HOÀN THIỆN PHƯƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƯỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD pptx

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP





HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG
DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA
BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN
CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD


Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: VÕ CÔNG DANH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP





HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG
DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA
BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN
CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD



Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. BÙI MINH TRÍ VÕ CÔNG DANH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007
iii

LỜI CẢM TẠ

Không ngôn từ nào có thể nói hết tình yêu con dành cho Ba Mẹ, ngƣời sẵn sàng hy
sinh tất cả vì con.
Cảm ơn các anh em, những ngƣời luôn tạo động lực cho tôi tiến lên.
Em xin chân thành cảm ơn:
Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận
tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học.
Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học
đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận.
Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận.
Chị Hƣng, chị Dung, chi Trân, anh Thế, anh Phƣơng, anh Khoa cùng
các anh chị trong Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ
Môi trƣờng đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa
luận.
Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong quá trình thu thập mẫu.
Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản
lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu
thập mẫu. Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học 29 đã cùng tôi
chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt bốn năm đại học.

Chân thành cảm ơn!

Võ Công Danh

iv

TÓM TẮT

VÕ CÔNG DANH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2007. “HOÀN
THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH
QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”.
Cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) tại khu dự trữ sinh quyển rừng
ngập mặn Cần Giờ rất có giá trị về kinh tế và môi trƣờng. Việc nghiên cứu đa dạng
di truyền của cây đƣớc đôi là cấp thiết nhằm bảo vệ, quản lý và phát triển khu dự
trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ theo hƣớng đa dạng sinh học.
Những kết quả đạt đƣợc
Thu thập đƣợc 40 mẫu lá đƣớc với những đặc điểm hình thái khác nhau
Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu lá đƣớc
Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ lá đƣớc
Xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây đƣớc
Kết quả thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 trên 10 mẫu kết quả
thu đƣợc 5 band đa hình chiếm tỷ lệ 83,3% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 16,7%.
Phân tích kết quả RAPD với phần mềm NTSYSpc cho kết quả nhƣ sau: các
mẫu đƣớc trồng cùng năm có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – 1,00. Các mẫu
đƣớc trồng năm 1978 và năm 1980 có hệ số đồng dạng di truyền biến thiên trong
khoảng 0,50 – 0,83. Các mẫu đƣớc nguồn gốc tại chỗ đƣợc trồng năm 1991 và trồng
năm 1996 có hệ số đồng dạng di truyền là 0,50. Những cây đƣớc đôi nguồn giống
tại chỗ và nguồn giống Cà Mau có hệ số đồng dạng di truyền khá thấp từ 0,33 đến
0,67.

( II )
( III )
v

SUMMARY

VO CONG DANH, Nong Lam University Ho Chi Minh City, September 2007.
“DEVELOP A METHOD TO ACEESS THE GENETIC DIVERSITY OF
Rhizophora apiculata Blume IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE
BY RAPD-PCR”
Mangrove population (Rhizophora apiculata Blume) in Can Gio swamp
forest eco-conservation area has a high economic and environmental value.
Researching the genetic diversity of this plant is necessary to preserve and develop
this area in a sustainable way.
Obtained results were:
Collected 40 samples of Rhizophora apiculata
Found out the best conditions to preserve Rhizophora apiculata
Completed DNA extraction protocol from Rhizophora apiculata
Established RAPD protocol for Rhizophora apiculata
We analysed 10 samples using RAPD with primer OPAC 10 and got 5
polymorphic bands (100 – 600kb) and 1 monomorphic band (170 kb) which made
up 83,3 percents and 16,7 percents of bands.
Analyse RAPD data with NTSYSpc software showed following results:
Rhizophora apiculata planted in 1978, 1980 had high similarity from 0,83 to 1,00.
Compare R. apiculata planted in 1978 with the one planted in 1980 showed a
similarity from 0,50 to 0,83. The similarity of local R. apiculata and the one planted
in 1991 or in 1996 is 0,50. While the local R. apiculata and the one from Camau
plants had long distance from 0,33 to 0,67.

vi

MỤC LỤC
CHƢƠNG TRANG
LỜI CẢM TẠ iii
TÓM TẮT iv
SUMMARY v
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH x
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ xi
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích, yêu cầu, giới hạn của đề tài 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu 2
1.2.3. Giới hạn đề tài 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 3
2.1.1. Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 3
2.1.2. Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 5
2.1.3. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 6
2.2. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây đƣớc đôi 8
2.2.1. Hình thái học 8
2.2.2. Phân bố 9
2.2.3. Vai trò của rừng đƣớc 9
2.3. Quy trình ly trích DNA thực vật 9
2.3.1. Đánh giá chất lƣợng DNA 11
vii

2.4. PCR (Polymerase chain reaction) 12
2.4.1. Khái niệm 12
2.4.2. Nguyên tắc 13
2.4.3. Ứng dụng 13
2.4.4. Ƣu và nhƣợc điểm 13
2.5. Đa dạng di truyền 14
2.5.1. Khái niệm 14
2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền 14
2.6. Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) 15
2.6.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 16
2.6.2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 17
2.6.3. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 18
2.6.4. Một số nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên cây đƣớc 21
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 22
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 22
3.1.1. Thời gian thực hiện 22
3.1.2. Địa điểm thực hiện 22
3.2. Vật liệu thí nghiệm 22
3.1.2. Mẫu đƣớc đôi 22
3.2.2. Hoá chất thí nghiệm 23
3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm 24
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 25
3.3.1. Bố trí thí nghiệm 25
3.3.2. Phƣơng pháp ly trích DNA 25
3.3.3. Kiểm tra kết quả ly trích 28
3.3.4. Kỹ thuật RAPD 30
viii

3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS 34
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1. Kết quả thu thập mẫu đƣớc tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần
Giờ 36
4.2. Bảo quản mẫu 36
4.3. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA 37
4.4. Kết quả phản ứng RAPD – PCR 44
4.4.1. Thí nghiệm 1 44
4.4.2. Thí nghiệm 2 45
4.4.3. Thí nghiệm 3 45
4.4.4. Thí nghiệm 4 46
4.4.5. Thí nghiệm 5 47
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51
5.1. Kết luận 51
5.2. Đề nghị 51
TÀI LIÊU THAM KHẢO 53
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 53
TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 54
PHỤ LỤC




ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine
bp: Base pair
CTAB: Cetyltrimethyl Ammonium Bromide
dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
DNA: Deoxyribonucleic acid

EB: Extraction Buffer
EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid
ng: Nanogram
OD: Optical density
PCR: Polymerase chain reaction
RNA: Ribonucleic acid
RNase: Ribonuclease
RAPD: Random Amplified Polymorphism of DNA
SDS: Sodium Dodecyl Sulfate
SIDA: Swedish Inernaional Devolopment cooperration Agency
TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA
TE: Tris EDTA
Tm: Melting temperature
UNESCO: United Nations Educational Scientific and Cultural Organization
UBND: Ủy ban Nhân dân
UV: Ultra Violet


x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4
Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD 19
Hình 3.1 Lá, hoa, trái của cây đƣớc đôi 23
Hình 4.1 Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 36
Hình 4.2 DNA tổng số của 4 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập
mặn Cần Giờ (Ly trích theo 3 quy trình ) 40
Hình 4.3 DNA tổng số của 6 mẫu lá đƣớc (Lá già và lá non) thu thập ở khu dự trữ
sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo quy trình 3). 40

Hình 4.4 DNA tổng số của 17 mẫu lá đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng
ngập mặn Cần Giờ 41
Hình 4.5 DNA tổng số pha loãng của 17 mẫu lá đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh
quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 41
Hình 4.6 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 3 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ
sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 44
Hình 4.7 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ Mg
2+
ở thí nghiệm 2 45
Hình 4.8 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer OPAC10

ở thí nghiệm 3 45
Hình 4.9 Sản phẩm PCR thử nghiệm 2 primer OPAC10 VÀ OPA10 46
Hình 4.10 Sản phẩm PCR của 10 mẫu đƣớc ở thí nghiệm 5 47
Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền của 10 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh
quyển ngập mặn Cần Giờ 48




( I )
( II )
xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 2.1 Phân tách các đoạn DNA trong gel theo kích thƣớc 12
Bảng 2.2 Các loại chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 15
Bảng 3.1 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD 30

Bảng 3.2 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD 31
Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg
2+
đến sản phẩm RAPD
với primer OPAC10 32
Bảng 3.4
Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD
với primer OPAC10 33
Bảng 3.5 Thực hiện phản ứng RAPD với primer OPA10 và OPAC10. 33
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất thích hợp sử dụng trong phản ứng RAPD 33
Bảng 4.1 Bảng giá trị OD của 6 mẫu đƣớc (Lá non và lá già) thu thập ở khu dự trữ
sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 10 mẫu dùng để thực hiện phản ứng PCR với
chỉ thị phân tử RAPD 42
Bảng 4.2 Bảng giá trị OD của 10 mẫu đƣớc dùng để thực hiện phản ứng PCR với
chỉ thị phân tử RAPD 43
Sơ đồ 4.1 Sơ đồ ly trích DNA từ lá đƣớc đôi theo quy trình 3 39
1


Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đƣớc đôi hay đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) là cây có giá trị về kinh
tế và môi trƣờng. Gỗ đƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi trong xây dựng nhà cửa, đóng vật
dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản. Than đƣớc
cho nhiệt lƣợng cao và ít khói [13]. Vỏ có nhiều tanin đƣợc dùng trong công nghệ
thuộc da, công nghệ dƣợc phẩm, kỹ nghệ in, nhuộm, làm keo dán. Rừng đƣớc sản
sinh nhiều bã mùn làm nền tảng cho chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển, cửa
sông. Các khu rừng đƣớc có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng
sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở và ngăn

chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển. Mặt khác các khu rừng đƣớc là
nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm. [5]
Trong chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập măn Cần Giờ đã bị hủy diệt hoàn
toàn bởi hàng chục ngàn tấn bom đạn, hàng triệu lít hóa chất khai quang đã rải
xuống gây thiệt hại vô cùng nghiêm trọng về tài nguyên và môi trƣờng sinh thái. Từ
năm 1978, Thành phố tiến hành khôi phục lại hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ
với hầu hết giống đƣớc đƣợc thu mua ở Năm Căn (Cà Mau). Qua 22 năm khôi
phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng ngập mặn Cần Giờ đã
thống nhất công nhận là “Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ” vào ngày
21/01/2000 [5]. Trƣớc áp lực là khu dữ trữ sinh quyển thế giới cùng với những vai
trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi trƣờng thì việc nghiên cứu đa dạng di
truyền của cây đƣớc đôi là vô cùng cấp thiết. Trên cơ sở đó, các cơ quan chức năng
sẽ có chiến lƣợc bảo vệ, quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn
Cần Giờ theo hƣớng đa dạng sinh học. Rừng đƣớc trồng thuần rất nhạy cảm và dễ
bị tổn hại khi có những tác động bên ngoài. Mặt khác chúng ta cũng có thể tìm ra
các chỉ thỉ phân tử nhằm rút ngắn thời gian cho quá trình chọn giống, tạo giống
phục vụ cho công tác trồng rừng, đảm bảo cho sự phát triển bền vững.
2


Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Nông
Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy Bùi Minh Trí, chúng tôi đã tiến hành
thực hiện đề tài: “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA
BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG
KỸ THUẬT RAPD”.
1.2. Mục đích, yêu cầu, giới hạn của đề tài
1.2.1. Mục đích
Hoàn thiện kỹ thuật RAPD trên cây đƣớc đôi.
Xác định đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi tại khu dữ trữ sinh quyển

rừng ngập mặn Cần Giờ.
1.2.2. Yêu cầu
Thành thạo thao tác ly trích DNA tổng số từ mẫu lá đƣớc
Nắm vững kỹ thuật RAPD, hạn chế sai sót khi thực hiện
Hiểu rõ phần mềm NTSYSpc 2.1
1.2.3. Giới hạn đề tài
Đề tài chỉ tiến hành nghiên cứu đối với quần thể đƣớc tại một số tiểu khu
trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
Chỉ tiến hành kiểm tra 2 primer chọn lọc dùng trong RAPD
Thời gian thực hiện từ ngày 08/05/2007 đến 30/08/2007.

3


Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
2.1.1. Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa bàn huyện Cần Giờ,
đƣợc hình thành ở hạ lƣu sông Đồng Nai - Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam
Thành phố Hồ Chí Minh có tọa độ địa lý nhƣ sau:
Vĩ độ Bắc 10
0
22’14’’ – 10
0
37’9”
Kinh độ Đông 106
0
46’12’’ – 107
0

00’59’’
Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp Biển Đông, phía Tây giáp tỉnh
Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu.
Khí hậu Cần Giờ có hai mùa rõ rệt: mùa mƣa từ tháng 5 - 10 và mùa nắng từ
tháng 11 – 4. Nhiệt độ trung bình 25,8
0
C. Lƣợng mƣa thấp, trung bình từ 1.300 –
1.400 mm/năm. [5]
Trƣớc kia rừng ngập mặn Cần Giờ che phủ một vùng khoảng 40.000 ha; Tài
nguyên động thực vật, thủy sản nƣớc lợ hết sức phong phú, đa dạng. Tán rừng dày
kín, cây rừng cao trung bình trên 20 m, đƣờng kính 25 – 40 cm. Đƣớc (Rhziophora
apiculata) là loài chiếm ƣu thế, cùng với các loài khác nhƣ bần trắng (Sonneratia
alba), mấm trắng (Avicennia alba), đƣng (Rhizophora mucronata), vẹt (Sonneratia
alba), xu (Xylocarpus spp.), cóc (Lumnizera spp.), chà là (Phoenix paludosa), giá
(Excoecaria aagallocha). Trong thời gian chiến tranh chống Pháp và đặc biệt trong
thời kỳ chống Mỹ , bom đạn cùng các loại chất độc hóa học đã hủy hoại gần nhƣ
toàn khu rừng này. Đến 1978, Thành ủy và UBND Thành phố Hồ Chí Minh chỉ đạo
ngành Lâm Nghiệp, UBND huyện Cần Giờ phục hồi lại hệ sinh thái rừng ngập mặn
đa dạng độc đáo này. Hiện nay, rừng ngập mặn Cần Giờ có trên 30.000 ha, chiếm
17% diện tích tự nhiên của toàn Thành phố và 46% diện tích của toàn huyện Cần
Giờ.[5]
4

Thảm thực vật Cần Giờ là môi trƣờng sống cho nhiều loài động vật; Theo
thống kê năm 1999 nhƣ sau:
Khu hệ động vật thủy sinh không xƣơng sống có trên 700 loài thuộc 44 họ,
19 bộ, 6 lớp, 5 ngành.
Khu hệ cá có trên 137 loài thuộc 39 họ và 13 bộ.




Ghi chú:



Vùng đệm

Vùng lõi

Vùng chuyển tiếp

Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

5


Khu hệ động vật có xƣơng sống trên cạn có 9 loài lƣỡng thê, 31 loài bò
sát, 4 loài hữu nhũ. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt
Nam nhƣ tắc kè (Gekko gekko), kỳ đà nƣớc (Varanus salvator), trăn đất
(Python molurus), trăn gấm (Python reticulatus), rắn cạp nong (Bungarus
fasciatus), rắn hổ mang (Naja naja), rắn hổ chúa (Ophiophagus), vích
(Chelonia), cá sấu hoa cà (Crocodylus posus) [5]
Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 loài
chim nƣớc và 79 loài không phải là chim nƣớc sống trong nhiều sinh cảnh
khác nhau.
2.1.2. Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Theo báo cáo về diễn biến môi trƣờng Việt Nam năm 2005 của tổ chức
SIDA, phần đa dạng sinh học đã đánh giá: “Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ, nằm ở
huyện ven biển phía Nam Thành phố Hồ Chí Minh, đã trở thành một trong những
điểm phục hồi rừng ngập mặn lớn nhất thế giới. Khu này có diện tích 75.740 ha,
gồm chủ yếu là rừng ngập mặn, với trên 200 loài động vật và thực vật nƣớc mặn và
nƣớc lợ”. Tổng diện tích 75.740 ha đƣợc phân chia thành 3 vùng: vùng lõi, vùng
đệm và vùng chuyển tiếp. [5]
2.1.2.1. Vùng lõi
Tổng diện tích: 4.721 ha gồm các tiểu khu 3, 4b, 6, 11, 12, 13 với sự đa dạng
cao về thực vật, động vật và các dạng sinh cảnh của rừng ngập mặn.
Các chức năng chính:
Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn cả rừng trồng và rừng tự nhiên.
Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn và các môi trƣòng sống của động vật

hoang dã, đặc biệt là chim nƣớc.
Bảo tồn thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển để tái sinh tự nhiên
cả các loài thực vật lẫn động vật.
Nghiên cứu khoa học
6


Du lịch sinh thái (Phải có giới hạn). [5]
2.1.2.2. Vùng đệm
Tổng diện tích: 37.339 ha bao gồm các tiểu khu 1, 2, 4a, 5, 7, 9, 10, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 và 24.
Chức năng: phục hồi các hệ sinh thái dựa trên các quần xã chiếm ƣu thế, bao
gồm:
Góp phần bảo vệ chung vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển.
Tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hoá nhân văn phục vụ cho du lịch sinh
thái.
Các mô hình lâm ngƣ kết hợp thân thiện với môi trƣờng cũng đƣợc ứng
dụng trong vùng này cho cƣ dân địa phƣơng.
2.1.2.3. Vùng chuyển tiếp
Tổng diện tích: 29.310 ha bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ
cả các khu lúa nƣớc và vƣờn cây ăn trái cùng thảm cỏ biển dọc theo ven biển Cần
Thạnh, Long Hoà, Lý Nhơn.
Chức năng:
Đệm xã hội: các hoạt động sản xuất trong vùng chuyển tiếp cung cấp các
loại sản phẩm và dịch vụ chủ yếu cho cƣ dân địa phƣơng. Việc sử dụng đất
và tài nguyên thiên nhiên trong khu vực này không đƣợc mâu thuẫn với
mục tiêu của khu dự trữ sinh quyển. Mối quan hệ giữa con ngƣời và thiên
nhiên cần phải đƣợc hài hòa.
Đệm mở rộng: việc quản lý và phát triển của vùng chuyển tiếp nhằm mục
tiêu mở rộng không gian có sẵn nhƣ môi trƣờng sống cho các loài thú

hoang dã từ vùng đệm. [5]



7


2.1.3. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ vừa là “lá phổi” vừa là “quả
thận” có chức năng làm sạch không khí và nƣớc thải từ các Thành phố công nghiệp
từ thƣợng nguồng sông Đồng Nai – Sài Gòn trƣớc khi ra Biển Đông. Tán cây rừng
dày kín là một nhà máy khổng lồ hấp thụ CO
2
và cung cấp nguồn O
2
quan trọng cho
Thành phố, đƣợc gió mùa Đông Nam góp phần thổi từ biển vào Nội thành nơi đang
bị ô nhiễm trầm trọng. Theo số liệu khoa học của đề tài nghiên cứu “Phát triển
mảng xanh đô thị Thành phố Hồ Chí Minh Đến 2010”, tính trên diện tích 20.000 ha
rừng trồng ở Cần Giờ trong suốt 25 năm qua, lƣợng CO
2
do cây rừng hấp thu đƣợc
là 10.164.440 tấn, lƣợng O
2
sinh ra là 6.776.296 tấn.[5]
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là môi trƣờng lý tƣởng lọc
nƣớc thải từ Thành phố Hồ Chí Minh, các khu công nghiệp Bình Dƣơng, Biên Hòa
đƣa xuống trƣớc khi ra biển. Số lƣợng nƣớc thải hàng năm đƣa xuống rừng Cần Giờ
là 587.000 m
3

. [5]
Các loài vi sinh vật trong đất, trong nƣớc sinh sôi phát triển nhƣ vi khuẩn,
nấm sợi, nấm men. Chúng có khả năng phân huỷ các chất hữu cơ rơi rụng, các xác
bã động thực vật, khoáng hóa thành các chất dinh dƣỡng, thức ăn cung cấp cho các
loài động thực vật rừng ngập mặn. Đặc biệt một số loài nấm sợi, nấm men có khả
năng phân giải dầu DO rất mạnh, làm cho nguồn nƣớc bị ô nhiễm trở nên trong
sạch. [5]
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là môi trƣờng cung cấp thức
ăn và bảo vệ các loài thuỷ sản sinh sôi, phát triển. Cây rừng có tác dụng điều hoà
nhiệt độ nƣớc và không khí. Nguồn lợi thủy sản xuất khẩu của Cần Giờ mang lại là
rất lớn. Hàng năm đạt từ 400 - 500 tỷ đồng, góp phần quan trọng nâng cao đời sống
nhân dân vùng rừng Cần Giờ. [5]
Sau khi rừng Cần Giờ đƣợc công nhận là khu dự trữ sinh quyển của thế giới,
lƣợng du khách đến tham quan, nghỉ ngơi, học tập và nghiên cứu khoa học ngày
càng tăng và số tiền thu đƣợc mỗi năm hàng chục tỷ đồng. Các hoạt động du lịch
8


sinh thái đã và đang tăng lên, tạo ra thêm nhiều công ăn việc làm nâng cao đời sống
ngƣời dân. [5]
2.2 Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây đƣớc đôi
Giới: Plantae
Nhóm: Tracheophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Rhizophorales
Họ: Rhizophoraceae
Giống: Rhizophora
Loài: Rhizophora apiculata
2.2.1. Hình thái học
Thân: cây cao 20 – 30 m, đƣờng kính có thể đạt tới 50 cm vỏ đen hay nâu sậm

với các đƣờng nứt ngang vòng qua thân, gỗ màu đỏ có đƣờng tỷ, rễ phụ hình chân
nôm có thể cao tới 1,5 m.
Lá: lá hình bầu dục và dài 15cm, rộng 6 cm, đầu nhọn, gân chính. Cuống lá
màu đỏ dài từ 1,5 – 3 cm, lá phụ màu hồng hay hơi đỏ dài từ 4 – 8 cm có tác dụng
bảo vệ lá non.
Hoa: hoa tự tán mọc ở nách lá, hoa không cuống kích thƣớc từ 3 – 4 mm xuất
phát từ các búp hình noãn dài 15 – 20 mm, lá nhỏ cong lên đầy thịt có kẻ hở hình
răng bao vòng phần dƣới của hoa. Đài hoa có cánh cong vào trong, nhọn, dài 10 –
14 mm, rộng từ 6 – 8 mm. Cánh đài hơi nhọn, mỏng không có lông, xoay quanh
một nhuỵ đối diện dài 8 – 11 mm. Nhụy có 4 ở ngoài cánh hoa và 4 ngoài đài hoa
không cuống nhọn, dài từ 6 – 7,5 mm, bầu noãn bán hạ phần trên cao hơn mặt đĩa từ
1,5 – 2,5 m, vòi nhuỵ dài từ 0,5 – 1 mm đầu bị chẻ đôi. Đƣớc trổ bông sau 5 – 6
năm vào tháng 4 – 5 đầu mùa mƣa. [9]
Trái: màu xanh, khi già có màu nâu hoặc hồng dài từ 20 – 25 cm, phần dƣới
phình ra, phần trên đƣợc bao bởi một ống trùm lên lá non phủ xuống 2 – 3 cm. Đầu
9


chóp có một mũi tà màu hơi hồng khi trái chín., mùa rụng trái thƣờng xảy ra từ
tháng 7 – 9 hàng năm. Thời gian bắt đầu ra hoa đến lúc trái thuần thục thƣờng kéo
dài 36 tháng, có khoảng 40 – 50 trái/kg. Trái nảy mầm trong một tuần lễ sau khi
trồng.
2.2.2. Phân bố
Đƣớc (Rhizophra apiculata) là loài cây mọc chủ yếu ở rừng ngập mặn, vùng
cửa sông ven biển khu vực nhiệt đới. Rừng ngập mặn phồn thịnh nhất là ở Đông
Nam Á nhƣ Malaysia, Indonesia, Thailand, Nam Việt Nam, Campuchia, Philippin.
Đƣớc thích mọc trên đất phù sa cận sinh đã đƣợc bần (Sonneratia alba), mấm
(Avicennia alba) cố định.
2.2.3. Vai trò của rừng đƣớc
Đƣớc là loài cây có sinh khối lớn, gỗ đƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi để xây

dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh
bắt thủy sản. Than đƣớc cho nhiệt lƣợng cao và ít khói. Vỏ có nhiều tanin đƣợc
dùng trong công nghệ thuộc da, công nghệ dƣợc phẩm, kỹ nghệ in, nhuộm, làm keo
dán. Đƣớc sau khi trồng 15 năm có thể thu đƣợc 15 tấn gỗ/ha [13]. Rừng đƣớc sản
sinh nhiều bã mùn làm nền tảng cho chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển, cửa
sông. Các khu rừng đƣớc có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng
sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở, sa mạc
hóa, ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển. Hơn thế nữa các khu
rừng đƣớc là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm.
2.3. Quy trình ly trích DNA thực vật
Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers
và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình
của Ziegenhagen và Fladung (1997). Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm
riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng đƣợc cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số
lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng
10


là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết
thích hợp.
Phƣơng pháp ly trích DNA cơ bản gồm ba bƣớc:
Bƣớc 1: phá màng tế bào và màng nhân bằng phƣơng pháp cơ học (nghiền).
Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào, trong một hỗn hợp chất tẩy (nhƣ SDS,
Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào
và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên
kết với DNA. Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt
động của các enzyme thủy phân nội bào, ngƣời ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào
bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (-198
0
C). Sau đó sử

dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (Phá vỡ hóa học).
Bƣớc 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein. Sự loại bỏ này dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử
khác nhau (Nucleic acid/ protein) trong hai pha không hòa tan (Chloroform, nƣớc).
Mẫu đƣợc lắc nhẹ trong dung dịch chloroform/iso amylalcohol (tỉ lệ 24/1). Dung
dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid.
Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic
acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha chloroform.
Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại.
Bƣớc 3: tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhƣng
thông thƣờng ngƣời ta dùng isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly
tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu
vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận
nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các
enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong
muốn. [3]


11


Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA:
DNA bị phân hủy hoặc bị gãy.
Có lẫn tạp RNA trong mẫu DNA.
Có lẫn tạp polysaccharide trong mẫu DNA.
Có lẫn tạp polyphenol trong mẫu DNA.
2.3.1. Đánh giá chất lƣợng DNA
2.3.1.1. Định lƣợng DNA bằng quang phổ
Sau khi ly trích, chất lƣợng DNA đƣợc xác định bằng máy soi màu ở độ dài
sóng 260nm. DNA trong dung dịch (1mg/ml) sẽ hấp thu sóng 260 nm. Một đơn vị

OD trong điều kiện sóng 260 nm (OD
260
) sẽ cho kết quả nồng độ DNA ở 50 μg/ml
của DNA mạch kép. Tuy nhiên, cách tính chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid
tinh sạch. Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị hấp thu
bƣớc sóng 280 nm (OD
280
). Tỷ số OD
260
/OD
280
là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất
nhƣ phenol hoặc protein. Tỷ số OD
260
/OD
280
là 1,8 đối với DNA tinh khiết.
2.3.1.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
Phƣơng pháp này dựa trên một đặc tính của acid nucleic là ở pH trung tính
chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodiester
của các sợi acid nucleic. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dƣơng khi
đặt chúng vào điện trƣờng. Kỹ thuật này đƣợc tiến hành trên một giá thể bán rắn gọi
là gel có tác dụng phân tách các phân tử acid nucleic theo kích thƣớc. Các phân tử
acid nucleic đi qua những lỗ nhỏ trong gel, kích thƣớc phân tử càng lớn thì di
chuyển càng chậm trong gel. Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng
đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các
lỗ có trong gel. Tùy theo kích thƣớc các phân tử cần phân tích ngƣời ta sử dụng 1
trong 2 loại gel:
Polyacryamid: phân tích DNA sợi đơn kích thƣớc dƣới 500 bp. Gel đƣợc đổ
giữa 2 tấm thuỷ tinh và phƣơng điện di là phƣơng thẳng đứng. Các phân tử DNA

đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng và nhận biết vị trí bằng phƣơng pháp phóng xạ
12


tự ghi, hoặc nhuộm bằng chất nhuộm chuyển biệt nhƣ bạc, khi đó các băng sẽ có
màu tím đỏ dƣới ánh sáng ban ngày bình thƣờng. [8]
Agarose: phân tích DNA sợi đôi, kích thƣớc từ 0,5 – 2kb. Gel đƣợc đổ trên
giá thể nằm ngang và điện di theo phƣơng nằm ngang. Để phát hiện DNA trên gel
ngƣời ta dùng chất nhuộm ethidium bromide, chúng có khả năng xen vào giữa các
base của acid nucleic và phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại, acid nucleic sẽ hiện ra
dƣới dạng các vạch màu đỏ cam có thể chụp ảnh và ghi nhận lại.[8]
Dựa vào kết quả điện di: so sánh các băng với băng chuẩn có thể biết chất
lƣợng DNA ly trích nhƣ gãy, lẫn tạp.
Bảng 2.1 Phân tách các đoạn DNA trong gel theo kích thƣớc [8]







(Lê Đình Lƣơng, 2001)
(Lê Đình Lƣơng, 2001)
(Lê Đình Lƣơng, 2001)
2.4. PCR (Polymerase chain reaction)
2.4.1. Khái niệm
Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một
cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng
DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất
hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng tỉ bản sao DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc

thu nhận từ DNA mẫu. [6]
Loại gel
Phạm vi phân tách (bp)
0,3% agarose
50.000 đến 1000
0,7% agarose
20000 đến 300
1,4% agarose
6000 đến 300
4% acrylamid
1000 đến 100
10% acrylamid
500 đến 25
20% acrylamid
50 đến 1
13


2.4.2. Nguyên tắc
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện qua 25-35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các
bƣớc: Biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài.
Biến tính: đây là bƣớc làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn.
Nhiệt độ thiết kế là 94
0
C
Gắn mồi: đây là bƣớc primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích (sợi đơn).
Nhiệt độ thay đổi từ 50 - 60
0
C. Nhiệt độ trong bƣớc này tùy thuộc vào độ
dài của cặp primer.

Kéo dài: 72
0
C, 60 – 90 giây. Đây là bƣớc kéo dài primer nhờ hoạt động
của Taq polymerase. Nhiệt độ 72
0
C là tối ƣu cho hoạt động của Taq
polymerase.
Sau 25 - 35 chu kỳ, tiếp tục ủ ở 72
0
C trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản
phẩm PCR.
2.4.3. Ứng dụng
Đánh giá mức độ biến dị di truyền trong một loài sinh vật thông qua mức
độ biểu hiện đa hình.
Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các giống, giữa quần thể khác loài.
Thiết lập bản đồ di truyền thông qua các phƣơng pháp phân tích các kỹ
thuật trong sinh học phân tử nhƣ RAPD, STS, SSR, AFLP.
Nghiên cứu và phân tích gia phả của sinh vật.
Kiểm tra và xác định nguồn gốc con lai.
Thiết lập hệ thống phân loại phân tử thông qua các kỹ thuật sinh học phân
tử có liên quan.
Giải trình tự DNA.
Ứng dụng chỉ thị phân tử để phát hiện gen.
Chẩn đoán bệnh trong y khoa, chẩn đoán nhóm máu, phát hiện các bệnh
trong y khoa.
14


Phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hàng triệu năm. [6]
2.4.4. Ƣu và nhƣợc điểm

2.4.4.1. Ƣu điểm
Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là có thể thực hiện
đƣợc.
2.4.4.2. Nhƣợc điểm
Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong
một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì
phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính.
2.5. Đa dạng di truyền
2.5.1.Khái niệm
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gene giữa các cá thể trong cùng
một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gene có thể di truyền đƣợc
trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. [18]
2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền
Việc nghiên cứu đa dạng di truyền có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chiến
lƣợc quản lý, bảo vệ và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ.
Kết quả quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ luôn luôn là
kế hoạch dài hạn. Từ 1978 – 1983 trồng phủ xanh bằng cây đƣớc (Rhizophora
apiculata), từ 1984 – 1999 trồng đa dạng loài để đạt đa dạng sinh học. Từ năm 2000
trở đi, quan sát động lực phát triển và mối quan hệ với các hệ sinh thái tiếp giáp,
theo dõi độ tăng đa dạng sinh học.[5]
Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đƣớc để tìm hiểu hệ số đồng dạng di
truyền, nhằm điều chỉnh kịp thời độ đa dạng di truyền của khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ. Bởi vì khi hệ số đồng dạng di truyền cao thì ảnh hƣởng
của các tác nhân nhƣ sâu bệnh là rất lớn và thiệt hai nếu xẩy ra là vô cùng nghiêm
trọng.