trị các bệnh tim mạch, bệnh mạch não, tiểu đường, viêm họng và ung

thư, đặc biệt là các vấn đề liên quan đến xơ cứng động mạch, cao huyết áp, chóng mặt,
mất ngủ, đánh trống ngực, đau tức ngực do các bệnh tim mạch [59]. CĐ có hoạt tính
sinh học trên chuyển hóa lipid, chống oxy hóa, ức chế khối u, có tác dụng hạ đường
huyết, và bảo vệ hệ thống tim mạch tương tự như trà xanh [35].
Các nghiên cứu trong nước:
- Nghiên cứu về thành phần hóa học, độc tính, tác dụng trên thần kinh
Nghiên cứu của tác giả Trần Thị Diệu Anh (2009) [1] đã phân lập và xác định
được cấu trúc 4 saponin triterpenoid pentacyclic, 2 flavonoid. Đây là những hợp chất
saponin và flavonoid lần đầu được phân lập và xác định cấu trúc hóa học từ lá CĐ thu
hái tại Cao Bằng. Saponin CĐ và cao nước CĐ có độc tính cấp thấp và được xếp vào

11


loại chế phẩm không xác định được LD50. Về độc tính bán trường diễn, cả 2 chế phẩm
saponin và cao nước CĐ đều không ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, tạo máu của
thỏ, tế bào gan, cầu thận và ống thận trong giới hạn bình thường. Saponin CĐ khơng
ảnh hưởng đến sự phát triển của cơ quan sinh dục và khả năng thụ tinh của chuột cống
trắng đục. Đối với tác dụng tăng cường khả năng học tập và ghi nhớ: Saponin CĐ có tác
dụng rút ngắn 8,57 % số ngày học tập phản xạ có điều kiện và kéo dài 69,14 % thời gian
duy trì phản xạ đã học được so với lô chuột đối chứng.
- Tác dụng chống oxy hóa, ức chế xơ gan, chống viêm cấp và mạn tính
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao chiết saponin tồn phần từ lá CĐ có các tác
dụng sau: ức chế xơ gan trên mơ hình gây tổn thương gan và xơ gan bằng CCl4, tác
dụng chống oxy hóa, lợi mật, chống viêm cấp và mạn [4].
Nghiên cứu của tác giả Đặng Thị Mai Huy (2003) [9] cho thấy flavonoid trong lá Chè
đắng có tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan và não chuột do ức chế q trình
POL rất rõ. Hoạt tính này tăng tỷ lệ thuận với nồng độ flavonoid. Flavonoid toàn phần
trong lá Chè đắng cũng có hoạt tính thu dọn gốc tự do anion superoxide trong hệ
Xanthin/Xanthin oxidase, khả năng thu dọn gốc tự do cũng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ

flavonoid toàn phần.
- Tác dụng chống độc
Các tác giả trường Đại học Y Thái Nguyên đã thử tác dụng của địch chiết lá CĐ
trên chuột bị gây độc bằng dioxin (2,4D). Kết quả cho thấy dịch chiết CĐ có tác dụng
giảm 20 - 40% sự tác động của 2,4D tới dòng bạch cầu , đồng thời giảm 36% tác hại của
2,4D tới enzym ASAT; ngăn chặn ảnh hưởng của 2,4D tới NST ở mơ tủy xương và mơ
tinh hồn và dịch chiết lá CĐ không gây rối loạn NST chuột. Saponin CĐ có thể dùng
phịng độc hại cho người làm việc trong môi trường độc hại kéo dài do nghề nghiệp hoặc
môi trường [12].
- Tác dụng cải thiện hội chứng Tự kỷ
Kết quả của nhóm nghiên cứu PGS. TS Phạm Thị Nguyệt Hằng và cộng sự cho
thấy: Cao chiết ethanol 80% từ lá Chè đắng (2 mg/ml) thể hiện tác dụng điều trị tự kỷ
trên mơ hình tương tác cộng đồng Social space thơng qua tiêu chí làm giảm khoảng cách
tương tác giữa các cá thể ruồi giấm, trên thử nghiệm đánh giá hành vi thức/ngủ. Kết quả
nghiên cứu bước đầu trên mẫu cao chiết ethanol 80% từ lá chè đắng (2 mg/ml) cho thấy
có tác dụng kéo dài thời gian ngủ vào ban đêm và buổi trưa, đồng thời đỉnh hoạt động
mạnh nhất được xác định vào buổi sáng (10 h) và buổi tối (20 h) [7]; Cao chiết ethanol
12


80% lá chè đắng có khả năng cải thiện các hội chứng tự kỷ như chống lo âu, tăng tương
tác xã hội và cải thiện suy giảm trí nhớ/ nhận thức trên mơ hình chuột tự kỷ thực nghiệm
[7]. Tuy nhiên, các nghiên cứu chưa phát hiện được hoạt chất nào trong lá chè đắng
đóng vai trị quan trọng trong tác dụng này và cơ chế phân tử của các biểu hiện hành vi
vận động trên các mơ hình tự kỷ . Do vậy, việc nghiên cứu sâu hơn các phân đoạn nhỏ
dần của cao chiết ethanol 80% từ lá chè đắng có tác dụng dược lý cũng như cơ chế tác
dụng đối với bệnh tự kỷ trên các mô hình ruồi giấm và động vật thực nghiệm là rất cần
thiết.
- Một số nghiên cứu lâm sàng
Tác dụng giải độc và bảo vệ gan của CĐ cũng đã được khẳng định khi thử nghiệm

trên một số chỉ số sinh học của dân cư sống quanh vùng khai thác thiếc Sơn Dương của
Đại học Y Thái Nguyên. Đã xác nhận rằng những người sống trong vùng có nguy cơ
nhiễm độc kim loại, chất độc, thuốc trừ sâu, với biểu hiện mất ngủ, đau đầu, chóng mặt,
tê đầu chi, nhức khớp, da tái nhợt, xét nghiệm thấy rối loạn công thức máu, tăng enzym
gan,. . . Sau một thời gian uống nước sắc lá CĐ đã làm giảm hàm lượng ASAT, ALAT
trong huyết thanh, làm ổn định về số lượng và tỷ lệ thành phần bạch cầu. Nếu sử dụng
thường xuyên có khả năng làm giảm một số triệu chứng cơ năng ở những người có biểu
hiện nhiễm độc mạn tính, nâng cao sức đề kháng [3].
Trong thí nghiệm trên bệnh nhân tăng huyết áp vô căn điều dưỡng tại bệnh viện
điều dưỡng và phục hồi chức năng tỉnh Thái Nguyên, Nông Thị Nga và cộng sự đã
chứng minh lá CĐ có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường giấc ngủ sâu và dài, cải thiện
một số chỉ tiêu chủ quan như: đau đầu, chóng mặt, chống váng, tê mỏi chân tay, đau
tức ngực trái. Lá CĐ cũng có tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol máu [10].
Các nghiên cứu trên thế giới :
- Tác dụng trên lipid và lipoprotein huyết tương
Những kết quả nghiên cứu trên cho thực nghiệm cho thấy dịch chiết lá cây CĐ
có tác dụng hạ huyết áp (HA) rõ rệt. Mức độ hạ HA từ từ, thời gian và mức độ hạ HA
phụ thuộc vào liều lượng, liều càng cao tác dụng càng mạnh. Dịch chiết lá CĐ có tác
dụng làm hạ cholesterol máu, mức độ hạ cholesterol phụ thuộc vào liều lượng thuốc
[40].
- Tác dụng bảo vệ hệ mạch

13


Cao chiết nước của CĐ làm tăng sự chảy của dịng máu trong động mạch vành
trên tim lợn cơ lập và làm tăng dòng máu động mạch não trên thỏ được gây mê, kéo dài
thời gian sống sót của chuột trong tình trạng thiếu oxy và bảo vệ chuột do thiếu máu cơ
tim gây bởi pituitrin. Các tác dụng này có lợi trong phịng ngừa và điều trị các bệnh
mạch vành và đau thắt ngực [60].

-Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh
Kim và cộng sự [29] đã báo cáo rằng CĐ bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương
thần kinh do thiếu máu cục bộ thoáng qua ở chuột nhắt. CĐ làm giảm đáng kể MCAO/tải
tưới máu gây ra do phù nề, thiếu máu thần kinh và chết tế bào não. Sự suy giảm glutathion
và quá trình peroxy hóa lipid gây ra bởi MCAO/tái tưới máu đã được ức chế khi dùng
CĐ, CĐ làm ức chế đáng kể sự tăng phosphoryl hóa MAPKs, COX - 2 và protein gây
chết tế bào theo chương trình ở chuột. Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương
do thiếu máu cục bộ thống qua ở chuột của CĐ có thể do tác dụng ngăn chặn sự chết tế
bào, là kết quả của tác dụng chống oxy hóa và tác dụng chống viêm của nó.
1.3. RUỒI GIẤM
Drosophila melanogaster Meigen là một loài ruồi thuộc chi Ruồi giấm
(Drosophila), họ Ruồi giấm (Drosophilidae), bộ Hai cánh (Diptera), lớp Côn trùng
(Insecta). Chúng được biết đến với tên thông dụng là ruồi giấm hay ruồi trái cây (fruit
fly). Ruồi giấm được coi là sinh vật có khả năng ứng dụng rộng rãi nhất trong việc tìm
hiểu cơ chế gây bệnh ở mức độ phân tử hay các vấn đề sinh học cơ bản từ sinh lý cho
đến thần kinh, chuyển hóa.
1.3.1. Đặc điểm
Ruồi giấm có màu vàng nâu và có các vịng đen ngang bụng. Con cái trưởng
thành dài khoảng 2,5mm, con đực nhỏ hơn một chút với lưng hơi tối. Con đực dễ dàng
phân biệt được với con cái dựa trên sự khác biệt về màu sắc, với một mảng đen khác
biệt ở bụng.
1.3.2. Hệ gen của ruồi giấm
Hệ gen của ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base gồm 15500 gen nằm trên
4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới
tính (XX, YY). trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể. Sự đơn giản này là một

14


trong những lý do tại sao chúng là một trong những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong

phân tích, sàng lọc di truyền [43].
1.3.3. Chu kỳ vòng đời
Chu kỳ phát triển của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và
ruồi trưởng thành (Hình 1.2). Ruồi cái có thể tạo ra khoảng 750- 1500 trứng trong suốt
vịng đời của nó. Trứng sau khi thụ tinh sẽ phát triển thành phơi trong vịng 24h. Các
phơi sau đó trải qua ba giai đoạn ấu trùng khác nhau (ấu trùng bậc một, ấu trùng bậc hai,
ấu trùng bậc ba tương ứng với một, hai, ba ngày tuổi) cuối cùng trưởng thành thành một
con ruồi giấm trưởng thành. Sự phát triển của một con ruồi trưởng thành chỉ mất 10
ngày kể từ khi thụ tinh. Tuổi thọ trung bình của ruồi giấm khi ni ở 29ºC khoảng 3040 ngày [43].

Hình 1. 2. Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm [56]
1.3.4. Cấu trúc thần kinh cơ của ruồi giấm
Hệ thống thần kinh cơ của ấu trùng ruồi giấm tương đối đơn giản, chỉ chứa 32
nơron vận động ở mỗi nửa phân đoạn ở bụng và cấu trúc thần kinh cơ của nó (NMJ) là
lớn, cá thể hóa, dễ dàng quan sát [32]. Các khớp thần kinh NMJ của ấu trùng sử dụng
các thụ thể glutamat ionotropic (Glamour) tương đồng với các thụ thể glutamat loại
AMPA trong não của động vật có vú. NMJ ruồi giấm hiển thị một số tính năng, bao gồm
khả năng tiếp cận cấu trúc, tính năng rập khuôn và khả năng tiếp cận các thao tác di
truyền, do đó nó được coi là mơ hình thuận tiện và hữu ích để làm sáng tỏ các cơ chế
hình thành khớp thần kinh, truyền synap, tính mềm dẻo và thối hóa khớp thần kinh
[37], [51].
15


Cấu trúc thần kinh cơ của ruồi giấm được cấu tạo bởi các nút bouton bao gồm
các vùng chức năng chính như vùng hoạt động trước synap (pre-synap active zone),
vùng sau synap chứa các protein tín hiệu (protein signaling) và thụ thể glutamat (GluR).
Các bouton tại NMJ của ấu trùng được bao quanh bởi một cấu trúc màng được gọi là
mạng lưới sau synap (SSR), chứa các thụ thể dẫn truyền thần kinh, phần khung và các
phân tử tín hiệu [23] (Hình 1.3.A).

Hình 1. 3. Cấu trúc thần kinh cơ (neuromuscular junction - NMJ) ở ấu trùng ruồi
giấm [15], [26]. A: Các vùng chức năng chính của sợi thần kinh cơ; B: Phân loại một
số dạng bouton chính dựa vào ảnh chụp tế bào thần kinh cơ với kháng thể anti –HRP và
kháng thể anti-DLG dưới kính hiển vi huỳnh quang; C: Phân loại bouton dựa vào kích
thước, số lượng mạng lưới sau synap (SSR) và loại chất dẫn truyền thần kinh (NT).
Có 3 loại bouton: Loại I, II và III (Hình 1.3.C). Chúng khác nhau về kích thước
và hình dạng, chất dẫn truyền thần kinh, số lượng mạng lưới sau synap (SSR) bao quanh
chúng. Bouton loại I sử dụng chất dẫn truyền là glutamat, được chia thành hai lớp: Ib
(lớn) và Is (nhỏ). SSR được nhuộm bởi kháng thể anti-Discs-Large (DLG), màng này
có ở cả bouton Ib và Is. Các bouton loại Ib được bao quanh bởi màng SSR nhiều hơn so
với các bouton loại Is, dẫn đến sự khác biệt giữa hai loại. Anti- DLG không đặc hiệu với
loại II và loại III. Kháng thể anti-HRP đặc hiệu với màng tế bào thần kinh tiền synap và
cho phép quan sát tất cả các loại bouton (Hình 1.4.B, C). Hầu hết các nghiên cứu kiểm
tra NMJ trên nhóm cơ số 4, nhóm cơ số 6/7, hoặc nhóm cơ số 12 [26].

16