ĐOÀN THỊ THANH PHƯƠNG NGHIÊN cứu tối ưu hóa QUÁ TRÌNH LOẠI tạp CHLOROPHYLL từ DỊCH CHIẾT XUYÊN tâm LIÊN (andrographis paniculata) sử DỤNG KHÔNG GIAN THIẾT kế (design space) KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HĨA Q TRÌNH
LOẠI TẠP CHLOROPHYLL TỪ
DỊCH CHIẾT XUYÊN TÂM LIÊN
(Andrographis paniculata) SỬ DỤNG
KHÔNG GIAN THIẾT KẾ (Design space)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2022


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ THANH PHƯƠNG
1701460

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HĨA Q TRÌNH
LOẠI TẠP CHLOROPHYLL TỪ
DỊCH CHIẾT XUYÊN TÂM LIÊN
(Andrographis paniculata) SỬ DỤNG
KHÔNG GIAN THIẾT KẾ (Design space)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
ThS. Trần Trọng Biên

Nơi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp dược

HÀ NỘI – 2022


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận này, đầu tiên, em xin bày tỏ lỏng biết ơn đến ThS
Trần Trọng Biên người đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho em trong
suốt quá trình em nghiên cứu thực hiện đề tài này. Cảm ơn Thầy đã tận tâm chỉ bảo và
theo sát em trong suốt quá trình thực nghiệm, kịp thời giải đáp thắc mắc và động viên
em trong từng bước nghiên cứu.
Nhân đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các Bộ môn và Phịng
ban, cùng tồn thể cán bộ cơng nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và
chỉ bảo tận tình cho em trong suốt 5 năm học tập tại trường.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã ln
ủng hộ, động viên và đồng hành cùng em trong suốt chặng đường vừa qua.
Hà Nội, ngày 27 tháng 6 năm 2022
Sinh viên
Đoàn Thị Thanh Phương


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .........................................................................................2

1.1. Thông tin về Xuyên tâm liên ................................................................................2
1.1.1. Đặc điểm thực vật của Xuyên tâm liên .........................................................2
1.1.2. Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng của Xuyên tâm liên ..............................2
1.1.3. Thành phần hóa học.......................................................................................2
1.2. Thơng tin về andrographolid ................................................................................3
1.2.1. Tính chất hóa lý .............................................................................................3
1.2.2. Tác dụng dược lý ...........................................................................................4
1.2.4. Một số nghiên cứu tinh chế andrographolid từ dịch chiết Xuyên tâm liên ...4
1.3. Ảnh hưởng của chất màu đến sản phẩm và một số phương pháp loại tạp màu
trong dịch chiết ............................................................................................................5
1.3.1. Ảnh hưởng của chất màu đến sản phẩm ........................................................5
1.3.2. Một số phương pháp loại tạp chất màu trong dịch chiết ...............................6
1.3.2.1. Phương pháp hấp phụ .............................................................................6
1.3.2.2. Phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng....................................................6
1.3.2.3. Phương pháp trao đổi ion .......................................................................7
1.3.2.4. Phương pháp kết tủa ...............................................................................7
1.3.2.5. Một số phương pháp khác ......................................................................8
1.4. Thông tin về không gian thiết kế ..........................................................................8
1.4.1. Khái niệm không gian thiết kế ......................................................................8
1.4.2. Vị trí và ý nghĩa của khơng gian thiết kế trong chất lượng theo thiết kế
(Quality by Design) .................................................................................................8
1.4.3. Xác định Không gian thiết kế ......................................................................10


1.4.4. Một số nghiên cứu tối ưu hóa sử dụng Không gian thiết kế .......................11
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu ..................................................................13
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................13
2.1.2. Thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm ........................................................13
2.1.3. Chất chuẩn và hóa chất ................................................................................13

2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................14
2.2.1. Tinh chế andrographolid từ dịch chiết Xuyên tâm liên ...............................14
2.2.2. Xác định cấu trúc, định danh và xác định hàm lượng .................................14
2.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................14
2.3.1. Phương pháp chiết xuất ...............................................................................14
2.3.2. Phương pháp tinh chế dịch chiết Xuyên tâm liên........................................14
2.3.3. Phương pháp định tính ................................................................................15
2.3.4. Phương pháp định lượng .............................................................................15
2.3.4.1. Phương pháp đo quang .........................................................................15
2.3.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................15
2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình loại chlorophyll ..17
2.3.5.1. Khảo sát loại chất hấp phụ....................................................................17
2.3.5.2. Khảo sát nhiệt độ của quá trình hấp phụ ..............................................18
2.3.5.3. Khảo sát thời gian của quá trình hấp phụ .............................................18
2.3.5.4. Khảo sát tỉ lệ khối lượng chất hấp phụ/dược liệu.................................18
2.3.5.5. Tối ưu hóa quy trình loại màu chlorophyll trong dịch chiết ................18
2.3.5.6. Tiến hành xử lý thu sản phẩm và kiểm nghiệm ...................................19
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................19
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................20
3.1. Thẩm định phương pháp định lượng andrographolid.........................................20
3.1.1. Độ đặc hiệu ..................................................................................................20
3.1.2. Độ thích hợp hệ thống .................................................................................21
3.1.3. Khoảng tuyến tính .......................................................................................21


3.2. Xác định hàm lượng andrographolid có trong nguyên liệu đầu vào và trong dịch
chiết ...........................................................................................................................22
3.3. Sơ bộ khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quy trình loại chlorophyll
trong dịch chiết Xuyên tâm liên ................................................................................22
3.3.1. Ảnh hưởng của loại chất hấp phụ ................................................................22

3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình hấp phụ ...........................................24
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ ...............................................................25
3.3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ chất hấp phụ/khối lượng dược liệu .............................25
3.4. Tối ưu hóa quá trình loại tạp chất màu chlorophyll trong dịch chiết Xuyên tâm
liên theo phương pháp bề mặt đáp ứng .....................................................................26
3.4.1. Tối ưu hóa quy trình loại chlorophyll trong dịch chiết ...............................26
3.4.2. Xác định và kiểm định Không gian thiết kế ................................................30
3.5. Sơ bộ quá trình tinh chế andrographolid và xác định chất tinh chế được ..........32
3.5.1. Quá trình tinh chế andrographolid...............................................................32
3.5.2. Xác định cấu trúc, nhận dạng chất tinh chế được và kiểm nghiệm .............33
3.5.2.1. Tính chất ...............................................................................................33
3.5.2.2. Sắc kí lớp mỏng ....................................................................................33
3.5.2.3. Nhiệt độ nóng chảy ...............................................................................33
3.5.2.4. Phổ hồng ngoại .....................................................................................34
3.5.2.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân .................................................................34
3.5.3. Tinh chế thu sản phẩm và định lượng andrographolid trong sản phẩm thu
được .......................................................................................................................36
BÀN LUẬN ..................................................................................................................37
4.1. Về kết quả của khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và không gian thiết kế của
phương pháp tối ưu hóa q trình loại chlorophyll trong dịch chiết Xuyên tâm liên
và sơ bộ chế tạo andrographolid ................................................................................37
4.2. Về quá trình tinh chế andrographolid từ dịch chiết Xuyên tâm liên ..................39
4.3. Về xác định cấu trúc và nhận dạng chất tinh chế được ......................................39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .........................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ý nghĩa

STT

Ký hiệu

1

CCF

2

CP 2015

Dược điển Trung Quốc 2015

3

CPP

Critical Process Parameters

4

CQA

Critical Quality Attributes

5

DĐVN V

6

HPLC

Central composite face-centered

Dược điển Việt Nam V
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)

7

KGTK

Không gian thiết kế (Design space)

8

KGTK

Không gian thiết kế

9

kl

10

MIP

Molecularly Imprinted Polymer (MIP)

11

QbD

Quality by Design

12

R

Hệ số hồi quy tuyến tính

13

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

14

RSM

Phương pháp đáp ứng bề mặt

15

tt

16

NSX

Khối lượng

Thể tích
Nhà sản xuất


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng ...........................................................................14
Bảng 2.2 Chương trình dung mơi pha động ..................................................................16
Bảng 3.1 Kết quả thẩm định độ thích hợp hệ thống…………………………………..21
Bảng 3.2 Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ andrographolid.....................21
Bảng 3.3 Kết quả định lượng andrographolid trong cành và lá Xuyên tâm liên ...........22
Bảng 3.4 Các mức thí nghiệm sử dụng trong mơ hình RSM-CCF ...............................26
Bảng 3.5 Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm của biến phụ thuộc ..................27
Bảng 3.6 Phân tích phương sai (ANOVA) cho hiệu suất loại chlorophyll ...................28
Bảng 3.7 Phân tích phương sai ANOVA cho hiệu suất thu hồi andrographolid ..........28
Bảng 3.8 Phân tích hệ số hồi quy của hiệu suất loại chlorphyll ....................................29
Bảng 3.9 Phân tích hệ số hồi quy của hiệu suất thu hồi andrographolid ......................29
Bảng 3.10 Kết quả kiểm định KGTK ............................................................................31
Bảng 3.11 Phân tích phổ hồng ngoại của sản phẩm tinh chế được ...............................34
Bảng 3.12 Kết quả định lượng và các định nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tinh chế
.......................................................................................................................................36


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc một số diterpen lacton trong Xuyên tâm liên.....................................3
Hình 1.2 Sơ đồ phát triển sản phẩm theo QbD ................................................................9
Hình 1.3 Khơng gian thiết kế được phát triển bởi thiết kế bề mặt đáp ứng, vùng màu
vàng là KGTK cần tìm ..................................................................................................11
Hình 1.4 KGTK của tối ưu chiết xuất củ Tam thất .......................................................12
Hình 2.1 Mơ hình q trình tối ưu hóa……………………………………………………………...18
Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV của andrographolid trong dung mơi ethanol
96%................................................................................................................................20
Hình 3.2 Sắc kí đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu .........................................................20
Hình 3.3 Đường chuẩn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ andrographolid
.......................................................................................................................................22
Hình 3.4 Hình ảnh của dịch chiết trước và sau loại màu...............................................23
Hình 3.5 Ảnh hưởng của loại chất hấp phụ đến hiệu suất loại chlorophyll trong dịch
chiết ...............................................................................................................................23
Hình 3.6 Phổ hấp thụ UV-VIS của dịch chiết Xuyên tâm liên trước và sau loại màu
bằng than hoạt ................................................................................................................24
Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ của quá trình hấp phụ đến hiệu suất loại chlorophyll
và thu hồi andrographolid ..............................................................................................24
Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ lên hiệu suất loại chlorophyll và thu hồi
andrographolid ...............................................................................................................25
Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ chất hấp phụ/dược liệu đến hiệu suất loại chlorophyll và
thu hồi andrographolid ..................................................................................................26
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của các biến độc lập tới hiệu suất loại
chlorophyll (%) ..............................................................................................................29
Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của các biến độc lập tới hiệu suất thu hồi
andrographolid (%) ........................................................................................................30
Hình 3.12 Khơng gian thiết kế được xây dựng từ mơ hình (1), (2) ..............................31
Hình 3.13 Sơ đồ quy trình tinh chế andrographolid từ Xuyên tâm liên ........................32
Hình 3.14 Sản phẩm sau tinh chế ..................................................................................33
Hình 3.15 Sắc kí lớp mỏng của sản phẩm tinh chế .......................................................33

Hình 3.16 Phân tích phổ 13C-NMR, 1H-NMR ...............................................................35
Hình 3.17 Cơng thức cấu tạo của sản phẩm tinh chế được ...........................................35
Hình 3.18 Sắc ký đồ HPLC kiểm nghiệm andrographolid trong sản phẩm cuối cùng
của ba mẻ .......................................................................................................................36


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xuyên tâm liên (Andrographis Paniculata (Burm.f) Nees) được trồng rất phổ
biến ở châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng đặc biệt trong tình hình dịch Covid-19
hiện nay. Xuyên tâm liên cũng được sử dụng nhiều trong các phương thuốc cổ truyền
bởi các tác dụng sinh học quan trọng của các hợp chất diterpen lacton có trong cây như
giảm đau, hạ sốt, chống viêm [43], kháng khuẩn [6], kháng virus [39]. Trong các
diterpen lacton này, andrographolid là thành phần có hàm lượng lớn nhất và tạo ra hầu
hết các tác dụng sinh học của cây [33]. Trong công nghiệp dược phẩm, andrographolid
đã được sản xuất và là thành phần trong một số thuốc đã được cấp phép sử dụng trên
lâm sàng. Trong quy trình sản xuất andrographolid từ Xuyên tâm liên, dung môi
thường được sử dụng là cồn (ethanol, methanol) do đạt hiệu suất chiết cao, vì vậy dịch
chiết bị lẫn nhiều tạp chất với cấu trúc đa dạng dẫn đến khó khăn trong q trình tinh
chế. Bộ phận thường dùng của cây là các bộ phận trên mặt đất trong đó theo Dược
điển Việt Nam V, lá chiếm khơng dưới 30%, do đó trong dịch chiết sẽ lẫn chlorophyll,
chất này ở trong dịch chiết làm cho việc tinh chế trở nên khó khăn, ảnh hưởng đến độ
ổn định của sản phẩm [10]. Vì vậy, việc nghiên cứu quá trình tinh chế loại tạp này là
cần thiết.
Do sự phức tạp của dược liệu nên việc duy trì tính đồng nhất giữa các lơ, mẻ rất
quan trọng. Gần đây, khái niệm chất lượng bởi thiết kế (Quality by Design) đang trở
nên phổ biến sử dụng để cải thiện tính đồng nhất giữa các mẻ của quy trình sản xuất.
Trong đó, cơng cụ khơng gian thiết kế (KGTK) là một thành phần quan trọng của
QbD, bởi tính ổn định của [9]. KGTK là khu vực để kiểm soát các tham số quy trình,
khi các tham số khác nhau nằm trong KGTK thì sự thay đổi có thể được bỏ qua. Hơn
nữa, Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào để cập đến mục tiêu tối ưu hóa bước loại

màu này. Do đó đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tinh chế andrographolid
từ dịch chiết Xuyên tâm liên sử dụng không gian thiết kế” được thực hiện với mục
tiêu:
Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố và tối ưu hóa q trình loại tạp chất
màu (chlorophyll) trong dịch chiết dược liệu Xuyên tâm liên sử dụng không gian thiết
kế.

1


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Thông tin về Xuyên tâm liên
Xuyên tâm liên [Andrographis paniculata (Burm.f.) Wall. ex Nees], tên đồng
nghĩa Justicia paniculata (Burm. f.) thuộc họ Ơ rơ, hay cịn gọi là công cộng, hùng
bút, nguyên cộng, lam khái liên, cây lá đắng, khô đảm thảo, nhất kiến kỷ… [4]
1.1.1. Đặc điểm thực vật của Xuyên tâm liên
Xuyên tâm liên là cây thảo cao 30 đến 90 cm, sống hằng năm, phân nhánh
nhiều, mọc thẳng đứng. Thân 4 góc lồi giống như 4 cánh ngắn. Cây lá nguyên, mềm,
mọc đối xứng và có cuống ngắn. Lá có chiều dài 3-12 cm và rộng 3,5 cm [51].
Hoa mọc thành chùm hình chùy ở đầu cành hoặc nách lá. Hoa có màu trắng,
điểm hồng. Quả dài, hơi nhẵn có chiều dài 15 mm và rộng 3,5 mm. Phiến lá hình
trứng, hình mũi mác hoặc hình elip hẹp, cả hai bề mặt đều nhẵn bóng, mặt ngồi xanh
lục nhạt, dọc trục màu xanh lục. Cụm hoa ở đầu cuối, hình chùy [51], hoa nhỏ và đơn
độc, tràng hoa trắng hoặc màu hồng nhạt với lông, hạt nhiều, màu nâu vàng [8].
1.1.2. Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng của Xuyên tâm liên
Xuyên tâm liên có nguồn gốc từ Ấn Độ và Sri Lanka, sau đó được di thực và
trồng phổ biến ở Nam Á, Đông Nam Á, miền nam Trung Quốc, khu vực Caribe, Trung
Mỹ, Australia và châu Phi… [51]. Cây được trồng ở nhiều tỉnh phía Bắc hoặc mọc
hoang. Cây ưa sáng và ưa mọc trên đất ẩm, sinh trưởng mạnh vào mùa xuân hè, mùa
đông tàn lụi. Mùa hoa tháng 9-12, mùa quả tháng 1-2 [37].

Người ta dùng bộ phận trên mặt đất (lá và cành) của cây, rễ rất hiếm khi được
sử dụng và nên thu hái trước khi cây ra hoa [5].
1.1.3. Thành phần hóa học
Xuyên tâm liên có các thành phần chính là diterpenoid, flavonoid. Hơn 78
diterpenoid, 41 flavonoid, 8 dẫn xuất axit quinic, 4 xanthon, 5 noriridoid hiếm, 3
steroid và 3 hợp chất khác và đã được phát hiện trong cây Xuyên tâm liên [18].
Trong đó, các diterpen lacton là thành phần chính tạo ra các tác dụng sinh học
của cây và andrographolid là dipterpenoid chính trong cây, bên cạnh đó cịn rất nhiều
các diterpenoid khác như deoxyandrographolid, neoandrographolid, 14-deoxy-11,12didehydroandrographolid, isoandrographolid…[19] Ngồi ra, trong cây cịn có các
acid hữu cơ, tanin, nhựa, đường, hợp chất có màu như chlorophyll… [26].

2


Andrographolid

Neoandrographolid

14-deoxy 11,12- didehydroandrographolid

Isoandrographolid

Hình 1.1 Cấu trúc một số diterpen lacton trong Xuyên tâm liên [42]
1.2. Thông tin về andrographolid
Được phân lập lần đầu tiên vào năm 1911 [35], andrographolid là dipterpenoid
chính trong cây, hàm lượng lên đến 4% trong cây khơ, 0,8-1,2% trong cành và 0,5-6%
trong lá và nó cũng là thành phần chính tạo ra các tác dụng sinh học của A. paniculata
[19].
Andrographolid có cơng thức phân tử: C20H30O5, tên khoa học là (3 - [2
{decahydro-6hydroxy-5-(hydroxymethyl)-5,8α-dimethyl-2-methylene1-naphthalenyl}

ethylidene] dihydro-4-hydroxy-2 (3H) furanone) và cấu trúc của nó được thể hiện
trong hình 1.1.
1.2.1. Tính chất hóa lý
Andrographolid là tinh thể khơng màu, vị đắng, có trọng lượng phân tử là 350,4
g/mol, nhiệt độ nóng chảy là 224-230°C; hấp thụ cực đại ở bước sóng 225 nm [34].
Andrographolid dễ tan trong methanol (14,5 mg/ml), ethanol, pyridin, acid
acetic, aceton; tan rất ít trong cloroform (0,21 mg/ml), nước (0,07 mg/ml), dung mơi
khơng phân cực, ngồi ra độ tan của andrographolid tăng theo nhiệt độ (15-65oC); hệ
số phân bố dầu nước logP = 2,632 ± 0,135 [33]. Andrographolid ổn định trong điều
kiện trung tính, acid, khơng ổn định trong kiềm [45].

3


1.2.2. Tác dụng dược lý
Tác dụng chống viêm: andrographolid trong cây ức chế yếu tố nhân kappa B
(NF-κB) liên kết với axit deoxyribonucleic, làm giảm sự biểu hiện của các protein gây
viêm như cyclooxygenase 2 (Cox-2) và nitric-oxide synthase [17].
Tác dụng bảo vệ gan: andrographolid có thể làm giảm bớt tổn thương bệnh lý
gan và stress oxy hóa ở chuột tiếp xúc với ethanol bằng cách giảm sự biểu hiện của
NF- κB và TNF-α [41].
Tác dụng chống ung thư: andrographolid ức chế sản xuất interferon (IFN-g) và
IL-2 cytokine và ngăn chặn quá trình chết theo chương trình của tế bào. Nó cũng ngăn
chặn các khối u đại trực tràng ở chuột [40].
Tác dụng kháng virus phổ rộng trong đó có cả virus SAR-CoV-2:
andrographolid ngăn chặn sự lây lan cũng như truyền virus sang các tế bào lân cận
bằng cách can thiệp vào các con đường truyền tín hiệu tế bào khác nhau [27].
Tác dụng bảo vệ thần kinh trung ương: Các nghiên cứu dược lực học đã chỉ ra
rằng andrographolid có thể vượt qua hàng rào máu não và phân bố vào các vùng não
khác nhau, và do đó tác dụng dược lý của nó trên hệ thần kinh trung ương (CNS) đã

bắt đầu được tiết lộ trong những năm gần đây [30].
1.2.4. Một số nghiên cứu tinh chế andrographolid từ dịch chiết Xuyên tâm liên
Năm 2009, Hoàng Việt Dũng và cộng sự đã phân lập hợp chất andrographolid
từ lá cây Xuyên tâm liên dùng làm chất chuẩn đối chiếu. Phương pháp chiết được dùng
là chiết ngấm kiệt bằng cồn; giai đoạn tinh chế kết hợp phương pháp kết tinh và sắc ký
chế hóa. Kết quả thu được andrographolid có độ tinh khiết đạt 97,04% và hiệu suất cả
quy trình là 0,89% [2]. Tuy nhiên, quy trình trong báo cáo chưa chi tiết, chưa nghiên
cứu được các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình, chưa đưa ra được quy trình cụ thể, khó
thực hiện.
Năm 2014, Dilip Jadhao và cộng sự đã nghiên cứu quá tinh chế andrographolid
từ cây Xuyên tâm liên. Quá trình tinh chế cũng sử dụng phương pháp kết tinh, dung
môi sử dụng là methanol như nghiên cứu trên, tuy nhiên điểm khác biệt là nghiên cứu
này sử dụng phương pháp hấp phụ để làm giàu andrographolid trong dịch chiết. Kết
quả thu được andrographolid có độ tinh khiết cao và đạt các tiêu chuẩn về kiểm
nghiệm [20]. Bên cạnh đó có thể thấy cịn một số hạn chế trong nghiên cứu đó là các
yếu tố chỉ được khảo sát độc lập, với quá trình hấp phụ mới chỉ đưa ra khảo sát một
yếu tố là lượng chất hấp phụ sử dụng, bên cạnh đó cũng cịn các yếu tố khác cũng có
thể ảnh hưởng đến q trình này như nhiệt độ hay thời gian hấp phụ.
Năm 2021, Devi và cộng sự cũng đã nghiên cứu phân lập và nhận dạng hợp
chất từ lá cây Xuyên tâm liên bằng việc kết hợp phương pháp chiết phân bố lỏng –
lỏng và phương pháp kết tinh [13]. Tuy nhiên, phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng
4


có nhược điểm rất lớn đó là quy trình khá phức tạp, khó ứng dụng trên quy mơ cơng
nghiệp.
Trong nghiên cứu gần đây, andrographolid đã được phân lập bởi Wiwin
Winingsih và cộng sự bằng phương pháp hấp phụ sử dụng polyme in dấu phân tử
(MIP). Đây là một phương pháp mới chưa được sử dụng để phân lập andrographolid
trước đây. Sau khi tinh chế bởi MIP, độ tinh khiết của andrographolid đã tăng từ

55,37% ± 0,69 lên 94,94% ± 0,34. Có thể thấy đây là một phương pháp giúp giảm
phần lớn thời gian tinh chế so với phương pháp kết tinh thơng thường. Tuy nhiên,
ngun liệu sử dụng có giá thành khá cao, chưa được ứng dụng thường quy trong sản
xuất [49].
1.3. Ảnh hưởng của chất màu đến sản phẩm và một số phương pháp loại tạp màu
trong dịch chiết
1.3.1. Ảnh hưởng của chất màu đến sản phẩm
Để có hiệu suất chiết cao, dịch chiết sạch, ít tạp chất và tiết kiệm chi phí sản
xuất thì cần phải lựa chọn dung môi và các điều kiện chiết xuất hợp lý. Tuy nhiên
trong thực tế, có rất ít dung mơi chiết xuất có tính chọn lọc hịa tan cao với hoạt chất.
Trong quy trình sản xuất các sản phẩm từ dược liệu, ethanol là dung môi được sử dụng
nhiều để chiết xuất, như vậy dẫn đến các thành phần hoạt tính và tạp chất đều có trong
dịch chiết. Các chất có màu thường xuất hiện trong dịch chiết cồn của dược liệu như
chất diệp lục (chlorophyll) (màu xanh), một số hợp chất flavon (màu vàng), tanin
(nâu)… Các chất màu có mặt trong dịch chiết có thể gây một số ảnh hưởng bất lợi đến
sản phẩm của quy trình.
Đối với các quy trình với mục đích thu sản phẩm là dịch chiết, cao cơ đặc từ
dịch chiết thì chất màu có ảnh hưởng rất lớn đến độ ổn định của sản phẩm. Ví dụ như
đối với chlorophyll, chất này rất nhạy cảm với nhiệt, ánh sáng, oxy… [31] dẫn đến sự
biến đổi về màu sắc của chúng trong quá trình bảo quản dịch chiết, cao dược liệu từ đó
sẽ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
Với các quy trình mục đích thu các sản phẩm sau tinh chế như đơn chất, cao
giàu hoạt chất… chất màu có một số tác động đến q trình tinh chế các sản phẩm này.
Sự có mặt của chất màu trong dịch chiết có thể cản trở sự kết tinh hoạt chất và ảnh
hưởng đến cảm quan của các sản phẩm cuối cùng [10], [20]. Ngoài ra việc lẫn các tạp
chất màu có thể dẫn đến sản phẩm chiết không đạt chất lượng về hàm lượng, độ ổn
định… Ví dụ trong sản xuất nguyên liệu làm dầu diesel sinh học, chất diệp lục làm cho
dầu dễ bị quang oxy hóa hơn, làm giảm độ ổn định khi bảo quản và gây ra mùi vị khó
chịu. Hơn nữa, sự có mặt của chất diệp lục có thể làm giảm hiệu suất chuyển hóa và
hiệu suất đốt của dầu diesel sinh học [28]. Ngồi ra, tạp chất màu có thể ảnh hưởng

5


đến tính an tồn trong q trình sử dụng như tanin trong thuốc có thể gây ra phản ứng
bất lợi tan máu [10].
Trong kiểm nghiệm, các tạp màu như chlorophyll xuất hiện trong dịch chiết
cũng có thể coi như hợp chất nhiễu, gây ra các khó khăn và sau số trong quá trình định
lượng, do khả năng hấp phụ UV – VIS, đặc tính huỳnh quang và xu hướng kết tủa
trong môi trường nước [23].
1.3.2. Một số phương pháp loại tạp chất màu trong dịch chiết
1.3.2.1. Phương pháp hấp phụ
Hấp phụ là sự tập trung của một hoặc một nhóm chất lên bề mặt vật liệu có cấu
trúc xốp [50]. Các vật liệu xốp được gọi là chất hấp phụ và các chất bị hút bám vào bề
mặt các chất hấp phụ gọi là các chất bị hấp phụ. Một số chất hấp phụ phổ biến thường
được dùng trong nghiên cứu và phổ biến như alumia hoạt tính, silicagel, nhựa
macroporous tổng hợp, sợi collagen và than hoạt tính [32].
Trong chuyên luận Xuyên tâm liên của dược điển Việt Nam V (DĐVN V) và
dược điển Trung Quốc 2015 (CP2015), để loại màu dịch chiết đã sử dụng phương
pháp hấp phụ với chất hấp phụ lần lượt là than hoạt và nhôm oxit[1].
Năm 2014, Dilip Jadhao và cộng sự đã nghiên cứu quá trình tinh chế AND từ
cây Xuyên tâm liên sử dụng phương pháp hấp phụ với chất hấp phụ là than hoạt, sau
khi khảo sát tỉ lệ than hoạt thu được kết quả lượng than hoạt cần dùng là 15% [20].
Tuy nhiên ở nghiên cứu này mới chỉ khảo sát các tỉ lệ than hoạt khác nhau, chưa khảo
sát các yếu tố khác cũng ảnh hưởng lên quá trình hấp phụ như nhiệt độ hay thời gian
hấp phụ. Trước đó cũng đã có các nghiên cứu cũng đã sử dụng than hoạt để loại đi
chất màu là chlorophyll có trong dịch chiết [21].
1.3.2.2. Phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng
Chiết phân bố lỏng lỏng dựa trên độ tan và sự phân bố khác nhau của các thành
phần trong dịch chiết trong các dung môi/hệ dung môi không trộn lẫn để tinh chế hoạt
chất hoặc nhóm hoạt chất. Với các hệ chiết phân bố lỏng-lỏng cổ điển, một pha là

nước và pha kia là dung mơi hữu cơ ít phân cực (khơng trộn lẫn với nước) có khả năng
hịa tan tốt và chọn lọc một số thành phần trong hỗn hợp. Hai pha cần có tỷ trọng khác
nhau và dễ dàng phân lớp sau khi trộn kỹ vào nhau [46].
Năm 2021, Devi Ayu Septiani và cộng sự đã nghiên cứu phân lập
andrographolid từ lá cây Xuyên tâm liên sử dụng phương pháp chiết phân bố lỏnglỏng để loại các tạp chất có màu, sử dụng dung môi là n-hexan lắc 19 lần và ethyl
acetat lắc 10 lần [13]. Có thể thấy, đây là phương pháp sử dụng lượng dung môi nhiều
dẫn đến cịn tồn dư dung mơi độc hại trong sản phẩm chiết; cần chiết nhiều lần nên tốn
thời gian, kinh tế; trang thiết bị sử dụng phức tạp và khó nâng quy mơ hay kiểm sốt
quy trình.
6


1.3.2.3. Phương pháp trao đổi ion
Phương pháp trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch giữa các ion đã bị
hấp phụ trên chất mang rắn và ion trong dung dịch. Các chất trao đổi ion có khả năng
gắn kết với các phân tử ion hóa và tách chúng khỏi dung dịch. Nhựa trao đổi ion là các
polyme liên kết chéo, khơng tan trong nước, mang nhiều nhóm chức ion hóa tại các vị
trí xác định trên cùng điện tích trong dung dịch. Trong cấu trúc nhựa trao đổi ion có
nhiều lỗ xốp tạo ra diện tích bề mặt riêng lớn. Chuỗi polyme có tính kỵ nước, ngược
lại các nhóm chức có tính thân nước. Do đó, ngồi cơ chế trao đổi ion, cơ chế hấp phụ
cũng giữ một vai trò nhất định trong tinh chế các phân tử đích [28].
Nhựa trao đổi ion có 2 loại: nhựa trao đổi cation (chất mang điện âm có khả
năng hấp phụ các phân tử tích điện dương) và nhựa trao đổi anion (chất mang điện
dương có khả năng hấp phụ các phân tử điện tích âm). Ngồi ra có loại nhựa lưỡng
tĩnh có khả năng trao đổi đồng thời cả cation và anion. Các nhóm trao đổi hay gặp gồm
nhóm trao đổi cation mạnh (-SO3-H+), nhóm trao đổi cation acid yếu (-COO-H+),
nhóm trao đổi anion base mạnh [28].
Trong một nghiên cứu của Yun-Ge Fan và cộng sự năm 2008 đã sử dụng
phương pháp trao đổi ion để loại màu và tinh chế saponin có trong lá của cây tam thất.
Nghiên cứu này đã khảo sát các loại nhựa trao đổi ion khác nhau và thu được kết quả

là nhựa trao đổi ion là nhựa tốt nhất để loại chất màu trong dịch chiết lá tam thất và thu
được các saponin tổng số có độ tinh khiết và chất lượng tốt [15]. Phương pháp tinh chế
này cũng được sử dụng trong một nghiên cứu khác để loại màu trong đường mía tự
nhiên [7].
1.3.2.4. Phương pháp kết tủa
Phương pháp kết tủa là một trong các phương pháp cơ bản nhất để tinh chế dịch
chiết dược liệu, phương pháp này dựa vào sự thay đổi độ tan của các tạp chất và hoạt
chất trong những điều kiện phù hợp để loại bỏ tạp chất.
Với các dịch chiết nước dược liệu có thể kết tủa bằng các cách sau: kết tủa bằng
nhiệt (đun nóng và cơ đặc dịch chiết cịn 1/2-1/4 thể tích ban đầu, để lắng chỗ mát, gạn
lọc loại protein, chất nhầy và các chất dễ bị đơng vón do nhiệt), kết tủa do thay đổi pH
(áp dụng với các chất có độ tan phụ thuộc pH), kết tủa bằng gelatin (tác nhân này giúp
kết tủa tannin, tuy nhiên gelatin tan trong nước nên khó loại bỏ triệt để gelatin khỏi
dịch chiết), kết tủa bằng cồn (cơ dịch chiết đến tỉ trọng thích hợp, thêm 2-3 lần thể tích
cồn cao độ, khuấy trộn đều, để lắng chỗ mát, gạn lọc để loại các tạp chất phân cực
mạnh).
Tuy nhiên phương pháp kết tủa có nhược điểm lớn là quy trình kết tủa khơng
chọn lọc, sự mất hoạt chất trong q trình tinh chế có thể xảy ra theo 3 cơ chế: mất do
bao gói, mất do kết tủa, mất do phân hủy trong đó chủ yếu theo cơ chế bao gói.
7


Để loại đi tạp màu có trong dịch chiết Belladon, CP2015 đã sử dụng phương
pháp kết tủa bằng cách giảm nồng độ ethanol sau đó tách phần tủa phía trên. Trong
một nghiên cứu khác được thực hiện vào năm 2011 về xác định điều kiện tối ưu loại
chlorophyll trong lá neem theo phương pháp kết tủa bằng nước cất. Kết quả cho thấy
hiệu suất loại chlorophyll khá cao khi sử dụng phương pháp này, tuy nhiên với phương
pháp kết tủa lượng hoạt chất bị mất đi trong quá trình loại tủa có thể khá lớn, do vậy
hiệu suất của quá trình khá thấp dẫn đến việc tăng chi phí sản xuất và giá thành sản
phẩm [3].

1.3.2.5. Một số phương pháp khác
Một số phương pháp khác cũng đã được sử dụng để loại bỏ hoặc phân lập chất
màu chlorophyll trong dịch chiết. Phương pháp sắc ký vùng ly tâm với hệ dung môi
bao gồm n-hexan-EtOAc-MeOH-nước (5:5:5:5, tt/tt) [24]; phương pháp đông tụ điện,
đây là một kỹ thuật điện hóa trong đó các điện cực nhơm và sắt được hịa tan, tạo ra
các chất đông tụ tại chỗ, sẽ làm mất ổn định các hạt keo [14]. Tuy nhiên các phương
pháp này khá phức tạp và cần dùng các thiết bị có giá thành cao nên cũng là điểm hạn
chế khi áp dụng trên quy mô công nghiệp.
Do chlorophyll là một diester có thể được xà phịng hóa bằng cách xử lý với
kiềm nên phương pháp xà phịng hóa được sử dụng để loại chlorophyll đã được nghiên
cứu và phương pháp này cho thấy hiệu quả loại chlorophyll lên đến 90%. Phương
pháp này thường dùng trong các trường hợp cần loại chlorophyll có trong các loại dầu
như dầu vi tảo [29].
1.4. Thơng tin về không gian thiết kế
1.4.1. Khái niệm không gian thiết kế
Trong hướng dẫn phát triển dược phẩm ICH Q8, không gian thiết kế được định
nghĩa là “Sự kết hợp và tương tác đa chiều của các biến đầu vào (ví dụ: thuộc tính
ngun liệu) và các thơng số q trình đã được chứng minh để đảm bảo chất lượng”.
Do đó sự kết hợp và tương tác đa chiều của biến đầu vào tương tác trong một không
gian, được gọi là Không gian thiết kế, và khi thực hiện trong khơng gian này chất
lượng của q trình được đảm bảo. Không gian thiết kế nhất thiết phải được bao phủ
miền thực nghiệm, là khơng gian đa chiều được hình thành bởi các phạm vi nhân tố
được sử dụng trong quá trình phát triển phương pháp [38].
1.4.2. Vị trí và ý nghĩa của không gian thiết kế trong chất lượng theo thiết kế
(Quality by Design)
Khái niệm chất lượng theo thiết kế (QbD) gần đây đã được áp dụng trong ngành
dược phẩm. Mục đính chung là chuyển từ mơ hình chất lượng bằng thử nghiệm (QbT)
đã được thực hiện trước đây trong ngành dược phẩm sang một sự phát triển nhằm nâng
8

cao hiểu biết về các quy trình và sản phẩm, do đó cải thiện chất lượng sản phẩm, hiệu
quả quy trình và tính linh hoạt.
QbD khơng mới và liên quan đến nhiều công cụ và phương pháp thống kê như
thiết kế thực nghiệm của các thí nghiệm, thống kê đa biến và kiểm soát chất lượng
thống kê. Để nâng cao chất lượng dược phẩm, gần đây đã có những nghiên cứu chứng
minh rằng nếu chỉ kiểm tra các sản phẩm ở cuối quy trình sản xuất thì chưa đảm bảo
chất lượng. Thay vào đó chất lượng sản phẩm phải được xây dựng và kiểm sốt trong
q trình sản xuất sản phẩm (hay QbD). Một thành phần quan trọng của quy trình áp
dụng QbD được gọi là Khơng gian thiết kế.

Hình 1.2 Sơ đồ phát triển sản phẩm theo QbD
Các thông số trong KGTK có lợi cho việc duy trì tính nhất quán hàng loạt của
sản phẩm, do đó, khi thực hiện trong KGTK không được coi là thay đổi [31]. Gần đây,
khái niệm chất lượng theo thiết kế và KGTK ngày càng trở nên phổ biến trong các quy
trình sản xuất thuốc [10].
Trong khuôn khổ của sự phát triển phương pháp này, KGTK có thể được coi là
một vùng lý thuyết vững chắc vì khơng có sự thay đổi lớn nào về mức độ của các chỉ
tiêu chất lượng trọng yếu (Critical Quality Attributes-CQAs). Do đó để xác định một
KGTK, một số yếu tố được sắp xếp một cách hợp lý, cịn được gọi là thơng số q
trình trọng yếu (Critical Process Parameters-CPPs) các yếu tố vận hành ảnh hưởng đến
quy trình đang được phát triển phải được nghiên cứu đồng thời.
Do ý nghĩa chính của QbD nên việc phân tích KGTK là để tăng thêm hiểu biết
về KGTK cũng như hiểu rõ hơn về sự liên quan giữa các quy trình sản xuất và khả
năng thực hiện của quy trình. Đây là một phương pháp tối ưu hữu ích, cho phép người
sử dụng đưa ra quyết định phù hợp với các kết quả được đưa ra. Việc xác định KGTK
9


của quy trình sản xuất cho phép xác định các thơng số quan trọng của quy trình, các

thơng số này có ảnh hưởng lớn đến các CQA của quy trình sản xuất. Do đó việc kiểm
sốt các yếu tố có ảnh hưởng lớn có thể được nghiên cứu tốt nhất.
Việc kiểm sốt thay đổi quy trình chỉ được u cầu khi thực hiện ngoài vùng
giới hạn của KGTK. Trường hợp cụ thể đó là có thể giảm bớt sai số trong chuyển giao
quy trình [47]. Điều này có thể thực hiện vì quy trình sản xuất được chuyển giao có thể
thực hiện trong KGTK của nó tại điểm tiếp nhận.
Cuối cùng, lý do chính để xác định KGTK là do KGTK cung cấp thơng tin về
tần suất quy trình thực hiện sẽ đáp ứng yêu cầu (hay xác suất thành cơng), mục đích để
cung cấp dữ liệu hữu ích và đáng tin cậy, từ đó sẽ tạo ra tính ổn định khi nâng cấp quy
mô, thay đổi môi trường sản xuất.
1.4.3. Xác định Không gian thiết kế
Để xác định được KGTK, đầu tiên cần xác định các thông số quy trình (CPPs)
và các thuộc tính chất lượng (CQAs). Sau đó xây dựng mơ hình định lượng giữa CPPs
và CQAs, thiết kế không gian và cuối cùng là kiểm định Không gian thiết kế.
Phương pháp thiết kế thí nghiệm (Design of experiments – DoEs) thường được
ứng dụng để xác định không gian thiết kế. DoE có hiệu quả tốt trong việc đánh giá
đồng thời tác động của các yếu tố và tương tác của chúng, đồng thời lập mơ hình và dự
đoán mối liên quan của các yếu tố này với CQA hoặc các đáp ứng. DoE được chọn cần
có đặc tính thống kê tốt (ví dụ: tính trực giao và/hoặc khả năng xoay) và phải duy trì
số lượng thử nghiệm càng ít càng tốt. DoE có thể chia thành hai loại chính đó là thiết
kế bề mặt đáp ứng (Respone surface designs) và thiết kế sàng lọc (Screening designs).
Thiết kế sàng lọc ước tính ảnh hưởng của các yếu tố đối với các đáp ứng đã
chọn. Khi có quá nhiều yếu tố ảnh hưởng lên các đáp ứng đầu ra, những thiết kế này
có thể sử dụng để chọn ra các yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất. Trong các thiết kế sàng
lọc, điển hình là các thiết kế Plackett và Burnman nghiên cứu các yếu tố ở hai cấp độ.
Thiết kế bề mặt đáp ứng thường được sử dụng để dự đốn và tối ưu hóa các đáp
ứng. Phương pháp bề mặt đáp ứng gồm các thiết kế hỗn hợp trung tâm và BoxBenkhen, thiết kế của Doehlert, D-optimal, thiết kế toàn mặt… Thiết kế bề mặt đáp
ứng là cơng cụ chính xác để xác định một KGTK. Nghiên cứu thử nghiệm một lớn
miền, hiểu xu hướng của các đáp ứng và CQA liên quan đến các yếu tố đã nghiên cứu
và cung cấp một mơ hình để dự đoán giá trị của các CQA trong phạm vi của các yếu tố

này.
Sau khi các thí nghiệm đã được thực hiện bằng cách sử dụng các thiết kế bề mặt
đáp ứng, mơ hình kết quả nói chung được minh họa và diễn giải thông qua đồ thị bề
mặt hoặc các đường đồng mức. Để xác định KGTK có thể tìm kiếm các phạm vị cho
thấy các yếu tố CQA đáp ứng được tiêu trí đã được xác định trước.
10


Sau khi xác định được KGTK, tiến hành thẩm định bằng cách thiết kế các thí
nghiệm ở cả trong và ngoài giới hạn của KGTK, xem xét kết quả thu được giữa thực
nghiệm và thiết kế có trùng khớp nhau hay khơng, các điểm thuộc vào KGTK có thỏa
mãn được các u cầu đã xác định trước đó khơng.
1.4.4. Một số nghiên cứu tối ưu hóa sử dụng Khơng gian thiết kế
Hiện nay việc sử dụng KGTK trong tối ưu hóa đã trở nên rất phổ biến đặc biệt
trong bào chế [22], [36]. Ngoài ra, KGTK cũng đang dần phổ biến trong chiết xuất
dược liệu và trở thành công cụ hữu ích trong việc đưa các nghiên cứu trong quy mơ
phịng thí nghiệm áp dụng trên các quy mơ lớn hơn mà vẫn đảm bảo được các mục
tiêu đề ra.
Nghiên cứu về quá trình khử màu của dịch chiết tam thất bằng phương pháp
hấp phụ được thực hiện bởi Teng Chen và cộng sự năm 2014 đã sử dụng phương pháp
tiếp cận là KGTK. Nghiên cứu đã sử dụng phương pháp thí nghiệm bề mặt đáp ứng,
xác định CQA là tỉ lệ thu hồi các saponin và tỉ lệ loại màu dịch chiết, CPP là tốc độ

Tốc độ dòng (BV/H)

dòng và thể tích mẫu. Sau khi xác định được mơ hình, để xác định KGTK, giá trị tối
thiểu của tỉ lệ loại màu, tỉ lệ thu hồi của các hoạt chất được đặt ra và xác định được
không gian thiết kế như hình 1.3.

Thể tích mẫu (BV)

Hình 1.3 Khơng gian thiết kế được phát triển bởi thiết kế bề mặt đáp ứng, vùng màu
vàng là KGTK cần tìm [10]
KGTK cũng đã được sử dụng trong một nghiên cứu khác về tối ưu hóa phương
pháp chiết xuất hồi lưu Tam thất để cải thiện tính đồng nhất giữa các mẻ khi chiết
dược liệu này. CQA được xác định của quy trình là năng suất saponin, tổng độ tinh
khiết của saponin và năng suất phần khơ; CPP của quy trình gồm có hàm lượng
ethanol, thời gian chiết, tỷ lệ của tốc độ dịng ethanol và thể tích dung mơi ban đầu
trong bể chiết (RES). Sử dụng phương pháp thiết kế thí nghiệm Box-Behnken thu
được các mơ hình bậc hai giữa CPP và CQA, với các hệ số xác định cao hơn 0,88.
Không gian thiết kế được tính tốn bằng phương pháp mơ phỏng Monte-Carlo với xác
suất chấp nhận là 0,90. Xác định được KGTK có hình dạng khơng đều, bao hàm hai
phần. Do vậy để dễ dàng thực hiện, chọn thời gian chiết là 6,1-7,1 giờ, RES từ 0,039
11


đến 0,04 phút-1, xác suất thỏa mãn tiêu chí CQA là 0,914 khi các tham số được kiểm

Thời gian chiết (giờ)

sốt trong vùng hoạt động bình thường [16].

Nồng độ ethanol (%)

Hình 1.4 KGTK của tối ưu chiết xuất củ Tam thất

12


CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Đối tượng nghiên cứu là bộ phận trên mặt đất (cành, lá) của cây Xuyên tâm liên
được thu mua từ Viện dược liệu. Xử lý dược liệu trước khi tiến hành thí nghiệm: xay
nhỏ dược liệu Xuyên tâm liên, bảo quản trong túi ni lơng kín, tránh ánh sáng trực tiếp.
2.1.2. Thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm
• Máy quang phổ HITACHI U-1900 (Nhật Bản)
• Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu SIL-20AHT (Nhật Bản) với
các bộ phận bơm chính: bơm cao áp LC-20AD, bộ phận đuổi khí DGU-20AD,
buồng cột CTO-10AS vp, deetector mảng diod SPD-M20A, phần mềm Lab
Solution.
• Cột pha tnh C18 InertSustatinđ (250 x 4,6 nm, 5 àm) (Nhật Bản)
• Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy Sỹ)
• Bếp cách thủy Memmert (Đức)
• Máy cơ quay Buchi Scientific Daihan Scientific (Hàn Quốc)
• Máy ly tâm Satorius (Đức)
• Cân kĩ thuật Satorius (Đức)
• Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy Sỹ)
• Máy cân sấy ẩm MB23 Ohaus (Trung Quốc)
• Tủ sấy tĩnh Memmert (Đức)
• Máy đo phổ hồng ngoại Jasco FT/IR-6700 (Nhật)
• Các dụng cụ kiểm nghiệm khác
2.1.3. Chất chuẩn và hóa chất
Chất đối chiếu: Bột andrographolid hàm lượng 95,00%, đạt tiêu chuẩn CP2015.

13


Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng
TT

Tên hóa chất

Nguồn gốc

Tiêu chuẩn

Việt Nam

Dung môi công nghiệp

1

Ethanol 96%

2

Methanol

Merck (Đức)

HPLC

3

Acid phosphoric đặc

Trung Quốc

HPLC

4

Cloroform

Trung Quốc

Tinh khiết phân tích

5

Than hoạt dạng bột mịn

Việt Nam

Tiêu chuẩn NSX

6

Nhựa Lewatit

Trung Quốc

Tiêu chuẩn NSX

7

Nhựa Dowex

Trung Quốc

Tiêu chuẩn NSX

8

Nhựa D101

Trung Quốc

Tiêu chuẩn NSX

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Tinh chế andrographolid từ dịch chiết Xuyên tâm liên
- Khảo sát và tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế loại tạp
màu (chlorophyll) của dịch chiết Xuyên tâm liên sử dụng không gian thiết kế.
- Ứng dụng để đưa ra sơ bộ quá trình tinh chế andrographolid.
2.2.2. Xác định cấu trúc, định danh và xác định hàm lượng
- Xác định cấu trúc của chất tinh chế được.
- Xác định hàm lượng của sản phẩm tinh chế được.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chiết xuất
Nhóm nghiên cứu đã tham khảo tài liệu [11] và tiến hành khảo sát các điều kiện
điều chế dịch chiết giàu andrographolid từ cây Xuyên tâm liên và lựa chọn quy trình
chiết xuất:
Dược liệu Xuyên tâm liên được xay nhỏ, kích thước khoảng 0,5-1,0 cm và chiết
xuất bằng phương pháp chiết hồi lưu với dung môi ethanol 96%. Các điều kiện chiết
bao gồm: số lần chiết 2 lần (lần 1: 2 giờ, lần 2: 1 giờ), tỉ lệ dung môi/dược liệu (ml/g):
lần 1 là 9/1 và lần 2 là 5/1. Gộp dịch chiết các lần, cơ đến thể tích 1000 ml; hàm lượng
andrographolid được xác định trong dịch chiết là 0,119 ± 0,006 mg/ml và tiến hành
khảo sát các điều kiện tinh chế.

2.3.2. Phương pháp tinh chế dịch chiết Xuyên tâm liên
Nghiên cứu đã lựa chọn phương pháp tinh chế loại chlorophyll có trong dịch
chiết Xuyên tâm liên là phương pháp hấp phụ tĩnh.
Trong các bình nón dung tích 50 ml, thêm một lượng chất hấp phụ và 10 ml
dịch chiết, đậy kín, lắc để phân tán đều chất hấp phụ vào dung dịch và để các bình này
14


ở điều kiện nhiệt độ và thời gian khảo sát. Kết thúc quá trình hấp phụ dịch chiết được
ly tâm, thu lấy dịch trong, dịch này được dùng để nghiên cứu trong các thí nghiệm.
2.3.3. Phương pháp định tính
Phương pháp sắc kí lớp mỏng với các điều kiện như sau:
- Pha tĩnh: Bản mỏng TLC silicagel 60 F254 (Merck).
- Pha động: Cloroform:methanol (9:1, tt/tt).
- Mẫu thử: Hòa tan sản phẩm tinh chế được trong methanol để thu được dung
dịch thử có nồng độ khoảng 2 mg/ml.
- Mẫu chuẩn: Hồ tan chất đối chiếu trong methanol để thu được dung dịch thử
có nồng độ khoảng 2 mg/ml.
- Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Triển
khai sắc ký đến khi dung môi đi được khoảng 6 cm, lấy bản mỏng ra để khơ
ngồi khơng khí. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm.
2.3.4. Phương pháp định lượng
2.3.4.1. Phương pháp đo quang
Khảo sát sơ bộ phổ UV-VIS của dịch chiết Xuyên tâm liên thu được các bước
sóng cực đại tại các bước sóng 663 nm, 414 nm, 292 nm, 239 nm. Bước sóng 663 nm
được lựa chọn là bước sóng đo quang do đây là bước sóng nằm trong vùng khả kiến,
đặc trưng cho chất màu chlorophyll.
Phương pháp xác định tỉ lệ chlorophyll bị loại đi được tham khảo theo tài liệu
[44], xác định theo phương pháp so màu, cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng
chlorophyll được xác định ở bước sóng 663 nm. Do đó hiệu suất loại chlorophyll được

xác định bằng tỉ lệ cường độ màu của dịch chiết trước và sau quá trình hấp phụ.
➢ Quy trình chuẩn bị mẫu
Mẫu thử dịch chiết ban đầu: Hút chính xác 1 ml dịch chiết cho vào bình định
mức 25 ml, sau đó dùng ethanol 96% để định mức, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng
663 nm.
Mẫu thử dịch sau khi đã thêm chất hấp phụ: chuẩn bị như ở mục 2.3.2, pha lỗng
ở nồng độ thích hợp, đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 663 nm.
Hiệu suất loại chlorophyll của các chất hấp phụ trong mẫu được tính như sau:
𝑘1 × 𝐴o −𝑘2 × 𝐴
Y1 (%) =
𝑘1 × 𝐴o
Trong đó: A0 là độ hấp thụ của dịch chiết ban đầu sau pha loãng
k1, k2 lần lượt là độ pha loãng của dịch chiết ban đầu, dịch sau tinh chế
A là độ hấp thụ của dịch tinh chế sau pha loãng
2.3.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
a. Xây dựng phương pháp định lượng
15


Tiến hành phép định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau:
➢ Điều kiện sắc ký
- Pha tĩnh: Ct pha tnh C18 (250 ì 4,6 nm, 5 àm)
- Pha động: methanol – acid phosphoric 0,1%, theo chương trình rửa giải gradient sau
Bảng 2.2 Chương trình dung mơi pha động
Thời gian – phút

Methanol
(%, tt/tt)

Acid phosphoric 0,1%

(%, tt/tt)

0 – 10

60

40

10 – 20

70

30

20 – 25

60

40

- Tốc độ dòng pha động: 1 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl
- Detector DAD bước sóng: 225 nm
➢ Quy trình chuẩn bị mẫu định lượng andrographolid tinh khiết
Mẫu chuẩn: Lấy chính xác 0,010 g andrographolid đối chiếu cho vào bình định
mức 100 ml sau đó thêm ethanol 96% hịa tan hết lượng đó, định mức 100 ml bằng
cùng dung mơi.
Mẫu thử: Lấy chính xác 0,010 g andrographolid sản phẩm của quy trình cho
vào bình định mức 100 ml sau đó thêm ethanol 96% để hịa tan hết, định mức 100 ml
bằng cùng dung môi, lắc đều sau đó lọc qua màng 0,45 μm và phân tích HPLC; xác

định hàm ẩm của AND bằng máy cân sấy ẩm.
➢ Quy trình chuẩn bị mẫu kiểm nghiệm dược liệu
Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1,000 g bột dược liệu (cành hoặc lá) (rây qua rây
số 125) cho vào bình nón có nút mài dung tích 100 ml, thêm chính xác 20 ml ethanol
96%, chiết đến kiệt hoạt chất có trong dược liệu (chiết ít nhất 3 lần, mỗi lần 30 phút).
Lọc, gộp các dịch lọc. Lọc lấy dịch chiết, rửa giấy lọc bằng ethanol 96%, gộp dịch lọc
và dịch rửa. Cơ dưới áp suất giảm đến cắn. Hịa tan cắn trong ethanol 96% với tỉ lệ
thích hợp, dùng dịch này để định lượng andrographolid bằng phương pháp HPLC.
➢ Quy trình chuẩn bị mẫu xác định hiệu suất thu hồi andrographolid
Mẫu thử dịch chiết ban đầu: Lấy chính xác 2 ml dịch chiết cho vào bình định
mức 25 ml rồi định mức đến vạch bằng ethanol 96%. Lắc đều, lọc qua màng 0,45 μm
và định lượng.
Mẫu thử dịch sau tinh chế: Lấy chính xác 2 ml dịch sau khi đã được loại tạp
màu cho vào bình định mức 25 ml rồi định mức đến vạch bằng ethanol 96%. Lắc đều,
lọc qua màng 0,45 μm và định lượng.
Mẫu trắng: ethanol 96%.
16