Nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ quả thế nấm cordyceps militaris

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIÉT POLYSACCHARIDE TÙ QUẢ
THẾ NẤM CORDYCEPS MILỈTARIS

Nguôi hướng dẫn

: ThS. vũ DUY NHÀN

Sinh viên thục hiện : HỒNG THỊ NHÀN
Lóp

: 13.01 - K20

Hà Nội - 2017


VIỆN DẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CỐNG NGHỆ SINH HỌC
======£03======

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CÚU TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE TÙ QUẢ

THÊ NÁM CORDYCEPS MỈLITARỈS

Người hướng dẫn

: ThS. VŨ DUY NHÀN

Sinh viên thực hiện

: HỒNG THỊ NHÀN

Lóp

: 13.01- K20

Hà Nội - 2017


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

LỊI CẢM ON
Lời đầu tiên tơi xin bày tị lịng kính trọng và biết cm sâu sac tới Th.s Vũ

Duy Nhàn, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tỏi trong quá
trình nghiên cứu và thực tập đe thực hiện đề tài “ “Nghiên cứu tách chiết

polysaccharide từ quá thế nấm Codyceps militarìs”

Tơi xin cám ơn ban lãnh đạo Viện Hóa học-Vật liệu/Viện Khoa học và
Cơng nghệ qn sự cùng các anh chị Phịng Hóa sinh, đã tạo mọi điểu kiện
thuận lợi cho tơi trong suốt q trình thực tập và làm đê tài tại đây.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu. Phòng Đào tạo Viện Đại học
Mờ Hà Nội, các thây cô đã tạo mọi điêu kiện trong suốt quá trình học tập tại

trường và thực hiên luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội
Hoàng Thị Nhàn

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

MỤC LỤC

Danh mục các chữ cái viết lắt
Danh mục hình
Danh mục báng
MỚ ĐẦU............................................................................................................... 1

PHÀN 1: TÓNG QUAN VỀ TÀI LIỆU............................................................. 4
1.1.

Giới thiệu về nấm Codyceps militaris.................................................... 4

1.1.1.

Đặc điếm của nấm Codyceps militaris.................................................. 4

1.1.2.

Thành phần hóa học trong Codyceps militaris..................................... 6

1.1.2.1

. Adenosine............................................................................................. 6

1.1.2.2

Cordycepin........................................................................................... 7

1.1.2.3

. Sterols.................................................................................................. 8

1.1.2.4

Nucleotides............................................................................................8

1.1.2.5

Protein và các amino acid.................................................................... 8
Acid béo..qqw.việa.y.ịện.Ị^ị.j^.MỞHàNội...................... 9

1.2.6

1.1.2.7.

Polysaccharide..................................................................................... 9

1.1.2.8.

Acid cordyceptic.................................................................................10

1.1,2.9.

1.1.3

Ergosterol........................................................................................... 11

Các ứng dụng từ quă thế nấmCodyceps militaris................................ 11

ỉ. 1.3.1 Tăng cường khả nâng miễndịch........................................................... 11
1.1.3.2

. Điểu trị bệnh ung thư...................................................................... 11

1.1.3.3

Giải độc thận....................................................................................... 12

ì .1.3.4. Điêu trị bệnh phôi.................................................................................. 12

1.1.3.5

. Điều trị bệnh tim mạch................................................................... 12

1.1.3.6

. Tăng sức bền.....................................................................................13

1.1.3.7
1.2.

1.2.1.

Làm giảm LDL-Cholesterol trong máu........................................... 13

Giới thiệu ve Polysaccharide từ quá thế nấm Cordyceps militaris.... 13
Đặc diêm Polysaccharide từ quá thề nấm Cordyceps militaris........ 13

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

1.2.2.

Viện Đại học Mở Hà Nội

Hiện trạng tách chiết và tinh sạch Polysaccharide từ quả thể nấm

Cordyceps militaris............................................................................................. 14
1.2.3.

1.3.

Tác dụng dược lý của polysaccharide................................................. 17

Tình hình nghiên cứu tách chiết Polysaccharide từ quà thê nấm Cordycep

nũlitarís................................................................................................................ 18
1.3.1

Tinh hình nghiên cứu Polysaccharide trên thế giới............................. 18

1.3.2

. Tình hình nghiên cứu ni trong Cordyceps militarís ờ Việt Nam.20

PHÀN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu......................... 23

2.1

Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu.......................................................... 23

2.1.1

Nguyên liệu............................................................................................23

2.1.2

Thiết bị và hóa chất............................................................................... 24

2.2
2.2.1

. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 24

Phương pháp tách chiết Polisaccharide từ Quà thẻ nấm Cordyceps

militarís................................................................................................................ 25
2.2.2.

Xác định hàm lượng Polysàccharidetheo phương pháp phenol-sunfuric

của Milchel.DuBois, K.A.Gilles và cs, 1956.................................................... 25
2.2.3.

Thu nhận Polysaccharide bàng phương pháp kết tùa........................ 28

2.2.4.

Phân tích nhóm chức của Polysaccharide bang 1R............................ 28

PHÂN 3: KẾT QUÁ.......................................................................................... 30

3.1.

Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết....................................... 30

3.2.

Nghiên cứu ănh hướng ti lệ mẫu/ dung môi dùng để tách chiết........... 31

3.3

Kháo sát ảnh hướng của các yếu tố đến hiệu suất tách chiết................. 32

3.3.1.
3.3.2.

Nghiên cứu ảnh hướng về thời gian chiết.......................................... 32
Nghiên cứu ành hưởng cùa nhiệt độ chiết.......................................... 34

3.4.

Xây dựng quy trình tách chiết................................................................. 35

3.5.

Kết quả đo phổ.........................................................................................40

KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ.......................................................................... 44

TÀI LIỆU THAM KHÁO................................................................................. 45

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC CHỦ CÁI VIÉT TẮT

Chừ viết tắt

Nội dung

CP

Cordyceps Polysaccharide

C.Militaris

Nhộng trùng hạ thảo

c. sinensis

Đơng trùng hạ thào

Sp.

Species- Một lồi

Spp.

Species plural- Nhiều loài

P1

Polysaccharide thu được từ dịch sau khi chiết với nước.

P2

Polysaccharide thu được từ phần bã đã bổ sung NaOH 4%

P3

Polysaccharide thu được sau khi kết tua

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cordyceps mililaris...............................................................................5
Hình 1.2: cấu trúc hóa học cùa Adenosine........................................................6
Hình 1.3: cấu trúc hóa học cùa Cordycepin..................................................... 7

Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo polysaccharide..................................................... 10
Hình 2.1: Cordyceps militaris ni cấy tại Viện Khoa học và công nghệ quân
sự - BQP............................................................................................................... 23

Hình 2.2: Mầu dùng đế tách chiết...................................................................... 23
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tách chiết và tinh sạch Cordyceps polysaccharide 25
Hình 2.4: Mầu đo đường chuẩn......................................................................... 27

Hình 2.5: Đồ thị đường chuẩn glucose( p.g/ml')............................................. 27
Hình 2.6: Máy ép thủy lực Specac....................................................................29
Hình 2.7: Máy đo phổ spectrum two............................................................... 29
Hình 3.1: Ánh hướng của phương pháp chiết tới hàm lượng polysaccharide

trong dịch chiết,.ThỊj.việa.Việ»Đạihọe"MỞHàNội...................... 30

Hình 3.2: Ảnh hường cùa phương pháp chiết tới khối lượng Polysaccharide
thu được..............................................................................................................30

Hình 3.3: Anh hưởng cùa ti lệ mầu/dung mơi trong dung dịch chiết............ 31
Hình 3.4: Anh hưởng của ti lệ mẫu/dung môi lên khối lượng polysaccharide
thu được............................................................................................................... 32
Hình 3.5: Anh hường thời gian chiết lên hàm lượng polysaccharide thu được...... 33
Hình 3.6: Ánh hường thời gian chiết đối với khối lượng polysaccharide thu

được..................................................................................................................... 33
Hình 3.7: Ánh hướng của nhiệt độ chiết tới hàm lượng polysaccharide thu

được..................................................................................................................... 34

Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới khối lượng polysaccharide thu
được..................................................................................................................... 34

Hình 3.9: Sơ đồ quy trình tách chiết Polysaccharide................................... 36

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

Hình 3.10: Phổ hồng ngoại IR cùa mẫu CM-hs-CPS2 chuẩn theo kết quả
nghiên cứu cùa Fengyao Wu [19].................................................................... 40

Hình 3.11: Kct quả đo phổ hồng ngoại IR cùa mẫu P1 .............................. 41
Hình 3.12: Ket quả đo phổ hồng ngoại IR của mầu P2.............................. 42
Hình 3.13: Ket quà đo phố hồng ngoại IR của mẫu P3.............................. 42

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại khoa học.............................................................................. 4
Bảng 1.2: Thành phan acid béo cùa Cordyceps militaris.................................. 9
Bàng 1.3: Hàm lượng cùa một số loại đường có trong Polysaccharide của quà
thế và sợi nấm Cordyceps militaris.................................................................... 14

Bàng 1.4: Hiện trạng kỹ thuật tách chiết Polysaccharides................................ 14

Bàng 1.5: Hiện trạng kỹ thuật tinh sạch Polysccharide.................................... 16
Bảng 1.6: Khả năng kháng khối u cúa một số polysaccharide được thu nhận từ
một số loại nấm....................................................................................................18
Báng 2.1: Thiết bị dùng trong thí nghiệm......................................................... 24

Báng 2.2: Xây dựng phương trình đường chuấn Glucose............................... 26

Bàng 3.2: So sánh phồ IR giữa các mầu........................................................... 42

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


MỞ ĐẦU

Chi nấm Cordyceps được biết đến cách đây hơn 2000 năm trước cơng
ngun, với hơn 350 lồi trên tồn thế giới. Trong đó có lồi Cordyceps
sinensis thường ký sinh và sinh trường lên ấu trùng của một lồi cơn trùng

thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là ấu trùng của loài Hepiaỉus

armoricanus. Sàn phẩm quả thồ nấm trên xác ấu trùng được dân gian Trung
Quốc từ xưa gọi là Đông Trùng Hạ Thảo, là loại dược liệu quý hiếm bậc nhất

đối với y học cổ truyền Trung quốc.Bên cạnh Cordyceps sinensis cịn có lồi
nấm Cordyceps militaris cũng có đặc điếm tương tự. Loài nấm Cordyceps
militaris phân bố chú yếu ở vùng núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao

trên 4000m so với mực nước biền như vùng Tây Tạng (Trung Quốc), một số
vùng thuộc Nepan và Butan[5].

Trong chi Cordyceps cịn có một lồi khác là Cordyceps militaris (L. ex
Fr.)Link cũng có thành phần và tính chất dược liệu tương tự với Cordyceps

sinensis. Loài nấm dược liệu này với nhiều tên thông dụng khác nhau tại một

Thu„vieii yi^iiiDaiJopc Mớ

-Ắ

so quoc gia như: Đông trùng hạ thảo, Trung tháo; Bãc Trùng thảo (Trung

Quốc), Tong ch’ung ha ch'o (Hàn Quốc), Tochukaso (Nhật Bán),

Yarchakunbu (Tây Tạng) Shonkor Kumar Das và cộng sự, 2010 [5],
Lồi Nấm Cordyceps niilitaris có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính
sinh

học

trong

q

thể

như

cordycepin,

ergosterol,

mannitol,

cordyepolysaccharide và nhiều thành phần khác tương đương, thậm chí cịn
cao hơn cả lồi Cordyceps sinensis[5]. Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng, sinh
khối của các loài nấm này có một số chức năng dược lý: bào vệ gan, tăng

cường chức năng thận, chống ung thư bạch cầu, chống hình thành khối u và
hạn che di căn, cải thiện khả năng tiết insuline đối với người tiêu đường, tăng

cường khả năng [5,7],

Các nghiên cứu gần đây chi ra rằng quả thể Cordyceps militaris và cơ thế
ấu trùng bị chúng kí sinh có chứa các chất có hoạt tính sinh học quan trọng, có

phố tác dụng dược lý rộng như polysaccharides, cordycepin, ergosterol! 81.

Cordyceps polysaccharides (CP) là nhóm hoạt chất giàu nhất và quan trọng
Hoàng Thị Nhàn

1

Lớp: 1301 - CNSH


nhất, được xem là công cụ và đối tượng nghiên cứu để ứng dụng và phát triển

các sãn phẩm đông trùng hạ tháo Cordyceps militaris. Đông trùng hạ thào được

xem là một loại dược liệu cở truyền quý hiếm bậc nhất của Trung Quốc so với
các loại nấm dược liệu khác. Chính vì vậy gan đây các phương pháp đế tách
chiết, tinh sạch, phân tích đánh giá cấu trúc của Cordyceps polysaccharide từ

sợi nấm và quà thể được quan tâm và nghiên cứu rộng rãi [9],
Các polysaccharide có tác dụng dược lý tăng cường miễn dịch, báo vệ tế bào

gan, giảm mỡ máu, chống đột biến, giảm đường huyết, chống oxy hóa [7], Trong
sổ các tác dụng trên, tác dụng kháng khối u của tế bào gan được đề cập nhiều hơn
cả. Các nghiên cứu dược tính của các hoạt chất trong sinh khối Cordyceps

militaris cho thay có khả năng kìm hãm sự phát triến của tế bào ung thư máu

(Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park c.et al.,2005), ung thư phổi, ung

thư vú (Ahn Y.J. et al„ 2001). Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có
hiệu quà trong chữa trị rối loạn chức năng của gan (Nan J.X et al. 2001), sự
lão hoá, các chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005). Ngồi ra cịn có

kk’11 Ýiẽii Da.i,lioc Mơ ] J.A01 "

___

tác dụng kìm hath sự oxy hóa cua lipid, lipoprotein va lipoprotein tỷ trọng

thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.s et al„ 2005) |7|.
Có rất nhiều nghiên cứu đề tìm ra phương pháp tách chiết
polysaccharides tối ưu nhất phù hợp với từng điều kiện cơ sở nghiên cứu cũng

như ứng dụng nhất định. Hiện nay, các phương pháp thường sử dụng công
nghệ chiết bằng siêu âm, chiết bằng nước nóng, chiết bằng cồn, đun hồi
lưu và đun hồi lưu trong môi trường kiềm. Công nghệ chiết bằng siêu âm đem

lại hàm lượng cao nhưng lại khó triển khai được bằng quy mơ lớn, trong khi
đó đun hồi lưu đạt được giá trị tương ứng cao nhất là 22.6% . Ớ Việt Nam đã

một số nhóm nghiên cứu đã bước đầu cơng bố một số kết quả trong việc sân
xuất chế phẩm từ các chùng nấm Cordyceps, sản phẩm thu nhận được có chất
lượng tốt nhưng khó khăn khi kiếm sốt hàm lượng polysaccharide và các

hoạt chất khác như adenosine, cordycepine trong sản phẩm và triển khai với
quy mơ cơng nghiệp. Chính vì vậy việc tìm ra một phương pháp tách chiết

phù hợp với điều kiện Việt nam hiện nay rất là quan trọng.
Hoàng Thị Nhàn

2

Lớp: 1301 - CNSH

Hiện nay trên the giới mồi năm sản lượng nấm dược liệu đạt được lên tới

hơn 10 triệu m', trong đó có bao gồm cả Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. và

Cordyceps militarís (L. ex Fr.) Link[5,7|. Trong 2 năm gần đây, tại Việt Nam
Cordyceps militaris (L. ex Fr.) Link bat đầu được nuôi quy mô công nghiệp ờ
một số địa phương như: Hà Nội, Đà Lạt, Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Sapa (Lào
Cao), Thành phố Hồ Chí Minh. Dự kiến trong những năm tới sàn lượng quà

thế Cordyceps militaris Link tại Việt nam sẽ tăng lên nhanh chóng, quy mơ
ni trong cồng nghiệp ngày càng được triển khai ớ nhiều địa phương. Như

vậy, nguồn nấm dược liệu Cordyceps militarís sẽ rất phong phú, phục vụ cho
các nghành sán xuất dược liệu và thực phấm chức năng trong nước, một phần

nguyên liệu cũng sẽ hướng tới xuất khấu.
Đe tài: “Nghiên cún tách chiết polysaccharide từ quả thế nấm

Codyceps militaris”

góp phần tạo ra kỹ thuật và công nghệ sản xuất

Cordycep polysaccharide là rất cần thiết nhàm bố sung nguồn nguyên liệu cho
ngành sán xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng.

...

Mục tiêu

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

- Xác lập được 01 quy trình tách chiết Polysaccharide từ quả thế nấm

Codyceps militaris.

-

Đánh giá được một so nhóm chức cơ bản cùa các polysaccharide tách

chiết được.
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu quy trình tách chiết polysaccharide: lựa chọn phương pháp
1

tách chiết phù hợp, tý lệ chất chiết: dung môi, nhiệt độ, pH, dung môi

kết tủa, thời gian chiết, tần suất chiết
1.1
1.2

Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết: đun hồi lưu, siêu âm

Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết: cờ hạt chất
chiết, tỷ lệ chất chiết/dung môi, hồn hợp dung môi. nhiệt độ, thời gian

Bước đẩu xác định một số nhóm chức cơ bán trên các mẫu
2

Polysaccharide phân lập được

Hoàng Thị Nhàn

3

Lớp: 1301 - CNSH


PHÀN 1: TĨNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. Giói thiệu về nấm Codyceps miỉitaris

1.1.1. Đặc điếm của nấm Codyceps militaris

Cordyceps militaris là một lồi nấm ký sinh trên cơn trùng có giá trị
dược liệu quý tương tự như nấm Cordyceps sinensis. Khác với nấm

Cordyceps sinensis với sân lượng rất ít và chì mọc trong tự nhiên, lồi nấm
Cordyceps militaris có thế được nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo. Vào cuối

mùa thu thì các chất trên da cúa ấu trùng Hepialus armoricanus tương tác với
các bào tứ nấm tạo ra các sợi nấm, các sợi nấm đã đâm sâu vào ấu trùng
Hepialus armoricanus đê sinh trưởng và phát triển. Đen đầu mùa hè năm sau,
do tác động cùa các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng thích hợp, nấm phát
sinh mạnh mẽ và gây chết sâu, sau đó chúng hình thành chồi, phát triển chui

ra khói mặt đất nhưng gốc vẫn dính vào đầu sâu. Đơng trùng hạ thào chú yếu
tìm thấy vào mùa hè ở các vùng núi cao trên 4000m như Vân Nam, Cam Túc,

Thanh Hải, Tứ Xụỵên... [8] Viện Đại học Mở Hà Nội

Báng ỉ.ỉ: Phân loại khoa học

Giới

Nấm

Ngành

Ascomycota

Phân ngành

Ascomycotina

Lớp

Asccomycetes/Pyrenomycetes

Bộ

Hypocreales

Hoàng Thị Nhàn

Chi

Cordyceps

Loài

Cordyceps militaris

4

Lớp: 1301 - CNSH


Hình 1.1: Cordyceps militaris
Theo Sung et al, trên thế giới có hơn 350 lồi Codyceps khác nhau, tính

riêng ớ Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 120 lồi Đơng trùng hạ thảo. Tuy
nhiên cho đến nay người ta mới chì nghiên cứu được 2 lồi nấm Codyceps

sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với con người. Loài

nấm Cordyceps militaris phân bố ở vùng núi thấp hơn có độ cao từ 20003000m so với mực nước biên, có hàm lượng các hoạt chất có tính sinh học

trong q thế như Cordycepin, mannitol, cordypolysaccharide, superoxide

dismutase và nhiều thành phần khác tương đương, thậm chí cịn cao hơn của
lồi Cordyceps sznensis[5]. Nhờ các hợp chất hóa học này giá trị dược liệu

chính của lồi nấm Cordyceps militaris được các nhà khoa học thống kê như

sau: kìm hãm sự phát triền của tế bào ung thư máu (Kim et al„ 2006, Lee H.et
al., 2006. Park c.et al., 2005), ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J et al., 2001).
Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quà trong chữa trị rối

loạn chức năng cúa gan (Nan J.X et al. 2001), sự lão hóa. Ngồi ra cịn có tác
dụng kìm hãm sự oxy hóa của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỳ trọng thấp

(Klaunig J.E và Kamendulis L>M., 2004, Balaban R.s et al„ 2005) [7].
Hiện nay trên thế giới mồi nãm sản lượng nấm đạt được lên tới hơn 10
triệu m3, trong đó Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. và Cordyceps militaris

(L. ex Fr) Link..[5,7]. Trong 2 năm gần đây, tại Việt Nam Cordyceps militaris
(L. ex Fr) Link bát đầu được nuôi quy mô công nghiệp ở một số địa phương

như: Hà Nội, Tam Đảo, Thành phố Hồ Chí Minh. Hàm lượng hoạt chất


adenosine trong sản phẩm đạt bình quân là 0,33-l,45mg/g và Cordycepin là 3-

9mg/g. Trong những năm vừa qua, Viện Hóa học - Vật liệu, Viện Khoa học
và Công nghệ Quân Sự/BQP cùng một số đơn vị trong cà nước như Viện Bão
vệ thực vật., đã nghiên cứu thành công công nghệ nhân giống, nuối trồng quy
mô công nghiệp đối với chủng Cordyceps militaris (L. ex Fr) Link và đã triền

khai chuyển giao cho nhiều cơ sở ớ Hà Nội, Đà Lạt, Nha Trang, Thành phố

Hồ Chí Minh.
1.1.2. Thành phần hóa học trong Codyceps militaris
Cordyceps militaris có chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quan

trọng nhất là adenosine, codycepin, polysaccharide có tác dụng rất tốt trong

điều trị bệnh ung thư và các bệnh do virus. Bên cạnh đó đơng trùng hạ thảo
còn chứa khoảng 28 acid béo bão hòa và khơng bão hịa, các loại vitamin như
Bl. B2, BI2, E, K và các chất vô cơ như K, Na, Mg, Fe, Cu, Ze, Mn,

Se...Selen (Se) là một chất có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, giúp ngăn
ngừa ung thư... 7|lu-

viện Viện Đại học Mở Hà Nội

1.1.2.1.Adenosine
Chat Adenosine có vai trị quan trọng trong q trình chuyển hóa năng
lượng của cơ thế. Chat này giúp cải thiện tuần hoán ngoại biên và tim mạch,

cải thiện năng lực cho cơ bắp, giảm sinh trưởng của các tế bào thối hóa, tăng
lượng oxy trong máu...Vì vậy việc bố sung hàm lượng Adenosin cao cho cơ

thể là vô cùng cần thiết, giúp cho con người luôn dồi dào năng lượng đề lao
động hiệu quả.

OH

OH

Hình 1.2: cấu trúc hóa học của Adenosine


1.1.2.2 Corđycepin
Cordycepin có cấu trúc 3’-deoxyadenosin là một purin alkaloid có dạng

cúa nucleosid adenosin bị mất một oxy ở vị trí 3’ phần đường ribose.

Cordycepin được phân lập lan đầu vào năm 1950 từ Cordyceps militaris.
Bang phân tích phố NMR (nuclear magnetic resonance) và 1R (infrared),

cordycepin được xem như là một hợp chất có hoạt tính sinh học được ly trích
từ q thế và sợi nấm. Cordycepin có cơng thức C10H13N5O3 và có phân tử

lượng 251, điểm nóng cháy tại 230-231 °C. độ hấp thu cực đại tại 259 nm. Có
thể hồ tan trong dung dịch đệm muối, methanol hay ethanol, nhưng khơng

hồ tan trong benzen, ether hay chloroform, do vậy nhiều nghiên cứu đã sử
dụng dung dịch muối khử trùng và đệm phosphat làm dung mơi.

Hình 1.3: cấu trúc hóa học cửa Cordycepin
Vì cordycepin có cấu trúc tương tự adenosin nên RNA polymerase
không thế phân biệt. Khi tham gia tơng hợp nên phân từ RNA, cordyccpin
ngăn chận q trình kéo dài thêm các RNA và tạo ra các phân tử RNA kết

thúc sớm. Do đó, cordycepin được xem như chất kháng ung thư hiệu quả.
Năm 2003, Sun và cs đã chứng minh hàm lượng cordycepin với hoạt tính

kháng

khối

u

ớ Cordyceps

kyushuensis cao

hơn Cordyceps

sinensis và Cordyceps militaris, ờ Cordyceps nuôi cấy cao hơn tự nhiên, và

trong sợi nấm cao hơn ấu trùng chù. Tác già cũng khang định ràng đây là hợp
chất có tiềm năng dược học cao. Năm 2007, Noriko Yoshikawa và cs chứng

minh cordycepin có hoạt tính kháng ung thư hiệu quá thông qua việc ức chế


q trình methyl hóa acid nucleic và polyadenin hóa. Đồng dạng cùa

cordycepin là 2’,5’- oligoadenin có tác dụng kháng virus thông qua việc ức
che reverse transcriptase. Tác già cũng chứng minh rang tiền chất của

cordycepin là adenosin cũng có hoạt tính kháng ung thư.
1.1.2.3 . Sterols

Một sổ hợp chat loại sterol đã được tìm thấy trong Cordyceps đơng
trùng hạ thảo . Một số trong những chất này là ergosterol, Delta - 3

ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol và campasterol. v.v...
Trong đó, ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiềm chất thiết yếu của

vitamin D2, có giá trị rất quan trọng. Ergosterol trong c. sinensis có thể được
xác định bàng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High

Performace Liquid Chromatography) do Li và cộng sự thực hiện năm 1991
[10,14], được cho là chất ophiocordin, ở Cordyceps pseudomilitaris là chất
bioxanthracenes và tập hợp bốn exopolysaccharidc với các trọng lượng phân

tử thay đổi từ 50 kDa tới 2260 kDa tìm tháy ờ c. Militarist].
1.1.2.4 Nucleotides

Nucleotides] gồm có adenosine, uridine và guanosine) là các thành phần

khá đa dạng trong nấm Cordyceps. Nhiều nghiên cứu chi ra rang, guanosine
có hàm lượng cao nhất trong tất cà các mẫu tự nhiên, khi nuôi cấy trong điều

kiện nhân tạo hàm lượng cùa nucleotide thường cao hơn C.Militaris tự nhiên.
Nucleotides trong Cordyceps

tự nhiên bắt nguồn từ sự phân rã của

nucleotides trong suốt quá trình bảo qn, tiếp đó các nhà nghiên cứu cũng

tìm ra rằng độ ấm có thế làm tăng đáng kề hàm lượng nucleotide trong

Codyceps khi nuôi trên môi trường rắn [13].
1.1.2.5 Protein và các amino acid
Hàm lượng protein trong Cordyceps vào khoảng 29,1 - 33% bao gồm 18

acid amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin,

methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin, histidin, cystin,
cystein và tryptophan. Các acid amin có hàm lượng cao nhất là glutamat,
Hoàng Thị Nhàn

8

Lớp: 1301 - CNSH

arginin và acid aspartic và có dược tính cao nhất là arginin, glutamat,
tryptophan và tyrosin. Năm 2011, Zheng và cs đã nghiên cứu họ protein

trong Cordyceps militaris. Kct quá cho thấy bộ gcn Cordyceps militaris chứa
61 họ protease nhưng hầu hết là serin protease và metallopeptidase, 12 gen

mã hóa trypsin, 167 gen mã hóa protein kinase, 105 gen mã hóa glycosid
hydrolase. Hơn nữa, Cordyceps militaris sở hữu hầu hết các gen cần thiết cho
hoạt động biến dưỡng adenin và adenosin, ngoại trừ việc thiếu ribonucleotid
triphosphat reductase và deoxyadenosin kinase [ 14,19],

1.2.6 Acid béo

Quả thế nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo khơng no, chiếm
70% tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong

quả thể và 21,5% trong sinh khối. Lượng acid béo no chủ yếu là acid

palmitic, chiếm 24,5% trong quả thè và 33,0% trong sinh khối
Bảng 1.2: Thành phần acid béo của Cordyceps militaris

À .Thu viện Việ

Phần trăm acid béo tổng (%)

Acid béo

Quả thề

Sinh khối

24.5

21,5

Palmitoeic acid (Cl6:1)

2.3

2,1

Stearic acid (Cl8:0)

5.8

5,0

Palmitic acid (Cl6:0)

Oleic acid (Cl8:1)

6.0

17,7

Linoleic acid (Cl8:2)

61.3

33,0

Linolenic acid (Cl8:3)

-

20,6

1.1.2.7. Polysaccharide

Cordyceps chứa một lượng lớn polysaccharid, khoảng 3-8% khối lượng,

đây là một trong những hợp chất sinh học chính. Từ năm 1977, nhiều nghiên

cứu khoa học tại Trung Quốc và Nhật Bản đã chứng minh được những ích lợi
từ polysaccharid trong việc kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng viêm cũng
như tác động điều hòa miễn dịch. Các hợp chất polysaccharid ờ Cordyceps là

Hoàng Thị Nhàn

9

Lớp: 1301 - CNSH


một galactomannan nhiều nhánh. Các họp chất này bao gồm D-mannose và

D-galactose với tỷ lệ 3:5. thường chứa một tỳ lệ nhị protein. Nó là một cấu
trúc phân nhánh gồm các liên kết (1-6) và (1-2) liên kết các gốc a-D-

mannopyranosyl ở mạch chính, có các liên kết đa dạng giữa các

monosaccharid kế cận tạo thành các cấu trúc xoắn và vòng nhỏ. Tuy nhiên,

một mannoglucan với trọng lượng phân tử xấp xi 7700 g/mol được phân tách
gần đây chi chứa các dơn vị mannose và glactose với tỷ lệ 1:9. Các phân tích

cho thấy nó có một khung sườn a-D-glucan với các liên kết (1-4) và (1-3); và

các mạch nhánh của a-D-(l-6)-mannopyranose (Manp) được gắn vào khung

sườn qua vị trí 0-6 cúa gốc a-(l-3)-glucopyranosyl (Glcp). Nghiên cứu này
cũng cho thấy dược tính của polysaccharid là từ các đặc tính cúa nó như trọng
lượng phân tứ, ví dụ như các polyglucan có trọng lượng phân tử lớn hơn (10-

1000 kDa) có xu hướng tan trong nước tốt hơn và vì thế có hoạt tính kháng
khối u hiệu q hơn. Tuy nhiên, hoạt tính kháng ung thư là do sự tăng cường
miễn dịch cho cơ the hơn là hiệu ứng gây chết tế bào trực tiếp[8,17],
ch2oh

Hình 1.4: Cơng thìa: cấu tạo polysaccharide
1.1.2.8. Acid cordyceptic

Acid cordyceptic là một isomer cùa acid quinic, được nghiên cứu đầu
tiên ớ Cordyceps sinensis năm 1957. cấu trúc tinh thê cùa acid cordyceptic
được xác định là D-mannitol. Mannitol là hợp chất sinh học chính có nhiều
hoạt tính quan trọng như kháng gốc tự do, lợi tiếu, trị ho. Chất này tồn tại

trong tự nhiên chù yếu ở rề, thân và lá cây; được tìm thấy nhiều trong nam ăn,
cà rốt và rêu. Hàm lượng acid cordyceptic trong Cordyceps khoảng 7-29%.

Mannitol có cấu tạo gồm một alcohol và một đường, hoặc một polyol; tương
tự như xylitol hay sorbitol. Tuy nhiên, mannitol có xu hướng loại bị ion


hydrogen trong nước làm dung dịch trờ nên acid. Công thức hóa học cùa

mannitol là C6H|4O6, trọng lượng phân tử 182, nhiệt độ nóng chảy 166°c, tỳ

trọng 1,489 (20°C) và nhiệt độ sơi 290-295°C (467 kPa). Mannitol có nhiều

đặc tính quan trọng đã được sử dụng trong y học và thực phấm, hàm lượng
mannitol có trong quà thể nấm Cordyceps vào khoảng 29-85 mg/g, sợi nấm

có hàm lượng acid cordyceptic cao hơn so với trong quã thế [7,15].
1.1.2.9. Ergosterol

Ergosterol là tiền chất quan trọng cho vitamin D. Hàm lượng ergosterol
ở Cordyceps militaris nuôi cấy rất cao, chi đứng sau Cordyceps sinensis tự

nhiên phân lập ớ Tây Tạng. Các ergosterol và các chất đồng dạng cúa nó có
hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh thận do giảm

immunoglobin A.
1.1.3 Các úng dụng từ quả thế nấm Codyceps militaris
1.1.3 . ỉ Tăng cường khă năng miễn dịch

Một thí nghiệm kéo dài 5 năm trên 61 bệnh nhân bị bệnh lupus cho thấy,
việc dùng Cordyceps niilitaris với liều 3-4 g/ngày và artémisinine (0,6

g/ngày) đã làm giảm sự tái diễn căn bệnh tự miễn này. Trong một thí nghiệm

khác với các bệnh nhân bị ung thư giai đoạn tiến triến, người ta kết luận rằng
các bệnh nhân được điều trị bằng loại nấm này đã được cài thiện chức năng
miễn dịch và nâng cao chất lượng cuộc sống|4|.

1.1.3.2 . Điểu trị bệnh ung thư
Chất Cordycepin trong thuốc Cordyceps militaris có thê ức chề sự phân
hạch của các tế bào ung thư, trì hỗn sự lây lan của các tế bào ung thư, có khá

năng diệt một lượng kín các tế bào T, các thực bào trong cơ thể. Các

polysaccharides trong Cordyceps militaris có the góp phần thúc đẩy chuyền hóa
hạch, tăng cường khả năng tự chống ung thư cơ thế. Đong thời Cordyceps
militaris cịn có tác dụng an thần, giảm đau tương đối tốt làm giảm sự khởi đầu

cùa cơn đau ung thư. Do hiện này vần chưa có thuốc chữa trị unh thư đặc hiệu,
và hầu hết các loại thuốc này khơng chi tốn kém mà cịn có tác dụng phụ tương
Hoàng Thị Nhàn

11

Lớp: 1301 - CNSH


đối lớn, như vậy nếu so sánh, Cordyceps militaris không những khơng có tác

dụng phụ mà cịn giúp cơ thế phục hồi một cách toàn diện, tăng cường chức
năng miền dịch cùa họ. Do đó, việc sử dụng Cordyceps militaris để phịng chống

ung thư và dùng như các chat bơ trợ trị liệu là một lựa chọn tốt[7].
1.1.3.3 Giãi độc thận

Thứ nghiệm mù đôi được thực hiện trên 21 bệnh nhân cao tuối theo liệu
trình điều trị với amikacine (một kháng sinh rất độc cho thận), người ta quan

sát thấy bệnh nhân có sử dụng nấm Cordyceps militaris thì thận được bào vệ
tổt hơn, giám tác dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chiếu dùng

giả dược. Kết quả một nghiên cứu khác trên 51 bệnh nhân bị suy thận chỉ
dùng nấm Cordyceps militaris thì thấy có cải thiện chức năng thận và hệ miền

dịch. Một thử nghiệm khác cũng được thực hiện trên 69 bệnh nhân ghép thận,

kết quá là nấm Cordyceps militaris đã làm giám độc tính cửa cyclosporine

trên thận [4].

ỉ.1.3.4. Điều trị bệnh phơi
Cordyceps militaris có khả năng tăng cường hiệu năng sử dụng oxy

trong cơ thế, cùng với các chiết xuất từ nó đã được chứng minh có thế giúp hồ
trọ điều trị nhiều bệnh về đường hô hấp, bao gồm cả các bệnh nghiêm trọng

như hen suyễn, COPD (bệnh phối tắc nghẽn mãn tính), viêm phế quản, giúp

ức che cơn co khí quản,v.v.|4|.

1.1.3.5. Điều trị bệnh tim mạch
Phân tích hố học cho thấy Cordyceps militaris có adenosine, deoxy-

adenosine, nucleotide adenosine và các loại nucleotide tự do khác,v.v.

giúp giữ ồn định và điều chinh rối loạn nhịp tim. Cordyceps militaris kết hợp
với bài thuốc cùa đơng y có thế hỗ trợ chữa trị các bệnh về tim.

Ngoài ra, các digoxin, hydrochlorothiaside, dopamine và dobutamine
trong đông trùng hạ thảo giúp cài thiện chất lượng cuộc sống cùa các bệnh

nhân suy tim mãn tính, như làm tăng các điều kiện chung về thê chất, sức
khoẽ, chức năng tim[4].
Hoàng Thị Nhàn

12

Lớp: 1301 - CNSH


1.1.3.6. Tăng sức bền
Lieu 3 g Cordyceps militaris mồi ngày cho kết quả tốt trong việc gia

tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mạn tính. Một thí

nghiệm thực hiện năm 2004 tại Mỹ cho thấy những người ở độ ti 40-70 có

sức khỏe tốt nếu dược dùng trích tinh Cordyceps militaris trong 12 tuần đã có
sự gia tăng sức bền thế lực so với nhóm đối chi dùng già dược [4].
1.1.3.7 Làm giảm LDL-Cholesterol trong máu
Nấm Cordyceps militaris có khả năng giảm lượng cholesterol xấu trong

máu đồng thời nâng cao hàm lượng cholesterol tốt trong cơ thể. Đây là kết
quả của cơng trình nghiên cứu từ 273 người tại Trung Quốc bị cao lipid máu,
được biết trong quá trình nghiên cứu, mỗi người sử dụng 3g Cordyceps

militarís mỗi ngày [12.15|.
1.2.

Giói thiệu về Polysaccharide từ quả thế nấm Cordyceps militaris

1.2.1. Đặc điểm Polysaccharide từ quả thề nấm Cordyceps militarís

Polysaccharides là các phân tứ carbohydrate polymc bao gồm chuồi dài

các đơn vị monosaccharide bị ràng buộc bởi các liên kết glycosidic và thủy
phân cho các monosaccharides cấu thành hoặc oligosaccharides.

Các hợp chất polysaccharid ờ Cordyceps là một galactomannan nhiều
nhánh. Các hợp chất này bao gồm D-mannose và D-galactose với tỷ lệ 3:5,

thường chứa một tỷ lệ nhỏ protein. Nó là một cấu trúc phân nhánh gồm các
liên kết (1-6) và (1-2) liên kết các gốc a-D-mannopyranosyl ở mạch chính, có

các liên kết đa dạng giữa các monosaccharid kế cận tạo thành các cấu trúc
xoắn và vịng nhơ. Tuy nhiên, một mannoglucan với trọng lượng phân tử xấp

xi 7700 g/mol được phân tách gần đây chi chứa các đơn vị mannose và
glactose với tý lệ 1:9. Các phân tích cho thấy nó có một khung sườn a-D-

glucan với các liên kết (1-4) và (1-3); và các mạch nhánh cùa a-D-(l-6)mannopyranose (Manp) được gán vào khung sườn qua vị trí O-6 của gốc a-

(l-3)-glucopyranosyl (Glcp). Nghiên cứu này cũng cho thấy dược tính của
polysaccharid là từ các đặc tính của nó như trọng lượng phân từ. ví dụ như
Hồng Thị Nhàn

13

Lớp: 1301 - CNSH


các polyglucan có trọng lượng phân từ lớn hon (10-1000 kDa) có xu hướng

tan trong nước tốt hơn và vì thế có hoạt tính kháng khối u hiệu q hơn. Tuy
nhiên, hoạt tính kháng ung thư là do sự tăng cường miền dịch cho cơ thế hơn
là hiệu ứng gây chết tế bào trực tiếp [8,17],

Bang 1.3: Hàm lượng của một số loại đường có trong Polysaccharide của

qua thế và sợi nấm Cordyceps militaris
Một số loại đường

Hàm lưọng (mg/g khô)

Quả thể

Sợi nấm

Arabinose

11.38± 0.97

Nd

Fuctose

21.23+3.48

7.31± 1.44

Mannitol

117.66 ±2.23

112.55 ±3.08

Ribose

86.76± 8.79

Nd

Sucrose

Nd

53.07± 9.10

Treschalose

23.61± 1.02

16.89 ±0.72

Total 1 hư VI Ọ11 '260.64+-16.4U M )' 1I;ìắ9:82± 10.68

(Nd: Khơng phát hiện được)
1.2.2. Hiện trạng tách chiết và tinh sạch Polysaccharide tù' quả thế nấm
Cordyceps militaris

Có rất nhiều nghiên cứu để tìm ra phương pháp tách chiết

polysaccharides tối ưu nhất phù hợp với từng điều kiện cơ sở nghiên cứu cũng
như ứng dụng nhất định. Bảng sau là một số kết quả nghiên cứu về tách chiết
Polysaccharides từ Cordyceps militaris.

Báng 1.4: Hiện trạng kỹ thuật tách chiết Polysaccharides
Nhóm
nghiên
cứu
Che và

Phương pháp

Kết quả

Chiêt từ quà thê: Sử dụng 3 phương

Sừ dụng phương pháp

cộng sư

pháp chiết: siêu âm và nước, siêu âm

nước nóng đun hồi lưu ớ

114]

và cồn, nước nóng đun hồi lưu

80°C, chiết ba lần, thời

Hoàng Thị Nhàn

14

Lớp: 1301 - CNSH


gian 90 phút là tốt nhất.
Shi và

Chiết từ quả thế: Sử dụng nước và

Hàm lượng

cộng sư

sóng vi ba, tỷ lệ chất chiết: nước:

Polysaccharides đạt

[15]

2:4, thời gian sử dụng sóng vi ba 20

10.7%

Jeong Seok

Chiết dịch ni cấy bang nước nóng

Hàm lượng

Kwon và

600C, thời gian 24h, 3 lần, kết tủa

Polysscharide trong dịch

cộng sự

bằng Ethanol.lọc bằng giấy lọc

nuôi cấy đạt 2.53 -6.74

[16]

Whatman 0.45 mm

g/1-

Hui Yan và

Chiết quá thê; sứ dụng sóng siều âm

Thu được hai thành phần

phút

cộng sự

140W và nước, tỳ lệ chất chiết/nước:

polysacharidc là CPS-1

[17]

1/45, thời gian chiết 80 phút, sử dụng

và CPS2, hiệt suất chiết

phương pháp enzym và Sevag để loại

đạt 0.82%

Protein trong Polysaccharide thô

Chen Xiao

Chiết quà thê:'.Sự dung.3 phương

Li và cộng

pháp chiết: cô cạn, đun hồi lưu, đun

sự [18]

hồi lưu trong môi trường kiềm. Các

với 3 phương pháp cô

điều kiện được lựa chọn là: (1)

cạn, đun hồi lưu, dun hồi

Phương pháp cơ cạn:tỷ lệ chất

lưu trong mơi trường

I là Nệ®àm lượng

polysaccharide đạt đối

chiết/nước: 1/40, thời gian 3 giờ,

kiềm đạt ương tứng là;

chiết 3 lần. (2) phương pháp chiết

20.25%; 22.6% và

đun hồi lưu: tỳ lệ chất chiết/nước:

1.49%.

1/20, thời gian 1 giờ, chiết 2 lần. (3)

Phương pháp chiết hồi lưu trong môi
trường kiềm:

nồng độ NaOH trong dung dịch chiết
là 0.7 mol/1, tý lệ chất chiết 1/8, thời

gian 0.5 giờ, chiết 3 lần

Hoàng Thị Nhàn

15

Lớp: 1301 - CNSH


Fengyao

Chiết quả thê bang nước nóng 70"C,

Thu được thành phần

Wu và

thời gian 10 giờ, 2 lần, tỷ lệ chất

CM-hs-CPS2.

cộng sự

chiết/nước: 1/20. Kết tủa

[19]

Polysaccharide bang ethanol

Tinh sạch:
Hiện trạng về kỹ thuật tinh sạch Polysaccharide được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 1.5: Hiện trạng kỹ thuật tinh sạch Polysccharide

Nhóm
Phuong pháp

Kết quả

Liu và cộng

Sử dụng côn đê kêt tủa và loại bô

- Phương pháp hỗn hợp

sự [20]

protein bằng các hỗn họp dung môi

dung môi chloroform:

chloroform: butanol tỷ lệ 1:2.4

butanol loại 97% hàm

(v/v), thời gian phán ứng 5 phút

lượng protein.

hoặc kết hợp phương pháp Sevag

Kết hợp phương pháp

nghiên cứu

với triflouromethy], trịẹhlọrọẹthane Hà NỘSevag với

triflouromethyl,

trichloroethane thì loại
được 96.2% protein.
Fengyao Wu

- Sử dụng cột sắc ký trao đổi inon

- Thu được hợp phan

và cộng sự

DEAE-Cellulos 52 để tinh sạch và

CM-Hs-CPS2 chứa ác

[191

lọc bằng cột lọc gel Sephadex G-

thành phần manose,

100

glucosse, galactose với

tỷ lệ 1.35:8.34:1.00 và
được liên kết bời nhóm

a- glycosidic
Hui Yan và

- Sử dụng phương pháp Sevag và

- Kết quả thu được hai

cộng sự [17]

Enzym đế loại protein với tý lệ 1/40

thành phần CPS-1 và

enzym trypsin 3%, tại pH 8, nhiệt

CPS2 ở dạng rắn.

Hoàng Thị Nhàn

16

Lớp: 1301 - CNSH