Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm biển ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật RAPD

i



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU
ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN
(Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN
RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
BẰNG KỸ THUẬT RAPD

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NIÊN KHÓA: 2003 – 2007
SINH VIÊN THỰC HIỆN: LÊ ĐỨC TUÂN





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007


ii




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU
ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN
(Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN
RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
BẰNG KỸ THUẬT RAPD



GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI MINH TRÍ LÊ ĐỨC TUÂN







Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007


ii



LỜI CẢM ƠN
Con xin cảm ơn ba mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con ăn
học thành tài.
Em xin chân thành cảm ơn:

Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền
đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học.
Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động
viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận.
Thầy Bùi Minh Trí, đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh đã động viên, giúp
đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận.
Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá
trình thu thập mẫu.
Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh, chị trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý
Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu.
Xin cám ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi chia sẻ biết bao niềm
vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học.

Xin chân thành cảm ơn!
LÊ ĐỨC TUÂN







iii



TÓM TẮT
LÊ ĐỨC TUÂN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “HOÀN
THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA

CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG
NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”.
Hội đồng hƣớng dẫn:
TS. BÙI MINH TRÍ.
Cây mắm biển (Avicennia marina) là một trong những loài thực vật đặc
trƣng sinh sống ở rừng ngập mặn đem lại giá trị kinh tế và môi trƣờng rất cao.Tuy
nhiên, những thập niên trở lại đây loài mắm biển có dấu hiệu lụi tàn. Vì vậy việc
xây dựng chiến lƣợc phát triển lâu dài đem lại hiệu quả kinh tế và môi trƣờng cao,
vấn đề đánh giá tổng quát quỹ gene và mức độ đa dạng của quần thể mắm tại khu
dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh đƣợc xem là một việc
làm cấp thiết.
Sau một thời gian thực tập ở Viện Nghiên cứu CNSH và CNMT, Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, chúng tôi đã đạt đƣợc kết quả:
- Thu thập đƣợc 52 mẫu lá mắm với những đặc điểm hình thái khác nhau.
- Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu lá mắm.
- Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ lá mắm, ly trích tốt 47/52 mẫu
- Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm. Qua thử
nghiệm trên ba primer: primer 1 và primer RAH8 và primer OPAC10 thì thấy
primer OPAC10 cho sản phẩm thể hiện sự đa dạng về di truyền cao.
- Kết quả chạy RAPD với primer 1 chỉ cho 1 band đồng hình kích thƣớc
400 bp cho cả ba loài mắm, giúp xác định đƣợc marker chỉ thị cho loài mắm
(Avicenniaceae).
- Kết quả chạy RAPD với primer OPAC10 cho trung bình 6 band/mẫu. Số
lƣợng band/mẫu không cao nhƣng lại thể hiện rõ sự đa hình giữa các mẫu. Chúng


iv

tôi thu đƣợc 9 band đa hình chiếm tỷ lệ 90% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 10%.
Kết quả phân tích trên phần mềm NTSYS (Numercial Taxonomy System) phiên
bản 2.1, 7 mẫu mắm đƣợc khảo sát đƣợc chia làm 2 nhóm chính với khoảng cách
phân nhóm là 0,40. Nhóm 1 gồm 4 mẫu: M8, M18, M25, M40. Các cây này có hệ
số đồng dạng di truyền cao từ 0,67 – 1,00.









v



MỤC LỤC
Chƣơng Trang
Trang tựa .............................................................................................................. ii
Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii
Tóm tắt ................................................................................................................. iv
Mục lục ................................................................................................................. v
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... viii
Danh sách các hình ............................................................................................... ix
Dang sách các bảng .............................................................................................. x
Chƣơng 1 LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................... 1
1.2 Mục đích, yêu cầu ....................................................................................... 2

1.2.1 Mục đích ..................................................................................................... 2
1.2.2 Yêu cầu ....................................................................................................... 2
1.2.3 Hạn chế của đề tài ..................................................................................... 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3
2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học ........................................................ 3
2.1.1 Đa dạng sinh học ......................................................................................... 3
2.1.2 Đa dạng di truyền ........................................................................................ 3
2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền .......................................... 4
2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................... 4
2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ......................................... 4
2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ rừng ngập măn Cần Giờ ....................................... 8
2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............ 9
2.3 Cây mắm biển.......................................................................................... 11


vi



2.3.1 Hình thái học ........................................................................................... 11
2.3.2 Nơi sống và sinh thái............................................................................... 12
2.3.3 Phân bố .................................................................................................... 12
2.3.2. Quy trình ly trích DNA thực vật ............................................................... 13
2.4.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .................................... 14
2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di .................................. 15
2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền.......................................... 16
2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử ................ 16
2.5.1.1 Chỉ thị hình thái ....................................................................................... 17
2.5.1.2. Chỉ thị isozyme ....................................................................................... 17
2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA ................................................................. 18

2.5.2 Kỹ thuật PCR .......................................................................................... 18
2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR ......................................................................... 18
2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR........................................................ 19

2.5.2.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR ....................................................................... 21
2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) ........... 22
2.5.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ..................... 22
2.5.4.1 Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD .................................................................. 25
2.5.4.2 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD ............................................................ 25
2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD ................................................................ 25
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ........................... 27
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................. 27
3.1.1 Thời gian nghiên cứu .............................................................................. 27
3.1.2 Địa điểm thực hiện .................................................................................. 27
3.2 Vật liệu thí nghiệm .................................................................................. 27
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 27


vii



3.3.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA ........................................................... 27
3.3.2 Quy trình ly trích DNA ............................................................................. 31
3.3.3 Kiểm tra kết quả ly trích DNA .................................................................. 33
3.3.4 Thực hiện kỹ thuật RAPD ......................................................................... 34
3.3.4.1 Dụng cụ và hóa chất dung trong kỹ thuật RAPD.................................... 34
3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 35
3.4 Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS ............................................. 38
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 40

4.1 Kết quả thu thập mẫu mắm tại rừng ngập mặn Cần Giờ ........................ 40
4.2 Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA ............................. 41
4.2.1 Bảo quản mẫu .......................................................................................... 41
4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích ................................................................... 41
4.3 Kết quả chạy RAPD ................................................................................ 43
4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8 với chu kỳ nhiệt 1 ...................... 43
4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1 với chu kỳ ở Bảng .............................. 44
4.3.3 Thí nghiiệm 3 .......................................................................................... 45
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 48
5.1.1 Kết luận ..................................................................................................... 48
5.1.2 Đề nghị ...................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 50
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 52






viii



DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp: Base pair
CNMT: Công Nghệ Môi Trƣờng
CNSH: Công Nghệ Sinh Học
DNA: Deoxyribonucleic acid
dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
E: East

EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid
EtBt: Ethidium bromide
N: North.
OD: Optical density
PCR: Polymerase chain reaction
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA.
RNA: Ribonucleic acid
RNase: Ribonuclease
T
a
: Annealing temperature
T
m
: Melting temperature
TE: Tris EDTA.
TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA.
UNESCO: United Nations Educational Scientific, and Cultural Organization
UV: Ultra Violet


ix



DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1: Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................ 5
Hình 2.2: Cấu trúc cành, lá và trái Mắm ........................................................ 11
Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR ........................................................ 21
Hình 2.4: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng

di truyền ........................................................................................................ 25
Hình 4.1: Trái mắm biển(A); Hoa(B) ........................................................... 41
Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ ................................................ 42
Hình 4.3: Kết quả ly trích theo quy trình 1 .................................................... 44
Hình 4.4: Sản phẩm DNA ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) ........ 44
Hình 4.5: Kết quả PCR ở thí nghiệm 1 .......................................................... 45
Hình 4.6: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 2 ....................................................... 46
Hình 4.7: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 3 ....................................................... 47
Hình 4.8 : Cây phân nhóm một số cây mắm biển tại khu dự trữ sinh quyển rừng
Cần Giờ ........................................................................................................ 48












x



DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose có nồng độ khác
nhau ...................................................................................................................... 16

Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide có nồng độ khác
nhau ...................................................................................................................... 16
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 36
Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 .......................... 36
Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm2 . 37
Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 .......................... 37
Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm3 38
Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 .......................... 38





















1

Chƣơng 1
LỜI MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Mắm biển (Avicennia marina) là một nhóm các loại cây rừng ngập mặn,
phân bố rộng khắp trên toàn thế giới trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa
triều lên và triều xuống về phía Nam của Bắc chí tuyến [17].
Sau 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng
ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là khu dự trữ sinh quyển rừng ngập
mặn vào ngày 21/01/2000 [18].
Ở nƣớc ta, cây mắm thƣờng sống ở những vùng rừng ngập mặn nhƣ Cần
Giờ, Long An, Củ Chi… dùng làm liệu xây dựng là cây có giá trị kinh tế và môi
trƣờng rất cao. Gỗ mắm đƣợc sử dụng rộng rãi để xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng,
làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản. Than mắm cho
nhiệt lƣợng cao và ít khói. Các khu rừng mắm có vai trò vô cùng quan trọng vào
việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm
quá trình xói lở, sa mạc hoá, ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng
biển. Mặt khác, các khu rừng mắm là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã.
Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học
Nông Lâm Tp. HCM, đƣợc sự hƣớng dẫn của TS. Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện
đề tài “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI
TRUYỀN TRÊN QUẦN THỂ MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ
SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”.

2



1.2 Mục đích, yêu cầu
1.2.1 Mục đích
 Bƣớc đầu phân tích sự đa dạng di truyền của quần thể mắm từ các mẫu
 Hoàn thiện kỹ thuật RAPD trên cây mắm biển.
 Đánh giá về mặt di truyền quần thể mắm trồng tại khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh.
 Ứng dụng trong tuyển chọn giống mắm phục vụ cho việc tái tạo rừng
ngập mặn trong tƣơng lai.
1.2.2 Yêu cầu
 Thiết lập phƣơng pháp ly trích DNA và bƣớc đầu xây dựng quy trình
RAPD thích hợp cho cây mắm biển.
 Thu thập mẫu lá từ những cây mắm biển có tuổi khác nhau và có đặc
điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u,
có màu sắc trái khác lạ…
 Ly trích đƣợc DNA từ mẫu lá mắm với độ tinh sạch cao.
 Thu thập đƣợc bằng kỹ thuật RAPD.
 Vẽ cây phân loại loài bằng phần mềm NTSYS.
1.2.2 Hạn chế của đề tài
 Chỉ nghiên cứu đa dạng di truyền của một vài quần thể ở rừng ngập mặn
Cần Giờ
 Không có đủ điều kiện để thu thập lƣợng mẫu lớn.
 Chỉ tiến hành chạy RAPD trên 3 primer.
 Thời gian thực hiện từ 20/04/2007 đến 30/08/2007.

3



Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học
2.1.1 Đa dạng sinh học
Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên - WWF (Word Wildlife fund)
(1989), đa dạng sinh học đƣợc định nghĩa nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn
thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là
các gen chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp tồn tại
trong môi trƣờng”.
Do vậy đa dạng sinh học đƣợc xem xét theo 3 mức độ:
 Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái
đất, từ vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm.
 Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các
quần thể sống cách ly về địa lý cũng nhƣ các cá thể cùng chung sống trong một
quần thể.
 Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó
các loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng nhƣ các quần xã sinh vật
tồn tại và cả sự khác biệt của mối tƣơng quan giữa chúng với nhau (Phạm Bình
Quyền, 2002).
 Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý. Đây là sự
phân biệt có tầm rộng và là chiến lƣợc nghiên cứu của nhiều nƣớc trên thế giới.
2.1.2 Đa dạng di truyền

Các cá thể trong một quần thể thƣờng có genome khác nhau. Sự đa dạng về
genome đƣợc biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể. Những alen khác
nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá
thể khác nhau là khác nhau. Những cây trồng đƣợc trồng lai ghép hay những động
vật đƣợc lai tạo từ những genome khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng,


4



vật nuôi cho năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt (Richard B. Primack,
1999).
Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ
tăng lên do kết quả tái tổ hợp do đột biến.
Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong
quần thể. Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần
thể này thích nghi hơn với những thay đổi môi trƣờng (Richard B. Primack, 1999).
2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự
nhiên và nó cũng quan trọng đối với con ngƣời.
Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống,
kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trƣờng. Sự
đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống
cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con ngƣời.
2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa bàn huyện Cần
Giờ, đƣợc hình thành ở hạ lƣu sông Đồng Nai-Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam
Thành Phố Hồ Chí Minh có toạ độ địa lý nhƣ sau:

Vĩ độ Bắc: 10
0
22
’
14
’’
- 10
0
37
’
39
’’
Kinh độ Đông :106
0
46
’
12
’’
– 107
0
00
’
59
’’
Ngày đƣợc UNESCO công nhận: 21/01/2000.
Tổng diện tích: 71.370 ha.
Dân số: 57.403ngƣời.
Tên chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ,Tp. Hồ Chí
Minh

5






















Hình 2.1: Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển đông, phía Tây giáp tỉnh
Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu.
Khí hậu Cần Giờ có hai mùa rõ rệt: mùa mƣa từ tháng 5 -10 và mùa nắng từ
tháng 11 – 4. Nhiệt độ trung bình 25,8

0
C. Lƣợng mƣa thấp, trung bình từ 1.300 –
1.400 mm/năm.
Ghi chú:




Vùng lõi
Vùng đệm
Vùng chuyển tiếp


6



Cách Tp. Hồ Chí Minh 30 – 40 km theo đƣờng chim bay, rừng ngập mặn
Cần Giờ đƣợc gọi là “Lá phổi xanh của Thành phố” với chức năng điều hoà không
khí, giảm ô nhiễm và hấp thu CO
2
do các hoạt động công nghiệp. Khu dự trữ sinh
quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc công nhận là khu rừng phòng hộ từ năm 1991.
Ủy ban nhân dân Tp. Hồ Chí Minh đã phê duyệt dự án đầu tƣ xây dựng Khu Bảo
tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ giai đoạn 2002 - 2011 theo Quyết định số
8413/QĐ-UB ngày 12/12/2001.
Rừng ngập mặn tập trung ở huyện Cần Giờ (phía Nam Thành phố) vốn là
rừng nguyên sinh, xuất hiện đã lâu năm theo lịch sử của quá trình hình thành bãi bồi
cửa sông ven biển; ƣu thế loài cây mắm (Avicenniaceae) có kích thƣớc lớn; với hệ
thực vật khá phong phú khoảng 104 loài thuộc 48 họ [14]. Thời thuộc Pháp, nó là

rừng cấm, song khoảng từ năm 1961 - 1970 bị các đợt khai quang rải chất độc hóa
học của Mỹ, nên có tới 80% diện tích rừng vùng này bị hủy diệt, khiến đại bộ phận
đất đai trở thành những trảng cỏ cây bụi thứ sinh. Từ năm 1978, thành phố Hồ Chí
Minh đã đầu tƣ trồng phục hồi hàng chục ngàn ha rừng mắm, chủ yếu tập trung vào
khoảng thời gian 1978 – 1986 [16].
Về cấu trúc quần thể thực vật rừng ngập mặn, sự phân bố các quần xã phụ
thuộc rõ rệt vào điều kiện lập địa - mà ở vùng ngập mặn, thì mức độ ngập thủy triều
và độ dẽ chặt của đất là yếu tố chi phối chủ yếu. Nhìn chung, các quần xã thực vật
quen thuộc ở rừng ngập mặn phía Nam nƣớc ta, hầu nhƣ đều hiện diện tại Cần Giờ.
Ngoài một số trên diện tích không lớn đất "giồng" đã đƣợc canh tác nông nghiệp và
trồng cây vƣờn ra, ở Cần Giờ hiện có các quần xã thực vật tự nhiên chủ yếu, đƣợc
hình thành và phân bố tuần tự từ nơi đất thấp, bùn lỏng chƣa cố định đến nơi cao ít
ngập triều đất đã cố định, nhƣ: quần xã mắm có các hợp tác xã mắm thuần loại-
mắm trắng (Avicennia alba), mắm đen (Avicennia officinalis); các quần xã mắm
hỗn giao với đƣớc hoặc với bần trắng (Sonneratia alba); quần xã dà + mắm có các
xã hợp dà + mắm đen (ceriop tagal + Avicennia alba); quần xã chà là có các xã hợp
chà là thuần loại (Phoenix paludosa), chà là + ráng đại (Acrostichum aureum), chà
là + giá (Excoecaria agallocha) và nhiều loài cây khác nhƣ sú, cóc (Lumnitzera


7



racemosa)…, thể hiện quy luật diễn thế thảm thực vật rừng ngập mặn, theo độ cao
địa hình một cách rõ rệt và nhạy cảm [19].
Từ khi phục hồi, môi trƣờng sinh thái vùng ngập mặn Cần Giờ đƣợc cải
thiện, chim, thú đã dần dần tái hiện, nhƣ cá sấu, khỉ, heo, chồn, cáo, trăn, rắn.. và
hàng chục loài chim. Ðồng thời, sản lƣợng tôm cá vùng rừng ngập mặn cũng ngày
càng nâng cao. Tác dụng to lớn của rừng ngập mặn Cần Giờ, là bảo vệ bờ lấn biển

và về lâu dài, còn là giữ vai trò "lá phổi" điều hòa khí hậu cho Thành phố, cho các
vùng lân cận và tô điểm cảnh quan phục vụ phát triển du lịch [19].
Sau ngày miền Nam hoàn toàn giải phóng 30/4/1975, rừng ngập mặn Cần
Giờ thuộc địa phận huyện Duyên Hải, tỉnh Đồng Nai. Đến năm 1978, huyện Duyên
Hải đƣợc giao lại cho thành phố Hồ Chí Minh với tổng diện tích toàn huyện lúc đó
là 71.361 ha, trong đó diện tích rừng ngập mặn và đất lâm nghiệp là 34.468 ha. Lâm
trƣờng Duyên Hải lúc đó trực thuộc Ty Lâm nghiệp Tp. Hồ Chí Minh đƣợc thành
lập vào năm 1978.
Từ năm 1984 trở đi, một số loài cây khác nhƣ gõ biển (Intsia bijuga), dà vôi
(Ceriops tagal), dà quánh (C. decandra), cóc trắng (Lumnitzera racemosa), xu ổi
(Xylocarpus granatum), tra (Thespesia populnea)… cũng đƣợc trồng để phủ xanh
các vùng đất cao, ít ngập triều.
Rừng ngập mặn Cần Giờ là một trong những khu rừng ngập mặn ở Việt Nam
mang tính chất rừng nhiệt đới cổ và phong phú về số loài thực vật di cƣ. Theo số
liệu điều tra, Rừng ngập mặn Cần Giờ có khoảng 35 loài thực vật, phổ biến là mắm
quăn (Avicennia lanata), mắm trắng (Avicennia alba), bần (Sonneratia evata), chà
là (Phoenix paludosa), dừa nƣớc (Nipa fruticans)… [18].
Cùng với sự phục hồi về thảm thực vật rừng, nhiều loài động vật tƣởng
chừng đã biến mất cùng với sự tàn phá của chiến tranh đã hồi sinh và phát triển lại
nhanh chóng ở rừng ngập mặn Cần Giờ nhƣ khỉ, lợn rừng, chồn, trăn, rái cá… trong
đó có nhiều loài đƣợc ghi trong Sách Đỏ Việt Nam nhƣ Cá sấu hoa cà, Rắn hổ mang
chúa… Đặc biệt, nhờ có sinh cảnh thuận lợi, các loài chim tự nhiên đã và đang hình


8



thành trở lại với số loài đã chiếm tới 34% tổng số loài chim nƣớc ở Việt Nam,
trong đó có tới 9 loài qúy hiếm đƣợc ghi trong Sách Đỏ Thế giới [18].

2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc chia làm 3 vùng chính:
vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp.
 Vùng lõi (4.721 ha)
Mục tiêu quản lý vùng lõi là bảo tồn đa dạng sinh học, hạn chế các hoạt động
của con ngƣời.
Vùng lõi bao gồm các tiểu khu rừng số 3, 4b, 6, 11, 12 và 13. Vùng này đặc
trƣng cho các hệ sinh thái rừng trồng và đặc biệt là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên
dọc theo các kênh rạch và bìa rừng với đa dạng sinh học cao về thành phần các loài
động vật, thực vật, vi sinh vật với cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn.
Các chức năng chính bao gồm:
- Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên.
- Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trƣờng sống của động vật
hoang dã, đặc biệt là chim nƣớc.
- Bảo tồn hệ thống thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển nơi kiếm ăn
và sinh đẻ của các loài động vật vùng triều.
- Tiến hành một số công trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ sinh thái và
du lịch sinh thái có giới hạn.
 Vùng đệm (37.339 ha)
Là vùng tiếp giáp với vùng lõi, có thể tiến hành các hoạt động kinh tế, nghiên
cứu, giáo dục và giải trí nhƣng không ảnh hƣởng đến mục đích bảo tồn trong vùng
lõi.
Vùng đệm bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 và 24. Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, vùng đệm
có vai trò quan trọng trong bảo tồn vùng lõi. Các hoạt động du lịch sinh thái, tham
quan và nghiên cứu có thể triển khai ở Khu căn cứ địa kháng chiến, đặc khu Rừng


9

Sác, thăm thú sẽ góp phần nâng cao thu nhập cho ngƣời dân, nâng cao ý thức và
hiểu biết giá trị của công tác bảo tồn góp phần làm giảm sức ép lên vùng lõi của khu
dự trữ sinh quyển. Mặt khác, vùng đệm còn tạo không gian cho thú hoang dã nhƣ
khỉ, rái cá, kỳ đà … kiếm ăn. Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung
vào vùng lõi nếu cần thiết, đồng thời tạo cảnh quan tự nhiên và hoạt động văn hoá
phục vụ cho du lịch sinh thái. Ngoài ra, các mô hình lâm ngƣ kết hợp thân thiện với
môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng, trình diễn cho nhân dân địa phƣơng đến tham
quan, học tập và trao đổi kinh nghiệm.
 Vùng chuyển tiếp: 29.310 ha
Vùng chuyển tiếp còn đƣợc gọi là vùng phát triển bền vững, nơi cộng tác của
các nhà khoa học, nhà quản lý và ngƣời dân địa phƣơng. Tạo điều kiện thuận lợi và
đẩy mạnh các hoạt động phát triển kinh tế, du lịch, dịch vụ đi đôi với tuyên truyền
giáo dục nâng cao nhận thức cộng đồng.
Vùng chuyển tiếp bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ bao gồm
các vùng bãi bồi, giồng, bãi cát, các khu vực sản xuất nông nghiệp, thủy sản, diêm
nghiệp và dân cƣ dọc theo ven biển Cần Giờ. Đây là vùng chuyển tiếp có nhiều tiềm
năng cho hoạt động kinh tế, đặc biệt là phát triển du lịch sinh thái, phát triển nông
nghiệp, ngƣ nghiệp và thủy sản bền vững. Hệ thống nhà nghỉ, khách sạn, nhà hàng
vùng ven biển Cần Giờ rất hấp dẫn khách du lịch.
2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc quản lý theo hệ thống
rừng đặc dụng (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) theo quyết định số
173/CT ngày 29/05/1991 do Chủ tịch Hội đồng Bộ trƣởng phê duyệt thành lập
Rừng phòng hộ Môi trƣờng. Ủy ban nhân dân Tp. Hồ Chí Minh đã phê duyệt dự án
đầu tƣ xây dựng Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ giai đoạn 2002-
2011 theo Quyết định số 8413/QĐ-UB ngày 12/12/2001.

10



Ủy ban nhân dân Huyện Cần Giờ: Trực tiếp quản lý về mặt hành chính, đất
đai, tài nguyên rừng cũng nhƣ tất cả các hoạt động kinh tế, xã hội, dân cƣ trên địa
bàn huyện. Các cơ quan trực thuộc bao gồm:
 Ban Quản lý rừng ngập mặn Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh: Quản lý tài nguyên
rừng, thực hiện chính sách bảo vệ rừng, cung cấp nguồn trợ cấp cho các hộ dân
trong rừng. Các đơn vị trực thuộc ban quản lý là các tiểu khu. Các tiểu khu chịu
trách nhiệm quản lý rừng và các hộ dân sống trong khu vực đó.
 Ủy ban nhân dân xã, phƣờng, thị trấn: Quản lý về mặt hành chính trong địa
bàn xã, thị trấn.
Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn: Quản lý tài nguyên rừng theo
ngành, các chủ trƣơng chính sách từ Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Các
cơ quan trực thuộc chính gồm:
 Chi cục Kiểm lâm: Tuần tra, bảo vệ rừng theo luật pháp hiện hành. Chi cục
có các Trạm Kiểm lâm nằm ở các vị trí xung yếu trong rừng để công tác bảo vệ
rừng đạt hiệu quả.
 Chi cục Phát triển Lâm nghiệp: Xây dựng kế hoạch tổng thể, nguồn nhân lực
và tài chính cho công tác trồng và bảo vệ rừng.
 Trung tâm Nghiên cứu Khoa hoc Kỹ thuật và Khuyến nông: Cung cấp và tƣ
vấn giống cây trồng vật nuôi, các mô hình kinh tế phát triển nông lâm nghiệp hài
hoà với môi trƣờng.
Sở Du lịch, Sở Tài nguyên và Môi trường, Sở Khoa học và Công nghệ: Quản
lý theo ngành về các lĩnh vực liên quan: Phát triển du lịch, nghiên cứu triển khai các
đề tài khoa học, công nghệ, hệ thống giám sát môi trƣờng, tuyên truyền giáo dục,
đào tạo…
Các công ty kinh doanh tư nhân: Bao gồm các công ty dịch vụ du lịch, các
chủ đầm nuôi tôm, đánh bắt thuỷ hải sản… tham gia bảo vệ môi trƣờng thông qua

việc đóng góp thuế phí…


11



Các trường đại học, viện nghiên cứu: Triển khai các đề tài nghiên cứu khoa
học, giám sát, đánh giá tác động môi trƣờng, tuyên truyền giáo dục ngƣời dân nâng
cao ý thức bảo vệ rừng…
Ban Quản lý khu dự trữ sinh quyển: Ban quản lý khu dự trữ sinh quyển Cần
Giờ dƣới sự quản lý và chỉ đạo trực tiếp của Ủy ban Nhân dân huyện Cần Giờ và Sở
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn với vai trò và nhiệm vụ điều phối tổng thể các
hoạt động trên theo đúng tiêu chí của khu dự trữ sinh quyển là kết hợp hài hoà giữa
bảo tồn và phát triển kinh tế, đồng thời tạo điều kiện triển khai các đề tài nghiên cứu
khoa học, tuyên truyền giáo dục và đào tạo, mở rộng hợp tác quốc tế.
2.3 Cây mắm biển.
Tên Việt Nam: Mắm biển
Tên La Tinh: Avicennia marina
Họ: Verbenaceae
Chi: Avicennia
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Lamiales

Hình 2.2: Cấu trúc cành, lá và trái Mắm
2.3.1 Hình thái học
Cây mắm có thể đạt đƣờng kính gốc và chiều cao khác nhau, có loài đạt
đƣờng kính gốc 60 cm và chiều cao 30 m. Cây mắm trƣớc đây dùng làm ghe,
thuyền, cất nhà và làm củi. Ngày nay mắm cũng cung cấp nguyên phẩm cho việc
biến chế dƣợc liệu và cung cấp sắc tố cho công nghiệp thuộc da.

Đặc điểm của cây mắm là có rễ đất và rễ phổi. Rễ phổi (cặc mắm) có nhiệm
vụ hấp thụ dƣỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn. Rễ phối cũng là
"kiến trúc" của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi.


12



Vì thiếu cây giống để trồng bảo vệ ven biển và đất bồi, một số nƣớc đã có
lệnh cấm xuất khẩu gỗ và cây con các loại cây mắm, đƣớc và vẹt [19].
 Hình dáng: Cây gỗ, cao đến 10 m với đƣờng kính 0,5 m, nhánh thấp, tán
rộng, cành non, có lông tơ màu trắng hay xám, thân ít khi thẳng, vỏ không nứt, màu
trắng với lớp vỏ cóc có dạng phiến mỏng (giống nhƣ vỏ ổi), rễ phổi đứng.
 Lá: Lá đơn, mọc đối, phiến nguyên láng, mỏng, thƣờng quăn queo, hình
xoan, đầu nhọn hay tù, chân nêm, dài 3 – 5 cm, bìa nguyên, hơi dợn sóng và có lông
ở gân phụ, cuống dài 0,5 cm, nhiều lông nhỏ.
 Rễ: Rễ phổi đứng.
 Hoa: Hoa vàng, to 5 – 8 mm, có mùi thơm mạnh, tạo thành tán - gié ở ngọn,
thƣờng có 3 nhánh, lá bắc phụ hình bầu dục, lõm, tai đài không bằng nhau và có
lông tơ, vành hình ống, ngắn hơn cánh, có thùy bằng nhau, dài 1 – 2 mm, tròn dài, 4
tiểu nhị: (2 dài, 2 ngắn), bầu nhụy hình trụ, tròn ở dƣới, không vòi nhụy. Trổ bông
vào tháng 10 - 12 dƣơng lịch.
 Quả: Trái hình tim, dài 1,5 – 2 cm, vỏ màu vàng xanh, đầy lông mịn. Cho
trái mắm vào tháng 4 - 6 dƣơng lịch.
2.3.2 Nơi sống và sinh thái.
Tại rừng sát Cà Mau, thƣờng gặp loài này trên đất bồi đã dẽ chặt, dọc bờ
biển ít ngập bởi nƣớc triều, tạo thành quần thụ đơn thuần hoặc hỗn giao với các loài
Avicennia officinalis (mắm đen), Excoecaria agallocha (giá) và Ceriop decandra
(dà quánh).

2.3.3 Phân bố
 Việt Nam: Bà Rịa – Vũng Tàu, Cà Ná, Phan Rang (Bình Thuận).
 Thế giới: Thái Lan, Inđônexia, Philippin, Ai Cập, Soudan, Ả Rập, Phi
Châu, Bồ Ðào Nha, Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Xri Lanca, Trung Hoa (Hải Nam),
Ðài Loan, Hồng Kông, Nhật (Ryukyu), Tân Tây Lan, Madagascar, Úc Châu ...




13



2.4 Quy trình ly trích DNA thực vật
Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers
và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình
của Ziegenhagen và Fladung (1997)… Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm
riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng đƣợc cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số
lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng
là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết
thích hợp.
Phƣơng pháp ly trích DNA cơ bản gồm ba bƣớc:
 Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng phƣơng pháp cơ học (nghiền).
Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào, trong một hỗn hợp chất tẩy (nhƣ SDS,
Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào
và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên
kết với DNA. Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt
động của các enzyme thuỷ phân nội bào, ngƣời ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào
bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (-196
o

C). Sau đó sử
dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (phá vỡ hóa học).
 Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là
các protein. Sự loại bỏ này dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân
tử khác nhau (nucleic acid/ protein) trong hai pha không hòa tan (phenol,
chloroform/ nƣớc). Mẫu đƣợc lắc nhẹ trong dung dịch phenol/chloroform/iso
amylalcohol (tỉ lệ 25/24/1). Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein
đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn
hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một
lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol, chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic
acid đƣợc thu nhận lại.
 Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol,
nhƣng thông thƣờng ngƣời ta dùng isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận


14



lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các
muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Mục đích của
việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng
khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong
dung dịch theo nồng độ mong muốn.
Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA:
- DNA bị phân hủy hoặc bị gãy.
- Có lẫn tạp RNA trong mẫu DNA.
- Có lẫn tạp polysaccharide trong mẫu DNA.
- Có lẫn tạp polyphenol trong mẫu DNA.
2.4.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ

Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sáng
mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ
đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260 nm. Sự hấp thụ này là do sự
tƣơng tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine. Dựa vào
sự hấp thụ này ngƣời ta có thể định lƣợng đƣợc hàm lƣợng DNA có trong mẫu ly
trích.
Sự hấp thụ ở đây đƣợc tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với DNA
tinh khiết một đơn vị OD
260 nm
tƣơng ứng với:
 50 g/ml DNA sợi đôi.
 40 g/ml DNA sợi đơn hay RNA.
 20 g/ml oligonucleotide sợi đơn.
` Từ giá trị OD đo đƣợc, ngƣời ta có thể suy ra đƣợc nồng độ acid nucleotide
trong mẫu ly trích.
Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết. Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp
protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác. Ngoài đỉnh hấp thụ là 280 nm
protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các acid nucleotide và làm