Tách chiết hợp chất kháng sinh trong dịch lên men nấm trichoderma ức chế nấm neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh long
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.13 MB, 115 trang )
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến
hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Nguyễn Duy Long và TS. Nguyễn Thị
Hai. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được cơng bố trong bất kỳ
cơng trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm
2019
Sinh viên
Nguyễn Kim Ngôn
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
LỜI CÁM ƠN
Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cơng
Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, q thầy cơ giảng dạy tại Viện Khoa Học Ứng Dụng cùng tất cả các
thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua.
Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Hai và ThS.
Nguyễn Duy Long người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp
đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khố luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các
thầy cơ Phịng Thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng cùng các anh chị tại Trung tâm Ươm
tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao và bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ tạo mọi điều
kiện thuận lợi để em hồn thành tốt đề tài của mình.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã ln bên cạnh, động viên con những
lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm
2019
Sinh viên
Nguyễn Kim Ngôn
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
MỤC LỤC
MỤC LỤC............................................................................................................................... i
DANH TỪ VIẾT TẮT......................................................................................................... iv
MỞ ĐẦU............................................................................................................................... 1
1 Tính cấp thiết của đề tài................................................................................................. 1
2 Mục đích nghiên cứu...................................................................................................... 2
3 Mục tiêu nghiên cứu....................................................................................................... 2
4 Đối tượng nghiên cứu..................................................................................................... 2
5 Phương pháp nghiên cứu............................................................................................... 2
5.1 Phương pháp tổng hợp tài liệu................................................................................. 2
5.2 Phương pháp nghiên cứu......................................................................................... 2
5.3 Phương pháp xử lý số liệu........................................................................................ 3
6 Ý nghĩa khoa học của đề tài........................................................................................... 3
7 Kết quả đạt được............................................................................................................ 3
8 Kết cấu đề tài.................................................................................................................. 3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................. 5
1.1
Giới thiệu về nấm Trichoderma spp........................................................................ 5
1.1.1
Phân loại............................................................................................................ 5
1.1.2 Đặc điểm hình thái................................................................................................. 6
1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa..................................................................................... 7
1.1.4 Cơ chế kiểm sốt sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh
cây trồng......................................................................................................................... 8
1.1.4.2 Ký sinh................................................................................................................. 9
i
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.1.4.3 Tiết kháng sinh (trích dẫn bởi Nguyễn Hồng Anh, 2013)............................ 10
1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp trên thế giới và Việt
Nam.................................................................................................................................. 13
1.2.1 Trên thế giới......................................................................................................... 13
1.2.2 Tại Việt Nam........................................................................................................ 14
1.2.3 Ứng dụng Trichoderma trong nông nghiệp......................................................... 15
1.3 Giới thiệu về peptaibol trong các chủng Trichoderma............................................ 16
1.3.1 Tình hình nghiên cứu về Trichobrachin............................................................. 22
1.3.2 Mức độ an toàn sinh học của peptaibol............................................................... 27
1.4 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long.............................27
1.4.1 Giới thiệu về bệnh đốm trắng............................................................................... 27
1.4.2 Tác hại của bệnh đốm trắng................................................................................ 30
1.4.3 Giới thiệu về chủng nấm gây bệnh Neoscytalidium dimidiatum........................30
1.4.4 Lịch sử nghiên cứu.............................................................................................. 32
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................35
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................................ 35
2.2 Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................... 35
2.2.1 Vật liệu:................................................................................................................ 35
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị............................................................................................... 35
2.2.3 Các loại môi trường:............................................................................................ 36
2.3 Phương pháp nghiên cứu.............................................................................................. 36
2.3.1 Phương pháp quan sát hình thái sợi nấm........................................................... 38
ii
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
2.3.2 Phương pháp tách chiết kháng sinh peptailbol từ dịch lên men các chủng nấm
Trichoderma.................................................................................................................. 39
2.3.3 Phương pháp xác định peptaibol chứa trong dịch chiết thô...............................42
2.3.4 Phương pháp khảo sát sơ bộ hiệu quả kháng nấm của kháng sinh peptaibol trong
điều kiện invitro............................................................................................................. 43
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................... 45
3.1 Kết quả khảo sát một số đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của các chủng
nấm Trichoderma............................................................................................................. 45
3.1.1 Đặc điểm hình thái của các chủng Trichoderma................................................ 45
3.1.2 Kết quả khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng Trichoderma TC25 và
TC15.............................................................................................................................. 46
3.2 Hàm lượng peptaibol thu được trong dịch nuôi cấy của các chủng Trichoderma
TC25 và TC15.................................................................................................................. 47
3.2.1 Kết quả phân tích phổ IR..................................................................................... 48
3.2.2 Kết quả phân tích sắc ký bằng phương pháp HPLC – UV.................................. 49
3.2.3 Kết quả phân tích sắc ký bằng phương pháp HPLC-MS....................................50
3.3 Kết quả đánh giá hiệu quả đối kháng nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum với
hợp chất thô peptaibol của chủng Trichoderma TC25 trong điều kiện invitro..........60
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................... 63
4.1 Kết luận...................................................................................................................... 63
4.2 Kiến nghị.................................................................................................................... 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................. 64
PHỤ LỤC.............................................................................................................................. 1
iii
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
DANH TỪ VIẾT TẮT
BVTV: Bảo vệ thực vật
CPD: Comprehensive peptaibiotics database
PDA: Potato Dextrose Agar
PDB: Potato Dextrose Broth
VSV: Vi sinh vật
iv
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum ..........................................................
Hình
1.2.
Hình
thái
đại
thể
của
một
số
chủng
Trichoderma
spp.
( .................. 6
Hình 1.3. Hệ sợi nấm Trichoderma ký sinh trên nấm gây bệnh Rhizoctonia solani (Agrios,
2005) ....................................................................................................................................... 10
Hình 1.4. Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được tiết ra từ
Trichoderma harzianum (Lê Thị Huệ, 2010) ...........................................................................
Hình 1.5. Cơ sở dữ liệu CPD (Comprehensive Peptaibiotics Database- Stoppacher, 2013) . 20
Hình 1.6. Cấu trúc phân tử alamethicin ..................................................................................
Hình 1.7. Tác động ức chế theo độ pha loãng khác nhau của M2 đối với C. chrysosperma YL
sau 5 ngày nuôi cấy. Tỷ lệ pha lỗng (2, 4, 6, 8, 16) hình (A). (B)........................................
Hình 1.8. Phổ peptaibol của Trichobrachin thu được từ T. longibrachiatum ........................
Hình 1.9. Phổ MS-HPLC của peptaibol Trichoderma ...........................................................
Hình 1.10. Triệu chứng bệnh khi xuất hiện trên thân, cành thanh long ( Nguồn: Viện bảo vệ
thực vật, 2014) ........................................................................................................................
Hình 1.11. Triệu chứng bệnh trên quả thanh long chín (Nguồn: Viện bảo vệ thực vật ,2014)
................................................................................................................................................ 29
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tách chiết hợp chất peptaibol thơ từ nấm Trichoderma.... 40
Hình 2.2. Quá trình tách chiết kháng sinh peptailbol từ dịch lên men các chủng nấm
Trichoderma TC25 và TC15 ..................................................................................................
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sơ bộ hiệu quả kháng nấm của hợp chất kháng sinh
peptaibol trong điều kiện invitro
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Hình 3.1. Hình thái đại thể của chủng nấm Trichoderma TC15 và TC25 sau 3 ngày nuôi cấy
trên mơi trường PDA............................................................................................................ 47
Hình 3.2. Dải phổ IR của alamethicin trên hệ thống chạy phổ IR......................................... 48
Hình 3.3. Dải phổ IR của chủng TC25 trên hệ thống chạy phổ IR........................................ 48
Hình 3.4. Dải phổ IR của chủng TC15 trên hệ thống chạy phổ IR........................................ 49
Hình 3.5. Phổ phân tích HPLC-MS của chủng Trichoderma TC15Error!
Bookmark
not
defined.
Hình 3.6. Trình tự peptaibol của chủng Trichoderma TC15.................................................. 51
Hình 3.7. Phổ phân tích HPLC-MS của chủng Trichoderma TC25Error!
Bookmark
not
defined.
Hình 3.9. Tỷ lệ ức chế (%) của hợp chất peptaibol thơ với Neoscytalidium dimidiatum.......61
Hình 3.10. Tỷ lệ đối kháng (%) của hợp chất peptaibol thô với Neoscytalidium dimidiatum62
vi
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm Trichoderma........................................... 45
Bảng 3.2. Đường kính tản nấm Trichodema (cm) sau các ngày nuôi cấy.............................46
Bảng 3.3. Hàm lượng peptaibol thu được của các chủng Trichoderma TC25 và TC15 sau khi
cô quay chân không.............................................................................................................. 47
Bảng 3.4. Hàm lượng alamethicin thu được tại bước sóng 215nmError!
Bookmark
not
defined.
Bảng 3.5. Hàm lượng peptaibol sau khi tinh chế với dung môi methanol thu được tại bước
sóng 215nm từ các chủng nấm khảo sát................................................................................ 49
Bảng 3.7. Trình tự peptaibol của chủng Trichoderma TC25 (trích từ cơ sở dữ liệu).......Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.8. Tỷ lệ ức chế (%) của hợp chất peptaibol thô với nấm Neoscytalidium dimidiatum
60
vii
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm gần đây, nền nông nghiệp Việt Nam có những bước tiến vượt bậc,
đáp ứng được nhu cầu lương thực - thực phẩm trong nước, ngoài ra sản lượng nơng sản xuất
khẩu cịn được xếp vào hàng đầu thế giới. Tuy nhiên, chất lượng và hiệu quả của việc sản
xuất nơng sản hàng hóa cịn nhiều hạn chế so với các nước trong khu vực. Vì thế, cơng tác
phát triển giống cây trồng và phòng trừ sâu bệnh hại đóng vai trị vơ cùng quan trọng. Tuy
nhiên biện pháp phịng trừ sâu bệnh hại bằng thuốc hóa học đã để lại nhiều hệ lụy, không chỉ
gây tốn kém chi phí cho nơng dân mà sự đa dạng hệ vi sinh vật đất cũng như chất lượng đất
bị suy giảm nghiêm trọng. Vì vậy, biện pháp sinh học được tập trung nghiên cứu và thay thế
dần các biện pháp hóa học. Các kết quả nghiên cứu cho thấy các lồi vi khuẩn, nấm như
Bacillus subtilis, Trichoderma, Pseudomonas có khả năng đối kháng với nhiều lồi nấm gây
bệnh có thể bảo vệ cây trồng chống lại các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời tạo điều kiện cho
cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt (Dunlap et al, 2013; Jamil Shafi et al., 2017;
Radhakrishnan et al., 2017). Vì thế, hiện nay khoảng 60% các chế phẩm sinh học đã đăng ký
trên thế giới là các sản phẩm dựa trên Trichoderma. Do Trichoderma có khả năng tiêu diệt vi
nấm gây hại cây trồng bằng nhiều cơ chế như ký sinh, sinh kháng sinh, tiết các enzyme
ngoại bào làm phân hủy vách tế bào nấm bệnh.
Ở Việt Nam, ứng dụng nấm Trichoderma trong nơng nghiệp rất nhiều. Tuy nhiên, ngồi
việc dùng trực tiếp bào tử Trichoderma sử dụng enzyme từ loài nấm này thì các hợp chất kháng
sinh có trong nấm vẫn chưa có tài liệu nghiên cứu nào. Do đó, việc nghiên cứu tách chiết
peptaibol ứng dụng trong phòng trừ nấm bệnh trên cây trồng sẽ là tài liệu tham khảo ban
đầu để tiếp tục mở rộng cho các hướng nghiên cứu tiếp theo về hợp chất này, không những
dừng lại giới hạn của việc dùng sinh khối trực tiếp trong việc phịng bệnh mà cịn có thể ứng
dụng để trị và ngăn sự lây lan phát tán của các loài nấm bệnh gây hại cây trồng.
1
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Xuất phát từ tính cấp thiết trên, sinh viên tiến hành đề tài “Tách chiết hợp chất kháng
sinh trong dịch lên men nấm Trichoderma ức chế nấm Neoscytalidium dimidiatum gây
bệnh đốm trắng thanh long”.
2 Mục đích nghiên cứu
Tách chiết hợp chất kháng sinh trong dịch lên men nấm Trichoderma ứng dụng phòng
trừ nấm gây bệnh đốm trắng trên thanh long.
3 Mục tiêu nghiên cứu
Xác định các kháng sinh peptaibol chứa trong dịch lên men nấm Trichoderma bằng
phương pháp sắc ký.
Khảo sát sơ bộ hiệu quả kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum của kháng sinh
peptaibol trong điều kiện invitro.
4 Đối tượng nghiên cứu
Nấm đối kháng: Chủng Trichoderma (TC25 và TC15) từ bộ sưu tập giống của Viện
khoa học ứng dụng Hutech.
Nấm gây bệnh: Chủng Neoscytalidium dimidiatum được cung cấp từ bộ sưu tập giống
của Viện khoa học ứng dụng Hutech.
5 Phương pháp nghiên cứu
5.1 Phương pháp tổng hợp tài liệu
Thu thập, tìm hiểu các tài liệu tham khảo, sách, giáo trình và internet liên quan đến đề tài.
5.2 Phương pháp nghiên cứu
Tách chiết hợp chất kháng sinh peptaibol từ các chủng nấm Trichoderma.
Xác định thành phần của kháng sinh peptailbol bằng phương pháp sắc ký.
Khảo sát sơ bộ khả năng ức chế của kháng sinh peptaibol với nấm bệnh Neoscytalidium
dimidiatum.
2
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
5.3 Phương pháp xử lý số liệu
Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát.
Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System 9.4 (SAS) và Microsoft Excel 2013.
6 Ý nghĩa khoa học của đề tài
Ý nghĩa khoa học: Đề tài đã xác định được hợp chất kháng sinh peptaibol có trong dịch
nuôi cấy nấm Trichoderma chủng TC25 và TC15 làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
Ý nghĩa thực tiễn: Bước đầu xác định được khả năng ức chế nấm Neoscytalidium
dimidiatum của chất kháng sinh có trong các chủng nấm TC25 và TC15 tạo cơ sở cho việc
ứng dụng hợp chất này trong phịng bệnh trên thanh long góp phần làm giảm thiệt hại cho
sản xuất thanh long.
7 Kết quả đạt được
Xác định được đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh trưởng của chủng Trichoderma
TC25 và TC15.
Xác định được các peptaibol chứa trong dịch chiết thô bằng phương pháp sắc ký.
Khảo sát được khả năng kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum từ dịch chiết kháng
sinh có trong các chủng nấm Trichoderma TC25 và TC15.
8 Kết cấu đề tài
“Tách chiết hợp chất kháng sinh trong dịch lên men nấm Trichoderma ức chế nấm
Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng thanh long” có tất cả 3 chương gồm:
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU: Giới thiệu tổng quan về nấm Trichoderma spp., phân
loại, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý sinh hóa, cơ chế kiểm soát sinh học của nấm. Giới
thiệu tổng quát về peptaibol và mức độ an tồn. Đồng thời, trình bày các đặc điểm sinh học cũng
như triệu chứng, thiệt hại của nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long.
Từ đó, đưa ra các kết quả nghiên cứu và ứng dụng của các biện pháp sinh học trong nông
3
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
nghiệp, nổi bật là dịch chiết kháng sinh peptaibol có trong nấm Trichoderma trong quản lý
bệnh hại trên cây thanh long, cụ thể như khả năng đối kháng với nấm bệnh cây trồng.
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: Trình bày về vật liệu và phương pháp
nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu bao gồm phần trình bày về thời gian và địa điểm tiến hành
đề tài, nguồn gốc nấm đối kháng, phương pháp tách chiết dịch Trichobrachin, nấm gây bệnh.
Phương pháp nghiên cứu tập trung ở dịch chiết thô peptaibol, cũng như đánh giá khả năng
đối kháng của dịch chiết thô peptaibol đối với nấm bệnh bằng phương pháp xử lý số liệu
thống kê SAS. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN: Trình bày kết quả xác định các
thành phần peptaibol có trong dịch chiết thơ. Qua đó, đánh giá khả năng đối kháng của dịch
chiết thơ peptaibol với nấm gây bệnh phổ biến trên cây thanh long.
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: Nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt
được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.
4
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp
1.1.1 Phân loại
Các chi Trichoderma được mô tả bởi Christiaan Hendrik Persoon năm 1794, nhưng các
nguyên tắc phân loại vẫn khó xác định. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa
vào sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và q trình sinh sản
bào tử vơ tính. Năm 1801, Persoon đã xác định Trichoderma thuộc phân loại:
Kingdom:
Division:
Class:
Order:
Family:
Genus:
Hình 1.1. Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum
( />
5
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Hình 1.2. Hình thái đại thể của một số chủng Trichoderma spp.
( />img=2104733_67fig15_23&req=4)
1.1.2 Đặc điểm hình thái
Sinh thái học của Trichoderma cho chúng ta biết sự phân bố của chúng trong đất. Nấm
Trichoderma có khu vực phân bố rất rộng, chúng hiện diện khắp nơi trong đất, trên vỏ cây
mục nát. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống
có khả năng phát triển ngay trên rễ. Khi quan sát hạch nấm hay chồi mầm của nhiều loại
nấm khác cũng có thể tìm thấy các lồi Trichoderma (Klein và Eveleigh, 1998). Sự phân bố
và điều kiện môi trường sống của các lồi Trichoderma có liên hệ mật thiết với nhau. Nhìn
chung các lồi Trichoderma xuất hiện ở vùng đất trung tính hoặc kiềm.
Cành bào tử khơng màu, sợi nấm khơng màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh
nhiều và cho lượng bào tử rất lớn. Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình trứng, trịn,
elip hoặc hình oval tùy từng lồi. Bào tử đính ở đỉnh của cành. Bào tử của hầu hết các lồi
có hình elip, 3 – 5 x 2 – 4 µm (L/W=1,3), bào tử hình cầu (L/W < 1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở
một vài loài. Đa số các bào tử trơn láng, kích thước khơng q 5 µm.
Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9 cm sau
0
4 ngày nuôi cấy ở 25 C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998). Chúng phát triển trên nhiều
loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO 2
6
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
ở mức cao (10%). Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả năng này mất dần đi. Điều
này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của Trichoderma.
Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan đến hiện
tượng làm giảm khả năng kháng nấm trong đất. Độ nhạy của đất kháng nấm được cơng bố
trên đất trung tính, đất kiềm chua và acid. Các bào tử phân sinh kháng nấm nhiều hơn hậu
mô bào tử, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào tử phân sinh. Thiết lập quần thể và hiện tượng nảy
mầm trong đất: VSV trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiều loại chất nền trong đất, có
nhiều phương pháp xác định khác nhau. Khi sợi nấm non (chưa có bào tử) vào đất chịu ảnh
hưởng nhiều bởi thành phần môi trường đất. Bào tử sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân
bằng trong đất (mật độ duy trì cân bằng trong đất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào đất).
Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà Trichoderma
harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng.
Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của Trichoderma
trong mơi trường khơng được cung cấp chất dinh dưỡng nên chlamydospores có thể được
dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học (Nguyễn Hồng Anh, 2013).
1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn
carbon và nitrogen. Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là monosaccharide,
disaccharide, polysaccharide… NH3 là nguồn đạm mà nấm Trichoderma dễ sử dụng nhất,
nên trong môi trường nuôi cấy Trichoderma người ta thường bổ sung NH3, những nguồn
nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho mơi trường có nhiều dinh dưỡng. Muối và các hỗn
hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma (Gary, 2005).
0
Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 30 C, có một vài lồi Trichoderma tăng trưởng được
0
0
ở 35 C. Một số ít phát triển tốt ở 40 C. Trichoderma phát triển tốt ở đất có độ pH từ 3,5
– 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5 và phát triển tốt ở pH trung tính
(Vũ Triệu Mân, 2007).
7
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Các lồi Trichoderma khác nhau thì u cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau. Ví
dụ: Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong mơi trường
có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum thích hợp ở nhiệt độ thấp,
Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu ấm áp. Ánh sáng có tác động sâu
sắc trên nhiều loại nấm bằng cách ảnh hưởng đến quá trình sống đa dạng của chúng, chẳng
hạn như: tác động đến tốc độ tăng trưởng, quá trình chuyển hóa, sắc tố và sự chuyển hóa.
Tác động của ánh sáng trên nấm đã là chủ đề được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và bàn
luận (Kubicek và Harman, 1998). Quá trình hình thành bào tử được cảm ứng theo hai con
đường khác nhau: thiếu dinh dưỡng hoặc ánh sáng. Khi khuẩn lạc của Trichoderma viride
phát triển trong cảm ứng tối do thiếu dinh dưỡng, hình thành bào tử màu xanh đậm và bắt
đầu khuếch tán từ trung tâm của khuẩn lạc, tại đó chất dinh dưỡng đã bị sử dụng hết. Mặt
khác, việc hình thành bào tử được cảm ứng bởi các xung ánh sáng tạo điều kiện cho các
khuẩn lạc phát triển trong tối, trước khi để chiếu sáng (Gary, 2004).
1.1.4 Cơ chế kiểm soát sinh học của nấm Trichoderma trong phòng trừ nấm gây bệnh
cây trồng
Trichoderma được sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại các loài nấm gây hại như:
Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia
spp., Botrytis spp. và
Fusarium spp.…gây bệnh khô vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, sầu riêng; bệnh
thối gốc trên các loại cây trồng như lúa, hồ tiêu, bắp, đậu, cà rốt, cà chua (Bùi Xuân Đồng,
1982).
Nấm Trichoderma spp. đối kháng với nấm bệnh bằng nhiều cơ chế khác nhau: ký sinh,
tiết kháng sinh để tiêu diệt nấm bệnh và cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh nơi sống với nấm
bệnh (Gary, 2004).
1.1.4.1 Cạnh tranh
Dinh dưỡng có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của VSV. Thiếu dinh
dưỡng được coi là nguyên nhân gây chết rất phổ biến. Trichoderma cạnh tranh khai thác với
8
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dưỡng chất một cách thụ
động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (Chlamydospores).
Ngồi ra, Trichoderma cịn cạnh tranh mơ già hoặc chết với nấm Botrysis spp. và
Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng
làm nền tảng để từ đó xâm nhập vào những mô khỏe). Nấm Trichoderma sử dụng những mô
già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm Trichoderma cạnh
tranh và triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. Không những
thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium spp. do dịch tiết của cây
kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Pythium spp. (gây bệnh
cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp.
bằng cách sử dụng dịch tiết của cây vì thế mà các bào tử Pythium spp. khơng thể nảy mầm.
Trichoderma cịn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của
mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Trần
Thị Thanh Thuần, 2009).
Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn carbon, nitơ và yếu tố cần thiết cho sự tăng
trưởng khác với nấm bệnh. T. harzianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây bệnh
trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại những vùng
bị nhiễm (Gullino, 1992). Sivan và Chet (1989), đã chứng minh rằng sự cạnh tranh chất dinh
dưỡng là cơ chế chính được T. harzianum sử dụng để kiểm soát nấm bệnh F. oxysporum.
1.1.4.2 Ký sinh
Là hiện tượng "giao thoa sợi nấm". Trước tiên sợi nấm Trichoderma vây xung quanh
sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm. Cuối cùng
nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng ngoài của nấm bệnh, gây nên sự
phân huỷ các chất nguyên sinh trong sợi nấm bệnh. Những nghiên cứu chi tiết gần đây bằng
kính hiển vi điện tử về vùng "giao thoa sợi nấm" cho thấy cơ chế chính của hiện tượng ký
sinh ở nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh là sự xoắn của sợi nấm Trichoderma quanh sợi
nấm vật chủ, sau đó xảy ra hiện tượng thủy phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà nấm
9
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Trichoderma xâm nhập vào bên trong sợi nấm vật chủ. Điều này dẫn đến hiện tượng chất
nguyên sinh ở sợi nấm vật chủ bị phá rối từng phần hoặc hồn tồn.
Hình 1.3. Hệ sợi nấm Trichoderma ký sinh trên nấm gây bệnh Rhizoctonia
solani (Agrios, 2005)
Cuối cùng, nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải phóng các sợi
nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma. Một điều quan trọng cho sự ký sinh của nấm
Trichoderma trên nấm gây bệnh cây là các bào tử của nấm Trichoderma sau khi mọc mầm
tạo thành sợi nấm phải tiếp xúc được với nấm vật chủ và phải hình thành được thể giác bám.
Thể giác bám này sẽ bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào của nấm vật chủ. Tỷ lệ
ký sinh sẽ tăng lên khi tăng sự tiếp xúc trực tiếp của nấm Trichoderma với nấm vật chủ.
1.1.4.3 Tiết kháng sinh (trích dẫn bởi Nguyễn Hoàng Anh, 2013)
Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy những vị trí mà nấm Trichoderma tiếp xúc và ký sinh
đã làm cho nấm bệnh chất. Tuy nhiên, ở những điểm khơng có sự tiếp xúc của nấm
Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất
kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh.
Howell (1987), thấy rằng những chủng T. virens đột biến mất khả năng ký sinh nhưng vẫn
giữ nguyên khả năng tổng hợp kháng sinh có hiệu quả kháng nấm bệnh R. solani tương đương
với chủng tự nhiên. Kết quả này đã chỉ ra rằng ký sinh khơng là cơ chế chính yếu trong phòng
trừ sinh học một bệnh cụ thể. Sự sinh kháng sinh cũng là một trong những đặc tính
10
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
quen thuộc của chi Trichoderma. Nó là một trong những cơ chế chính đối với điều khiển
sinh học. Những kháng sinh này có thể ức chế mạnh sự sinh trưởng của những VSV khác.
Khả năng sinh kháng sinh của các lồi, các chủng khơng giống nhau. Chúng gồm:
– Gliotoxin: Chất kháng sinh này được R. Weindling và O. Emerson mô tả năm 1936 do
nấm T. lignorum sinh ra. Gần đây được xác định lại là do nấm T. virens sinh ra. Chất
gliotoxin có phổ tác động rộng lên nhiều VSV: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, Botrytis,
Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia…).
– Steroids (viridin): Đây là chất kháng sinh thứ cấp do nấm Trichoderma tạo thành
trong hoạt động của chúng. Chất kháng sinh này được phát hiện năm 1945. Viridin độc hơn
rất nhiều so với gliotoxin và là một độc tố thực vật, có hiệu lực như một loại thuốc diệt cỏ,
giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm, được sản xuất từ T. virens.
– Trichodermin và Dermadin: Ở Nhật Bản năm 1975, Atsushi, Shunsuke đã phát hiện
được hai chất kháng sinh Trichodermin và Dermadin có trong dịch ni cấy loài T. koningii
và T. aureoviride.
Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có liên
quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides, isonitrin
D và F, trichorzianines, furanone do T. harzianum sinh ra; các kháng sinh gliovirin, viridian,
viridiol và valinotricin do T. virens sinh ra.
Các chất trao đổi thứ cấp được sản sinh từ Trichoderma là bao gồm một loạt các hợp chất
hóa học. Theo Ghisalberti và Sivasitham param (1991), chúng có thể được phân loại như sau: (i)
các chất kháng sinh dễ bay hơi như 6-pentyl - α – pyrone (6PP), (ii) các hợp chất hòa tan trong
nước như heptelidic acid hoặc koningic acid, (iii) peptaibol. Chất kháng sinh peptaibols là một
chuỗi các oligopeptides của 12 – 22 amino acid có chứa nhiều α - aminoisobutyric acid, Nacetylated tại N-terminus và chứa một amino alcohol (Phenol hoặc Trypol) tại C-terminus do T.
polysporum, harzianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng
trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme
11
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
phá hủy thành tế bào ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng
lại mầm bệnh.
Francesco Vinale và các cộng sự (2008), đã khảo sát khả năng đối kháng của Trichoderma
từ việc tiết kháng sinh để ức chế sự phát triển của các chủng nấm bệnh. Ông sử dụng chất kháng
sinh được tiết ra từ T. harzianum bổ sung vào môi trường nuôi cấy của chủng
P. ultimum. Kết quả ông thu được là: ở đĩa (1) mơi trường có chứa kháng sinh 6PP được tiết
ra từ chủng T. harzianum, ức chế sự phát triển của chủng P. ultimum.
Hình 1.4. Ức chế sự phát triển của nấm Pythium ultimum bởi chất kháng sinh được
tiết ra từ Trichoderma harzianum (Lê Thị Huệ, 2010)
1.1.4.4 Tăng khả năng kháng của thực vật
Ngoài khả năng bảo vệ giúp thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh tiềm ẩn trong đất,
nhiều loài trong chi Trichoderma được bổ sung vào đất cịn có khả năng kích thích cơ chế tự bảo
vệ thực vật chống lại virus, vi khuẩn, nấm. Trong trường hợp này, các nấm Trichoderma đóng
vai trị là những nhân tố mẫn cảm với rễ, kích thích hệ rễ miễn dịch chủ động và bị động
ở thực vật. Nấm Trichoderma cịn có tác dụng tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm
phát triển trong đất, kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân
giải chất xơ, chitin, ligin… trong các phế thải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng tạo điều
kiện cho cây trồng hấp thu dễ dàng (Susanne và ctv, 2007).
12
TIEU LUAN MOI download :
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Các chủng đặc trưng của nấm thuộc chi Trichoderma xâm nhập vào mơ rễ, sau đó bắt đầu
làm một loạt các thay đổi và hình thái và hóa sinh trong cây, điều này được xem như là phản
ứng phịng vệ của cây. Khi bón T. harzianum vào rễ cây đậu cho thấy rằng giảm được từ 25% 100% mốc xám trên lá do Botrytis cinerea gây ra. Các nhà khoa học đã sử dụng T. harzianum
T39 và chất benzothiadiazol để kiểm tra khả năng chống chịu Botrytis cinerea của cây cà chua
và thấy rằng chủng T. harzianum T39 ngăn cản sự phát triển của nấm bệnh ngay
ở giai đoạn đầu và giảm đến 30% tổn thương cho cây (Audenaert và ctv, 1998). Theo Yedidia và
ctv (1999), thì sự kích hoạt hệ thống phịng vệ của cây có liên quan đến rễ cây được xử lí với T.
harzianum T-203. Những rễ được bổ sung chủng T-203 cho thấy hoạt tính chitinase, β-1,3glucanase, cellulase và perosidase cao hơn so với đối chứng khơng xử lí trong 72 giờ. Cịn
những cây dưa leo được xử lí với 2,6 - dichloroisonicotinic acid, một chất cảm ứng cho hệ
thống phòng vệ của thực vật, cho thấy cũng có những phản ứng diễn ra nhưng khơng giống
với khi xử lí bằng T. harzianum. Theo Khan và ctv (2001) thì T. hamatum chủng 382 kích
ứng hệ thống kháng của cây cà chua đối với bệnh thối rễ và bạc lá do Phytophthora gây ra
(trích dẫn bởi Trần Thị Thanh Thuần, 2009).
1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của nấm Trichoderma spp trên thế giới và Việt
Nam
1.2.1 Trên thế giới
Hiện nay Trichoderma spp. đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như không được
đăng ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật. Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản xuất
và sử dụng như là chất kiểm sốt sinh học một cách có hiệu quả. Hình thức sử dụng dưới dạng
chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp
dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây (Nguyễn Kim Vân, 2009).
Trên thế giới có một số sản phẩm nấm Trichoderma được đưa vào ứng dụng tính đối
kháng nấm bệnh trên một số cây trồng. Sản phẩm Trichoderma 2000 (Israel) chứa
Trichoderma harzianum trong phòng chống nấm Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssim,
Pythium. Sản phẩm Trichopel (New Zealand) chứa nấm Trichoderma harzianum đối kháng
13
TIEU LUAN MOI download :
