KỸ THUẬT ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỔ doc

Đề tài Sinh học phân tử
Đề tài Sinh học phân tử

Nguyễn Thị Xuân Thảo

Nguyễn Thị Thúy Hằng

Nguyễn Thị Mỹ Thuận

Lê Thị Diệu Anh

Phan Hoàng Yến

Mai Văn Điểu

Trần Văn Thảo

Võ Hiệp
ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
DNA
DNA

Định lượng của các axit nucleic là
thường được thực hiện để xác định nồng
độ trung bình của DNA hoặc RNA có
mặt trong hỗn hợp.

Ứng dụng của phương pháp
định tính, định lượng DNA được
dùng nhiều nhất trong lĩnh vực y

học như để chẩn đoán các bệnh
học về di truyền
PHƯƠNG PHÁP
PHƯƠNG PHÁP
ĐO QUANG PHỔ
ĐO QUANG PHỔ
Mục đích
Nguyên tắc
hoạt động
Các yếu tố
ảnh hưởng
Mục đích
Mục đích
Xác định hàm lượng và kiểm tra
độ tinh khiết của phân tử DNA, ARN
có trong dung dịch.

Phương pháp đo quang phổ dựa
vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại
ở bước sóng 260nm của các base
Purine và Pyrimidine, độ hấp thụ này
tỷ lệ với nồng độ DNA.
Nguyên tắc
Nguyên tắc

Dựa vào tính chất này mà người
ta có thể xác định được hàm
lượng các nucleic acid bằng
phương pháp đo quang phổ hấp
thụ ở bước sóng 260nm (OD

260nm
–
Optical Density
260nm
).
Một đơn vị OD ở bước sóng 260nm ký
hiệu là OD
260nm
.
OD
260nm
= 50µg/ml cho một dung dịch
DNA mạch kép
OD
260nm
= 40µg/ml cho một dung dịch
DNA mạch đơn hoặc RNA
Đ h p th ánh sáng c a các baseộ ấ ụ ủ
Công thức xác định hàm
Công thức xác định hàm
lượng DNA trong dung dịch
lượng DNA trong dung dịch

DNA mạch đôi
Hàm lượng ADN (µg/ml)= 50 x OD
260nm
x n
Trong đó :
OD
260nm :

độ hấp thụ của dung dịch DNA
ở 260 nm
50: hệ số chuyển đổi của dung dịch có
nồng độ DNA sợi đôi
n: hệ số pha loãng

DNA mạch đơn hay ARN

Hàm lượng DNA (µg/ml)= 40 x OD
260nm
x n
Trong đó :
40: hệ số chuyển đổi của dung dịch có
nồng độ DNA sợi đơn.
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ
Các yếu tố ảnh hưởng đến độ
hấp thụ quang phổ
hấp thụ quang phổ
PH
Nhiệt
độ
Nồng
độ ion
Tạp
chất
protein

Để đánh giá độ tinh sạch của dung
dịch DNA, người ta còn đo dung dịch
ở bước sóng 280nm là mức hấp thụ

cực đại của protein, nhưng các
protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước
sóng 260nm như các nucleic acid do
đó làm sai lệch giá trị thật của nồng
độ acid nucleic.
- Nếu tỉ lệ OD
260nm
/OD
280nm
= 1,8 – 2 thì có
thể xem dịch chiết DNA là tinh sạch.
-
Nếu tỉ lệ OD
260nm
/OD
280nm
> 2 thì dung
dịch chiết RNA là tinh sạch, dung
dịch DNA bị biến tính hoặc phân
hủy.
-
Nếu tỉ lệ OD
260nm
/OD
280nm
< 1,8 thì dung
dịch DNA,ARN có lẫn tạp chất.

Ưu điểm: Cho kết quả nhanh, độ
chính xác tương đối cao

Nhược điểm: Chỉ kiểm tra được hàm
lượng DNA trong mẫu tinh khiết.