Khảo sát thành phần hoá học, hoạt tính enzyme, khả năng tiêu hoá cùa ba 3 loại hạt nguyên liệu kê trắng, kê vàng, kê đỏ

BỘ CƠNG THƯƠNG
ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: Khảo sát thành phần hố học, hoạt tính enzyme, khả năng tiêu hoá cùa
ba (3) loại hạt nguyên liệu: kê trắng, kê vàng, kê đỏ

Mã số đề tài: 21/1SHTPSV05
Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Hữu Hiếu
Đơn vị thực hiện: Viện công nghệ Sinh học và Thực Phẩm


LỜI CÁM ƠN
Cảm ơn Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ kinh phí
cho đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên mã số 21/1SHTPSV05, đồng cảm ơn Viện
Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về trang thiết bị để
chúng tơi hồn thành nghiên cứu này.
Chúng em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hà Diệu Trang đã tận tình giúp đỡ,
định hướng cách tư duy và cách làm việc khoa học. Đó là những góp ý hết sức q
báu khơng chỉ trong q trình thực hiện nghiên cứu này mà còn là hành trang tiếp
bước cho em trong quá trình học tập và lập nghiệp sau này.
Chúng em xin chân thành cảm ơn!

1


PHẦN I.

THƠNG TIN CHUNG

I. Thơng tin tổng qt
1.1. Tên đề tài: Khảo sát thành phần hố học, hoạt tính enzyme, khả năng tiêu hoá
cùa ba (3) loại hạt nguyên liệu: kê trắng, kê vàng, kê đỏ
1.2. Mã số:21/1SHTPSV05
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT
1

Họ và tên
(học hàm, học vị)

Đơn vị cơng tác

Vai trị thực hiện đề tài

Nguyễn Hữu Hiếu
(sinh viên)

Viện công nghệ Sinh
Học và Thực Phẩm

Chủ nhiệm đề tài

1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm
1.5. Thời gian thực hiện:
1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 3 năm 2021 đến tháng 3 năm 2022
1.5.2. Gia hạn (nếu có):

đến tháng….. năm…..

1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng….. năm…… đến tháng….. năm…..
1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng
(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện;
Nguyên nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)
1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 10.000.000 VND (mười triệu
đồng)
II.Kết quả nghiên cứu
1. Đặt vấn đề
Hạt kê được coi là một trong những loại ít dị ứng nhất, trong hầu hết các loại ngũ cốc
có thể tiêu hóa được và là loại ngũ cốc làm ấm vì vậy nó giúp làm nóng cơ thể vào
mùa lạnh hoặc mưa. Tuy nhiên, việc sử dụng hạt kê bị hạn chế do bản chất của hạt.
Nó có hàm lượng chất xơ cao và bên ngồi lớp vỏ của hạt dày, chế biến khó, cho chất
lượng cảm quan kém và quan trọng nhất là khó tiêu hóa nên con người khơng lựa
chọn hạt kê là thực phẩm trong bữa ăn mà thường được sư dụng làm thức ăn cho chim.
Ngoài ra, thiếu nguồn đầu ra và phát triển sản phẩm dẫn đến hạt kê chưa được đánh
giá đúng giá trị kinh tế của nó cả về sản xuất và tiêu dùng [1]. Ngoài ra, ở khu vực
miền tây nước ta vừa qua đã xảy ra tình trạng hạn hán, khơng có nguồn nước để tưới

2


tiêu dẫn đến mất mùa thiệt hại rất lớn cho người dân. Hạt kê là một loại nông sản này
được ưa thích nhờ có năng suất cao và vụ mùa ngắn thích hợp trồng ở điều kiện khơ
cằn, nhiệt độ cao. Một trong những vấn đề của an ninh lương thực trên thế giới là giải
quyết vấn đề về lương thực cho dân số tăng lên 9 tỷ người vào năm 2050 và cung cấp
nguồn lương thực giàu dinh dưỡng cho những địa phương thường xuyên xảy ra thiên
tai. Do tác động của biến đổi khí hậu và nước biển dâng, nơng nghiệp Việt Nam có
nguy cơ giảm 7,2 triệu tấn lúa và ảnh hưởng đến 32,2% diện tích đất nơng nghiệp vào

cuối thế kỷ 21 [2]. Do đó, hiện trạng này đặt ra nhu cầu cần phải sản xuất ra được
nhiều lương thực hơn trên cơ sở tài nguyên thiên nhiên ngày càng cạn kiệt để đảm
bảo khả năng tiếp cận lương 2 thực công bằng hơn cho mọi người dân. Vì cây kê là
loại cây trồng chịu hạn tốt, mang lại năng suất cao và cây trồng tiềm năng cho biến
đối khí hậu. Ở Việt Nam, hạt kê là nguồn nguyên liệu chứa rất nhiều chất dinh dưỡng,
không có gluten, cây trồng dễ, năng suất cao và chịu hạn tốt [1]. Tuy nhiên, hạt kê
chưa được nhiều người biết đến và sử dụng rộng rãi. Ngoài ra, về bản chất thành phần
của hạt theo nhiều nghiên cứu, hạt kê là loại hạt có chứa thành phần khó tiêu hóa
2. Mục tiêu
2.1. Mục tiêu tổng quát
Mục tiêu của đề tài là khảo sát và rút ra được các thông số ban đầu về thành phần hóa
học, hoạt tính enzyme, và khả năng tiêu hóa của ba loại hạt kê: kê proso trắng, kê
đi chồn vàng và kê ngón tay đỏ trồng tại Việt Nam, Mỹ và Châu Á. Kết quả của đề
tài nghiên cứu này thu nhận được nhờ vào thực nghiệm trên hạt kê nguyên liệu có thể
phục vụ cho sự so sánh về sự thay đổi của hạt kê trước khi hạt được nảy mầm và đồng
thời cung cấp thơng tin hữu ích cho ngành cơng nghiệp thực phẩm khi xây dựng các
sản phẩm từ hạt kê, nhằm mục địch tăng tiềm năng và giá trị sử dụng của nguồn lương
thực cao lương này.
2.2. Mục tiêu cụ thể.
- Xác định thành phần hóa học đa lượng và vi lượng của ba loại hạt kê
- Xác định hoạt tính enzyme của ba loại hạt kê

3


- Xác định khả năng tiêu hóa protein của ba loại hạt kê
- Xác định biến sự đặc trưng và mối liên hệ giữa các chỉ tiêu chất lượng (mục tiêu
1,2,3) và ba loại hạt kê
- Xác định sự phân bố nhóm khi so sánh tổng quát ba loại hạt kê
3. Phương pháp nghiên cứu

3.1. Phương pháp hóa lý
3.1.1. Xác định độ ẩm: theo TCVN 9934:2013 [23]
3.1.1.1. Quy trình
Đối với sản phẩm đã được nghiền thì cân nhanh tất cả phần nghiền thu được cho vào
cốc đã được làm khô và cân trước, cùng với nắp, chính xác đến 0,2 mg, cân khoảng
1g mẫu ghi lại khối lượng. Đặt cốc chứa mẫu vào tủ sấy, nhiệt độ 105 ̊ C với thời gian
sấy 2 giờ.
Sau 2 giờ, lấy cốc để vào bình hút ẩm trong 3 phút để cốc giảm nhiệt lượng, cân cốc
chính xác đến 0,2 mg. Lặp lại các thao tác quy định ở trên cho đến khi thu được khối
lượng không đổi (nghĩa là cho đến khi chênh lệch giữa hai lần cân liên tiếp nhỏ hơn
0,6 mg).
3.1.1.2. Cơng thức tính tốn

Trong đó:
m0 là khối lượng của đĩa rỗng và nắp đã được sấy, tính bằng gam (g).
m1 là khối lượng của đĩa cùng với phần mẫu thử và nắp trước khi sấy, tính bằng gam
(g).
m2 là khối lượng của đĩa cùng với phần mẫu thử và nắp sau khi sấy, tính bằng gam
(g).

4


3.1.2. Xác định hàm lượng tro: bằng phương pháp nung theo TCVN
8124:2009 và ISO 712 [24]
3.1.2.1. Quy trình
Cân khoảng 10 - 20g mẫu trong cốc nung. Đốt trên bếp điện để than hoá. Nung ở
nhiệt độ 500 ̊ C cho đến khi thu được tro màu trắng ngà (khi có mặt sắt sẽ có màu đỏ
gạch, có mặt đồng và mangan có màu xanh nhạt).
Làm nguội trong bình hút ẩm. Quá trình nung được lặp lại cho đến khi cốc nung có

khối lượng khơng đổi. Để tăng nhanh q trình tro hố có thể cho vào cốc chứa tro
(đã nguội) 3 - 5 giọt hydroperoxit 5%, sau đó tiến hành như trên
3.1.2.2. Cơng thức tính tốn

Trong đó:
m - lượng mẫu cân (g).
m1 - khối lượng cốc nung (g).
m2 - khối lượng cốc nung và tro (g).
3.1.3. Xác định hàm lượng protein: theo TCVN 10385:2014 [25].
3.1.3.1. Quy trình
Vơ cơ hố mẫu bột hạt kê thành dạng lỏng. Dùng pipet lấy 10 ml mẫu thử (Vs) cho
vào bình Kjeldahl và chuyển vào bình vài viên trợ sơi. Làm nóng nhẹ bằng cách để
trong hoặc trên thiết bị thủy phân cho đến khi mẫu thử có màu đen nhưng khơng làm
bay hơi đến khơ hồn tồn. Để nguội.
Dùng 4 ml axit suifuric đậm đặc cho một gam chất rắn hòa tan mà chủ yếu là đường
để tính hàm lượng chất rắn hịa tan của mẫu thử từ tỷ trọng tương đối xác định được
trong TCVN 8907 (EN 1131).
Sau khi nguội, chuyển vào bình Kjeldahl lượng axit sulfuric đậm đặc tính được cộng
với 1 ml dư. Thêm 0,9 g hỗn hợp chất xúc tác và hạt selen dioxit.
Làm nóng nhẹ lại trên hoặc trong thiết bị thủy phân, sau đó đun sơi cho đến khi dung
dịch trong và thường xuyên lắc bình cho đến khi khơng có hạt ngun liệu nào dính
trên cổ bình. Sau đó, giữ chất lỏng sơi tiếp trong 60 phút. Để nguội đến nhiệt độ
phòng. Thêm cẩn thận khoảng 35 ml nước. Trộn và để nguội lại.

5


Chưng cất
Chuyển vào bình nón 30 ml dung dịch axit boric và một hoặc hai giọt dung dịch chất
chỉ thị. Trộn. Đặt bình nón dưới bình ngưng sao cho đầu ra của ống ngập trong dung

dịch axit boric. Chuyển lượng chứa trong bình Kjeldahl vào thiết bị chưng cất. Dùng
ống đong bổ sung 20 ml dung dịch natri hydroxit.
Chưng cất để thu được khoảng 100 ml dịch chưng cất trong khoảng 4 phút đến 5 phút.
Đảm bảo rằng dịch chưng cất được làm nguội hiệu quả và nhiệt độ của lượng chứa
trong bình nón khơng vượt q 25 °C trong suốt quá trình chưng cất. Khoảng 30s
trước khi kết thúc q trình chưng cất, hạ thấp bình nón sao cho đầu ra của ống không
bị nhúng sâu trong dung dịch axit và tráng đầu ống bằng một lượng nhỏ nước.
Chuẩn độ: Chuẩn độ dịch chưng cất trong bình nón, sử dụng dung dịch chuẩn cho
đến khi chất chỉ thị đổi sang màu hồng. Ghi lại thể tích (V) của axit sulfuric hoặc axit
clohydric tiêu tốn.
3.1.3.2. Cơng thức tính tốn

Trong đó:
Biểu thị hàm lượng nitơ, rN của mẫu thử đến số nguyên. Đơn vị (mg/l), đổi sang (%)=
(mg/l) /10.000
V là thể tích, dung dịch axit sulfuric hoặc dung dịch axit clohydric cần cho phép xác
định, tính bằng mililit (ml);
Vs là thể tích của phần thử, tính bằng mililit (ml).
Cần tính đến hệ số pha loãng và mối liên hệ với khối lượng hoặc thể tích. Nếu mẫu
cơ đặc đã được pha lỗng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) thì ghi lại tỷ trọng
tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó.

6


3.1.4. Xác định hàm lượng lipid: Phương pháp hydrolysis – extraction (AOAC
996.06, Vu et al 2019) [26]
3.1.4.1. Quy trình
Cân 1 g mẫu rắn xử lý với 6 ml of 5M HCl trong ống nghiệm có nắp. Vortex mạnh
hỗn hợp 10s, và gia nhiệt trong bể nước nóng (80 ̊ C/60 phút). Lắc ống nghiệm, 10

phút lắc một lần.
Sau khi thủy phân, làm nguội ống nghiệm bằng nước. Thêm 7 ml ethyl ether vào ống
nghiệm. Lắc ống nghiệm trong 10 phút. Ly tâm (5000-6000 rpm, 5-10 phút), thu dung
môi trên sang một erlen sạch (cân erlen trước khi chuyển dung môi sang). Thêm 7 ml
ethyl ether, và lập lại quá trình trích ly thêm hai lần. Làm bay hơi dung mơi bằng khí
N2. Cân lại erlen.
3.1.4.2. Cơng thức tính tốn

Trong đó:
m - lượng mẫu cân (g).
m1 - khối lượng erlen (g).
m2 - khối lượng cốc nung và lipid trong mẫu (g).
3.1.5. Xác định cacbonhydrate: [27]
Hàm lượng cacbonhydrate (%)=100 - ( Hàm lượng % Protein + Hàm lượng % Lipid
+ Hàm lượng % Tro + Hàm lượng % Độ ẩm)
3.1.6. Xác định hàm lượng phenolic acids: [39]
3.1.6.1. Quy trình.
Free PAs
Cân 1g bột hạt, ghi chú số lượng, số cân 4 số lẻ. Loại béo bằng cách : hút 5mL Diethyl
ether vào mẫu, vortex lắc 1 phút, ly tâm 5000 rpm trong 10 phút, tách bỏ dịch trên,
thu cặn dưới. Để cặn dưới bay hơi hết dung môi, xốc mẫu lên nếu cần để dung môi
bay hết trong mẫu.
Thêm 5mL 80% MetOH, vortex, xịt khí Nitơ vào trong ống, sau đó lắc trong máy lắc
ở nhiệt độ 250C trong vòng 24h (qua đêm). Ly tâm tách dịch trên ở 5000 rmp trong
vòng 10 phút. Chỉnh pH dịch chiết xuống <2 bằng HCl đậm đặc

7


Lọc qua SPE Columns 500mg C18(EC) 3ml, gồm 4 bước:

Condition: 5 mL MeOH 100%, 3 mL DI water
Load: load hết tất cả lên cột, lặp lại 3 lần
Wash: 3 mL DI water
Elute: 2 mL MeOH 80% thu 1 mẫu
Thổi bay hơi dung mơi bằng khí Nitơ, sau đó hịa tan lại bằng 200 uL MeOH 100%,
đánh siêu âm lạnh 10 phút, hút bỏ vào vial 2mL kèm insert
Bound PAs:
Cặn sau khi ly tâm, bỏ 10 mL NaOH 2M, đánh siêu âm 400C trong 90 phút. Sau đó
xịt khí nitơ vào ống, cuốn bằng giấy bạc và để trong tối qua đêm. Chỉnh pH dịch chiết
bằng HCl đậm đặc cho pH<2.
Ly tâm tốc độ 5000 rpm trong 10 phút. Thu dịch trên.
Từ dịch trên, trích ly ba lần với ethyl acetate, mỗi lần 3-5 mL
Thu tổng dịch trên ly tâm, thổi khí nitơ để bay hơi dung mơi. Hịa tan các chất bằng
1 ml MeOH 100%, đánh siêu âm lạnh trong 10 phút, hút hết các mẫu lọc qua filter
0,45 µm vào trong vial.
Chạy HPLC bằng máy SHIMADZU LC-2030C 3D với pha A là dung dịch nước axit
formic 1%, pha C là methanol nguyên chất (HPLC grade), tốc độ dòng 0,8ml/phút,
thời gian chạy mỗi mẫu là 48 phút.Cột sử dụng là cột VertiSep GES C18 HPLC
4.6*250mm, 5µm. Bước sóng đo 275nm và 295nm.
Chạy std mix (5 nồng độ) xây dựng đường chuẩn vào mỗi ngày chạy mẫu. Chạy std
mix xong để vào tủ đơng -20°C.
Cơng thức tính tốn
à ượ
ℎ
à ượ
ℎ

(
(

/
/

) = (0,2 ∗ )/( _ â −
) = ( )/( _ â − _ẩ

Trong đó:
x là hàm lượng phenolic acids đo được trong vial, tính bằng ppm (mG/L)
m_cân

là khối lượng mẫu cân được, tính bằng gam (G)

m_ẩm là khối lượng ẩm trong mẫu cân = m_cân * %(độ ẩm)

8

_ẩ
)

)


3.2. Phương pháp hoạt tính enzyme
Đơn vị của hoạt lực hay còn gọi là hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng
xúc tác được một micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. Đơn vị: U/ml
hoặc U/g.
3.2.1. Xác định hoạt tính enzyme α-amylase [28]
3.2.1.1. Nguyên tắc
Dựa trên sự thủy phân của tinh bột bởi enzyme α-amylase thành dextrin có phân tử
lượng khác nhau trong điều kiện thí nghiệm.

Định nghĩa đơn vị
Một đơn vị hoạt độ tương ứng với 1,0 mg maltose được giải phóng từ quá trình thủy
phân tinh bột trong 30 phút ở pH 5,0 ở 35°C.
Quy trình
Tách chiết enzyme thơ: Tiến hành cân 1g mẫu bột vào bình định mức 10ml, định mức
lên 10ml bằng dung dịch đệm 50 mM acetate pH 5,0. Lắc đều và vortex trong 1 phút.
Đem ly tâm 3000 rpm trong 10 phút, phần nổi bên trên là phần dịch chiết enzyme
amylase thơ được sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.
Quy trình thực hiện thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme amylase
Bảng 1. Quy trình thực hiện thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme amylase
Mẫu thử
Dịch mẫu

Mẫu trắng
0,5ml (đun sôi trong 15
phút – bất hoạt enzyme)

Để nguội
Dung dịch tinh bột 1%
0,5ml (ủ lạnh trong 3-4
phút)
Dịch mẫu
0,5ml
Để trong bể ổn nhiệt ở 35 ̊ C, t=30 phút
Dung dịch Acid
0,5ml
dinitrosalicylic (DNS)
Đun trong nước sôi trong 15 phút
Nước cất
9ml

Lắc đều
Đem đi đo quang ở bước sóng 540nm

9

0,5ml

0,5ml

9ml


Bảng 2. Xây dựng đường chuẩn amylase
Lượng dung dịch
glucose 0.2% (µL)
50
100
200
300
400

Lượng nước cất thêm vào (µL)

Lượng DNS (ml)

950
900
800
700
600

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

Cơng thức tính tốn

Trong đó:
x1: độ hấp thụ đã được tính dựa trên đường chuẩn của mẫu
x2: độ hấp thụ đã được tính dựa trên đường chuẩn của mẫu trắng
F: hệ số pha lỗng
a: khối lượng mẫu (g)
3.2.2.
Xác định hoạt tính enzyme cellulase [29]
Định nghĩa đơn vị
Đơn vị hoạt tính cellulase/xylanase (U/ml) được xác định như là lượng enzyme phân
giải tạo ra lượng đường khử tương đương với 1 µL glucose/xylose trong một phút ở
điều kiện 37 ̊ C. Đơn vị tính: U/ml hoặc U/g.
Quy trình
Tách chiết enzyme thơ: Tiến hành cân 1 g mẫu bột vào bình đinh mức 10 ml, định
mức lên 10 ml bằng dung dịch đệm. Nếu khơng có bình định mức thì đong 9 ml dung
dịch vào erlen đựng mẫu, vortex 1 phút, lắc đều. Đem ly tâm 3000 rpm trong 10 phút,
hút pha trên để đi phân tích, gọi này là dịch chiết.
Bảng 3. Quy trình thực hiện thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme cellulase
Mẫu thử
Dịch mẫu
Để nguội

10

Mẫu trắng
0,5ml (đun sôi trong 15
phút – bất hoạt enzyme)


Dung dịch Carboxymethyl
Cellulose (CMC) 1%

0,5ml (ủ lạnh trong 34 phút)
Dịch mẫu
0,5ml
Để trong bể ổn nhiệt ở 37 ̊ C, t=60 phút
Dung dịch Acid
0,5ml
dinitrosalicylic (DNS)
Đun trong nước sôi trong 15 phút
Nước cất
9ml
Lắc đều
Đem đi đo quang ở bước sóng 540nm

0,5ml

0,5ml

9ml

Bảng 4.Xây dựng đường chuẩn hàm lượng glucose bằng thuốc thử DNS

Lượng dung dịch glucose 0.2%
(µL)

Lượng DI water thêm
vào (µL)

Lượng DNS (ml)

50

950

0,5

100
200
300
400

900
800
700
600

0,5
0,5
0,5
0,5

Cơng thức tính tốn

Trong đó:
x1: độ hấp thụ đã được tính dựa trên đường chuẩn của mẫu
x2: độ hấp thụ đã được tính dựa trên đường chuẩn của mẫu trắng
F: hệ số pha lỗng
3.2.3.
Xác định hoạt tính enzyme Enzyme protease [30]
Định nghĩa đơn vị
Đơn vị hoạt độ Enzyme protease tương ứng với một micromol tyrosine (0,181 mg)
được tạo thành sau phản ứng phân giải protein bởi enzyme Enzyme protease có trong
dịch chiết ở điều kiện ở 37 ̊ C trong thời gian 30 phút. Đơn vị tính: U/ml hoặc U/g

11


Quy trình
Bật bể ổn nhiệt ở 37 C
̊ . Để đá lạnh vào trong thùng xốp để làm lạnh tất cả hóa chất,
mẫu.
Cân 1g mẫu bột vào bình định mức 10mL, định mức lên 10mL bằng dung dịch đệm.
Nếu không có bình định mức thì đong 9mL dung dịch vào erlen đựng mẫu, vortex 1
phút, lắc đều. Đem ly tâm 3000 rpm trong 10 phút, hút pha trên để đi phân tích, gọi
này là dịch chiết.
Hút 5mL dung dịch casein 1% vào ống nghiệm có nắp, để trong bể ổn nhiệt 37 ̊ C
trong 5 phút, bỏ tiếp 1 mL dung dịch chiết, vortex/lắc đều, và để trong bể ổn nhiệt ở
37 C
̊ trong vịng chính xác 30 phút.
Lấy ra và bỏ 5 mL dung dịch Acid Tricloacetic (TCA) 5%, vortex 1 phút. Lọc bằng
giấy lọc, thu dịch lọc để đi phản ứng tạo màu. Hút 1 mL dịch lọc, thêm 2 mL NaoH
0,5 N, sau đó thêm 0,6 mL thuốc thử Folinifer Ciocalteu (FCR). Lưu ý là bỏ thuốc

thử Folin cùng lúc với dịch chuẩn Tyrosine. Lắc đều, để yên 10 phút. Đi đo độ hấp
thu ở bước sóng 540nm.
Mẫu trắng: đun sôi, để nguội cho casein vào, đem đi ủ cùng lúc với mẫu ở nhiệt độ
37 C
̊ , tương tự làm theo mẫu.
Bảng 5.Quy trình thực hiện thí nghiệm khảo sát hoạt tính enzyme Enzyme protease
V (ml)
Dịch chiết

Mẫu thử
1ml

Mẫu trắng
1ml (đun sôi, bất hoạt
enzyme)
Dung dịch casein 1%
5ml (để trong bể ổn
Dung dịch chiết nguội –
nhiệt 37 C
̊ , t=5 phút)
5ml
Để trong bể ổn nhiệt 37 C
̊ , t=30 phút
Dung dịch Acid
5ml
5ml
Tricloacetic 5%
Vortex 1 phút, đem đi lọc lấy dịch
Dịch lọc
1ml

1ml
NaOH 0,5N
2ml
2ml
Thuốc thử Folin
0,6ml
0,6ml
Nước cất
7,4ml
7,4ml

12


Lắc đều, để yên trong 10 phút
Đem đi đo quang ở bước sóng 540nm
Bảng 6.Xây dựng đường chuẩn của tyrosin
Lượng dung
dịch tyrosin
1mM)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1

Lượng HCl
0,2 N (ml)

Lượng NaOH
0,5 N (ml)

Folin (ml) –
để cuối cùng

Nước cất (ml)

1
0,8
0,6
0,4
0,2
0

2
2
2
2
2
2

0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6

6,4

6,4
6,4
6,4
6,4
6,4

Cơng thức tính tốn

Trong đó:
x1: độ hấp thụ đã được tính dựa trên đường chuẩn của mẫu
x2: độ hấp thụ đã được tính dựa trên đường chuẩn của mẫu trắng
F: hệ số pha loãng
a: khối lượng mẫu (g)

3.3. Xác định khả năng tiêu hố [31]
Quy trình
Hịa bột hạt kê trong 50mL nước đến nồng độ cuối cùng là 6,25 mg protein thô/ mL
(hoặc 1 mg N / mL), và khuấy trong 60 phút ở 37 ºC.
Chuẩn bị dung dịch trypsin (1,6 mg / mL) trong nước và điều chỉnh pH đến 8,0. Bảo
quản trên đá. Điều chỉnh pH của dịch mẫu đến 8,0 với 0,1 N NaOH.
Thêm 5 mL dung dịch trypsin và bắt đầu hẹn giờ. Ghi lại pH sau chính xác 10 phút.
Mẫu chuẩn thích hợp có thể là bột mì hoặc casein
Cơng thức tính tốn
.% ỷ ệ ê ℎó

= 210,4 − 18,1 ∗

13

ố

ù


3.4. Phương pháp phân tích thống kê
3.4.1.1. Phân tích phương sai (ANOVA) 1 yếu tố :
Phân tích phương sai là phương pháp phân tích sự ảnh hưởng của một yếu tố nguyên
nhân (định tính) đến một yếu tố kết quả (định lượng) . Phân tích phương sai là phương
pháp kiểm định sự bằng nhau của trung bình tổng thể với mức ý nghĩa thống kê nhất
định.
3.4.1.2. Phân tích thành phần chính (PCA)
Phân tích thành phần chính (Principal Component Analysis-PCA) là kĩ thuật biểu
diễn số liệu dựa theo các tiêu chuẩn về đại số và hình học mà khơng địi hỏi một giả
thuyết thống kê hay mơ hình đặc biệt nào, thường được sử dụng khi làm việc với các
dataset nhiều chiều. PCA giúp làm giảm số chiều thường rất lớn của dữ liệu mà vẫn
giữ lại được các thông tin cần thiết của bộ dữ liệu ban đầu. [39]
3.4.1.3. Phân tích Phân cụm phân cấp (Hierarchical clustering)
Phân cụm phân cấp là một thuật tốn chia nhóm các đối tượng dữ liệu thành từng
cụm (cluster) để các đối tượng trong cùng một cụm có sự tương đồng theo một tiêu
chí nào đó. Kết quả là một tập hợp các cụm, trong đó mỗi cụm khác biệt với từng
cụm khác, và các đối tượng trong mỗi cụm tương tự nhau.
3.4.1.4. Phần mềm phân tích R
Phần mềm R là một ngơn ngữ lập trình và mơi trường phần mềm dành cho tính tốn
và đồ họa thống kê. Phần mềm R hỗ trợ phân tích và xử lí dữ liệu cơ bản như: phân
tích so sánh nhóm với các biến liên tục (t test, ANOVA), phân tích tương quan (PCA,
Clustering).
3.4.1.5. Phần mềm phân tích Statgraphics Centurion XV
Statgraphics Centurion XV là phần mềm được sử dụng phổ biến trong phân tích thống
kê: phân tích và tính tốn các đặc trưng mẫu, so sánh các trung bình mẫu và phân tích
phương sai, , vẽ sơ đồ và đồ thị quan hệ.

14


4.

Tổng kết về kết quả nghiên cứu

4.1. Kết quả thành phần hoá học
4.1.1. Thành phần hoá học đa lượng
Bảng 7.Thành phần hoá học đa lượng của nguyên liệu

Chỉ tiêu
Tro (%)
Crude fat (%)
Độ ẩm (%)
Crude protein (%)
Carbohydrate (%)

Loại hạt kê
Kê ngón tay đỏ
DN
DL
3,51ᶜ±0,02
3,47ᶜ±0,02
2,57ᵃ± 0,06
3,22ᵇ±0,01
4,19ᵇ±0,01 3,17ᵃ± 0,17
7,71ᶜ± 0,19
4,54ᵇ±0,04

5,88ᶜ±0,02
5,82ᶜ±0,02
4,30ᵃ± 0,06
4,74ᵇ±0,01
11,35ᵇ±0,07 12,75ᶜ± 0,07 10,55ᵃ±0,21 10,55ᵃ± 0,21
75,08ᵇ±0,01 74,80ᵃ± 0,15 74,88ᵃᵇ±0,06 76,96ᶜ±0,08
T

V

Different lowercase letters in the same row indicate a statistically significant difference
(ρ<0,05)
Bảng thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái a, b, c, d khác nhau biểu thị sự
khác biệt theo hàng của các loại hạt kê với mức ý nghĩa thống kê p-value < 0,05
.

Bảng 8 cho thấy tồn tại sự khác biệt có ý nghĩa về hàm lượng tro giữa các mẫu hạt
mà nhóm nghiên cứu (p-value < 0,0001). Ngồi ra, hàm lượng tro trung bình của hạt
kê sử dùng trong nghiên cứu này là từ 2,57% đến 3,51% tương đồng so với kết quả
nghiên cứu của John R.N. Taylor và cộng sự (2017) nằm trong khoảng 0,8% đến 8,8%
[32].
Bảng 8 cho thấy tồn tại sự khác biệt có ý nghĩa về hàm lượng béo thơ giữa các mẫu
hạt mà nhóm nghiên cứu (p-value = 0,0004). Ngồi ra, hàm lượng béo thơ trung bình
của hạt kê sử dùng trong nghiên cứu này là từ 3,17% đến 7,71% tương đồng so với
kết quả nghiên cứu của John R.N. Taylor và cộng sự (2017) nằm trong khoảng 1,6%
đến 9,3%.
Bảng 8 cho thấy sự khác biệt về hàm lượng độ ẩm giữa các mẫu hạt là có ý nghĩa (p
= 0,0002). Ngồi ra, hàm lượng ẩm trung bình của hạt kê sử dùng trong nghiên cứu
này là từ 4,30% đến 5,88% không tương đồng so với kết quả nghiên cứu của S. D.
Anusha và cộng sự (2020) nằm trong khoảng 10,32% đến 10,76% [33].

Bảng 8 cho thấy sự khác biệt về hàm lượng đạm thơ giữa các mẫu hạt là có ý nghĩa
(p-value = 0,0004). Ngồi ra, hàm lượng đạm thơ trung bình của hạt kê sử dùng trong

15


nghiên cứu này là từ 10,55% đến 12,75% không tương đồng so với kết quả nghiên
cứu của John R.N. Taylor và cộng sự (2017) nằm trong khoảng 4,9% đến 17%.
Bảng 8 cho thấy tồn tại sự khác biệt có ý nghĩa về hàm lượng cacbonhydrate giữa các
mẫu hạt mà nhóm nghiên cứu (p-value = 0,0001). Ngoài ra, hàm lượng cacbonhydrate
trung bình của hạt kê sử dùng trong nghiên cứu này là từ 74,80% đến 76,96% tương
đồng so với kết quả nghiên cứu về John R.N. Taylor và cộng sự (2017) nằm trong
khoảng 63% đến 82%.
4.1.2. Thành phần phenolic acids

Hình 1.Sắc ký đồ HPLC của các chất phenolic tiêu chuẩn của dung dịch có 10
µg/mL của mỗi chất phân tích tại bước sóng 275 nm

Hình 2.Sắc ký đồ HPLC của các chất phenolic tiêu chuẩn của dung dịch có 10 µg/mL
của mỗi chất phân tích tại bước sóng 295 nm

16


Bảng 8. Retention times of phenolic peaks .- Thông số thời gian lưu HPLC của các
chất axit phenolic tiêu chuẩn
ID#
1
2
3

4
5
6
7
8

Name
gallic acid
cinnamic acid
chlorogenic
acid
caffeic acid
coumaric acid
ferulic acid
2,4
dihydroxybenzoic
acid
salicylic acid

Ret.time
4,929
23,476

Area
323543
945373

Height
33530
109175

Conc.
9,742
8,935

Unit
mg/L
mg/L

10,224
12,3
16,061
17,004

354797
648210
883593
834118

40790
88369
85081
83421

9,598
9,71
10,171
10,579

mg/L

mg/L
mg/L
mg/L

18.83
21,255

174508
157554

24871
22218

9,754
9,396

mg/L
mg/L

17


18

Different lowercase letters in the same row indicate a statistically significant difference (ρ<0,05)
Bảng thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái a, b, c, d khác nhau biểu thị sự khác biệt theo hàng của các loại hạt kê với mức ý nghĩa thống
kê p-value < 0,05

Pas: phenolic acids; GA là gallic acid; CiA là cinnamic acid; CA là caffeic acid; CoA là coumaric acid; FA là ferulic acid; BA là 2-4 dihydroxybenzoic;
SA là salicylic acid; TPC: Total Polyphenol Compound

Bảng 9.Thông số kết quả phenolic acids của mẫu hạt kê nguyên liệu (mg/kg mẫu khô)


Bảng 10 cho thấy tồn tại sự khác biệt có ý nghĩa về hàm lượng trung bình của các phenolic
acid (dạng tự do và dạng liên kết) giữa các mẫu hạt mà nhóm nghiên cứu (p-value = 0,0284
đối với chlorogenic acid và p-value <0,0001 đối với các phenolic axit còn lại). Hàm lượng
PAs dạng liên kết (bound) chiếm chủ yếu trong hạt.
Bảng 10 cho thấy hàm lượng riêng trung bình và hàm lượng tổng trung bình các free phenolic
của hạt kê sử dùng trong nghiên cứu này là từ 0,01 đến 1,89 (mg/kg) và 0,82 đến 2,42 (mg/kg),
ít tương đồng vì thấp hơn so với kết quả nghiên cứu về ngũ cốc lương thực của Maria N. Irakli
và cộng sự (2012) nằm trong khoảng 0,07 đến 11,78 (mg/kg) đối với hàm lượng riêng các
free phenolic acids trung bình và 5,2 đến 56,18 (mg/kg) [36].
Bảng 10 cho thấy hàm lượng riêng trung bình và hàm lượng tổng trung bình các bound
phenolic acids của hạt kê sử dùng trong nghiên cứu này là từ 0,26 đến 348,27 (mg/kg) và
386,22 đến 701,35 (mg/kg) ít tương đồng vì thấp so với kết quả nghiên cứu về ngũ cốc lương
thực của Maria N. Irakli và cộng sự (2012) nằm trong khoảng 2,95 đến 1032,81 (mg/kg) đối
với hàm lượng riêng các bound phenolic acids trung bình và 128,60 đến 1776,09 (mg/kg).
Bảng 10 cho thấy hàm lượng riêng trung bình và hàm lượng tổng trung bình free phenolic
acids thấp hơn so với các bound phenolic acids. Bảng 10 cho thấy khơng tồn tại sự khác biệt
có ý nghĩa về hàm lượng tổng trung bình các phenolic acid giữa các mẫu hạt mà nhóm nghiên
cứu (p-value = 0,5467). Đồng thời, hàm lượng tổng trung bình các phenolic acid của hạt kê
sử dùng trong nghiên cứu này là từ 388,11 đến 702,17 (mg/kg) ít tương đồng so với kết quả
nghiên cứu về ngũ cốc lương thực của Sergio O. Serna-Saldivar và cộng sự (2020) nằm trong
khoảng 900 đến 2000 (mg/kg).

4.2. Thành phần enzyme
Bảng 10.Thành phần enzyme nguyên liệu
Loại hạt
Chỉ tiêu

Cellulase(U/g)
Amylase(U/g)
Protease(U/g)

T

V

Kê ngón tay đỏ
DN
DL
1,016ᵈ±0,008 0,492ᶜ±0,008 0,453ᵇ±0,001 0,319ᵃ±0,001
982,6ᵇ±1,0
868,6ᵃ±0,4
926,3ᵇ±15,7
913,1ᵃ±6,0
0,001ᵃ±0,000 0,005ᶜ±0,000 0,004ᵇ±0,000 0,001ᵃ±0,001

Different lowercase letters in the same row indicate a statistically significant difference
(ρ<0,05)
19


Bảng thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái a, b, c, d khác nhau biểu thị sự
khác biệt theo hàng của các loại hạt kê với mức ý nghĩa thống kê p-value < 0,05
Bảng 11 cho thấy tồn tại sự khác biệt có ý nghĩa về hoạt tính enzyme amylase giữa các mẫu
hạt mà nhóm nghiên cứu (p-value = 0,0061). Ngồi ra, hoạt tính enzyme amylase trung bình
của hạt kê sử dùng trong nghiên cứu này là từ 868,6 đến 982,6(U/g) không tương đồng vì thấp
hơn so với kết quả nghiên cứu của Abir Sarker và cộng sự (2015) khoảng 1269,5 (U/g) [34]
Bảng 11 cho thấy tồn tại sự khác biệt có ý nghĩa về hoạt tính enzyme cellulase giữa các mẫu

hạt mà nhóm nghiên cứu (p-value < 0,0001). Bảng 11 cho thấy tồn tại sự khác biệt có ý nghĩa
về hoạt tính enzyme protease giữa các mẫu hạt mà nhóm nghiên cứu (p-value = 0,0004).
Ngồi ra, hoạt tính enzyme protease trung bình của hạt kê sử dùng trong nghiên cứu này là từ
0,001 đến 0,005(U/g) khơng tương đồng vì thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của Savitha
Gujjaiah và cộng sự (2013) nằm trong khoảng 0,1 - 0,5 (U/g) [35].

4.3. Khả năng tiêu hố protein
Bảng 11.Thơng số khả năng tiêu hố protein của mẫu hạt kê nguyên liệu
Loại hạt
Chỉ tiêu

T

V

PD %

76,776

65,774

Kê ngón tay đỏ
DN
DL
71,950
68,231

Bảng 12 cho thấy khả năng tiêu hoá của hạt kê sử dùng trong nghiên cứu này là từ 65,774 đến
76,776 (%) khơng tương đồng vì cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Sergio O. SernaSaldiv và cộng sự (2020) nằm trong khoảng 59,9 đến 68,5 (%) [37]. Sự khác biệt có thể do
số liệu chưa khách quan vì chưa có lần lặp.

4.4. Phân tích thành phần chính PCA
Sự phân bố của các mẫu hạt kê và các chỉ tiêu chất lượng trên cùng mặt phẳng tương quan
giữa thành phần chính thứ 1 và thứ 2.

20


Hình 3.Biểu đồ phân bố vị trí hình chiếu của các cụm mẫu hạt kê trên mặt phẳng

21


Hình 4.Vịng trịn tương quan phân bố và biểu diễn các biến trên mặt phẳng chính

Bảng 12.Sự tương quan có nghĩa của các biến với dim 1

Chỉ tiêu
Độ ẩm
Tro
Chất đạm (protein)
Chất béo (lipid)

Chỉ số tương
quan
0,9543721
0,9400129
0,8483628
-0,9444553

p.value
0,0002294298
0,0005156639
0,0077555193
0,0004107695

Bảng 13.Sự tương quan có nghĩa của các biến với dim 2

22

Sự tương
quan
Thuận
Thuận
Thuận
Nghịch


Chỉ số tương
p.value
Sự tương
Chỉ tiêu
quan
quan
Enzyme protease
0,8998751
0,002324711
Thuận
Cacbonhydrate
-0,7628543

0,027692711
Nghịch
Trên hình 4 các cặp biến V(1)-V(2), T(1)-T(2), DN(1)-DN(2), DL(1)-DL(2) nằm ở 4 góc
phần tư khác nhau của mặt phẳng chính chứng tỏ có sự tương đồng giữa 2 lần lặp trong cùng
một loại hạt kê khi thực hiện thí nghiệm, đồng thời có sự khác biệt về tổng thể giữa các hạt
kê nguyên liệu. Các mẫu phân làm 6 cụm: DN(1), DN(2), DL(1)-DL(2), T(1), T(2), V(1)V(2).
Kết quả các chỉ tiêu ở Hình 9, Bảng 13 , Bảng 14 cho thấy:
Hạt kê Proso trắng đặc trưng bởi biến “Enzyme cellulase”, “Tro”, “Độ ẩm”. Hạt kê đuôi chồn
vàng đặc trưng bởi biến “Enzyme protease”, “Đạm thô”.
Hạt kê đỏ nhỏ đặc trưng bởi biến “Tổng axit phenolic(TPC)”.
Hạt kê đỏ đặc trưng bởi biến. “Enzyme amylase”, “Cacbonhydrate”
Ngoài ra, các biến “Độ ẩm”, “Tro”, “Enzyme amylase”, “Chất béo” gần trục F1 nên thành
phần chính thứ 1 chịu ảnh hưởng nhiều nhất bởi biến “Độ ẩm”, “Tro”, “Enzyme amylase”,
“Chất béo”.
Biến “Enzyme protease” và “Cacbonhydrate” nằm cạnh trục F2 (thành phần chính thứ 2) nên
thành phần chính thứ 2 phụ thuộc nhiều vào biến “Enzyme protease” và “Cacbonhydrate”.
Bên cạnh đó, các biến nằm gần nhau có mối liên hệ thuận với nhau:Biến "Enzyme cellulase"
có tương quan thuận với biến "Tro"
Các biến nằm khác phía nhau có mối liên hệ nghịch đảo với nhau:Biến "Chất béo" có tương
quan nghịch với biến " Enzyme cellulase ", “Tro”.Biến "Enzyme amylase" có tương quan
nghịch với biến "Crude protein". Biến "Cacbonhydrate" có tương quan nghịch với biến "
Enzyme protease ". Biến " Enzyme amylase " có tương quan nghịch với biến " Crude protein"
Các biến nằm gần như vng góc nhau thì ít hoặc khơng tương quan với nhau :
“Cacbonhydrate” và “Enzyme protease” không tương quan “Tro”, “Enzyme cellulase” và
“Chất béo”.“Axit phenolic” không tương quan với “Crude protein”
Khi thể hiện các mẫu hạt kê và các biến chỉ tiêu trên đồ thị, các mẫu hạt kê có vị trí gần nhau
thì có các biến chỉ tiêu tương tự nhau. Sự phân tán mẫu trên đồ thị Hình 8 cho thấy loại hạt
kê khác nhau thì có sự đặc trưng về biến chỉ tiêu là khác nhau, đồng thời cùng loại hạt kê thì
vị trí phân bố sẽ gần nhau và nằm trong cùng 1 góc phần tư trên biểu đồ. Chứng tỏ số liệu của
nghiên cứu có tính lặp lại tốt.

23


4.5. Phân tích cụm

Hình 5. Biểu đồ phân nhánh vị trí của các cụm mẫu trên mặt phẳng

Hình 6. Biểu đồ phân nhánh vị trí của các cụm mẫu trong không gian
24