Phân lập và khảo sát đặc điểm các chủng vi sinh vật từ cá cơm nguyên liệu và sản phẩm nước mắm ở một số giai đoạn lên men

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

PHẠM THỊ KIM XUYẾN
HUỲNH THỊ KIM NGÂN
HUỲNH THỊ THÚY HẰNG

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM CÁC
CHỦNG VI SINH VẬT TỪ CÁ CƠM NGUYÊN
LIỆU VÀ SẢN PHẨM NƯỚC MẮM Ở MỘT SỐ
GIAI ĐOẠN LÊN MEN

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã chuyên ngành: 52420201

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021


THÔNG TIN CHUNG
Họ và tên sinh viên: Phạm Thị Kim Xuyến

MSSV: 17099581

Lớp

: DHSH13A

Khóa: K13

Chun ngành

: Cơng nghệ sinh học

SĐT

: 0854886617

Email

:

Họ và tên sinh viên: Huỳnh Thị Kim Ngân

Mã chuyên ngành: 52420201

MSSV: 17037401

Lớp

: DHSH13A

Khóa: K13

Chun ngành

: Cơng nghệ sinh học

SĐT

: 0868205141

Email

:

Mã chuyên ngành: 52420201

Họ và tên sinh viên: Huỳnh Thị Thúy Hằng

MSSV: 17045441

Lớp

: DHSH13A

Khóa: K13

Chun ngành

: Cơng nghệ sinh học

SĐT

: 0964348674

Email

:

Tên đề tài

: Phân lập và khảo sát đặc điểm các chủng vi sinh vật từ cá cơm
nguyên liệu và sản phẩm nước mắm ở một số giai đoạn lên men

Mã chuyên ngành: 52420201

Người hướng dẫn : PGS.TS. Trịnh Ngọc Nam – ThS. Nguyễn Tất Sơn
SĐT

: 0947911888

Email

:

Cơ quan cơng tác : Phịng Quản lí Khoa học và Hợp tác quốc tế. Trường Đại học
Công Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh


Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 05 năm 2020
Người hướng dẫn

Sinh viên

(Ký và ghi rõ họ tên)

(Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và nghiên cứu, với sự giúp đỡ tận tình của Thầy Cơ, gia đình và
bằng sự nỗ lực của bản thân, chúng tơi đã hoàn thành nghiên cứu. Để đạt được kết quả
này, chúng tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến:
Thầy Trịnh Ngọc Nam đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức và kinh
nghiệm quý báo, cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi để chúng tơi có thể hồn thành
đề tài. Dù thầy rất bận với cơng việc giảng dạy nhưng thầy vẫn luôn theo dõi và tận
tình chỉ báo chúng tơi trong suốt thời gian làm đề tài tốt nghiệp.
Chúng tôi xin cảm ơn thầy Nguyễn Tất Sơn đã hỗ trợ chúng tôi về mặt kiến thức cũng
như về mặt kỹ năng sử dụng tốt các thiết bị để phục vụ cho nghiên cứu của mình. Thầy
đã dành nhiều thời gian hướng dẫn để chúng tôi có thể hồn thành được đề tài nghiên
cứu của mình.
Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô của Viện công nghệ sinh học và thực phẩm,
Trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã cho tơi những kiến thức
quý báu trong thời gian học tập tại trường.
Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Chủ doanh nghiệp nước mắm Quang Minh, Cà Ná
tỉnh Ninh Thuận đã tạo điều kiện tốt nhất để chúng tơi có cơ hội lấy mẫu và xử lí mẫu
để thực hiện nghiên cứu này.
Cuối lời chúng tơi xin kính chúc q Thầy Cơ và anh chị doanh nghiệp dồi dào sức
khỏe và thành công trong cuộc sống!


TÓM TẮT
Nước mắm được sản xuất theo phương pháp lên men truyền thống ở Việt Nam có
mùi vị thơm ngon đặc trưng. Tuy nhiên, nhược điểm của chúng là độ đạm không
cao, thời gian sản suất quá dài, năng suất thấp. Các nghiên cứu về phân lập vi khuẩn
và nấm men trong nguyên liệu sản xuất và các giai đoạn lên men nước mắm để cải
tiến chất lượng nước mắm của từng vùng còn hạn chế. Do vậy, nghiên cứu này
được thực hiện nhằm cung cấp thông tin về các chủng vi khuẩn và nấm men trong
nước mắm cá cơm ở giai đoạn nguyên liệu ban đầu, lên men 1 tháng và lên men 2

tháng. Mẫu được thu nhận từ làng nước mắm truyền thống Cà Ná ở tỉnh Ninh
Thuận. Các chủng vi khuẩn và nấm men được phân lập từ cá cơm và sản phẩm lên
men ở một số giai đoạn được khảo sát đặc tính chịu mặn, khả năng phân giải protein
bằng enzyme protease ngoại bào và định danh theo khóa phân lồi của Bergey. Kết
quả phân lập đã xác định có 12 chủng vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu cá cơm, 7
chủng vi sinh vật trong mẫu ủ chượp 1 tháng và 6 chủng vi sinh vật trong mẫu ủ
chượp 2 tháng. Sau khi thực hiện định danh theo khóa phân loại vi khuẩn của
Bergey có 9 chủng thuộc nhóm I (Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus), 2
chủng thuộc nhóm III (Lactobacillus, Liseria, Kurthia), 1 chủng nhóm IV
(Corynebacterium, Propionibacterium, Arthrobacter), 7 chủng thuộc nhóm VI
(Micrococcus, Planacoccus, Staphylococcus), 3 chủng thuộc nhóm VIII
(Psedomonas, Alcaligenes, Halobacterium), 4 chủng thuộc nhóm XI (Neisseria,
Veillnella). Trong số các chủng vi khuẩn phân lập được thì thấy rằng khả năng chịu
mặn và khả năng phân giải protein của các chủng vi sinh vật chủ yếu thuộc phân
lồi nhóm I (Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus) và nhóm VIII (Psedomonas,
Alcaligenes,

Halobacterium)

và

nhóm

VI

(Micrococcus,

Planacoccus,

Staphylococcus) trong mẫu nguyên liệu cá cơm và 2 giai đoạn ủ chượp. Kết quả

nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn và nám men được khảo sát có tiềm năng
ứng dụng tốt để tạo ra các chế phẩm vi sinh ứng dụng trong quá trình sản xuất nước
mắm truyền thống của Việt Nam.

6


MỤC LỤC
TĨM TẮT ...................................................................................................................6
MỤC LỤC ...................................................................................................................7
DANH MỤC HÌNH ẢNH ..........................................................................................9
DANH MỤC BẢNG BIỂU ......................................................................................10
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................11
CHƯƠNG 1
1.1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................15

Giới thiệu về nước mắm ..............................................................................15

1.1.1

Giới thiệu nước mắm cá cơm................................................................15

1.1.2

Nguyên liệu sản xuất nước mắm ..........................................................15

1.1.3

Quy trình lên men nước mắm truyền thống ..........................................17

1.1.4

Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nước mắm ................................19

1.1.5

Hệ vi sinh vật có trong cá .....................................................................22

1.1.6

Hệ vi sinh vật có trong q trình lên men nước mắm...........................23

1.2

Enzyme protease ..........................................................................................23

1.2.1

Khái niệm protease ...............................................................................23

1.2.2

Cơ chế phản ứng của protease .............................................................26

1.3

Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước .................................................27

CHƯƠNG 2
2.1

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...............................32

Vật liệu ........................................................................................................32

2.1.1

Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................32

2.1.2

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ................................................................32

2.2

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................34

2.2.1

Phương pháp thu thập mẫu ...................................................................34

2.2.2

Phương pháp phân lập các loài vi sinh vật ..........................................34

2.2.3

Phương pháp quan sát hình thái đại thể ................................................34

2.2.4

Phương pháp nhuộm Gram ..................................................................35

2.2.5

Phương pháp phân lồi vi sinh vật theo khóa Bergey .........................35

2.2.6

Phương pháp sàng lọc khả năng chịu mặn của các loài vi sinh vật ......40

7


2.2.7

Phương pháp khảo sát khả năng phân giải protein . ...........................40

2.2.8

Phương pháp xử lí số liệu .....................................................................41

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................43

3.1

Kết quả phân lập ..........................................................................................43

3.2

Kết quả phân nhóm theo khóa phân lồi Bergey .........................................45

3.3

Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn ...........................................................54

3.4

Kết quả khảo sát khả năng phân giải protein ...............................................59

CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................68

4.1

Kết luận........................................................................................................68

4.2

Kiến nghị .....................................................................................................69

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................70

8

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. 1 Cơ chế xúc tác của enzyme protease.........................................................25
Hình 2. 1 Sơ đồ phân lồi theo khóa Bergey đối với vi khuẩn Gram dương ............36
Hình 2. 2 Sơ đồ phân lồi theo khóa Bergey đối với vi khuẩn Gram âm .................37
Hình 3. 1 Sơ đồ phân lồi theo khóa Bergey đối với nhóm Gram dương ................50
Hình 3. 2 Sơ đồ phân lồi theo khóa Bergey đối với nhóm Gram âm ......................53
Hình 3. 3 Biểu đồ tổng hợp khả năng chịu mặn của các vi sinh vật ở mẫu cá nguyên
liệu ở các nồng độ muối sau 22h ni cấy ................................................................55
Hình 3. 4 Biểu đồ tổng hợp khả năng chịu mặn của các vi sinh vật mẫu ủ chượp 1
tháng ở các nồng độ muối sau 22h ni cấy .............................................................56
Hình 3. 5 Biểu đồ tổng hợp khả năng chịu mặn của các vi sinh vật ở mẫu ủ chượp 2
tháng ở các nồng độ muối sau 22h nuôi cấy .............................................................57

9


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1 Giá trị dinh dưỡng trong cá cơm...............................................................17
Bảng 2. 1 Thiết bị, máy móc được sử dụng trong nghiên cứu ..................................32
Bảng 2. 2 Hóa chất và môi trường sử dụng ..............................................................33
Bảng 3. 1 Bảng mô tả hình thái khuẩn lạc các chủng vi sinh mẫu ủ chượp 1 tháng 44
Bảng 3. 2 Bảng mô tả hình thái khuẩn lạc các chủng vi sinh mẫu ủ chượp 2 tháng 44
Bảng 3. 3 Kết quả khảo sát khả năng sinh protease mẫu cá nguyên liệu..................60
Bảng 3. 4 Bảng tổng hợp kết quả khảo sát khả năng sinh protease mẫu ủ chượp 1
tháng ..........................................................................................................................63
Bảng 3. 5 Kết quả khảo sát khả năng sinh protease mẫu ủ chượp 2 tháng ...............65

10

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nước mắm là sản phẩm được lên men truyền thống ở Việt Nam nói riêng và các
nước Châu Á nói chung. Nguyên liệu chủ yếu làm nên hương vị đặc trưng của nước
mắm chính là cá và muối. Nhờ tác dụng của enzyme có sẵn trong thịt và hệ tiêu hóa
của cá giúp phân giải các protein từ phức tạp đến đơn giản rồi đến các acid amin
giúp thành phần của nước mắm đa dạng các chất như chất đạm, các acid hữu cơ,
muối NaCl, các chất thơm và các chất vi lượng khác. Tùy theo điều kiện của từng
vùng mà các loại cá làm nước mắm có thể thay đổi, cơng thức phối trộn giữa tỉ lệ
muối và cá khác nhau cũng góp phần ảnh hưởng đến thời gian thành phẩm cũng
như chất lượng của từng loại nước mắm [1].
Vi sinh vật trong nước mắm đóng vai trị quan trọng trong q trình tạo hương vị
cũng như chất lượng nước mắm. Hàm lượng muối trong nước mắm khá cao tùy
theo tỉ lệ giữa cá và muối. Vì vậy, các vi sinh vật trong sản xuất nước mắm chủ yếu
là ưa muối hay ưa mặn. Vai trò quan trọng của vi sinh vật trong nước mắm là phân
giải protein, sự phát triển mùi tạo nên hương vị trong nước mắm. Từ đó, các vi sinh
vật trong nước mắm được chia làm hai nhóm rộng là vi sinh vật góp phần phân giảì
protein và vi sinh vật tạo mùi và hương vị [2].
Nước mắm là một sản phẩm truyền thống rất phổ biến và đặc thù của Việt Nam. Ở
mỗi vùng miền có ngun liệu, quy trình và kinh nghiệm lên mem nước mắm khác
nhau. Theo đó, chất lượng nước mắm bị ảnh hưởng rất lớn bởi nguyên liệu cá làm
nước mắm, tỉ lệ muối, quy trình lên men và đặc biệt là hệ vi sinh vật trong q trình
lên men nước mắm. Vì những lí do trên nên nghiên cứu này được thực hiện nhằm:
“Phân lập và khảo sát đặc điểm các chủng vi sinh vật từ cá cơm nguyên liệu và
sản phẩm nước mắm ở một số giai đoạn lên men”.

11

Nhằm cung cấp thông tin về các chủng vi sinh vật có tiềm năng ứng dụng cao để
sản xuất các chế phẩm dùng cho quá trình lên men nước mắm truyền thống ở Việt
Nam.
2. Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu chính: Phân lập và khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn và vi nấm trong
nguồn nguyên liệu cá cơm và sản phẩm ủ chượp nước mắm 1 tháng, 2 tháng định
hướng ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh vật cho giai đoạn lên men nước mắm.
Mục tiêu cụ thể:
+ Phân lập được vi khuẩn và vi nấm trong nguồn nguyên liệu tươi là cá cơm, mẫu ủ
chượp 1 tháng và mẫu ủ chượp 2 tháng của cơ sở sản xuất nước mắm Quang Minh
tại Cà Ná- Ninh Thuận.
+ Định danh được các chủng vi sinh vật phân lập được theo khóa phân loại vi khuẩn
của Bergey.
+ Đánh giá được đặc tính chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập được.
+ Xác định được khả năng phân giải protein của các chủng vi sinh vật phân lập
được.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1 Đối tượng nghiên cứu:
Các lồi vi sinh vật có trong nguồn ngun liệu cá cơm, giai đoạn ủ chượp 1 tháng,
giai đoạn ủ chượp 2 tháng của quá trình lên men nước mắm tại cơ sở sản xuất nước
mắm Quang Minh tại Cà Ná – Ninh Thuận.
3.2 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn và vi nấm có trong nguyên liệu cá cơm, mẫu ủ
chượp nước mắm 1 tháng, mẫu ủ chượp nước mắm 2 tháng trên môi trường LB agar

12


(Lysogeny broth agar), MRS Agar (De man, Rogosa and Sharpe agar), Hansen,
Czapek dox.

Nội dung 2: Định danh các chủng vi sinh vật có trong nguyên liệu cá cơm, mẫu ủ
chượp 1 tháng, mẫu ủ chượp 2 tháng bằng phương pháp kiểm tra sinh hóa theo khóa
phân lồi vi khuẩn của Bergey.
Nội dung 3: Khảo sát đặc tính chịu mặn của các chủng vi sinh vật đã được phân lập
ở mẫu nguyên liệu cá cơm, mẫu ủ chượp 1 tháng, mẫu ủ chượp 2 tháng ở các nồng
độ muối (NaCl) Đối chứng, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%.
Nội dung 4: Khảo sát khả năng phân giải protein của các chủng vi sinh vật đã được
phân lập ở mẫu nguyên liệu cá cơm, mẫu ủ chượp 1 tháng, mẫu ủ chượp 2 tháng
dựa vào khả năng phân giải casein trên môi trường thử nghiệm.
3.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Từ 20/10/2020 đến 10/05/2021
Địa điểm nghiên cứu: Phịng thí nghiệm sinh học phân tử của Viện Công nghệ Sinh
Học và Thực Phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. Nhà F,
số 12 Nguyễn Văn Bảo, Phường 4, Quận Gị Vấp, Tp. Hồ Chí Minh.
4. Ý nghĩa của đề tài
4.1 Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu cung cấp thông tin về các chủng vi sinh vật có tiềm năng ứng dụng
trong quá trình sản xuất nước mắm tại tỉnh Ninh Thuận định hướng ứng dụng tạo
chế phẩm vi sinh sử dụng cho quá trình lên men nước mắm ở Việt Nam.
4.2 Ý nghĩa thực tiễn
Hệ vi sinh vật là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng nước mắm. Việc phân lập
và khảo sát thành công các chủng vi sinh vật sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu cải
thiện chất lượng nước mắm.

13


Hương vị, màu sắc là tiêu chuẩn để lựa chọn một sản phẩm nước mắm ngon và an
toàn. Việc bổ sung chế phẩm vi sinh góp phần tăng chất lượng và vẫn giữ được
hương vị đặc trưng của nước mắm.

4.3 Tính mới của đề tài
Các nghiên cứu về hệ vi sinh vật trong q trình lên men nước mắm cịn hạn chế.
Hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu về phân lập và khảo sát đặc điểm các chủng vi sinh
vật trong mẫu nguyên liệu cá cơm, giai đoạn ủ chượp 1 tháng và giai đoạn ủ chượp
2 tháng của cơ sở nước mắm Cà Ná – Ninh Thuận. Nghiên cứu nhằm mục đích
cung cấp thơng tin về các chủng vi sinh vật có trong giai đoạn nguyên liệu cá cơm
và giai đoạn ủ chượp 1 tháng, giai đoạn ủ chượp 2 tháng, tạo tiền đề cho các nghiên
cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh vào quá trình sản xuất nước mắm.

14


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nước mắm
1.1.1 Giới thiệu nước mắm cá cơm
Nước mắm cá cơm hiện nay là sản phẩm truyền thống của người dân Việt Nam.
Cùng với địa lí Việt Nam thì nước mắm cá cơm mỗi vùng miền sẽ có hương vị đặc
trưng riêng. Do đặc thù của vùng biển Ninh Thuận, khu vực xã Cà Ná huyện Thuận
Nam đã hình thành làng nghề sản xuất nước mắm cá cơm nổi tiếng. Để sản xuất
được nước mắm cá cơm mang được hương vị đặc trưng thì người sản xuất ở Cà Ná
đã chọn lựa kĩ lưỡng những nguyên liệu chất lượng kết hợp với kĩ thuật hòa trộn
muối trắng với cá cơm sao cho vừa đủ. Sản phẩm nước mắm cá cơm cuối cùng phải
có màu sắc và mùi vị thơm ngon và đặc trưng nhất. Chính vì vậy có thể thấy, sản
phẩm nước mắm cá cơm Cà Ná đang được người tiêu dùng sử dụng phổ biến trong
ẩm thực và được giới thiệu rộng rãi.
1.1.2 Nguyên liệu sản xuất nước mắm
1.1.2.1 Cá cơm thường [3]

Tên khoa học: (Stolephorus commersonii)
Bộ: Cluperformes
Họ: Engraulidae
Chi: Stolephorus
Loài: Stolephorus commersonii
Môi trường sống: ở các vùng ven biển và cửa sông
Đặc điểm sinh học: Cá cơm thường kết thành đàn lớn, ở trên các tầng giữa và trên
bề mặt, thích ánh sáng đèn. Thức ăn chủ yếu là tảo silic và chân mái chèo
Copepoza. Hằng năm cá thường đẻ vào tháng 2 và tháng 6 ở gần ven biển và cửa
sông.

15


Đặc điểm hình thái:
Cá cơm thường có thân hình dài thon, hơi dẹp bên, màu trằng đục, dọc hai bên đều
có dọc trắng bạc. Chúng có xương hàm trên dài, mút sau vượt quá rìa sau của xương
nắp mang trước, ở phía sau đỉnh trán rộng, rìa bên cong lịi ra, giữa mút cuối xương
hàm trên và rìa sau của xương nắp mang trước phẳng hơn, bên ngồi lịi lên. Đầu
tương đối to, trên đầu có hai chấm màu xanh lục, mõm nhọn, mắt to, khơng có
màng mắt, miệng rộng hơn xiên ngang rất nhỏ. Có một vây lưng tương đối to, vây
ngực to vừa ở thấp, vây bụng nhỏ, vây hậu môn tách biệt, với vây đuôi rộng dạng
đuôi én, khởi điểm ở dưới gốc vây lưng. Các tia phần trên vây ngực không kéo dài
thành sợi, cơ trên phần má kéo dài về phía trước che lấp xương gốc nắp mang. Ở
gốc vây lưng và vây hậu môn đều có một số chấm nhỏ.
Cá cơm thường có chiều dài thân gấp 4.4-5.2 lần chiều cao thân, gấp 4.2-4.5 lần
chìu dài đầu, chiều dài đầu gấp 4-6 lần chiều dài mõm. Kích thước thơng thường
của cá cơm thường 50-70 mm, lớn nhất là 100 mm.
Đặc điểm phân bố: Ở Việt Nam thường phân bố chủ yếu ở các vùng biển như:
Quảng Ninh, Hải Phịng, Thanh Hóa, Thái Bình, Nam Định, Nghệ An, Hà Tĩnh,

Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú n, Khánh Hịa, Ninh
Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu…
Cá cơm có nhiều acid béo omega-3, protein, vitamin và khống chất giúp duy trì
sức khỏe tốt. Chúng chứa canxi, sắt, magie, phospho, kali, natri, và kẽm. Cá cơm là
một nguồn giàu vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, folate, vitamin C, B12, B6,
A, E, và K. Những loại cá này cũng chứa chất béo và cholesterol tốt.

16


Chất
Canxi
Sắt
Magie
Photpho
Kali
Natri
Kẽm
Đồng
Mangan
Selen

Các khoáng chất
Hàm lượng
125 mg
2.8 mg
34.8 mg
148 mg
326 mg
88.4 mg

1.5 mg
0.2 mg
0.1 mg
31 mcg

% DV
12%
15%
9%
15%
9%
4%
10%
9%
3%
44%

Bảng 1. 1 Giá trị dinh dưỡng trong cá cơm [3]
1.1.2.2 Muối và nước
Muối là nguyên liệu phụ nhưng là nguyên liệu không thể thiếu trong chế biến nước
mắm. Muối tạo vị mặn cần thiết và có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của vi sinh
vật gây thối. Nồng độ muối luôn tỉ lệ thuận với thời gian chế biến chượp, nồng độ
muối càng cao thì thời gian thủy phân protein cá càng dài. Trong chế biến nước
mắm thì nồng độ tối thiểu nên ở tỉ lệ 4:1 (Cá: Muối) hoặc 25% (w/w) [4]. Các phần
tạp chất trong muối cũng có tác dụng kích thích phản ứng thủy phân protein cá
nhưng lại có ảnh hưởng đến vị của nước mắm. Trong muối ăn (NaCl) có lẫn những
loại muối khác như KCl, MgCl2… gây ảnh hưởng đến chất lượng nước mắm.
Trong sản xuất nước mắm thường dùng muối cất giữ lâu ngày (tầm 3-4 tháng) để
các chất khơng cần thiết như Mg, Ca, K nói trên mất đi trong q trình muối thốt
nước. u cầu của muối trong quá trình sản xuất nước mắm phải là muối thực

phẩm, muối tinh khiết [4].
1.1.3 Quy trình lên men nước mắm truyền thống
Mỗi khu vực, vùng miền có quy trình và kinh nghiệm lên men nước mắm khác
nhau.Về cơ bản, nước mắm truyền thống được chế biến bằng phương pháp gài nén
hoặc khuấy đảo thơng qua quy trình gồm các công đoạn cụ thể bao gồm [4]:

17


Dụng cụ: Dụng cụ làm nước mắm rất đơn giản, chỉ gồm dụng cụ chứa đựng và
dụng cụ khuấy đảo.
Thùng gỗ: Đây là loại chượp phổ biến nhất-đặc biệt với các đơn vị sản xuất mắm
lớn. Thùng gỗ làm nước mắm được kết thành từ những thanh gỗ bời lời lớn, gia cố
bằng những sợi to bản, bện chặt làm từ cây mây rừng. Ưu điểm của loại chượp này
là thể tích lớn, có thể chứa được lượng ngun liệu lên tới hàng tấn cá-muối. Tuy
nhiên, loại chượp này khả năng hấp thụ nhiệt kém nên thời gian ủ lâu hơn.
Bể xi măng: Chượp xi măng có ưu điểm là giá thành rẻ, dễ làm và sức chứa lớn-có
thể lên tới vài chục tới hàng trăm tạ. Tuy nhiên, chượp bằng bể xi măng lại có
nhược điểm chính từ chất liệu chượp-xi măng. Trong q trình sử dụng chượp có
thể gây bể những vụn xi măng hoặc những chất độc hại khác có thể bị hịa tan vào
trong chượp, dẫn tới chất lượng mắm không cao.
Lu sành/chum sành: Đây là loại chượp cho chất lượng mắm tốt nhất. Thông thường
việc lựa lu sành cũng có những nguyên tắc riêng như lu sành phải đạt độ dày thành
2.5 cm và phải chọn loại lu sành không tráng men để đảm bảo không ảnh hưởng đến
chất lượng mắm. Nhược điểm của loại chượp lu sành là sức chứa nhỏ, loại lu lớn
nhất cũng chỉ chứa được vài chục tạ cá-muối. Tuy nhien nước mắm ủ trong chum
sành có hương vị thơm ngon và màu sắc rất bắt mắt.
Nguyên liệu: Nước mắm truyền thống chỉ bao gồm cá và muối. Nguyên liệu là cá
phải tươi và muối phải sạch.
Phương pháp: Có 2 phương pháp chế biến nước mắm phổ biến hiện nay là phương

pháp đánh khuấy và phương pháp gài nén. Mỗi phương pháp có một ưu nhược điểm
khác nhau.
Với phương pháp đánh khuấy, người thợ làm nghề cho cá, muối vào trong lu sành
sau đó mang đi phơi nắng để tiếp nhiệt và đánh đảo hằng ngày. Cách làm này phổ
biến ở các tỉnh ven biển miền Bắc, nơi có mùa đơng, nhiệt độ thấp, thời gian để chế
biến chượp kéo dài.

18


Với phương pháp gài nén chủ yếu dựa vào men trong cá để phân giải protein của
thịt cá, không thực hiện đánh khuấy thùng chượp. Cách làm này phổ biến ở Nha
Trang, Phan Thiết, Phú Quốc.
Tỷ lệ cá và muối: Thơng thường thì cá và muối sẽ được ướp theo tỷ lệ 3:1 (3 cá: 1
muối). Đây là tỷ lệ phổ biến tại nhiều làng nghề hiện nay, được coi là tỷ lệ đẹp nhất
để tạo ra thứ nước mắm ngon nhất. Lượng muối giảm bớt nước mắm sẽ không bị
mắn quá, vị thanh hậu ngọt tự nhiên và quan trọng là tăng được độ đạm acid amin.
Thời gian ủ chượp, phơi chượp/ đảo chượp và kéo rút: Phụ thuộc vào kinh nghiệm
của mỗi vùng, mỗi cơ sở sản xuất nước mắm.
Rút mắm nhỉ và lọc mắm: Nước mắm chín, dậy mùi thơm và chuyển sang màu nâu
cánh gián đậm là có thể rút được. Nước mắm rút ra khơng sử dụng được ngay mà
phải lọc để loại bỏ cặn, giúp cho nước mắm trong và có màu sắc đẹp mắt. Thông
thường người ta sẽ dùng nhiều lớp khăn xô hoặc vải màn để lọc nước mắm. Không
phải lọc một lần mà xong mà phải lọc liên tục, nhiều lần đến khi nước mắm trong
và có màu cánh gián đặc trưng.
1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nước mắm
1.1.4.1 Nguyên liệu
Để làm nên hương vị đặc trưng của nước mắm thì phần lựa chọn nguyên liệu rất
quan trọng. Cá chủ yếu là lựa chọn loại cá gầy, hàm lượng lipid thấp, kích thước
nhỏ. Mỗi loại cá sẽ tạo nên mùi vị đặc trưng do sự khác nhau của hệ vi sinh vật, hệ

enzyme, các sắc tố, kết cấu thịt… Các loại cá chủ yếu được sử dụng để sản xuất
nước mắm như cá nục, cá trích, cá liệt, cá cơm, cá tạp… Tuy nhiên việc lựa chọn
loại cá phụ thuộc vào đặc điểm tự nhiên của từng vùng [1].
Cá là nguyên liệu chính nhưng muối cũng chính là nguyên liệu không thể thiếu để
sản xuất nước mắm. Muối tạo nên vị mặn cần thiết và ức chế sự sinh sản của các vi
sinh vật gây thối. Sản xuất nước mắm dựa trên quá trình thủy phân của thịt cá thành
các acid amin nhờ vào tác dụng của các enzyme.

19


1.1.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ muối
Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nước mắm. Nồng độ muối
gây ảnh hưởng lớn đến các giai đoạn lên men. Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc
đẩy quá trình thủy phân protein nhanh hơn, chượp mau chín. Nếu nồng độ muối quá
cao có tác dụng ức chế làm mất hoạt tính của enzyme, q trình thủy phân chậm lại,
thời gian thủy phân kéo dài. Thông thường muối cho vào khoảng 20-25% so với
khối lượng cá [1].
1.1.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Trong quá trình chế biến, khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng sẽ tăng. Vào mùa
hè, nhiệt độ cao làm cho enzyme và vi sinh vật trong bản thân nguyên liệu hoạt
động mạnh. Do đó thời gian cần bổ sung muối vào cá là sau 3 ngày với những ngày
nắng, nhiệt độ ngoài trời lên đến 40-450C và 5 ngày với thời tiết mát mẻ như mùa
thu, nhiệt độ ngoài trời trong khoảng 28-320C. Thời tiết miền Bắc, từ tháng 4 đến
tháng 11 hàng năm nhiệt độ dao động trong khoảng 30-500C, đây là khoảng thời
gian tốt nhất trong năm. Các bể chượp chế biến trong thời gian này sẽ nhanh chín
hơn và hương thơm tốt hơn các bể chượp chế biến vào các tháng 12 đến tháng 3
trong năm. Nhiệt độ ảnh hưởng rõ nhất đến quá trình chế biến nước mắm, do vậy để
rút ngắn thời gian chế biến thường tận dụng nhiệt độ về mùa hè, tăng tần suất đánh
khuậy và kéo rút náo đảo để nhiệt độ khối chượp được đồng đều, nhằm tạo điều

kiện cho khối chượp [2].
1.1.4.4 Ảnh hưởng của pH
Quá trình chế biến nước mắm là quá trình thuỷ phân protein của thịt cá qua nhiều
giai đoạn trung gian phức tạp để đi đến sản phẩm cuối cùng của sự phân giải ra acid
amin. Suốt trong q trình đó đều phải nhờ tác dụng của enzyme. Mỗi enzyme chỉ
hoạt động mạnh ở độ pH xác định. Enzyme pepsin hoạt động tốt ở mơi trường acid
có pH trong khoảng 1.5-2.2. Enzyme trypsine giữ vai trị quan trọng nhất, có khả
năng hoạt động mạnh ở nhiệt độ 10-500C, hoạt động mạnh ở môi trường pH trong
khoảng 8-9. Chượp chế biến bằng phương pháp tự nhiên có mơi trường pH trong

20


khoảng 5.5-6.5, ở môi trường tự nhiên pH trong khoảng 5.5-6.5 tuy không ưu tiên
phát triển loại enzyme nào, nhưng cả hai loại enzyme chính là pepsin và trypsine
đều phát triển được [1].
1.1.3.5 Ảnh hưởng của hệ vi sinh vật
Trong quá trình chế biến nước mắm, nhờ khả năng sinh protease của hệ vi sinh vật
trong nội tạng của cá, giúp q trình thủy phân cá được nhanh chóng. Các chủng vi
khuẩn thuộc nhóm Bacillus và Streptococcus tạo nên các loại acid bay hơi cao, góp
phần quan trọng tạo hương vị của nước mắm. Một số chủng vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp ra nhiều acid amin và ngược lại một acid amin: alanin, methionin,
histidine, … Khả năng sinh tổng hợp acid amin của vi sinh vật rất lớn, vì vậy ta cần
sử dụng khả năng này vào trong chế biến nước mắm để gia tăng giá trị dinh dưỡng
của nước mắm [4].
1.1.4.6 Quá trình thủy phân cá và lên men
Trong suốt quá trình lên men, bắt đầu từ giai đoạn ủ chượp 1 tháng đến tháng thứ 9
thì hệ vi sinh vật cũng như hệ enzyme có nhiều biến đổi. Sau mỗi tháng ủ chượp,
mỗi sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men sẽ ảnh hưởng đến chất lượng nước
mắm.

Bản chất của quá trình lên men nước mắm là quá trình thủy phân protein trong cá
nhờ hệ enzym protease và cuối cùng tạo thành các sản phẩm chủ yế là các acid amin
và các peptid cấp thấp. Quá trình thủy phân này là một quá trình rất phức tạp.
Sự tham gia của enzym trong quá trình thủy phân theo cơ chế xúc tác [5].
E + S ↔ ES ↔ E + P
Với

E: enzym.

S: cơ chất.
ES: hợp chất trung gian giữa enzym và cơ chất.

21


P: sản phẩm.
Sự tạo thành và chuyển biến hợp chất ES qua 3 bước:
Bước 1: Enzym kết hợp với protein tạo thành phức chất enzym protein, bước này
xảy ra khá nhanh, liên kết không bền.
Bước 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ các mối
liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng. Khi đó phức chất ES đồng thời xảy ra
hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến sự cực hóa của mối liên
kết tham gia vào phản ứng và sự biến dạng hình học của nối liên kết đồng hóa trị
trong phân tử protein cũng như trong trung tâm hoạt động của enzym, làm cho
protein hoạt động, quá trình thủy phân dễ dàng hơn.
Bước 3: Giai đoạn tạo thành các acid amin và peptid cấp thấp, giải phóng enzym.
Theo nghiên cứu của Beddow, ba bước tạo thành và chuyển hóa hợp chất ES tương
ứng với 3 chặng đường biến đổi hợp chất nitrogen trong quá trình thủy phân cá. Pha
1 (0-25 ngày): Có sự gia tăng thể tích của phần chất lỏng nổi ở trên bề mặt sản
phẩm và protein hòa tan.

Pha 2 (80-120 ngày): Mô tế bào bị phá vỡ, protein của tế bào trở nên tiếp xúc với
enzym, sản phẩm của quá trình tự phân protein được phóng thích. Hầu như tất cả
mơ tế bào đều bị phân hủy và biến mất sau 120-140 ngày.
Pha 3 (140-200 ngày): Enzym phóng thích và tấn cơng vào các phần protein hịa
tan.
1.1.5 Hệ vi sinh vật có trong cá
Nhiều kết quả nghiên cứu đã xác định hệ vi sinh vật của cá không khác biệt với hệ
vi sinh của môi trường nước xung quanh của cá sinh sống. Trong các mô và cơ quan
của cá tươi thường gặp Sarcina lutea, Sarcina flava, Sarcina alba, Micrococcus
flavus, Micrococcus cereus, Proteus vulgaris, Chromobacterium prodigiosum,
Pseudomonas fluorescens liquefacien, Bacterium pudium, Bacillus megatherium, B.

22


mycoides, B. subtilis, B. mesentericus, Clostridium putrificus, Aspergiluss niger,
Mucor [4].
1.1.6 Hệ vi sinh vật có trong q trình lên men nước mắm
Qua phân tích hệ vi khuẩn trong nước mắm được phân thành 2 nhóm chính đó là vi
khuẩn sản xuất các enzyme thủy phân protein như Bacillus sp., Pseudomonas sp.,
Micrococcus sp., Staphylococcus sp., Halococcus sp., Halobacterium salinarium;
và vi khuẩn có liên quan đến sự hình thành hương vị đặc trưng của nước mắm như
Staphylococcus sp., Pediococcus halophilus [6]. Một số nghiên cứu khác cho thấy
hệ vi sinh vật có trong nước mắm như Lactobacillus, các loài ưa mặn như
halotolerant hoặc halophilic: Tetragenococcus muriaticus, Halobacillus sp.,
Lentibacillus halophilus, Lentibacillus salicampi, Lentibacillus Juripiscarius,
Halobacterium halobium, Halococcus thailandensis và Bacillus vietnamensis.
Phân tích hệ vi sinh vật có trong các giai đoạn lên men chượp từ tháng 1 đến tháng
12 của quy trình sản xuất nước mắm Cát Hải. Dự án đã đưa ra kết quả phân loại
trong chượp lên men nước mắm Cát Hải được 20 loài thuộc 7 chi khác nhau là chi

Bacillus,

Enterococcus,

Lysinibacillus,

Rummeliibacillus,

Staphylococcus,

Tetragenococcus và Vigribacillus [4].
Staphylococcus spp. và Bacillus spp. luôn tồn tại trong quá trình lên men đối với 2
loại cá (cá cơm và cá nục) sử dụng làm nguyên liệu. Nhóm vi khuẩn ưa mặn
Halophiles gồm Micrococcus luteus và Staphylococcus arlettae tăng trong 30 ngày
lên men đối với 2 loại cá sử dụng làm nguyên liệu [6].
1.2 Enzyme protease
1.2.1 Khái niệm protease
Protease hay peptide hydrolase là những enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết
peptid (CO-O-NH-) trong phân tử protein và các polypeptide. Sản phẩm của q
trình thủy phân này có thể là các polypeptide chuỗi ngắn, các acid amin. Nhiều

23


enzyme protease cịn có thể xúc tác phản ứng thủy phân liên kết este, liên kết amid
và phản ứng chuyển vị gốc acid amin [7].
Phản ứng theo sơ đồ sau:
H2N- CH(R1)- CO- NH- CH(R2)- CO ...- NH- CH(Rx)- COOH +H2O
H2N-CH(R1)-COOH + H2N-CH(R2)-CO... NH-CH(Rx)-COOH- R2
1.2.1.1 Phân loại protease

Dựa vào cơ chế xúc tác: theo IUBMB đã chia peptidase thành 2 nhóm [2].
Nhóm 1: Exo-peptidase cịn được gọi là peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch.
Thủy phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptide. Nếu xúc tác ở đầu gốc carboxyl tự
do thì gọi là enzyme carboxypeptidase. Nếu xúc tác ở đầu có gốc amin tự do thì gọi
là enzyme aminopeptidase.
Dựa trên cơ chất enzyme sử dụng thì protease được chia thành hai nhóm: protease
và peptidase.
Nhóm 2: Endo-peptidase cịn gọi là protease hay enzyme phân cắt nội mạch. Xúc
tác phản ứng thủy phân liên kết peptide bên trong chuỗi polipeptidase.
Cả hai enzyme endo-peptidase và exo-peptidase kết hợp với nhau một cách hiệu quả
trong việc thủy phân phân tử protein, có thể nói rằng chức năng chính của endopeptidase là tạo một lượng lớn những peptid có đầu tận cùng là nhóm carboxyl tự
do và nhóm amin tự do để tạo điều kiện cho exo-peptidase hoạt động.

24


Hình 1. 1 Cơ chế xúc tác của enzyme protease [2]

Dựa vào hoạt động của pH: dựa vào mức hoạt động trong dung dịch có trị số pH
khác nhau, enzyme protease được chia thành 3 loại.
Loại 1: Protease acid: pH tối ưu trong khoảng 2-5. Nhóm enzyme này xúc tác cho
sự thủy phân các peptid và protein ở vùng pH acid. Ngồi ra chúng cịn có khả năng
thủy phân một số đi-tri peptid do có sự hiện diện của enzyme carboxylpeptidase.
Loại 2: Protease trung tính: pH tối ưu trong khoảng hẹp, từ 6-7.5. Loại này không
bền với nhiệt độ và mất hoạt tính khi có mặt của protease kiềm, có trung tâm hoạt
động là kim loại, chứa nhiều Zn2+.
Loại 3: Protease kiềm: pH tối ưu trong khoảng 8-1. Loại này thường được tổng hợp
nhiều bởi vi khuẩn và nấm men.
Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động: dựa trên đặc điểm cấu tạo trung tâm hoạt
động của enzyme nên phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme đó nên có thể thấy đây

là cách phân loại chi tiết nhất. Theo cách phân loại này protease được chia thành 4
nhóm.

25


Nhóm I: Cystein - protease (EC.3.4.22), cịn được gọi là thinol protease hoặc
sulfhydryl protease. Đặc trưng cho nhóm này là papain, bromelin, ficin và một số
protease từ vi sinh vật. Trung tâm hoạt động của nhóm I bao gồm 2 acid amin là
cysteine và histidine. Hoạt động trong vùng pH rộng trong khoảng 4.5-10, tuy nhiên
vùng pH tối ưu là 6-7.5, phụ thuộc vào cơ chất. Có khả năng bền với nhiệt độ từ 60800C ở pH tự nhiên.
Nhóm II: Aspartic protease (EC 3.4.23), còn được gọi là acid protease. Đại diện cho
nhóm các enzyme như rennin, pepsin. Tâm hoạt động gồm: 2 aspartic acid và 1
tyrosine pH hoạt động trong khoảng 2-4 và còn gọi là protease-acid, riêng cathepsin
D có pH tối ưu trong khoảng 6-7. Hoạt tính enzyme bị ức chế bởi peptatin.
Nhóm III: Metallo - protease (EC 3.4.24), các enzyme nhóm này gồm exopeptidase,
dipeptidase, amino peptidase, carboxylpeptidase A & B, prolidase và một số
protease thu nhận từ vi sinh vật như B. cereus, B. megaterium, B. subtilis,
Streptomyces griseus, Aspergillus oryzae. Hoạt động trong vùng pH 6-9.
Nhóm IV: Serine protease (EC.3.4.21) đại diện cho nhóm này là các enyme có
nguồn gốc từ động vật như trypsin, chymotrypsin, plasmin và thrombin. Một số
khác được tổng hợp từ vi sinh vật mà đặc biệt là từ vi khuẩn và nấm mốc như B.
cereus, B. firmus, B. subtilis, Asp.flavus, Asp. oryzae. Hai acid amin hình thành
trung tâm hoạt động là serine và histidine. Khoảng pH tối ưu là 7-11.
Trong các nhóm protease được phân loại, ứng dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực nhất là
nhóm serine protease do chúng có khả năng thích ứng trong khoảng pH khá rộng từ
trung tính đến kiềm đã làm tăng khả năng ứng dụng của nhóm enzyme này so với
các nhóm protease khác.
1.2.2 Cơ chế phản ứng của protease [5]
Việc thủy phân protease là một tiến trình vật lý khá đa dạng. Hoạt động của chúng

được chia ra làm 2 loại như sau:

26