Tìm hiểu về CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM
----ooo000ooo----

ĐỀ TÀI

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

TP. Hồ Chí Minh, 2021

1


MỤC LỤC
1. Tổng quan về clostridium perfringens...................................................................2
2. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu đối tượng Clostridium perfringens..........5
3. Dùng các kỹ thuật khác nhau để phân tích đối tượng C. perfringens.................9
4. Phương pháp ELISA.............................................................................................10
5. Phương pháp PCR.................................................................................................11
6. Phương pháp nuôi cấy...........................................................................................12
7. Kỹ thuật định lượng trong môi trường thạch tryptose sulfide cycloserin (tsc). 14
8. Phương pháp truyền thống- phương pháp đếm khuẩn lạc.................................20
9. Phương pháp phân lập và xác định type độc tổ (toxinotype) của vi khuẩn
clostridium perfringens ở động vật nhai lại bằng kỹ thuật multiplex pcr.........24
10. Nghiên cứu về clostridium perfringens..............................................................30


1.Tổng quan về clostridium perfringens
-Phân loại khoa học
Loài C. perfringens thuộc:

 Giới: Bacteria
 Ngành: Firmicutes
 Lớp: Clostridia
 Bộ: Clostridiales
 Họ: Clostridiaceae
 Chi: Clostridium
 Loài: C. perfringens

Clostridium perfringens (trong quá khứ được gọi là C. Welchi hoặc Bacillus
Welchi, mục đích để vinh danh người đã phát hiện ra nó vào năm 1891 và xác định nó
là tác nhân gây bệnh hoại thư khí, William Henry Welch) là một vi khuẩn Gram
dương, dạng hình que, phát triển trong điều kiện kị khí (có thể phát triển trong điều
kiện khơng có oxi), vi khuẩn này sinh nội bào tử gây bệnh thuộc chi Clostridium, vi
khuẩn này thích hợp với mơi trường có độ axit và tính trung tính nhất định, độ pH lý
tưởng của nó nằm trong khoảng từ 5,5-8. Loại vi khuẩn này thực hiện trao đổi chất dựa
trên quá trình lên men. Về cơ bản, nó có khả năng lên men đường glucose, đường sữa
và đường sucrose. Ruột của người và động vật là nơi loại vi khuẩn này thường được
tìm thấy. Chúng gây thiệt hại khủng khiếp cho loại sinh vật mà nó xâm nhập và có khả
năng gây tử vong, chúng từ từ giết chết các mô bị lây nhiễm và khơng hề để lại bất kì
cơ hội phục hồi nào.
C. perfringens có khả năng tồn tại ở nhiệt độ cao. Vi khuẩn sẽ phát triển trong
quá trình làm lạnh cũng như giữ thực phẩm ở nhiệt độ từ 54°F-140°F (12°C-60°C). Và
đặc biệt phát triển rất nhanh trong khoảng nhiệt độ từ 109°F – 117°F (43 ° C – 47 ° C).


Loại vi khuẩn này có đặc tính di động: Mặc dù khơng hề có đi nhưng
C.perfringens vẫn có khả năng lướt trên bề mặt nhờ toàn bộ cơ thể được lót bằng các
sợi tơ (sợi filament). Các biến thể siêu di động (hypermotile) như biến thể SM101
thường được phát hiện tại các cạnh của khuẩn lạc trên đĩa thạch. Video kính hiển vi ghi
lại sự chuyển động trượt của chúng cho thấy rằng chúng có cấu trúc hình sợi dài, mỏng

cho phép chúng có khả năng di chuyển nhanh khơng thua kém gì các vi khuẩn có đi.
Clostridium perfringens có khả năng gây ra một số loại độc tố như:
-Enterotoxin: độc tố chính gây ra các trường hợp ngộ độc thực phẩm.
-Alpha toxin: thường liên quan đến bệnh hoại thư khí ở người, ngồi ra cịn có
bệnh viêm ruột hoại tử ở một số động vật như gà, gia súc và ngựa.
-Toxin Beta: theo nhiều nghiên cứu cho thấy loại độc tố này có khả năng hoạt
động như một chất độc thần kinh đồng thời tạo ra các cơn co thắt động mạch. Ngồi ra
nó được biết đến là liên quan tới một số bệnh lý về đường tiêu hóa ở một số động vật
có vú.
-Toxin Epsilon: Đây là một chất độc gây chết người được sản xuất bởi bất cứ vi
khuẩn nào trong chi. Có khả năng gây ra các chứng phù nề da. Theo nhiều nghiên cứu
khác nhau cho thấy rằng nó có thể vượt qua hàng rào máu não, thơng qua đó truy cập
thẳng vào não và tích lũy tại đó...
-Độc tố Iota: là một loại độc tố gây nên chứng viêm da và đồng thời gây tổn
thương ở cấp độ đường tiêu hóa. Tương tự như enterotoxic nó cũng có khả năng gây
độc tế bào.
C. perfringens được biết đến như một nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc thực phẩm ở
Anh Quốc. Chứng ngộ độc thường xảy ra với trường hợp thức ăn bị nhiễm vi
khuẩn cũng như chế biến không đúng cách, điều này làm cho C. perfringens nhân
lên một cách nhanh chóng. Việc sản xuất độc tố trong ruột được cho là nguồn cơn
của căn bệnh do vi khuẩn này gây ra.
Ngoài ra C. perfringens cũng được biết là nguyên nhân gây ra một số căn bệnh
khác như nhiễm trùng da và các mô sâu hơn. Hiện tượng này còn được gọi là “Bệnh
xơ hóa cơ do clostridial” hoặc “hoại thư sinh khí”, và đây cũng là kết quả do các độc
tố của C. perfringens gây nên. Vết thương sâu bị nhiễm các vật lạ có chứa vi khuẩn là
điều kiện thuận lợi cho căn bệnh hoại thư quái ác này.


Các loại thực phẩm thường chứa vi khuẩn Clostridium perfringens
Thịt bị, thịt gia cầm, nước thịt, thực phẩm khơ hoặc các loại thực phẩm được chế biến

sẵn là nguồn cơn lây nhiễm C. perfringens phổ biến.

Ngoài ra khi thức ăn được chế biến với số lượng lớn và đồng thời giữ ấm trong
thời gian dài trước khi dùng cũng là điều kiện thuận lợi để C. perfringens phát triển.
Các cơ sở như bệnh viện, nhà ăn trường học, nhà tù và viện dưỡng lão, các sự kiện có
phục vụ ăn uống thường là những khu vực dễ xảy ra các đợt bùng phát dịch.
Mọi người đều có nguy cơ bị ngộ độc thực phẩm từ C. perfringens.
Hai nhóm đối tượng có nguy cơ nhiễm C. perfringens cao nhất là trẻ nhỏ và
người cao tuổi và có thể gặp các triệu chứng nghiêm trọng hơn kéo dài từ 1 đến 2 tuần.
-Các dấu hiệu và triệu chứng khi bị nhiễm vi khuẩn C. perfringens:
+Ngộ độc thực phẩm:
Khi nạn nhân ăn phải thức ăn chứa số lượng lớn vi khuẩn, C. perfringens sẽ gây
tiêu chảy là chính. Ngồi ra có khả năng xuất hiện một số triệu chứng khác như buồn
nôn, nôn, đau bụng và sốt.
Các triệu chứng thường khởi phát một cách đột ngột và xảy ra trong khoảng từ
8-12 giờ; vài trường hợp có thể mất đến 24 giờ kể từ khi ăn.
24 giờ là thời gian tối đa các triệu chứng xuất hiện.
+Viêm ruột hoại tử:


Loại
A

Bệnh
Đối tượng gây bệnh
- Hoại thư sinh hơi
- Người, động vật, gà
- Viêm ruột hoại tử
- Heo, gà
- Viêm ruột nhiễm độc máu

- Bò, cừu non
- Ngộ độc thực phẩm
- Người
- Viêm ruột kết
- Ngựa
- Viêm dạ dày xuất huyết
- Chó
B
- Bệnh lỵ
- Cừu non
- Viêm ruột độc máu
- Ngựa con, cừu, dê
C
- Viêm ruột hoại tử
- Người
- Viêm ruột độc máu
- Bê,cừu, heo con
D
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Cừu, dê, trâu bò
E
- Viêm ruột
- Thỏ
- Viêm ruột nhiễm độc máu
- Bê con và cừu con
Tiêu chảy là triệu chứng xuất hiện đầu tiên của nhiễm trùng này, không viêm và
kèm theo đó là vùng thượng vị đau nhói. Một số ít trường hợp có thể xuất hiện các
triệu chứng như sốt, buồn nơn và nơn.
+Bệnh xơ hóa cơ do clostridial (hoại thư sinh khí):
Các triệu chứng khởi phát một cách đột ngột, đặc biệt cảm thấy đau dữ dội tại

vết thương
Màu da trên khu vực bị nhiễm thay đổi (ví dụ: màu thay đổi từ trắng sang đồng,
sau đó là tím hoặc đỏ)
Nạn nhân có cảm giác tồn tại khí dưới da
2.Tầm quan trọng của việc nghiên cứu đối tượng clostridium perfringens
Tỷ lệ mắc bệnh viêm ruột hoại tử do C. perfringens tạo ra, thường được thấy ở
thịt cừu, gà và các loài gia cầm trên khắp thế giới. C.perfringens gồm có 5 loại (A-E)
gây ra nhiều bệnh khác nhau và thậm chí một số chủng có thể gây nhiễm trùng cho cả
người và động vật.


Tỷ lệ nhiễm độc tố ruột ở gia súc nhai lại nhỏ ở các nước khác nhau trên thế giới
Vì vậy vấn đề quan trọng nhất đối với các cuộc điều tra dịch tễ học là nhận biết
chính xác các biến thể của C. perfringens. Hơn nữa, các loài nhai lại đặc biệt là các
loại giống bản địa, đóng một vai trò quan trọng trong bộ phận đáng kể dân cư vùng
nhiệt đới từ các khía cạnh kinh tế - xã hội.


Số vụ bùng phát Clostridium perfringens từ 1998 đến 2010 tại Hoa Kỳ từ 1998 đến
2010
Trung bình, các đợt bùng phát C. perfringens được xác nhận chiếm 5% tổng số
các đợt bùng phát bệnh do thực phẩm được xác nhận được báo cáo hàng năm. Trong
tất cả các năm, C. perfringens là nguyên nhân thứ hai gây ra các đợt bùng phát bệnh do
vi khuẩn thực phẩm được xác nhận là sau Salmonella. Tỷ lệ bộc phát lên đến 70%. Do
đó, nỗ lực từ ban quản lý và cải thiện di truyền để tăng cường sản xuất có tầm quan
trọng thiết yếu. Trong vài năm gần đây, việc chăn nuôi đà điểu đã có những bước phát
triển vượt bậc và ngành chăn nuôi trên thế giới đã đạt được một số ổn định về kinh tế.
Vai trò của Clostridium perfringens trong khả năng gây bệnh ở cừu, gà thịt là rất quan
trọng vì các loại độc tố của chúng có liên quan đến bệnh dạ dày và đường ruột của
động vật

Sau khi biết được khả năng C. perfringens gây bệnh trong thực phẩm chế biến,
các nhà nghiên cứu đã tìm ra cách kiểm soát vệ sinh thực phẩm như hạn chế ơ nhiễm,
làm sạch kỹ lưỡng, đóng hộp thích hợp và duy trì thực phẩm ở nhiệt độ ngồi phạm vi
phát triển của C. perfringens. Các mặt hàng thực phẩm được chế biến sẵn, đặc biệt là
các sản phẩm thịt, phải được giữ ở nhiệt độ rất nóng hoặc rất lạnh để hạn chế C.
perfringens tăng lên… Thực phẩm nên được ăn trong vịng 3 giờ sau khi nấu chín. Nếu
thực phẩm được giữ ở nhiệt độ ấm để phục vụ sau này, chúng nên được giữ ở nhiệt độ
trên 550C. Nếu nhiệt độ giảm xuống dưới 550C, thực phẩm nên được hâm nóng trên
600C. Thực phẩm được phục vụ lạnh sau khi nấu phải được làm lạnh nhanh đến 20 0C
và giữ ở hoặc dưới 70C cho đến khi được phục vụ.
Theo cuốn Avian Pathology có đề cập, bệnh hoại tử ruột do C. perfringens và
nhiễm trùng cận lâm sàng xuất hiện ở gà sau khi EU cấm các chất kích thích kháng
sinh, tăng trưởng làm giảm trọng lượng và gây khủng hoảng kinh tế nặng nề cho
ngành chăn nuôi gia cầm. Mối quan tâm về tỷ lệ nhiễm C. perfringens gia cầm cao và
nguy cơ lây truyền sang chuỗi thực phẩm gây ra các vấn đề sức khỏe cộng đồng.
Mặc dù Clostridium perfrngens là nguyên nhân gây ra số lượng lớn các vụ ngộ
độc thực phẩm ở châu Âu hàng năm, nhưng về mặt lý thuyết, việc kiểm sốt trong
ngành cơng nghiệp thịt dễ dàng hơn rất nhiều so với B. cereus trong ngành công
nghiệp sữa. Một vấn đề cụ thể với C. perfringens là các chủng hoang dã phân lập từ
mơi trường hầu như ln âm tính với độc tố ruột (Skjelkvile và cộng sự, 1979). Một số
chủng vẫn có thể mang gen này nhưng có thể khơng dương tính với độc tố ruột.
Thật vậy, nó đã được chứng minh rằng chủng âm tính với độc tố ruột có thể
chuyển đổi thành dương tính bằng cách tạo ra quá trình bào tử lặp đi lặp lại và sốc
nhiệt (750C, 20 phút) (Uemura và Skjelkvble, 1976). Ngộ độc thực phẩm do C.
perfringens gây ra luôn luôn là trách nhiệm của nhà sản xuất thực phẩm. Nếu nhà máy
thực phẩm được làm sạch và khử trùng đúng cách, chuỗi xử lý nhiệt và bào tử sẽ bị
phá vỡ, và khơng thể tạo ra các chủng enterotoxin dương tính. Tuy nhiên, việc khử
trùng thực phẩm bị nhiễm bào tử phải được thực hiện cẩn thận. Chỉ Hypoclorit được

điều chỉnh đến pH dưới 8 mới tiêu diệt được các bào tử, sau khi làm sạch thích hợp
(Granum và Magnussen, 1987).
Các giải pháp thay thế hiệu quả về chi phí phải được tìm kiếm và cần khẩn
trương nghiên cứu thêm về vấn đề này. Trước hết, cần có một mơ hình thực nghiệm tái
tạo bệnh. Mơ hình này sau đó có thể được áp dụng cho các sản phẩm thử nghiệm,
được kỳ vọng sẽ kiểm soát được dịch bệnh. Nghiên cứu nên tập trung vào việc tạo ra
các biện pháp bảo vệ mới chống lại căn bệnh này. Cân đối thành phần ngun liệu
thức ăn chăn ni có lẽ là biện pháp phịng chống và kiểm sốt hiệu quả nhất. Tiêm
phòng cho gia cầm chống lại C. perfringens là một vấn đề đang được thực hiện
nghiêm túc. Việc sử dụng prebiotics và probiotics đã được chứng minh là có hiệu quả
chống lại các mầm bệnh khác nhau ở gia cầm, và cần phải có nhiều nỗ lực hơn nữa
trong lĩnh vực này
Ngồi ra đại học Mannheim- Đức đã có nghiên cứu về việc điều trị ung thư
tuyến tụy bằng cách sử dụng độc tố ruột của Clostridium perfringens. Độc tố của
Clostridium perfrigens là mục tiêu điều trị mới cho bệnh ung thư tuyến tụy và đề xuất
phương thức điều trị mới bằng cách sử dụng hợp chất CPE (Clostridium perfringens
enterotoxin) có sẵn trong tự nhiên.
Phân tích các phản ứng miễn dịch được phát triển chống lại độc tố C.
perfringens loại A và C cho thấy chất bổ trợ từ dầu khoáng tăng cường sản xuất kháng
thể chống lại độc tố C. perfringens loại A và C được đo bằng SNT. Ở gà được tiêm
ngừa với Vắc xin kết hợp bất hoạt bổ trợ dầu sativa, hiệu giá kháng thể chống lại độc
tố C. perfringens loại A và C. Những kết quả cho thấy N. sativa tăng cường sản xuất
kháng thể chống lại các chất độc mạnh hơn chất hỗ trợ dầu khoáng. Sự khác biệt về
ảnh hưởng của N. sativa đối với mức độ của các kháng thể được tạo ra theo loại tác
nhân tạo miễn dịch (hiệu giá kháng thể thấp hơn trong trường hợp kháng nguyên
Salmonella và mức độ kháng thể cao hơn trong trường hợp độc tố C. perfringens) là
khó giải thích.
C. perfringens đóng một vai trò phụ trong việc kiểm tra nước. Clostridia là
những sinh vật xây dựng bào tử và có khả năng chống lại nhiệt, khử trùng bằng clo và
các yếu tố khác. Trái ngược với các tế bào sinh dưỡng như coliform (E. coli,

enterococci)- sức đề kháng kém hơn, C. perfringens có ưu điểm là sống được lâu hơn.
Do đó, trong khi sự nhiễm bẩn trong phân được phát hiện chủ yếu bởi coliform như
một chất chỉ thị, có thể biến mất sau một bước xử lý, C. perfringens vẫn tồn tại. Sinh
vật này không phải là mối nguy hiểm trong nước; đúng hơn, nó nguy hiểm khi nước
tiếp xúc với thực phẩm.
3.Dùng các kỹ thuật khác nhau để phân tích đối tượng C. perfringens
Khi xem xét các thực tế, rõ ràng việc phát hiện và xác định C. perfringens là
một bước quan trọng để kiểm soát và tiêu diệt mầm bệnh này. Một số enzym đặc trưng
của C. perfringens là hemolysin (ß-tan máu), lecithinase, protease ngoại bào, lipase
(phospholipase- C), collagenase, hyaluronidase, enzym đường hóa và enzym khử
sulphite thành sunfua. Các enzym này cũng được sử dụng làm mục tiêu phát hiện và
phân biệt. Cũng cần lưu ý rằng C. perfringens là một vi khuẩn khơng di động và nó là


vi khuẩn quan trọng nhất trong số clostridia khử sulphite. Ngoài ra, C. perfringens
thường phát triển ở 44 ° C, trong khi một số clostridia khác bị ức chế ở nhiệt độ này.
Tính chất này được sử dụng trong các phương pháp ISOO để cung cấp cho mơi trường
có độ chọn lọc cao hơn
C. perfringens nổi tiếng vì sở hữu một lượng độc tố cực kỳ phong phú, với hơn
15 loại độc tố và có thể là lồi gây bệnh phổ biến trên thế giới. Do đó, sinh vật có khả
năng tạo ra các bệnh lý khác nhau và gây ra nhiều loại bệnh về đường ruột và độc tố
khác nhau ở cả người và động vật. Alpha (α), beta (β), epsilon (µ) và iota bao gồm
bốn độc tố chính của C. perfringens tạo cơ sở cho việc phân loại vi khuẩn này thành
năm loại khác nhau, từ A đến E. Các loại vi khuẩn khác nhau này gây ra nhiều bệnh
khác nhau và thậm chí một chủng có thể gây nhiễm trùng cho nhiều vật chủ. Chủng
loại A (alpha-toxin) thường gặp nhất gây ra chứng hoại thư do khí (myonecrosis), tiêu
chảy và bệnh truyền qua thực phẩm ở người. Các chủng loại B (alpha-, beta- và
epsilon-độc tố) và loại D (alpha- và epsilon-độc tố) là tác nhân gây ra bệnh nhiễm độc
ruột gây tử vong ở động vật nuôi và đôi khi ở người. Chủng loại C (độc tố alpha và
beta) gây viêm ruột hoại tử nghiêm trọng ở người và lợn. Khả năng gây bệnh của các

chủng loại E (độc tố alpha và iota) là không rõ ràng và hiếm khi được phân lập ở
người. Để giảm thiểu hoặc loại bỏ nguy cơ này, các chiến lược phải được phát triển để
chẩn đoán và ngăn chặn động vật bị nhiễm bệnh xâm nhập vào chuỗi thức ăn
Trong khi chẩn đốn giả định về C. perfringens có thể đạt được bằng các phát
hiện lâm sàng và bệnh lý, việc xác nhận được thực hiện thường xuyên bằng các
phương pháp phân lập và đặc điểm vi sinh thông thường bao gồm ni cấy vi khuẩn,
phân tích sinh hóa và xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym
Trong một số phịng thí nghiệm, xét nghiệm trung hịa huyết thanh trên chuột
hoặc chuột lang được sử dụng để xác định và chẩn đoán độc tố của vi khuẩn. Phương
pháp này tốn thời gian, tốn kém chi phí. Hơn nữa, việc áp dụng nó với chi phí gây thiệt
hại cho động vật thí nghiệm là khơng phù hợp và phi đạo đức
Theo Timoney và cộng sự, kháng độc tố µ trong huyết thanh cừu được đo bằng
ELISA, được chứng minh là một phương pháp cụ thể, nhanh chóng và phù hợp kinh tế
có thể thay thế xét nghiệm trung hịa huyết thanh. ELISA sử dụng các kháng thể đa
dòng để xác định độc tố C. perfringens. Tuy nhiên, nhược điểm của nó là phản ứng
tương tác giữa các kháng thể được tạo ra có tác dụng chống lại các chất độc, điều này
có thể gây khó khăn cho việc xác định các loại độc tố. Hơn nữa, ELISA không xác
định được độc tố β 2 và để xác định độc tố từ vi khuẩn hình thành bào tử, nó phải được
kích hoạt bằng các phương pháp nuôi cấy đặc biệt
Các xét nghiệm sinh hóa cũng khơng có khả năng phân biệt các loại C.
perfringens khác nhau. PCR là công nghệ thực tế hiện đại nhất trong việc chẩn đoán
các bệnh truyền nhiễm và so với các kỹ thuật cổ điển, nó được chứng minh là nhanh
hơn, với kết quả thu được trong vài giờ và cũng đáng tin cậy hơn. PCR cho phép xác
định vi khuẩn nhanh hơn trực tiếp từ các mẫu lâm sàng
4.Phương pháp ELISA


Cơng nghệ Elisa là một phương pháp sinh hóa chủ yếu được sử dụng
trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của kháng thể hoặc kháng thể
trong một mẫu. Elisa được sử dụng để chẩn đoán y tế và chẩn đoán bệnh

thực vật. Và trong nhiều trường hợp kiểm sốt chất lượng.
Phương pháp ELISA có 3 loại là: trực tiếp, gián tiếp và “sandwich”
Phương pháp có thể phát hiện 5 loại độc tố quan trọng của
Clostridium perfringens: α, β, ε, iota và enterotoxin. Nguyên tắc hoạt động là
sử dụng các kháng thể đặc hiệu với độc tố của vi khuẩn. Phương pháp này
thường cho kết quả nhanh chóng và độ nhạy cao. Tuy nhiên, nó cũng có hạn
chế là yêu cầu độ tinh khiết của mẫu cao để tránh bị ức chế bởi protein thực
phẩm. Nếu không, mẫu phải cịn ngun vẹn và khơng biến tính để tránh kết
quả âm tính giả.
Hiện nay, ELISA được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu ở nhiều
lĩnh vực như y học, nơng nghiệp và đặc biệt là các quy trình kiểm tra chất
lượng các sản phẩm sinh học:
 Trong thực phẩm
• Phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm
trong vịng vài giờ sau khi tăng sinh.
• Phát hiện độc tố trong tảo
• Phát hiện E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,
sán lá gan ... trong thực phẩm.
• Phát hiện chloramphenicol trong tơm, cá và các sản
phẩm thủy sản
• Kiểm tra lượng dư của kháng sinh, thuốc diệt cỏ, thuốc
trừ sâu,… cịn trong thực phẩm.
 Trong y học
• Là một trong những kỹ thuật xét nghiệm HIV để phát
hiện kháng ngun p24.
• Chẩn đốn và điều trị các bệnh như viêm gan B, viêm
gan C và ung thư.
• Ứng dụng phát hiện bệnh aspergillosis (bệnh viêm
màng não) Quảng Châu
• Xác định tỷ lệ nhiễm KSTSR ở miền Trung-Tây

Nguyên.
 Trong nông nghiệp
• Chẩn đốn bệnh Tristeza (tác nhân gây bệnh héo
Fusarium) trên cây có múi.
• Đánh giá sự có mặt của BBTV
• Phát hiện kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae (ML)
ở lợn.


•

Đánh giá bệnh lùn xoắn lá trên lúa bằng phương pháp
DAS ELISA cải tiến.

5.Phương pháp PCR
Phân tích PCR, cịn được gọi là phân tích sinh học phân tử, là một kỹ
thuật dựa trên chu trình nhiệt tạo ra một số lượng lớn các bản sao DNA mục
tiêu trong ống nghiệm. Công nghệ này được phát minh bởi nhà khoa học
người Mỹ Cary Mullis vào năm 1985.
Xét nghiệm PCR đóng một vai trị quan trọng trong lĩnh vực cơng
nghệ sinh học vì phản ứng rất nhạy và có thể cho kết quả cụ thể. Các xét
nghiệm PCR thường có kết quả chính xác rất cao. Tuy nhiên, kết quả cịn phụ
thuộc vào trình độ của kỹ thuật viên, máy móc làm việc và kiểm tra chất
lượng. Cùng một phép thử nhưng một số nơi cho kết quả nhạy và chính xác,
một số nơi khác lại kém nhạy hơn.
Việc phát hiện Clostridium perfringens trong thực phẩm thường tập
trung vào việc phát hiện các gen độc tố ruột, đây là nguyên nhân chính gây ra
ngộ độc thực phẩm.
Năm 1997, Patrick Fach và Michel R. Popoff đã sử dụng công nghệ
PCR để phát hiện Clostridium perfringens sản sinh độc tố ruột trong thực

phẩm. Sử dụng công nghệ này, hai cặp mồi (PL3, PL7) và (P145, P146) được
sử dụng để phát hiện sự hiện diện của mã hóa α Hai gen đỉnh của
phospholipase C và gen cpe enterotoxin. Cả hai gen đều cùng nằm trên
nhiễm sắc thể của Clostridium perfringens.
Ứng dụng của phương pháp PCR trong cơng nghệ phân tích:
 Trong vi sinh vật học, PCR là một cơng cụ hữu ích để phát hiện
mầm bệnh vi sinh vật
 PCR cũng được sử dụng để xác định độc tố vi sinh vật
 PCR cũng được sử dụng để nghiên cứu khả năng kháng kháng
sinh của vi khuẩn
 Trong lĩnh vực ký sinh trùng, người ta dùng PCR để chẩn đốn
Leishmania, Echinococcus, ...
6.Phương pháp ni cấy
Ni cấy vi khuẩn là đưa mầm bệnh phẩm nghi ngờ có chứa vi khuẩn vào
trong mơi trường thích hợp nhằm tạo giúp cho vi khuẩn phát triển trong mơi trường
đó. Tùy theo nhu cầu mà các môi trường nuôi cấy có các chất dinh dưỡng hay các yếu
tố đặc biệt (ví dụ muối, muối mật, các chất tạo màu...) để nhận biết được các tính chất
riêng biệt sinh vật hóa học của vi khuẩn. Từ đó giúp nhận ra được sơ bộ ban đầu về


các nhóm vi khuẩn hoặc vi khuẩn có nguy cơ gây bệnh. Có rất nhiều kỹ thuật ni cấy
vi khuẩn, ta có thể phân loại như sau:
 Cấy định danh: Là phương pháp cấy trên các môi trường định danh, nhằm dễ
dàng phát hiện các tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn. Mỗi vi khuẩn có 1 bộ tính
chất sinh vật hóa học khác nhau hồn tồn. Vì vậy sau khi cấy định danh 24h, dựa vào
bộ tính chất sinh vật hóa học để tìm ra tên vi khuẩn.
 Cấy tăng sinh: Là phương pháp tăng sinh số lượng vi khuẩn trong mẫu bệnh
phẩm, đặc biệt với các bệnh phẩm ít vi khuẩn như máu, dịch não tủy, dịch màng
phổi...
 Cấy định lượng: Là phương pháp cấynhằm xác định mật độ vi khuẩn trong

mẫu bệnh phẩm ban đầu 1 cách khá chính xác. Điển hình của phương pháp cấy định
lượng là cấy nước tiểu.
 Cấy bán định lượng: Là phương pháp cấy nhằm xác định mật độ vi khuẩn
trong mẫu bệnh phẩm ban đầu 1 cách chưa hoàn hảo. Điển hình của phương pháp cấy
định lượng là cấy đờm.
 Cấy lưu chủng: Là phương pháp cấy vi khuẩn đã xác định tên, đã biết tên
vào mơi trường thích hợp để lưu giữ chủng vi khuẩn phục vụ nghiên cứu hoặc các mục
đích khác.
Các phương pháp ni cấy truyền thống để xét nghiệm C. perfringens được xây
dựng dựa trên những đặc điểm về vi sinh, sinh hóa của vi khuẩn và gồm một số bước
như sau:
Phương pháp nuôi cấy truyền thống dùng để xét nghiệm Clostridium
Perfringens được tạo dựng lên dựa trên những đặc điểm về vi sinh, sinh hóa của vi
khuẩn mà ta tìm ra, gồm các số bước như sau:
- Phân lập và nuôi cấy:
Ta lấy mẫu thực phẩm được đồng nhất và dung dịch đồng nhất đem đi pha
lỗng đến một nồng độ thích hợp. Ta cấy 0,1 ml dịch được pha lỗng vào trong mơi
trường thạch sâu Iron Sulfite Agar (hay còn gọi ISA). TIếp theo, đổ thêm lên trên bề
mặt một lớp trong môi trường ISA. Ta ủ kị khí ở 37°C cho đến 24 giờ rồi kết khúc ủ.
Trong môi trường Iron Sulfite Agar, khuẩn lạc đặc trưng của Clostridium Perfringens
sẽ có hình trịn, màu đen rõ rệt. Trong qua trình ni cấy và phân lập này dĩ nhiên sẽ
một số chủng Clostrdium khác loại cũng có thể tạo khuẩn lạc có đặc điểm khá giống
trên nên cần phải qua các bước khẳng định sinh hóa.
- Kiểm tra khẳng định sơ bộ:


Cấy một vi khuẩn lạc đặc trưng của Clostridium Perfringens trong môi trường
ISA sang môi trường Thioglycolate Broth. Ủ ở nhiệt độ 37°C trong vòng 24 giờ, kế
tiếp là tiến hành nhuộm gram và quan sát hình ảnh tế bào dưới hiển vi.
Ta lấy 1ml dịch nuôi cấy ở môi trường Thioglycolate Broth sang môi trường

iron-milk ở nhiệt độ 46°C. 2 giờ sau khi cấy, cứ cách mỗi tiếng ta kiểm tra sự lên men
ở môi trường được chuyển tới.
- Kiểm tra khẳng định ( độ chính xác):
Ta làm thử phản ứng sinh hóa trên 2 mơi trường Motility- Nitrate và LactoseGelatin, thử hoạt tính Catalase và khả năng di động để đi đến kết luận cuối cùng là
Clostridium Perfringens. Đây là trực khuẩn Gram dương, tạo khuẩn lạc màu đen trên
môi trường ISA, không di động, khử nitrate thành nitrite, cho thử nghiệm hoạt tính ra
kết quả Catalase âm tính, lên men Lactose sinh ra axit và hơi, làm tan hồn tồn
Gelatin.
Để xác định thêm chính xác ta sử dụng thêm cơ chất MUP
(Methylumbelliferylphosphate) để thêm vào ở môi trường ISA trong bước phân lập
nuôi cấy để chắc chắn C. perfringens mà không cần qua bước khẳng định sinh hóa.
MUP là cơ chất của Phosphatase là chất chỉ thị đặc trưng đối với C. perfringens.
Phosphatase sẽ phân ra MUP tạo thành 4 MUP và chất này sẽ phát sáng huỳnh quang
dưới đèn UV.
7.Kỹ thuật định lượng trong môi trường thạch tryptose sulfide cycloserin (tsc)
-Nguyên lý phương pháp
Vi khuẩn C. perfringens (trong môi trường thạch Tryptose Sulfide Cycloserin
(TSC)) trong điều kiện kỵ khí sẽ phát triển thành các khuẩn lạc có màu đen. Chọn
khuẩn lạc điển hình, xác định tính chất sinh vật hoá học theo thường quy.
-Phạm vi áp dụng
Phát hiện ô nhiễm Clostridium perfringens trong nước, thực phẩm và thức ăn
chế biến sẵn.
-Dụng cụ, môi trường, thuốc thử
+ Dụng cụ, thiết bị
 Nồi cách thủy.


 Bình ni cấy kỵ khí.
 Pipet chia độ 1, 5, 10 ml.
+ Môi trường, thuốc thử

 Thạch Tryptose Sulfide Cycloserin (TSC agar).
 Môi trường Iron - Milk.
 Môi trường Lactoza gelatin.
 Canh thang gan cục hoặc canh thang thịt.
 Canh thang nuôi cấy nha bào.
 Dung dịch thioglycolat.
 Dung dịch đệm glycerin - salt.
 Nước muối đệm Pepton 9‰.
 Thuốc nhuộm Gram.
-Chuẩn bị môi trường, thuốc thử
+ Chuẩn bị mơi trường
Mơi trường ni cấy, canh thang, nước pha lỗng và mơi trường sinh vật hố
học được pha chế theo cơng thức. Các mơi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình
nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút)
+ Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử
 Chuẩn bị mẫu
Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện
vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
Lưu ý: Mẫu thực phẩm nếu xét nghiệm sau 8 giờ phải được bảo quản
trong dung dịch muối đệm - glycerin (Buffer glycerin Salt Solution - BGS)


bằng cách: ngâm thực phẩm trong dung dịch BGS theo tỷ lệ 1:1 và bảo quản
trong điều kiện lạnh - 20oC.
Trước khi xét nghiệm, phải làm tan băng.
 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1
Cân chính xác 25 g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 25ml thực
phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn 225 ml nước muối đệm pepton (BPW)
9‰.
Lắc đều 2 - 3 phút. Thu được dung dịch mẫu thử 10-1

 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10- 2,10- 3,10- 4...
Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa
sẵn 9ml nước muối đệm pepton 9‰. Lắc đều trong 2-3phút. Thu được dung
dịch 10-2.
Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương
ứng 10-3, 10-4, 10-5.... (theo sơ đồ ).
-Phương pháp tiến hành
A. Cấy đếm vi khuẩn trên đĩa thạch
Bước 1:
- Rót 6 - 7 ml thạch TSC vào mỗi đĩa petri đã được đánh dấu nồng độ
pha loãng. Lắc cho thạch láng đều mặt đĩa.
- Khi thạch đơng chặt, lấy pippet hút chính xác 1 ml ở mỗi nồng độ pha
loãng dung dịch mẫu thử nhỏ lên mặt thạch. Mỗi nồng độ cấy trong hai đĩa petri
tương ứng.
- Rót tiếp 15 ml thạch TSC vào mỗi đĩa petri đã được láng mẫu thử. Lắc
trộn đều sao cho thạch phủ đều khắp bề mặt đĩa petri.
- Khi thạch đơng chặt, lật ngược đĩa, đặt vào bình kỵ khí (ví dụ các túi
hóa chất tạo kỵ khí hoặc tủ ấm ni vi khuẩn kỵ khí).


Đặt bình kỵ khí vào tủ ấm 350C/20 -24 giờ.
Bước 2: Đọc kết quả sơ bộ sau 24 giờ
- Đếm tồn bộ các khuẩn lạc có các đặc tính: trịn, lồi, bờ đều, nhẵn, có
màu đen..
- Tính số lượng vi khuẩn C. perfringens /1 g thực phẩm bằng trung bình
cộng giữa các đĩa ni cấy cùng nồng độ pha lỗng nhân với hệ số pha loãng
tương ứng.
* Ghi chú :
- Chỉ đếm các đĩa thạch có khoảng 20 - 200 khuẩn lạc để tính kết quả.
- Nếu các khuẩn lạc phân bố trên đĩa ni cấy khơng rõ ràng thì phải làm lại.

Bước 3: Xác định hình thể và tính chất bắt mầu
a) Chuẩn bị canh trùng thuần nhất
Chọn khuẩn lạc điển hình với đặc điểm: trịn, lồi, bờ đều, nhẵn, đen trên đĩa
thạch TSC cấy vào 1 ống môi trường canh thang thioglycolat hoặc canh thang gan cục
và canh thang nha bào.
Ủ ấm 350C/18 - 24 giờ. Thu được canh trùng thuần nhất.
b) Hình thể và tính chất bắt mầu
- Từ canh trùng thuần nhất, nhuộm Gram để xem hình thể và tính chất bắt
mầu. C. perfringens là trực khuẩn ngắn, bắt mầu thuốc nhuộm

Gram, Gr ( +).

- Phát hiện khả năng sinh nha bào: nhuộm Gram từ canh thang nha bào thấy:
trực khuẩn ngắn, trịn đầu, giữa có khoảng trắng sáng không bắt mầu thuốc nhuộm.
Bước 4: Thử tính chất sinh vật hố học
a) Thử nghiệm Iron - Milk
- Lấy 1ml canh trùng thuần nhất cho vào ống nghiệm môi trường Iron - Milk
- Đun cách thuỷ 46oC/2giờ.


- C.perfringen làm đông sữa nhanh ở đáy ống nghiệm và tạo ra lớp nhũ tương ở
trên.
b) Thử tính chất lên men đường và hoá lỏng gelatin
- Từ canh trùng thuần nhất cấy vào môi trường lactoza gelatin. Sau 24 giờ ở
350C , nhận định khả năng lên men đường Lactoza, và khả

năng sinh hơi. Đặt ống

nghiệm vào 50C/1 giờ - Đọc kết quả sơ bộ khả năng hóa lỏng gelatin..
- Nếu môi trường vẫn ở dạng đặc, ủ thêm 24 giờ/ 350C.

c) Khả năng chuyển hoá nitrat thành nitrit:
- Từ canh trùng thuần nhất cấy vi khuẩn vào ống nitrat, ủ 35 oC/24 giờ. Nhỏ
0,25ml thuốc thử A và B.
- Quan sát mầu môi trường chuyển sang mầu cam hoặc tím (+)/10 phút.
Tiêu chuẩn để xác định C. perfringen
Trực khuẩn ngắn: Gr

Có nha bào

Khuẩn lạc mầu đen trên TSC

Nitrit: (+)

Lactoza: (+)

Hơi: (+)

Iron-milk: (+)

Gelatin: (+)

(+)

B. Phương pháp nuôi cấy trong ống thạch
B.1. Môi trường thuốc thử
- Thạch Wilson Blair hay thạch Perfringens selective được đổ vào mỗi ống
nghiệm ( mỗi ống nghiệm khoảng 30ml thạch)
- Dung dịch natri sunfit 20%.
- Dung dịch ferrous amon sunfat 5% (dung dịch phèn sắt 5%).
B.2. Tiến hành

- Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử như trên, tùy theo mức độ sạch, bẩn của
mẫu mà pha lỗng đến đậm độ dùng ni cấy.
- Đun chảy thạch Wilson Blair hoặc thạch Perfringens selective, để nguội
khoảng 500C, cho vào thạch 10ml dung dịch mẫu thử. Mỗi nồng

độ cấy trong 2

ống. Mỗi ống cho thêm 2ml dung dịch Na 2SO3 20% và 5giọt phèn sắt 5%. Lắc trộn
đều.
- Đun cách thủy 750C/15phút. Làm đông nhanh thạch.
- Để 370C/18-24h.
B.3. Đọc kết quả: Khuẩn lạc vi khuẩn C. perfringens tròn, đen, có đường kính ³
3mm.
-Tính kết quả
Tính số vi khuẩn có trong 1g mẫu bằng cách lấy trung bình cộng số khuẩn lạc
nghi ngờ C. perfringens có trong hai đĩa thạch hoặc ống nghiệm nuôi cấy cùng nồng
độ nhân với hệ số pha lỗng tương ứng và chia cho 10.
Ví dụ: Độ pha loãng 10-2 :
 Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 1 có: 10 khuẩn lạc
 Đĩa thạch hoặc ống nghiệm 2 có: 14 khuẩn lạc
 Số khuẩn lạc có trong 1g thực phẩm được tính
X×100=120
Như vậy: Trong 1 gam thực phẩm có 1,2 ´ 10 2 vi khuẩn C.perfringens
 Đồng nhất mẫu


Thạch Tryptose – Sunfit – Cycloserin (TSC)
 Đổ thạch

 Ủ ấm
Bình kỵ khí để trong điều kiện 350C/20-24 giờ
 Nhận định kết quả sơ bộ: Chọn đĩa có 20-200 khuẩn lạc đen để đếm
 Xác định hình thể, tính chất bắt mầu và khả năng sinh nha bào
 Xác định tính chất sinh vật hố học
Trực khuẩn ngắn

Có nha bào

Lactoza: (+)

Hơi: (+)

Mầu đen trên môi trường TSC
Iron – milk: (+)

Làm lỏng gelatin

8.Phương pháp truyền thống- phương pháp đếm khuẩn lạc

MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THUỐC THỬ DÙNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG C.
PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM
 Thạch Tryptose - Sulfide - Cycloserine (TSC agar)
Tryptose (Difco)

15g


Men thủy phân

5g

Soyton

5g

Sắt ammonium citrat

1g

Natri metabisunfit

1g

Agar

20g

Nước cất

900ml

Đun tan môi trường TSC.
pH = 7,6 ± 0,2. Hấp ướt tới 1210C/15 phút. Trước khi dùng, để môi trường ở
500C.
Dung dịch D-cycloserine : Pha 1gam D-cycloserin (tinh thể trắng) vào 200ml
nước cất. Khử trùng bằng cách lọc và bảo quản 40C trước khi dùng.
Khi dùng : cho 20 ml dung dịch D-cycloserin vào 250 ml thạch nêu trên. Trộn
đều đổ đĩa.
Trong trường hợp cần thạch TSC có lịng đỏ trứng gà, sau khi cho D-cycloserin

vào, cho thêm 20 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà. Trộn đều đổ đĩa trước khi dùng.
 Canh thang thyoglycolat
L.cystin

0,5g

Agar

0,75 g

NaCl

2,5 g

Dextroza

5g

Men thủy phân

5g

Trypton

15 g

Natri

thioglycolat

hoặc

axit 0,5g

thioglycolat
Resazurin natri solution(1:1000) mới 1ml


pha
Nước cất

1 lít

Pha L- cystin, NaCl, dextroza, men thủy phân và tryptose trong 1 lít nước. Đun
cách thủy cho tan. Pha thêm natri thioglycolat hoặc axit thioglycolic, pH = 7,1 ± 0,2.
Cho thêm dung dịch Natri resazurin, trộn rồi hấp ướt 121 0C/20 phút. Có thể san ra các
ống nghiệm trước khi sấy ướt.
 Môi trường Iron - Milk cải tiến
Sữa tươi tồn phần

1 lít

Sắt sunfat.7H2O

1g

Nước cất

50ml

Hịa sắt sunfat vào trong 50 ml nước cất. Cho từ từ 1 lít sữa, vừa cho vừa quấy
đều bằng máy khuấy từ (hoặc bằng đũa thủy tinh). Hút 11ml môi trường vào ống
nghiệm 16 x 150 mm. Hấp ướt 118 0C/15 phút. Môi trường này pha chế nên sử dụng
ngay.


Môi trường lactoza - gelatin

Tryptose

15g

Men thủy phân

10g

Lactoza

10g

Đỏ phenol

0,05 g

Gelatin

120g

Nước cất

1 lít

Đun cho tan Tryptose, men thủy phân và lactoza trong 400ml nước. Hòa tan
gelatin trong 600ml nước nóng 50 - 600C cho tan. Trộn 2 hỗn dịch trên lại, chỉnh pH
đến 7,5 ± 0,2. Cho thêm chỉ thị màu đỏ phenol. San ra các ống nghiệm 16 x 150mm.


Hấp ướt ở 1210C/10phút. Trong vòng 8 giờ nếu chưa dùng cần để nóng 50 - 70 0C/ 2 3 giờ trước khi tiến hành xét nghiệm.
 Môi trường canh thang bào tử (Sporulation broth)
Polypepton

15g

Men thủy phân

3g

Starch, soluble

3g

MgSO4 khan

0,1g

Natri thioglycolat

1g

Na2HPO4

11g

Nước cất

1lít

Chỉnh pH 7,8 ± 0,1. San ra các ống nghiệm. Hấp ướt 1210C/15 phút.


Mơi trường di động nitrat

Cao thịt bị

3g

Pepton (Difco)

5g

KNO3

1g

Na2HPO4

2,5g

Thạch

3g

Galactoza

5g

Glycerin

5 ml

Nước cất

1 lít

Hịa các chất trên trừ thạch. Chỉnh pH 7,3 ± 0,1. Cho thêm thạch và đun đến khi
tan. San ra các ống 11 ml. Hấp ướt 121 0C/15 phút. Nếu trong vịng 4 giờ chưa sử dụng
thì trước khi tiến hành xét nghiệm phải đun sôi cách thủy 10 phút, sau đó làm lạnh
ngay bằng nước.


 Dung dịch đệm glycerin muối
Glycerin

100ml

K2HPO4

12,4g

KH2PO4

4g

NaCl

4,2g

Nước cất

900ml

Hòa tan muối NaCl trong bình có 900ml nước cất. Cho glycerin và phosphat
chỉnh pH=7,2. Hấp ướt 1210C/15phút. Trong trường hợp dùng dung dịch glycerin đậm
đặc (20%) , cho 200ml glycerin trong 800ml nước cất.

9.Phương pháp phân lập và xác định type độc tổ (toxinotype) của vi khuẩn
clostridium perfringens ở động vật nhai lại bằng kỹ thuật multiplex pcr
 Đặt vấn đề
Clostridium perfnngens là loại trực khuẩn yếm khí gam dương, gây ra nhiều thế
bệnh khác nhau ở người và gia súc, gia cầm. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn liên quan
đến 4 loại độc tố chính do chúng sản sinh ra là Alpha, Beta, Epsilon và Iota; ngồi ra
cịn độc tố ngoại bào enterotoxin gây bệnh ngộ độc thực phẩm ở người, Beta 2 toxin
gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gia súc, đặc biệt là ở lợn con, ngựa, chó,... Hiện nay đã
xác định C. perfringens có 5 type căn cứ vào khả năng sản sinh các loại độc tố là type
A. B, C, D, và E.
Theo Dwight và cộng sự (2004), tất cả 5 type đều sản sinh Alpha toxin, riêng C.
perfringens type A chỉ sản sinh Alpha toxin là loại phospholipase C có khả năng
sphingomyeline. Cả 2 loại protein này đều có thể kết hợp với màng tế bào của vật chủ.
Beta toxin do Cl. perfringens type B và C sản sinh, nằm trên plasmid của vi khuẩn,
gây tổn thương các tế bào biểu mô ruột, tế bào màng trong ruột. Ngồi ra, beta toxin

cịn tác động đến mơ thần kinh làm ảnh hưởng đến trao đổi calcium màng gây ra rối


loạn chức năng thần kinh bình thường. Mới đây, nhiều tác giả còn đề cập đến độc tố
beta toxin 2 (Cpb2), gene mã hoá nằm trên plasmid. Theo Dawn thuỷ phân
phosphotidylcholine và Cộng sự ( 2003 ) Trường đại học Arizona ( Mỹ ) thì tỷ lệ lưu
hành của gene Cpb2 trong các chủng Củ . perfringens phân lập trên bò bị bệnh tiêu
chảy , bệnh viêm ruột nhiễm độc máu và chết đột tử là 21,4 % , trên bê bị bệnh do type
A là 11,8 % , type C là 40 % và type E là 97,3 %.
Epsilon toxin do C. perfringens type B và D sản sinh , gene mã hóa nằm trên
plasmid . Đích của độc tố này là nhóm lipid : Cholesterol và sphingolipid có mặt trên
màng tế bào của động vật Eukaryotic , vì vậy , độc tố này tập trung ở não và thận .
Độc tố Ex được tiết ra như là 1 tiền độc tố và được kích hoạt bằng men proteolytic .
Iota toxin do C. perfringens type E sản sinh , có 2 vị trí : Vị trí gắn độc tố với tế bào
biểu mơ đích ( lb ) và vị trí hoạt hóa enzyme ( Ia ). Sau khi độc tố gắn vào thụ thể đặc
hiệu trên bề mặt tế bào , la xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào.
Trong các ổ dịch viêm ruột tiêu chảy , các chủng C. perfringens gây bệnh được thải ra
và tồn tại một thời gian dài trong đất.
C. perfringens type A gây bệnh viêm ruột tiêu chảy cho gia súc đã gặp ở hầu hết mọi
quốc gia . Type B gây bệnh lý cho cừu ở Châu Âu và Nam Phi , bệnh viêm ruột tiêu
chảy cho dê cừu ở Iran, Type C gây bệnh tiêu chảy cho gia súc và còn là nguyên nhân
gây bệnh viêm ruột nhiễm độc máu ở người . Type D gây bệnh cho cừu , type E chỉ
phát hiện Anh , Mỹ , và Úc gây bệnh viêm ruột nhiễm độc máu . Nhằm đánh giá sự
lưu hành các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens phân lập từ bỏ bê và dê cừu mắc
bệnh tiêu chảy nuôi tại một số tỉnh duyên hải miền Trung , chúng tôi đã sử dụng kỹ
thuật multiplex PCR để định type , từ đó đề ra các hướng nghiên cứu đồng thời để xuất
những giải pháp nhằm giảm thiểu thiệt hại đối với chăn nuôi động vật nhai lại , cũng
như bệnh ngộ độc thực phẩm do C. perfringens gây ra ở người.
 Nguyên liệu và phương pháp:
Nguyên liệu:

Bệnh phẩm là phân , chất chứa đường ruột , và phủ tạng của bò bê , dê cừu bị
tiêu chảy .