nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên




























VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN VIỆT NAM
ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN

*****


NGUYỄN LƢƠNG THOẠI




NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT TỔ HỢP ENZYME PHÂN GIẢI
PROTEIN TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN




LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Mã ngành: 60. 42. 30





HÀ NỘI – 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN VIỆT NAM
ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN
*****


NGUYỄN LƢƠNG THOẠI

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT TỔ HỢP ENZYME PHÂN GIẢI
PROTEIN TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Mã ngành: 60. 42. 30



Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Hoài Châu



HÀ NỘI – 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoài Châu –
Viện trƣởng Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã hƣớng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình
học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ thân Môi
trƣờng – Viện Công nghệ Môi trƣờng đặc biệt là PGS.TSKH. Ngô Quốc
Bƣu đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Duy Nhứt – Trung tâm ứng

dụng Khoa học & Công nghệ Nha Trang đã hƣớng dẫn tận tình và truyền đạt
những kiến thức quý báu cho tôi.
Tôi cũng xin bày tỏ sự cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở Đào
tạo sau Đại học - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Khoa học và
Công nghệ Việt nam.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tác giả luận văn


Nguyễn Lương Thoại




Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố
trong bất kỳ công trình nào khác tại Việt Nam.
Tác giả luận văn


Nguyễn Lương Thoại

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APS Ammonium persulphate
Tris.Base Tris (hydroxy methyl) amiomethane (HOCH
3
)CNH
2

TEMED Trichloroacetic acid
kb kilo base
kDa kilo Dalton
PCR Polymerase Chain Reaction
U Unit
ADN Acid Deoxyribonucleic
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
TCA Trichloroacetic acid
OD Optical density
SDS-PAGE Sodium dodecylSulphate polyacrylamide gel Electrophorei
SDS Sodium dodecyl sulphate
DEP Diethoxylphosphoryl
DFP Di-isopropylfluorophosphate
3,4-DCI 3,4-Dichloroisocoumarin

PMSF Phenylmethysulfonyl fluoride
TLCK Tosyl-L-lysine Chloromethyl Ketone
PCMB P-Chloromercuribenzoate
v/p vòng/phút
v/v Volume/volume
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính protease từ mẫu Nhà máy chế biến hải sản
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính dịch chiết chạy qua màng lọc 50kDa
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính với casein sau khi ủ với casein
Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính protease với mẫu mua ghẹ
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của enzyme
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 30%; 40%
Bảng 3.7. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 50%
Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 60%;70% và 80%
Bảng 3.9. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 90%
Bảng 3.10. Hoạt tính và hiệu suất thu hồi ở các tỉ tệ cồn khác nhau
Bảng 3.11. Kết quả thử hoạt tính ở các tốc độ li tâm khác nhau.
Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt qua lọc màng (10kDa;50kDa).
Bảng 3.13. Kết quả thử hoạt qua lọc màng (50kDa;100kDa).
Bảng 3.14. Kết quả thử hoạt tính theo các phân đoạn (NH
4
)
2
SO
4

Bảng 3.15. So sánh giữa các phương pháp kết tủa thu hồi enzyme
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme

Bảng 3.17. Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme
Bảng 3.18. Hàm lượng protease thu được so sánh với mẫu của Nga
Bảng 3.19. Kết quả mẫu đem chạy điện di
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide
Hình 1.2. Mô hình enzyme protease thủy phân
Hình 1.3. Cấu trúc không gian enzyme protease
Hình 1.4. Sơ đồ phân loạ i protease
Hình 1.5. Sơ đồ cơ chế xúc tác trung tâm hoạt động của enzyme
Hình 1.6. Cơ chế xúc tác của cysteine protease.
Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của Aspartic protease
Hình 1.8. Mô hình phân tử enzyme protease
Hình 1.9. Nội tạng cua biển
Hình 1.10. Sự phân bố của cua vua đỏ (vùng màu vàng)
Hình 1.11. Loài cua vua (king crab)Paralithodes camtschaticus
Hình 2. Đường chuẩn Tyrosine
Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cồn tới enzyme protease.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tốc độ máy lọc màng tới enzyme protease
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
lên hoạt tính của protease
Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ pH lên hoạt tính của enzyme protease
Hình 3.5. So sánh giữa các phương pháp kết tủa thu hồi enzyme
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme

Hình 3.7. Điện di đồ sau khi tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
và cồn 70%





Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PROTEASE 3
1.1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới. 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nƣớc…………………… 4
1.2. ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN - PROTEASE…………………….5
1.3. PHÂN LOẠI 7
1.3.1. Exopeptidase…………………………………………………………8
1.3.2. Endopeptidase 9
1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI HOẠT TÍNH PROTEASE 10
1.5. CƠ CHẾ XÚC TÁC PHẢN ỨNG 11
1.5.1. Serine protease…………………………………………………………… 12
1.5.2. Metallo protease……………………………………………………………12
1.5.3. Cysteine protease………………………………………………… ………13
1.5.4. Aspartic protease………………………………………………… …… 14

1.6. CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE 15
1.7. NGUỒN THU NHẬN ENZYME PROTEASE 18
1.7.1. Enzyme protease từ động vật 18
1.7.2. Enzyme protease từ thực vật 18
1.7.3. Enzyme protease từ vi sinh vật 19
1.7.3.1. Vi khuẩn 19
1.7.3.2. Nấm …………………………………………………………………………20
1.7.3.3. Xạ khuẩn……………………………………………………………………21
1.7.3.4. Virus…………………………………………………………………………21
1.8. TỔ HỢP ENZYME HEPATOPANCREAS (HP) TỪ GAN TỤY CỦA
CUA BIỂN 22
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

1.8.1. Sản phẩm thu đƣợc từ gan tụy cua biển……… …….……………….22
1.8.2. Ứng dụng trong y học……………………………….……………… 24
1.8.3. Giới thiệu về loài cua nghiên cứu tại Nga………………………… 25
1.9. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE 26
1.9.1. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm………………………………27
1.9.2. Trong chế biến thuỷ sản 27
1.9.3. Trong công nghiệp chế biến sữa 28
1.9.4.Trong công nghiệp sản xuất bia 28
1.9.5. Trong công nghiệp da 28
1.9.6. Trong công nghiệp dệt 29
1.9.7. Trong công nghiệp y – dƣợc 29
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 31
2.1.1. Nguyên liệu 31
2.1.2. Hoá chất 31
2.1.3. Thiết bị 32
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.2.1. Xác định hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas theo phƣơng pháp
Anson cải tiến, 1972 33
2.2.2. Xác định hàm lƣợng tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phƣơng pháp
Lowry cải tiến 35
2.2.3. Phƣơng pháp định tính hoạt tính của tổ hợp enzyme hepatopancreas
bằng cơ chất casein 36
2.2.4. Phƣơng pháp tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas 37
2.2.5. Phƣơng pháp tinh sạch 37
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

2.2.5.1. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng dung dịch
(NH
4
)
2
SO
4
………………………………………………………………………… 38
2.2.5.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phương pháp lọc
màng…………………………………………………………………………….… 39
2.2.5.3. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cồn theo các tỷ lệ khác
nhau…………………………………………………………………………………40
2.2.6. Khảo sát ảnh hƣởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của tổ hợp
enzyme hepatopancreas…………………………………………………….40
2.2.7. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm đến khả năng tinh sạch tổ hợp
enzyme hepatopancreas……………………………………………………41
2.2.8. Khảo sát ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính tổ hợp enzyme
hepatopancreas…………………………………………………………….41
2.2.9. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính tổ hợp enzyme
hepatopancreas ……………………………………………………………42

2.2.10. Điện di protein trên gel polyacrylamide xác định khối lƣợng tổ hợp
enzyme…………………………………………………………………… 42
2.2.11. Phƣơng pháp sấy đông khô dịch chiết enzyme ………………… 44
3.1. Khảo sát mẫu nội tạng cua biển thu nhận từ 2 nguồn thu nhận khác nhau
45
3.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………….48
3.2.1. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cồn theo các tỷ lệ khác
nhau 48
3.2.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phương pháp lọc màng
52
3.2.3. Tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas từ gan tụy cua biển dùng
(NH
4
)
2
SO
4
54
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

3.2.4. Thu nhận tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cách điều chỉnh pH dịch
ly tâm 545
3.3. So sánh giữa các phƣơng pháp tủa pH, cồn và ammonium sulfate 57
3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của tổ hợp enzyme
hepatopancreas 58
3.5. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm đến khả năng tinh sạch tổ hợp
enzyme hepatopancreas 59
3.6. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH tới hoạt tính của enzyme 60
3.7. Hàm lƣợng protein 62
3.8. Chạy điện di xác định khối lƣợng phân tử tổ hợp enzyme 62

3.9. Quy trình nghiên cứu 64
KẾT LUẬN 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 68
PHỤ LỤC 73
1
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hàng năm, lƣợng enzyme đƣợc sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên
300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, trong đó khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân đƣợc sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Protease đƣợc coi là một trong ba nhóm enzyme công nghiệp lớn nhất (60%)
và là nhóm enzyme thủy phân protein đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều
lĩnh vực: sản xuất chất tẩy rửa, chế biến thực phẩm, thuộc da, mỹ phẩm, y học
và nông nghiệp [35].
Protease có thể đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau từ động vật,
thực vật đến các vi sinh vật. Hiện nay từ gan tụy cua ngƣời ta có thể thu nhận
chế phẩm enzyme có độ sạch cao chứa chất xúc tác hydrolase, cụ thể là tổ hợp
enzyme hepatopancreas (HP) phân giải protein có khả năng ứng dụng trong
điều trị vết thƣơng tốt nhất [20].
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano chế tạo vật liệu phủ vết thƣơng
trên cơ sở xenlulo đƣợc cấy enzyme phân huỷ protein là một hƣớng nghiên
cứu tƣơng đối mới trên thế giới, là thành quả nghiên cứu khoa học hàng chục
năm qua của đội ngũ các nhà khoa học Nga. Vấn đề này tại nƣớc ta hiện chƣa
có cơ sở nghiên cứu khoa học nào triển khai nghiên cứu.
Tại Việt Nam có nhiều cơ sở chế biến sản phẩm hải sản xuất khẩu từ
cua biển, trong đó phần nội tạng của cua đƣợc loại bỏ dƣới dạng chất thải. Từ
lâu ngƣời ta biết rằng gan tụy cua biển chứa một lƣợng đáng kể các loại
enzyme tiêu hóa có khả năng phân hủy protein với phổ rộng và hoạt tính cao
trong điều trị tổn thƣơng đối với các vết thƣơng mủ - hoại tử hoặc các vết loét

khó lành. Tổ hợp enzyme hepatopancreas tách từ cua biển trong thành phần
của mình, ngoài colagenase còn chứa các protease serin, nhờ vậy mà chúng có
khả năng thủy phân nhiều đối tƣợng cơ chất khác nhau và thể hiện tính năng
2
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

điều trị đặc thù. Vì vậy, nhóm nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đề xuất đề tài:
“Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển
Việt Nam” nhằm bƣớc đầu thu nhận tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải
protein từ gan tụy cua biển ở Việt Nam, tiến tới chế tạo băng gạc điều trị vết
thƣơng mang lại sản phẩm có giá trị công nghệ cao ứng dụng trong y học và
cuộc sống.
Trong khuôn khổ của đề tài luận văn này, chúng tôi tiến hành:
- Khảo sát quá trình tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải
protein từ gan tụy cua biển Việt Nam.
- Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết và đánh giá
hoạt tính tổ hợp enzyme thu đƣợc.










3
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PROTEASE
1.1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới.
Trên thế giới, protease động vật đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả. Ngay từ
thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp Recmur đã phát hiện ra một loại
protease ở hệ tiêu hóa của loài chim ăn thịt. Năm 1857, Corvisart tách đƣợc
tripsin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận đƣợc ở dạng chế phẩm. Năm
1861, Brucke cũng đã tách đƣợc pepsin từ dịch dạ dày chó ở dạng tƣơng đối
tinh khiết. Năm 1869-1872, Schmidt đã có những phát hiện đầu tiên về
enzyme tham gia quá trình đông máu là fibrin mà ngày nay gọi là thrombin.
Ông cũng đã tách chiết enzyme này và kết tủa bằng ethanol, chế phẩm nhận
đƣợc có tác dụng làm cho fibrinogen đông lại nhanh hơn [40].
Các protease thực vật đƣợc phát hiện muộn hơn. Năm 1879, Wurtz
đƣợc xem là ngƣời đầu tiên tách đƣợc protease thực vật. Ông đã tách chiết
đƣợc papain từ nhựa quả đu đủ Carica papaya [2]. Đến nay ngƣời ta đã
nghiên cứu đƣợc khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều protease nhƣ:
papain, tripsin, kimotripsin, subtilizin
Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt protease động vật,
thực vật và vi sinh vật đƣợc tách chiết nghiên cứu. Những nƣớc có công nghệ
sản xuất và ứng dụng từ enzyme protease tiên tiến trên thế giới nhƣ Đan
Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức và Áo. Hằng
năm, nhịp độ sản xuất protease ở quy mô công nghiệp tại các nƣớc phát triển
tăng vào khoảng 5% - 10%. Ngày nay, ngƣời ta có thể sản xuất các enzyme cố
định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều
4
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

lần. Vì vậy mà việc ứng dụng enzyme protease vào cuộc sống ngày càng gia
tăng.
Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt Moskva (NCVLD) đã chế tạo thành công

băng gạc phủ vết thƣơng trên cơ sở xenlulo vi mô đƣợc cấy enzyme phân giải
protein có khả năng làm sạch vết thƣơng mà không cần đến sự trợ giúp của
phẫu thuật, nghĩa là có khả năng làm tan các protein hoại tử để chúng thấm
vào lớp vải phủ. Trong số các loại vật liệu phủ vết thƣơng đã nghiên cứu chế
tạo và đƣa vào sử dụng trong điều trị nhƣ các loại băng Proteox, Dalcek-
tripsin trên ơ sở vật liệu xenlulo tự nhiên có chứa các loại enzyme phân giải
protein và các chất hoạt tính sinh học khác nhau, loại băng Multiferm chứa tổ
hợp enzyme đƣợc lấy ra từ gan tụy của một số động vật biển cho hiệu quả
điều trị cao nhất. Sử dụng chế phẩm Multiferm cho phép làm sạch bề mặt vết
thƣơng khỏi các mô hoại tử cũng nhƣ quá trình lên da non diễn ra nhanh 2,3
lần so với phƣơng pháp điều trị truyền thống. Nhiều kết quả thực nghiệm chỉ
ra rằng băng Multiferm chứa tổ hợp enzyme hepatopancreat phân giải protein
cho phép làm sạch vết loét dinh dƣỡng khỏi khối mủ - hoại tử hiệu quả hơn
2,3 lần so cới băng chứa tripsin và mexidon [21]
1.1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nƣớc.
Năm 1960, protease mới bắt đầu đƣợc nghiên cứu chính thức ở Việt
Nam. Ở động vật, có những nghiên cứu ban đầu về protease ở các loài cá
dùng trong sản xuất nƣớc mắm [7]. Ở thực vật, có những nghiên cứu về
bromelain ở dứa [3], papain ở đu đủ [2] và các protease ở bí đao [4]. Vai trò
của enzyme protease đƣợc ứng dụng rất rộng rãi vào trong đời sống của con
ngƣời. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của
các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các
lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hƣớng tách, tinh sạch
5
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối
liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng
enzyme trong thực tế.
Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã đƣợc tiến hành bởi nhiều tác giả

nhƣ sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin sử
dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Hiện nay, protease đã có những ứng dụng
sản xuất thử nghiệm nhƣ sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, sản
xuất bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rƣợu bằng enzyme cố
định trên cột. Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P450
trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc Trong lĩnh vực y dƣợc,
việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích
kiến tạo nên một số thuốc dùng điều trị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số
chế phẩm thuốc chống suy dinh dƣỡng ở trẻ em, đồng thời đã tiến hành sản
xuất đại trà. Đây là một đóng góp rất thiết thực và kịp thời trong việc phòng
chống suy dinh dƣỡng ở nƣớc ta [40].
Những nghiên cứu gần đây tại Việt Nam cho thấy, protease có thể đƣợc
thu nhận từ rất nhiều nguồn khác nhau. Tại các phòng thí nghiệm trọng điểm
của các Viện nghiên cứu, các trung tâm nghiên cứu hoặc từ một số trƣờng đại
học lớn trên cả nƣớc đã tiến hành nghiên cứu tách chiết và tìm các điều kiện
ảnh hƣởng tới hoạt tính của enzyme này. Chúng ta có thể thu nhận enzyme
protease từ ruột cá basa [5], từ vi sinh vật, từ môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Baccillus hay từ môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn P. aeruginosa CB07 [6]…
1.2. ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN - PROTEASE
Protease hay peptidase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối
liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số
cơ chất khác tƣơng tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử
6
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide
thấp. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và
vận chuyển acid amin.

Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý nhƣ:
hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải
phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển
protein qua màng. Các protease có thể hoạt động nhƣ các yếu tố phát triển của
cả tế bào ác tính và tế bào bình thƣờng, trong sự phân chia tế bào, sinh tổng
hợp ADN… Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức
năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên đƣợc phân bố rất rộng rãi trên
nhiều đối tƣợng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ,
dứa ) và động vật (gan, tụy, dạ giày, ).
Hình 1.2. Mô hình enzyme protease thủy phân

7
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc
không gian đặc trƣng của protease. Đáng chú ý là cấu trúc không gian của
protease tách chiết từ gan tụy của loài cua vua (king crab) đƣợc ông Kuzmin.
S và cs…[30] mô phỏng theo cấu trúc không gian dƣới đây:

1.3. PHÂN LOẠI
Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) [24]. Trong hệ thống
danh pháp MEROPS trên website www.merops.ac.uk [43] đã phân loại
protease, subtilisin (EC.3.4.21.62) thuộc phân nhánh Subtilases (SB) của
nhóm serine protease (EC.3.4.21 ) với điểm đặc trƣng là sử dụng đơn phân
serine (Ser) nằm trong trung tâm xúc tác phản ứng của enzyme. Ngoài
Hình 1.3. Cấu trúc không gian enzyme phân giải protein
8
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

subtilisin, trong phân nhánh SB còn có các protease liên quan đến quá trình
xử lý tiền hormone nhƣ KEX2 protease, furin, và PC2.
Protease đƣợc phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
Hình 1.4. Sơ đồ phân loạ i protease

1.3.1. Exopeptidase
Exopeptidase phân cắt liên kết peptide ở hai đầu tự do của chuỗi
polypeptide. Dựa vào vị trí phân cắt liên kết peptide ở đầu C và đầu N ,
exopeptidase đƣợ c phân chia thà nh hai loạ i : Aminopeptidase và
Carboxypeptidase.
Protease
(E.C.3.4)
Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Aminopeptidase
Carboxypeptidase
Serine proteinase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Metallo proteinase
9
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.

Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của
chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
1.3.2. Endopeptidase
Endopeptidase phân cắt liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide cách
xa hai đầu tự do N và C. Sự có mặt của hai đầu tự do này không ảnh hƣởng
tới hoạt tính của enzyme. Theo tác giả Herley (1960), dựa vào động học của
cơ chế xúc tác, endopeptidase đƣợc chia thành bốn nhóm nhƣ sau [22]:
Serin protease (EC 3.4.21): là những protease chƣ́ a nhóm –OH của gốc
serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt
động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin
và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật nhƣ
chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi
khuẩn nhƣ subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN.
Serine protease bị kìm hãm bởi 3,4-dichloroisocoumarin (3,4-DCI), L-
3-carboxytrans 2,3-epoxypropyl-leucylamido (4-guanidine) butane (E.64), di-
isopropylfluorophosphate (DFP), phenylmethysulfonyl fluoride (PMSF) và
tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK). Một số khác bị kìm hãm bởi
thuốc thử thiol ví dụ nhƣ p-chloromercuribenzoate (PCMB). Serine protease
hoạt động ở vùng pH trung tính và kiềm với phổ pH 7-11, điểm đẳng điện
thƣờng ở pH 4-6. Serine protease có tính đặc hiệu rất rộng [23].
Cysteine protease (E.C.3.4.22): Các protease chƣ́ a nhóm –SH trong
trung tâm hoạt động. Hoạt tính của Cysteine protease phụ thuộc vào sự có mặt
10
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

của bộ đôi xúc tác cysteine-histidine (ví dụ nhƣ papain chứa bộ đôi Cys25-
His159 trong trung tâm hoạt động). Cystein protease bao gồm các protease
thực vật nhƣ papain, bromelin, một vài protein động vật và protease ký sinh
trùng. Các cystein protease thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính
đặc hiệu cơ chất rộng.

Aspartic protease (E.C.3.4.23): Hầu hết các aspartic protease thuộc
nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin,
chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl
trong trung tâm hoạt động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH trung tính. Trung
tâm hoạt động của aspartic protease chứa bộ ba amino acid Asp-Xaa-Gly. Các
aspartic protease phổ biến gồm có pepsin, rennin, protease acid của vi sinh
vật.
Metallo protease (E.C. 3.4.24): Metallo protease là nhóm protease
đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các vi sinh vật bậc cao hơn. Các
metallo protease thƣờng hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh
dƣới tác dụng của EDTA. Trung tâm hoạt động chứa ion kim loại trực tiếp
tham gia phản ứng xúc tác (chủ yếu là ion Zn
2+
). Hầu hết các metall protease
bị ức chế bởi các phức chất nhƣ EDTA nhƣng không bị ức chế bởi sulfhydryl
và DEP.
1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI HOẠT TÍNH PROTEASE
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều các công bố nghiên cứu về các yếu
tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease cũng nhƣ tác động khác nhau với mỗi
loại protease có nguồn gốc khác nhau. Có những yếu tố ảnh hƣởng âm tính
đến hoạt độ xúc tác của protease này nhƣng lại có tác động tích cực đến hoạt
độ xúc tác của protease khác.
11
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

Một số yếu tố ảnh hƣởng thƣờng đƣợc khảo sát dƣới đây:
a) Chất hoạt động bề mặt.
b) Dung môi hữu cơ, đa số đều ảnh hƣởng ít nhiều đến hoạt độ của
protease, chúng thƣờng ảnh hƣởng tới khả năng phân cực của protease cũng
nhƣ cơ chất.

c) Một số ion kim loại đều có ảnh hƣởng trực tiếp hay gián tiếp đến
hoạt độ của protease.
d) Các yếu tố về điều kiện nhiệt độ pH cũng tác động không nhỏ tới
hoạt độ của enzyme protease.
1.5. CƠ CHẾ XÚC TÁC PHẢN ỨNG
Cơ chế xúc tác của protease là một lĩnh vực nghiên cứu thu hút nhiều
sự quan tâm của các nhà khoa học. Quá trình nghiên cứu cơ chế xúc tác của
protease góp phần phân loại enzyme, đồng thời tạo điều kiện cho việc ứng
dụng các enzyme này trong các lĩnh vực khác nhau đƣợc dễ dàng và hợp lý.
Enzyme protease có cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai
bƣớc chính (theo Barrett và cộng sự, 1994):
Bước 1, acyl hóa: Hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của
serine với nguyên tử cácbon trong nhóm cácboxyl của phân tử cơ chất nhờ có
hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine.
Bước 2, khử acyl hóa: Phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử
H
2
O theo chiều ngƣợc lại của bƣớc một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển
proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme.
Cơ chế xúc tác của enzyme protease cho phản ứng thủy phân liên kết
peptide đƣợc minh họa theo sơ đồ sau:

12
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên



Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất, enzyme- S - P
1
: Là

sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P
2
: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có
thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các
liên kết peptid định trƣớc.
Sau đây là cơ chế xúc tác của 1 số loại protease đặc trƣng:
1.5.1. Serine protease
Trung tâm hoạt động xúc tác sự phân giải cơ chất của enzyme này chứa
bộ ba Ser-His-Asp [12]. Sự thủy phân diễn ra theo hai bƣớc bao gồm:
+ Bƣớc một: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa enzyme tự do và cơ
chất tạo thành phức trung gian [25]. Tiếp theo đó là sự acyl hóa và giải phóng
ra sản phẩm đầu tiên là R’-NH
2
+
.
+ Bƣớc hai: diễn ra quá trình khử acyl hóa, phức chất trung gian
enzyme - cơ chất phản ứng với phân tử H
2
O giải phóng ra sản phẩm thứ hai
cùng với sự tái sinh lại của enzyme tự do.
1.5.2. Metallo protease
Trung tâm xúc tác của hầu hết metalloprotease có dạng His-Glu-Xaa-
Xaa-His. Enzyme này hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của các cation hóa
trị 2 và có thể bị kìm hãm bởi quá trình thẩm tách hoặc sự có mặt của chất tạo
phức. Dựa vào những nghiên cứu tia X cho thấy thermolysine có khả năng tạo
phức với chất ức chế là acid hydroxamic. Kết quả là Glu-143 giúp phân tử
E + S Enzyme – S Enzyme – S + P
1
Enzyme + P

2


Hình 1.5. Sơ đồ cơ chế xúc tác trung tâm hoạt động của enzyme
13
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

H
2
O tấn công vào nguyên tử cacbon trong nhóm –COOH đã bị phân cực bởi
ion Zn
2+
ở liên kết peptide bị phân cắt [27].
1.5.3. Cysteine protease
Xúc tác thủy phân dẫn xuất carboxylic acid qua hai bƣớc trong đó xảy
ra quá trình hình thành các acid-base và sự thủy phân hợp chất trung gian cyl-
thiol.
Hình 1.6. Cơ chế xúc tác của cysteine protease.

14
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên

1.5.4. Aspartic protease
Cơ chế xúc tác của aspartic protease phụ thuộc vào acid aspartic trong
trung tâm hoạt động của enzyme. Các protease của họ pepsin là những phân
tử có hai thùy, rãnh nằm giữa hai thùy đóng vai trò trung tâm hoạt động. Mỗi
thùy góp một acid aspartic vào rãnh đó [26]. Hai thùy này tƣơng đồng với
nhau và là kết quả sử sự nhân đôi gene. Tuy nhiên, ở phân tử retropepsin chỉ
có một thùy mang một acid aspartic duy nhất [19]. Hầu hết enzyme của họ
pepsin, trung tâm aspartic xúc tác có dạng Asp-Thr-Gly-Xaa ở cả hai đầu tự

do N và C của mỗi thùy trong phân tử enzyme. Xaa ở đây là Ser hoặc Thr có
chuỗi bên có thể tạo liên kết hydro với aspartic, trong khi đó hầu hết
retropepsin thì Xaa là Ala.
Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của Aspartic protease

Phức hợp ES
Tứ diện trung gian
Phức hợp EP