Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ thu nhận isoflavone từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TRẦN TRẦN THỊ NGỌC THƯ THƯ

h
ại
Đ

ọc

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
THU NHẬN ISOFLAVONE TỪ MỘT SỐ NGUỒN
THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

Đ

Mã số:

9 54 01 01

à

Chuyên ngành: Cơng nghệ Thực phẩm

ẵn

N
g

TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT

Đà Nẵng, 2022


Cơng trình này được hồn thành tại:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA-ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Trương Thị Minh Hạnh

h
ại
Đ

2. TS. Bùi Xuân Vữngpgs. TS. Trương Thị Minh Hạnh
1. TS. Bùi Xuân Vững

Phản biện 1: PGS.TS. Trần Thanh Trúc

ọc

Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Hoàng Lộc
Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Quang Vinh

à

Đ
N

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận án tiến sĩ cấp
04 tháng 06 năm 2022

g

ẵn

trường họp tại Trường Đại học Bách khoa-Đại học Đà Nẵng vào ngày

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Trung tâm Học liệu và Truyền thông, Trường Đại học Bách Khoa
- Trung tâm Thông tin – Học liệu và Truyền Thông, Đại học Đà
Nẵng
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Isoflavone là một hợp chất thuộc nhóm flavonoid, thường có trong
các cây họ đậu, có hoạt tính estrogen giúp chống lại các triệu chứng
như loãng xương, trầm cảm, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, ung thư
vú, v.v…thường xuất hiện ở phụ tiền mãn kinh. Do đó, isoflavone
được giới khoa học trên thế giới quan tâm nhiều thập kỷ qua và được
sử dụng chế biến các sản phẩm thực phẩm chức năng, dược phẩm, mỹ

h
ại
Đ

phẩm, nước giải khát và đồ uống trên trong nước và trên thế giới. Tuy
nhiên, các nghiên cứu trong nước về isoflavone cịn ít, các sản phẩm
thực phẩm bổ sung isoflavone hầu hết nhập ngoại có giá thành cao. Vì
vậy cần xây dựng quy trình thu nhận isoflavone từ nguồn nguyên liệu

ọc

dồi dào trong nước và ứng dụng vào sản xuất thực phẩm bảo vệ sức
khỏe bổ sung isoflavone làm đa dạng hóa sản phẩm trong nước, giảm

Đ

giá thành sản phẩm so với sản phẩm ngoại nhập, phát triển nền nông

à

nghiệp và công nghiệp chiết xuất các hợp chất isoflavone. Do đó đề
tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone

N

từ một số nguồn thực vật và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức
2. Mục tiêu nghiên cứu

ẵn

năng” đã được lựa chọn.

g

Xây dựng quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone từ nguồn
nguyên liệu cung cấp isoflavone sẵn có tại khu vực miền Trung-Tây
Nguyên bao gồm các quá trình trích ly, tinh chế và nâng cao hàm lượng
hoạt tính sinh học cao isoflavone; Kiểm tra an toàn thực phẩm và hoạt
tính sinh học của cao isoflavone; Ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo
vệ sức khỏe bổ sung isoflavone.


2
3. Nội dung chính của luận án
Đánh giá thành phần và hàm lượng isoflavone ở một số nguyên liệu
thực vật tại khu vực miền Trung-Tây Nguyên; Khảo sát các phương
pháp trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành; Khảo sát các phương
pháp tinh chế và nâng cao hoạt tính cao isoflavone tinh chế; Kiểm tra
chất lượng an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học của cao isoflavone;
Đề xuất quy trình cơng nghệ thu nhận isoflavone; Ứng dụng cao
isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe; Đề xuất giải pháp

h
ại
Đ

tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau khi trích ly isoflavone.
4. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu trong luận án là phương pháp nghiên

cứu thực nghiệm kết hợp với phân tích lý thuyết và tổng hợp tài liệu.

ọc

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Luận án đã sử dụng quy hoạch thực nghiệm tồn phần 23 và mơ

Đ

hình thực nghiệm leo dốc Box-Wilson để tìm điều kiện trích ly

à

isoflavone tối ưu từ hạt và bã đậu nành. Luận án đã nghiên cứu cụ thể
sự hấp phụ và giải hấp phụ các hợp chất isoflavone từ cao trích ly hạt

N

và bã đậu nành theo mơ hình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir và

ẵn

Freundlich. Q trình hấp phụ và giải hấp phụ động học các hợp này
cũng đã được thực hiện trên sắc kí cột D101, là cơ sở để xây dựng quy

g

trình tinh chế quy mơ lớn.

Luận án xây dựng được quy trình thu nhận isoflavone từ hạt và
bã đậu nành với một số công đoạn được cải tiến: trích ly bằng chiết
khuấy, tinh chế bằng nhựa macroporous D101 và nâng cao hàm lượng
aglycone bằng chế phẩm enzyme Celluclast1.5L. Quy trình thu nhận

isoflavone dễ vận hành, chi phí thấp, an tồn và giảm thiểu ơ nhiễm
môi trường thông qua việc sử dụng dung môi ethanol và nước. Cao
thô và cao tinh chế isoflavone đã được chứng minh các hoạt tính sinh


3
học và đảm bảo an toàn thực phẩm. Hai sản phẩm thực phẩm bảo vệ
sức khỏe bổ sung giàu isoflavone từ cao isoflavone là sữa chua đậu
nành nước cốt dừa và nectar chanh dây đã được kiểm tra và đánh giá
đảm bảo các tiêu chuẩn trong nước.
6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 133 trang, 51 Bảng biểu, 61 Hình ảnh. Nội dung của
luận án gồm: Mở đầu (5 trang); Chương 1: Tổng quan (20 trang); Chương
2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (16 trang); Chương 3. Kết

h
ại
Đ

quả và thảo luận (89 trang); Kết luận và kiến nghị (3 trang).
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Trình bày các nghiên cứu trên thế giới và trong nước về các vấn đề:

ọc

1.1. Giới thiệu về isoflavone

Isoflavone là một phân nhánh thuộc nhóm flavonoid, có nhiều

Đ

trong các loại thực vật họ đậu (leguminosae). Các nguồn nguyên liệu

à

thực vật giàu isoflavone đã và đang được nghiên cứu hiện nay như đậu
nành, cỏ ba lá đỏ, cỏ linh lăng, đậu trắng, củ sắn dây, v.v… Các nhóm

N

aglycone (genistein, daidzein và glycitein) có hoạt tính sinh học cao

ẵn

và dạng -glycoside (genistin, daidzin và glycitin) ổn định với nhiệt
độ, chiếm lượng lớn trong tổng số thành phần isoflavone nên chúng

g

được quan tâm nhiều nhất để trích ly và sử dụng.

1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về công nghệ thu
nhận và ứng dụng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung
isoflavone
Trên thế giới, nhằm đáp ứng hàm lượng bổ sung vào các sản phẩm
thực phẩm bảo vệ sức khỏe isoflavone, nhiều cơng trình nghiên cứu về
phương pháp trích ly và tinh chế đã được công bố và ứng dụng vào quy
mô sản xuất công nghiệp, tuân theo các kỹ thuật trích ly “xanh”, dựa

4
vào các yếu tố về nguồn nguyên liệu và công nghệ khai thác “xanh”.
Tại Việt Nam, tuy có lợi thế về các nguồn nguyên liệu giàu
isoflavone, song các nghiên cứu trong nước về thu nhận isoflavone và
sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung cao isoflavone chưa được
nghiên cứu một cách toàn diện.
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

h
ại
Đ

2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu

Nguyên liệu thực vật dùng nghiên cứu trích ly isoflavone: Hạt đậu
nành (Glycine max (L.) Merr), hạt đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek)

ọc

được thu nhận tại Đại Lộc-Quảng Nam, củ sắn dây (Pueraria montana
var. lobata (Wild) Sanjappa& Pradeep) được thu nhận tại Thiệu Hóa,
Thanh Hóa và bã đậu nành được thu nhận tại cơ sở chế biến đậu phụ,

Đ

sữa đậu nành tại Đà Nẵng. Nguyên liệu được làm sạch, sấy khô, trộn

à

đều, xay mịn và bảo quản trong hộp kín ở nhiệt độ -20±2oC.

N

2.1.2. Hóa chất, chế phẩm sinh học và thiết bị sử dụng chính
Các chất chuẩn isoflavone, hóa chất phân tích được sử dụng trong

ẵn

nghiên cứu có xuất xứ từ hãng Merck (Đức), Sigma (Hoa kỳ) và các

g

hãng khác, đạt chuẩn phân tích. Các loại nhựa macroporous được sử
dụng để nghiên cứu gồm: D101, AB8 (Anhui Sanxing Resin
Technology Co., Ltd, Trung Quốc), Diaion HP20 (Mitsubishi
Chemical Corporation, Nhật Bản) và Amberlite XAD4 (Acros, Pháp).
Giống vi khuẩn lactic thương mại Yoflex Express 1.0 (Chr Hansen
Đan Mạch), chế phẩm enzyme thương mại Celluclast 1,5L
(Novozymes, Đan Mạch) được sử dụng trong nghiên cứu.


5
2.2. Bố trí thí nghiệm
2.2.1. Đánh giá hàm lượng isoflavone và thành phần trong một số
loại nguyên liệu thực vật
Khảo sát hàm lượng isoflavone và một số thành phần hóa học của
4 loại nguyên liệu: hạt đậu nành, hạt đậu xanh, củ sắn dây và bã đậu
nành. Hàm lượng isoflavone của các loại nguyên liệu này được đánh

giá theo 6 hợp chất gồm: daidzein, genistein và glycitein (thuộc nhóm
aglycone), daidzin, glycitin và genistin (thuộc nhóm -glycoside).

h
ại
Đ

2.2.2. Khảo sát các phương pháp trích ly đến hiệu quả thu nhận
isoflavone từ hạt đậu nành và bã đậu nành
Khảo sát điều kiện trích ly isoflavone trên nguyên liệu đã lựa

chọn bằng 2 phương pháp: chiết khuấy và dùng sóng siêu âm; tiến

ọc

hành tối ưu hóa điều kiện trích ly theo hàm lượng isoflavone bằng quy
hoạch thực nghiệm toàn phần 2 mức 3 yếu tố và leo dốc tìm cực trị

Đ

theo mơ hình Box-Wilson.
từ hạt và bã đậu nành

à

2.2.3. Khảo sát các phương pháp tinh chế cao isoflavone thu nhận

N

Khảo sát lựa chọn tinh chế isoflavone gồm trích ly rắn-lỏng và

ẵn

sắc ký cột (hạt pha tĩnh là các loại nhựa macroporous). Khảo sát nâng
cao hàm lượng aglycone bằng thủy phân glycoside isoflavone sử dụng

g

chế phẩm enzyme Celluclast1.5L.

2.2.4. Kiểm tra chất lượng an toàn thực phẩm và hoạt tính sinh học
của cao isoflavone
Cao isoflavone được kiểm tra an toàn thực phẩm (hàm lượng kim
loại nặng, độc tính cấp v.v..) và kiểm tra hoạt tính sinh học (hoạt tính
estrogen in vitro và in vivo, hoạt tính bảo vệ gan ex vivo, hoạt tính
chống peroxy hóa lipid v.v..).


6
2.2.5. Đề xuất quy trình thu nhận isoflavone từ hạt và bã đậu nành
Đề xuất quy trình cơng nghệ với 1 số giải pháp công nghệ được
cải tiến.
2.2.6. Ứng dụng isoflavone để sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe
Xây dựng 2 quy trình sản xuất sữa chua đậu nành-nước cốt dừa và
nectar chanh dây bổ sung isoflavone từ đậu nành và bã đậu nành đạt
chất lượng sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe theo tiêu chuẩn Việt
Nam

h
ại

Đ

2.2.7. Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau khi
trích ly isoflavone

Đánh giá thành phần hóa học và đề xuất giải pháp sử dụng

phụ phẩm bột đậu nành sau khi trích ly isoflavone ứng dụng chế biến

ọc

các sản phẩm thực phẩm.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

Đ

Một số phương pháp nghiên cứu được sử dụng:

à

Phân tích isoflavone theo phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC
(AOAC 2008.83) và các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh được thực hiện theo

N

tiêu chuẩn Việt Nam.

ẵn

Phương pháp đánh giá cảm quan: phép thử mô tả đặc tính của sản
phẩm, phép thử cho điểm thị hiếu, phép thử so hàng thị hiếu, phép thử

g

tam giác được thực hiện.

Các thí nghiệm đều được thực hiện ít nhất 2 lần, kết quả được
trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, so sánh sự khác
nhau có nghĩa theo chuẩn Fisher ở mức ý nghĩa =0,05. Tính tốn quy
hoạch thực nghiệm tồn phần 3 yếu tố 2 mức TYT23 và phân tích
ANOVA thực hiện trên phần mềm Minitab 18.


7
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá hàm lượng isoflavone và thành phần hóa học từ một
số nguyên liệu thực vật
Hàm lượng isoflavone tổng trong đậu nành cao nhất, gấp 14,30
lần so với bã đậu nành, và gấp 4,25 lần so với củ sắn dây. Đậu xanh
hạt chỉ xuất hiện genistein với hàm lượng rất thấp. Mặt khác đậu nành
là cây ngắn ngày, thâm canh từ 2-3 vụ trong năm, cho sản lượng lớn,
giá rẻ. Trong khi sắn dây chỉ thu hoạch 1 lần/năm nên giá thành cao.

h
ại
Đ

Việc sử dụng bã đậu nành để trích ly isoflavone vừa đóng vai trị quan
trọng về mặt tận dụng giá trị dinh dưỡng cịn lại, vừa giảm thiểu ơ

nhiễm mơi trường. Hình 3.1. và 3.3 mơ tả sắc kí đồ của 6 hợp chất
isoflavone đậu nành và bã đậu nành. Do đó nghiên cứu chọn nguyên

ọc
à

Đ
N

chất isoflavone.

ẵn

liệu đậu nành và bã đậu nành để tiến hành khảo sát trích ly nhóm hợp

nhận isoflavone từ hạt đậu nành

g

3.2. Ảnh hưởng của một số phương pháp trích ly đến hiệu quả thu
3.2.1. Phương pháp chiết khuấy
Nghiên cứu đã khảo sát đơn biến 5 yếu tố ảnh hưởng đến q trình
trích ly sử dụng phương pháp chiết khuấy. Giữa 3 mẫu trích ly có sự
khác nhau về pH môi trường (pH 2,5, pH 7,1; pH 9), mẫu có pH 7,1
cho hàm lượng isoflavone cao nhất và khơng có sự khác biệt có nghĩa
giữa các mẫu (p>0,05). Kết quả cho các yếu tố nồng độ ethanol, tỉ lệ


8
DM/NL, nhiệt độ và thời gian trích ly có tác dụng đáng kể đến hàm

lượng isoflavone thu nhận (hình 3.5 và 3.7).

h
ại
Đ

3.2.2. Phương pháp dùng sóng siêu âm
Qua phân tích 2 chiều ANOVA
về hàm lượng isoflavone của các

ọc

mẫu thí nghiệm, nghiên cứu đã
chọn được điều kiện siêu âm đạt

Đ

giá trị hàm lượng isoflavone tổng

à

cao nhất là 70% mức NLSA-15

phút (1773,0±21,7g/g chất khơ)

N

(hình 3.11).
ly thực nghiệm
siêu âm tại mức NLSA 70% giữ

g

Trích ly isoflavone bằng sóng

ẵn

3.2.3. So sánh hiệu quả thu nhận isoflavone từ 2 phương pháp trích

được hoạt tính chống oxi hóa của
các hợp chất isoflavone và rút
ngắn được thời gian trích ly
nhưng khó ứng dụng trong cơng
nghiệp. Phương pháp trích ly bằng
chiết khuấy cho hiệu quả trích ly cao hơn và đơn giản, dễ vận hành,


9
chi phí năng lượng thấp hơn so với phương pháp siêu âm (hình 3.12).
Vì vậy trong các nghiên cứu tiếp theo, phương pháp chiết khuấy được
lựa chọn để trích ly isoflavone.
3.3. Tối ưu hóa điều kiện trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành
bằng phương pháp chiết khuấy
Ứng dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm toàn phần để đánh
giá ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố là nhiệt độ (x1), thời gian (x2)
và tỉ lệ DM/NL (x3) đến q trình trích ly isoflavone. Qua tính tốn và

h
ại
Đ

phân tích đã xây dựng được phương trình hồi quy (pt 3.1).
Ỹđậu nành= 1803,63+65,00x1+24,96x2+68,99x3 - 44,98x1x3 (pt 3.1)

ọc
à

Đ
N

Phương trình hồi quy (pt 3.1) đã thể hiện sự ảnh hưởng đồng biến

ẵn

của 3 yếu tố nhiệt độ, thời gian và tỉ lệ dung mơi/ngun liệu trên cả
2 ngun liệu. Ngồi ra sự tương tác giữa 2 yếu tố nhiệt độ và tỉ lệ

g

dung mơi/ngun liệu ảnh hưởng đến q trình trích ly. Hình 3.13 đã
thể hiện rõ sự ảnh hưởng của các yếu tố này trên mặt phẳng không
gian 3 chiều.
Tiếp tục tối ưu hóa q trình trích ly bằng mơ hình leo dốc tìm cực
trị Box-Wilson, đã tìm được điều kiện tối ưu: nhiệt độ 72,5oC trong
67,5 phút, với tỉ lệ DM/NL=26,5/1 (ml/g), đạt hàm lượng isoflavone
tổng số là 1932,4 μg/g nguyên liệu khơ.
Q trình trích ly isoflavone từ bã đậu nành cũng đã được thực hiện


10

tối ưu hóa bằng quy hoạch thực nghiệm tồn phần tương tự như ở hạt
đậu nành. Kết quả thực nghiệm cũng thu được phương trình hồi quy
bậc nhất (pt 3.2). Tối ưu hóa q trình trích ly bằng mơ hình leo dốc
tìm cực trị Box-Wilson đã chọn được điều kiện trích ly là 74,5° ở 79,0
phút và tỉ lệ dung DM/NL= 26,5/1 (ml/g) đạt hàm lượng isoflavone
cực đại 160,2 (g/g).
Ỹbã

đậu nành

= 133,52+5,99x1+5,10x2+5,28x3

(pt 3.2)

Như vậy, q trình trích ly isoflavone từ hạt đậu nành và bã

h
ại
Đ

đậu nành bằng phương pháp chiết khuấy phù hợp với mơ hình thực
nghiệm tồn phần, thể hiện sự ảnh hưởng đồng biến của 3 yếu tố nhiệt
độ, thời gian và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu trên cả 2 nguyên liệu.
3.4. Ảnh hưởng của phương pháp tinh chế cao isoflavone thô thu

ọc

nhận từ hạt và bã đậu nành.

3.4.1. Tinh chế cao isoflavone thô thu nhận từ hạt đậu nành bằng

Đ

phương pháp trích ly lỏng-rắn
ethyl

acetate

và

à

Thực hiện khảo sát trên hệ đơn dung môi (ethanol, 2-propanol,
dichloromethane)

và

hệ

hai

dung

môi

N

(dichloromethane/ethanol, acetone/nước). Trong các hệ dung mơi nêu

ẵn

trên, chỉ hệ dichlomethane/ethanol có tỉ lệ 1/3 (v/v) cho hàm lượng thu
nhận cao trích ly cao nhất, đạt 35,501±0,313(mg/g)) và hiệu suất thu

g

hồi trên 50%.

3.4.2. Khảo sát một số loại nhựa macroporous dùng tinh chế
isoflavone từ hạt đậu nành
Bốn loại hạt nhựa macroporous đều hấp phụ và giải hấp phụ tốt với
các isoflavone.
Cụ thể, khả năng hấp phụ của tổng số isoflavone, daidzin và
genistin nằm trong khoảng 4,89-5,32 mg/g, 1,31 -1,45 mg/g hạt nhựa
và 2,19-2,35 mg/g hạt nhựa tương ứng (hình 3.18a). Tỷ lệ hấp phụ của


11
4 loại nhựa nằm trong khoảng 76,1-82,1% đối với isoflavone tổng số,
64,0-71,0% đối với daidzin và 79,3-85,1% đối với genistin (hình
3.18b) và giữa các loại nhựa khơng có sự khác nhau có nghĩa (p>0,05).

h
ại
Đ

Tương tự, khả năng giải hấp và tỷ lệ giải hấp của tổng số
isoflavone, genistin và daidzin giảm theo thứ tự Amberlite® XAD4>

ọc

D101> AB-8> HP-20. Khả năng giải hấp của daidzin, genistin và tổng
số isoflavone trên nhựa D101 lần lượt là 1,45 mg/g hạt nhựa, 2,21 mg/

Đ

g hạt nhưa và 4,48 mg/g hạt nhựa và có sự khác biệt không đáng kể
(p> 0,05) giữa nhựa D101 và Amberlite® XAD4 (hình 3.19).

à
g

ẵn

N
So với nhựa Amberlite® XAD4 có thành cao, nhựa D101 lại có giá
thành rẻ hơn và năng lực hấp phụ và giải hấp phụ tương tự như XAD-4.
Do đó, nhựa D101 được lựa chọn là nguyên liệu cho quá trình tinh chế
isoflavone.


12
3.4.3. Nghiên cứu tinh chế isoflavone từ cao thô thu nhận từ hạt
đậu nành bằng nhựa macroporous D101
Theo đồ thị hình 3.20 cho thấy quá trình hấp phụ đẳng nhiệt của
isoflavone từ đậu nành phù hợp với mơ hình Langmuir và Freundlich.

h
ại
Đ

ọc

Trên mơ hình hấp phụ sắc kí cột (hình 3.22) đã chọn được thể tích
dung dịch isoflavone hấp phụ là 3,75 BV, tức 750ml với tốc độ với tốc
độ hấp phụ là 1,5 BV/h.

à

Đ
ẵn

N
g

Kết quả thực nghiệm khảo sát khả năng giải hấp phụ qua cột D101
(hình 3.23) cho thấy lượng ethanol 70% cần để rửa giải các hợp chất
isoflavone hoàn toàn ở 2,5BV với tốc độ rửa giải là 1 BV/h. Trong đó,
đường cong rửa giải tập trung từ 0,5BV đến 1,5BV, đạt đỉnh tại
0,625BV cho daidzin, genistin và isoflavone tổng cho thấy khả năng
rửa giải hấp phụ nhanh chóng (hình 3.22 và 3.23). Cao isoflavone tinh
chế đạt được 144,664±1,214 (mg/g), gấp 8,73±0,06 lần so với cao thô
và gấp 3 lần so với cao dichlomethane/ethanol thực hiện bằng phương


13
pháp trích ly rắn lỏng.
3.4.4. Khảo sát điều kiện nâng cao hàm lượng aglycone từ cao
isoflavone tinh chế bằng chế phẩm enzyme Celluclast 1.5L
Nghiên cứu này nhằm mục tiêu nâng cao hàm lượng aglycone

trong cao isoflavone tinh chế bằng phương pháp thủy phân nhóm
-glycoside sử dụng chế phẩm enzyme Celluclast1.5 L. Khảo sát đã
cho thấy các yếu tố thủy phân là nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất và
thời gian thủy phân đã ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển hóa các hợp

h
ại
Đ

chất -glycoside sang các hợp chất aglycone tương ứng. Tại thời điểm
thủy phân là 360 phút, hiệu suất thủy phân của daidzin, glycitin và
genistin đạt trên 96% và đạt hiệu suất thu hồi daidzein, glycitein và
genistein lần lượt là 91,8, 71,6 và 84,3 và khơng có sự khác biệt có

ọc

nghĩa (p>0,05) so với thời điểm 420 phút và 480 phút. Kết quả nghiên
cứu đã cho thấy chế phẩm enzyme Celluclast1.5 nồng độ với nồng

Đ

độ enzyme là 0,16%, trong thời gian 360 phút và nồng độ cơ chất 17,5

à

mg/ml đã thủy phân hồn tồn nhóm -glycoside thu được hàm lượng
nhóm aglycone chiếm trên 95% hàm lượng isoflavone tổng.

N

Hình 3.27 thể hiện hàm lượng aglycone tăng và các pic của hàm

g

ẵn

lượng glycoside hầu như không xuất hiện sau khi thủy phân.

3.4.5. Nghiên cứu tinh chế isoflavone thu nhận từ bã đậu nành
bằng nhựa macroporous D101
Isoflavone từ bã đậu nành cũng cho thấy phù hợp với 2 mơ hình
hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir và Freundlich (hình 3.30).


14
Trên mơ hình sắc kí cột, cao isoflavone tinh chế từ bã đậu nành
đạt được 36,216 (mg isoflavone /g cao), tăng gấp 7,090 lần so với cao
thô, đạt hiệu suất thu hồi là 74,82%.

h
ại
Đ

Như vậy kết quả tinh chế isoflavone từ hạt và bã đậu nành bằng

nhựa D101 thu được đã đáp ứng mục tiêu đề ra là nhằm gia tăng hàm
lượng isoflavone để bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm. Mặt khác,

ọc

phương pháp sử dụng nhựa hấp phụ D101 để tinh sạch isoflavone là
phương pháp hiệu quả về công nghệ và kinh tế do sử dụng các dung
dung môi, hiệu suất thu hồi cao.

à

Đ

môi nước cất và ethanol nên an tồn, khơng gây độc hại, dễ thu hồi
3.5. Kiểm tra hoạt tính sinh học và tính an tồn thực phẩm của cao

N

tinh chế

ẵn

3.5.1. Kiểm tra hoạt tính sinh học của cao isoflavone

Thử nghiệm hoạt tính estrogen in vitro 4 loại cao isoflavone trên

g

dòng tế bào MCF7 cho thấy cao tinh chế từ hạt đậu nành tăng sinh
được 14,94% tế bào và từ bã đậu nành là 7,41% tế bào.

Kết quả thực nghiệm thử nghiệm hoạt tính estrogen in vivo cao
isoflavone từ hạt đậu nành trên chuột cái thuần chủng dòng BALB/c
đã được làm suy giảm buồng trứng bằng 4-vinylcyclohexene
diepoxide (VCD) cho thấy ở các lơ chuột có bổ sung các mẫu cao chiết

không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể chuột, làm tăng khối lượng
tử cung chuột so với mẫu đối chứng bệnh lý bị suy giảm buồng trứng.


15
Hình 3.33 thể hiện tử cung chuột của các mẫu thử nghiệm có biểu
hiện ít bị teo nhỏ so với mẫu đối chứng âm của lơ chuột sử dụng VCD.

Hình 3.33: Hình ảnh tử cung của chuột ở các lơ thí nghiệm

Mặt khác các mẫu cao chiết isoflavone đã làm tăng sự phát triển

h
ại
Đ

nang trứng, hàm lượng estradiol trong huyết thanh so với lô chuột đối
chứng bệnh lý. Như vậy các cao chiết isoflavone đã thể hiện chức năng
của một estrogen, cải thiện tình hình của chuột suy giảm buồng trứng
đều cao hơn so với chuột xử lý VCD.

ọc

Thử nghiệm hoạt tính chống peroxy hóa lipid ex-vivo trên tế bào

gan chuột, các mẫu cao tinh chế có giá trị EC50(µg/ml) lần lượt là

Đ

360,65±17,49 (g/ml) và 418,13±9,19(g/ml), thể hiện được khả năng

chống peroxide hóa lipid. Ngồi ra, bốn mẫu cao isoflavone được thử

à

hoạt tính bảo vệ gan trên mơ hình ni cấy tế bào HepG2 dưới tác

N

động của CCl4.

ẵn

Kết quả khảo sát hiệu quả quét gốc tự do DPPH của cao
isoflavone cho thấy hiệu quả quét gốc tự do tỉ lệ thuận với hàm lượng

g

isoflavone trong mẫu. Giá trị IC50(µg/ml) cao tinh chế từ hạt đậu nành
và bã đậu nành lần lượt đạt 352,3 (µg/mL) và 853,6 (µg/mL).
3.5.2. Kiểm tra tính an toàn thực phẩm của cao tinh chế
Kết quả thử nghiệm hoạt tính độc cấp cả 4 mẫu cao isoflavone
khơng thể hiện khả năng gây độc cấp tính cho chuột nhắt trắng dòng
BALB/c theo đường uống trong thử nghiệm uống liều cao nhất là
10 gram/kg thể trọng, đảm bảo an tồn thực phẩm.
Kết quả phân tích hàm lượng kim loại nặng như Pb, Cd, As và Hg


16
trong cao tinh chế đậu nành và bã đậu nành đều dưới giới hạn định
lượng của phương pháp phân tích (AOAC 999.10).

Tóm lại, qua phân tích cho thấy cao isoflavone từ đậu nành và bã
đậu nành đều đảm bảo an tồn thực phẩm và thể hiện được các hoạt
tính sinh học bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng.
3.6.1. Đề xuất quy trình sản xuất isoflavone từ hạt và bã đậu nành
3.6.1. Đề xuất quy trình trích ly, tinh chế và nâng cao chất lượng
cao isoflavone từ hạt và bã đậu nành

ọc

h
ại
Đ
à

Đ
g

ẵn

N


17
Quy trình cơng nghệ trích ly, tinh chế và nâng cao chất lượng cao
isoflavone từ hạt và bã đậu nành được trình bày ở hình 3.39 cho 3
nhóm sản phẩm: sản phẩm bột cao isoflavone thô, sản phẩm bột cao
isoflavone tinh chế và sản phẩm bột cao giàu aglycone.
3.6.2. Đề xuất giải pháp tận thu phụ phẩm bột đậu nành sau khi

ọc

h
ại
Đ

trích ly isoflavone
So với mẫu bột đậu nành nguyên liệu, bột đậu nành sau khi trích ly
isoflavone giữ lại hầu hết các thành phần hóa học như protein tổng
(32,692g/100g), lipid (17,810g/100g), xơ tổng(12,897g/100g) và các
khoáng chất (Ca, P, K, Mg). Hàm lượng acid béo linoleic chiếm gần
50%, kế đến là oleic acid và palmitic acid, tương tự như trong bột đậu
nành. Từ các phân tích trên cho thấy bột đậu nành sau khi đã trích ly
isoflavone là nguồn nguyên liệu giàu thành phần protein và lipid, đề
xuất ứng dụng chế biến cao protein đậu nành và dầu ăn.
3.7. Ứng dụng cao isoflavone trong sản xuất thực phẩm bảo vệ sức

à

Đ

khỏe

3.7.1. Thử nghiệm sản xuất sữa chua đậu nành-nước cốt dừa bổ

N

sung isoflavone thu nhận từ đậu nành

ẵn

Nghiên cứu đã lựa chọn được công thức phối chế của sữa chua đậu
nành-nước cốt dừa với tỉ lệ nước cốt dừa bổ sung là 15% so với dịch

g

sữa đậu nành là phù hợp để dùng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe
bổ sung isoflavone. Sản phẩm sữa chua đậu nành-nước cốt dừa với
liều lượng cao isoflavone thô bổ sung là 1 g cao thơ/100g sản phẩm
(kí hiệu SoCY) đã được kiểm tra đảm bảo các chỉ tiêu hóa lý, chỉ tiêu
vi sinh lượng (theo QCVN 5-5:2010/BYT Quy chuẩn kỹ thuật quốc
gia đối với các sản phẩm sữa lên men, Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN
7030:2016 Sữa lên men). Hàm lượng isoflavone có trong sản phẩm là
21,15 mg/100g sản phẩm, đạt hơn 15% so với liều dùng tối thiểu


18
khuyến cáo hằng ngày là từ 3090 mg/ngày. Hình 3.42 thể
hiện

sắc

ký

đồ

HPLC

isoflavone của 2 mẫu sữa chua,
minh chứng cho sự gia tăng
hàm lượng isoflavone ở mẫu

bổ sung cao thô isoflavone
(SoCY) so với mẫu đối chứng không bổ sung isoflavone. Sản phẩm

h
ại
Đ

sữa chua đậu nành-nước cốt dừa bổ sung isoflavone đã được Hội đồng
cảm quan thị hiếu cho điểm đạt trên 7 điểm cho các chỉ tiêu (trạng thái,
màu, mùi, vị và mức chấp nhận chung), cao hơn có nghĩa so với các
mẫu sữa chua khác (p<0,05), khơng có sự khác biệt so với mẫu sữa

ọc

chua nước cốt dừa không bổ sung isoflavone.
Luận án đã đề xuất quy trình chế biến sản phẩm bảo vệ sức khỏe

Đ

sữa chua đậu nành-nước cốt dừa được mơ tả chi tiết trên hình 3.45.

à

Sản phẩm sữa chua đậu nành-nước cốt dừa đã được xây dựng “Bản
công bố sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone”,

N

đáp ứng được các điều kiện cần về thực phẩm bảo vệ sức khỏe Nghị

g

ẵn

định 15/2018 NĐ-CP về Luật thực phẩm.


19

ọc

h
ại
Đ
à

Đ
Hàm lượng cao isoflavone tinh
sản phẩm nectar chanh dây là

g

chế từ bã đậu nành được bổ sung vào

ẵn

tinh chế từ bã đậu nành

N

3.7.2. Thử nghiệm sản xuất nectar chanh dây bổ sung cao isoflavone

0,5g/100ml để đảm bảo hàm lượng
isoflavone tổng là 17,87mg/100 ml
sản phẩm (bảng 3.43). Sản phẩm
nectar chanh dây bổ sung isoflavone
đảm bảo các chỉ tiêu chất lượng hóa lý và vi sinh theo
TCVN 7946:2008 Nước quả và nectar -Quy định kỹ thuật và


20
QCVN 6-2:2010/BYT Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về Đồ uống
không cồn. Đồng thời 200ml sản phẩm nectar chanh dây sẽ cung cấp
gần 40mg isoflavone, phù hợp với liều lượng isoflavone khuyến nghị
cho người tiêu dùng. Sản phẩm đạt điểm thị hiếu >7,5 điểm đối với
các chỉ tiêu cảm quan (trạng thái, màu, mùi, vị và mức chấp nhận
chung), và khơng có sự khác biệt có nghĩa so với sản phẩm đối chứng
không bổ sung isoflavone (p>0,05) do Hội đồng đánh giá cảm quan
gồm 100 thành viên. Điều này chứng minh sản phẩm bổ sung

h
ại
Đ

isoflavone khơng ảnh hưởng đến tính chất cảm quan và các chỉ tiêu
hóa lý của sản phẩm nectar chanh dây.

ọc
à

Đ
g

ẵn

N


21

Quy trình cơng nghệ chế biến sản phẩm bảo vệ sức khỏe nectar
chanh dây bổ sung isoflavone được đề xuất ở hình 3.53. Với kết quả
nghiên cứu này, sản phẩm nectar chanh dây đã được xây dựng “Bản
công bố sản phẩm thực phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung isoflavone”,
đáp ứng được các điều kiện cần về thực phẩm bảo vệ sức khỏe.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

h
ại
Đ

A. Kết luận

1- Từ 4 loại nguyên liệu thực vật có sản lượng lớn tại khu vực miền
Trung-Tây Nguyên, nghiên cứu đã chọn hạt đậu nành và bã đậu

ọc

nành làm nguyên liệu để thu nhận isoflavone. Hàm lượng hợp chất
này trong hạt đậu nành là 1.579,1 (µg/g chất khơ) và bã đậu nành chứa

Đ

111,5(µg/g chất khô).

à

2- Luận án đã cho thấy rằng giữa hai phương pháp trích ly isoflavone
từ đậu nành, phương pháp chiết khuấy có gia nhiệt 45 phút-70oC

N

cho hàm lượng isoflavone (1843,8 g/gchấtkhơ) cao hơn trích ly siêu

ẵn

âm (1773,0 g/gchất khơ).

3- Q trình trích ly isoflavone phù hợp với mơ hình quy hoạch thực

g

nghiệm với 2 mức và 3 yếu tố ảnh hưởng (TYT23), thể hiện sự ảnh
hưởng chính của nhiệt độ, thời gian và tỉ lệ dung mơi/ngun liệu.
Điều kiện trích ly isoflavone đã được tối ưu theo mơ hình BoxWilson:

+ Hạt đậu nành: 72,5°C - 67,5 phút, tỉ lệ dung mơi/ngun liệu=
26,5/1 đạt hàm lượng isoflavone trong dịch trích ly là
1932,44 g /gchất khô NL.

+ Bã đậu nành: 74,5oC -79 phút, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu


22
= 26,5/1 đạt hàm lượng isoflavone trong dịch trích ly là
160,21g /gchất khô NL.
4- Qua khảo sát khả năng tinh chế của 4 loại nhựa macroporous
(D101, Amberlite XAD-4, Diaion HP-20 và AB-8), nhựa D101 đã
được lựa chọn để tinh chế isoflavone. Luận án đã nghiên cứu và
giải thích cụ thể sự hấp phụ các hợp chất isoflavone từ hạt đậu nành
và bã đậu nành bằng nhựa D101 theo mơ hình đẳng nhiệt hấp phụ
Langmuir và Freundlich, tính được dung lượng hấp phụ cực đại của

h
ại
Đ

isoflavone từ đậu nành và bã đậu nành lần lượt là
7,396 (mg/g hạt D101) và 3,786 (mg/ghạt D101).
5- Bằng mơ hình sắc kí cột D101 đã tinh chế được các hợp chất
isoflavone với hàm lượng isoflavone cao tinh chế của đậu nành

ọc

(144,664 mg/g) và bã đậu nành ( 36,216 mg/g) gấp từ 7-9 lần so
với cao thô ban đầu, đạt hiệu suất thu hồi xấp xỉ 80%. Kết quả

Đ

nghiên cứu này cao hơn so với phương pháp trích ly với hệ

à

dichlomethanol/ethanol (1/3 v/v) có hàm lượng cao trích ly đạt
35,456±0,313 mg/g và hiệu suất thu hồi là 53,33%.

N

6- Q trình thủy phân nhóm β-glycoside đã xảy ra hồn tồn bằng

ẵn

chế phẩm enzyme Celluclast®1.5L với nồng độ enzyme là 0,16%,
trong thời gian 360 phút và nồng độ cơ chất 17,5 mg/ml, thu được
tổng số.

g

hàm lượng nhóm aglycone chiếm trên 95% hàm lượng isoflavone
7- Đánh giá chất lượng cao thô và cao tinh chứa isoflavone thu nhận
từ hạt và bã đậu nành

+ Hoạt tính nội tiết tố estrogen:
− Tỉ lệ tăng sinh tế bào MCF-7 của cao tinh/cao thô (%) đạt
14,94/3,90 từ hạt đậu nành và 7,41/1,07 từ bã đậu nành.


23
− Bằng phương pháp in vivo trên lô chuột cái trắng nhận thấy
bổ sung isoflavone [cao thô (M1)/cao tinh (M3)] với liều

lượng 2.000/1.000 (mg/kg thể trọng chuột) đã cho sự phục
hồi khối lượng tử cung chuột đã bị xử lý VCD (mg/10g thể
trọng chuột) từ 20,7 lên 27,3/từ 20,7 lên 26,6.

+ Hoạt tính sinh học:
− Hoạt tính bảo vệ dịng tế bào gan HepG2 của cao tinh/cao
thô (%) đạt giá trị lần lượt 15,39/2,32 từ hạt đậu nành;

h
ại
Đ

22,17/4,55 từ bã đậu nành.

− Sử dụng phương pháp MDA-test đánh giá khả năng chống
peroxy hóa lipid màng tế bào của isoflavone trong cao tinh
thông qua giá trị IC50 (g/ml): 360,65 từ hạt đậu nành và

ọc

418,13 từ bã đậu nành.

8- Đề xuất cải tiến cơng đoạn trích ly bằng chiết khuấy và tinh chế

Đ

hoạt chất isoflavone bằng nhựa macroporous D101 trong dây

à

chuyền trích ly isoflavone từ hạt và bã đậu nành. Nâng cao hàm
lượng aglycone bằng chế phẩm enzyme Celluclast 1.5L.

N

9- Đề xuất mới 2 quy trình cơng nghệ sản xuất thực phẩm bổ sung

ẵn

isoflavone là sữa chua đậu nành-nước cốt dừa và nectar chanh dây.
Hai quy trình đề xuất trên đã được xây dựng bản cơng bố Sản phẩm
B. Những đóng góp mới của luận án

g

thực phẩm bảo vệ sức khỏe theo Nghị định 15/2018 NĐ-CP.
1- Q trình trích ly isoflavone từ hạt đậu nành và bã đậu nành bằng
chiết khuấy đạt được thơng số trích ly tối ưu, với việc tăng nhiệt độ
trích ly và lượng dung mơi sử dụng nên rút ngắn thời gian trích ly.
2- Tinh chế isoflavone từ đậu nành và bã đậu nành bằng sắc ký cột
D101 là đề xuất mới cho quy trình tinh chế isoflavone quy mô
công nghiệp, đáp ứng “SẢN XUẤT XANH”.