PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR docx

iii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG
TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS
BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR







Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: VÕ NGỌC THƠ

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007


iv

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG
TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS
BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN VÕ NGỌC THƠ
BSTY. HOÀNG THANH HẢI






Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007

iii

LỜI CẢM ƠN
 Chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho
tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.
Các Thầy Cô và anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại
Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.
Thầy Hải, Cô Hà và các Thầy Cô Bộ Môn Vi Sinh-Truyền Nhiễm đã tận tình
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Anh Lê Hồng Phong ở Cục Thú Y vùng 6 đã rất tận tình chỉ bảo và giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận.
Anh Uyên đã động viên và chia sẻ vấn đề của tôi.
Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 (nhất là các bạn trong phòng 14A, cƣ
xá B) đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

 Đặc biệt tôi xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến Cô Trần Thị Bích Liên và Anh
Hoàng Thanh Hải đã rất tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận.

 Con xin gởi lòng mang ơn đặc biệt nhất đến với cha mẹ, những ngƣời sinh
thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ và luôn cho con một tinh thần thoải mái để luôn chú tâm
vào chuyện học.

 Và lời cám ơn đặc biệt nhất tôi xin gởi đến ngƣời bạn thân thiết nhất, Nguyễn
Minh Khôi, đã luôn luôn bên tôi, an ủi và động viên để tôi làm tốt nhất. Xin cám ơn,
cám ơn từ tận đáy lòng tôi.
Thủ Đức, tháng 8 năm 2007

iv
Võ Ngọc Thơ
TÓM TẮT
Đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 và xác định virus
bằng kỹ thuật RT-PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007
tại phòng Vi Sinh Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi Thú Y và tại Trung Tâm Phân
Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh.
Mục tiêu của đề tài là phân lập virus từ các loại mẫu khác nhau và xác định sự
hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Nội dung nghiên cứu gồm:
 Hồi phục tế bào và xác định thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào
phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) trên bình nuôi cấy 25cm

2

với những lƣợng tế bào là 7.10
5
và 10
6
.
 Khảo sát bệnh tích tế bào MARC-145 sau khi nuôi cấy phân lập từ các loại
mẫu khác nhau: huyết thanh, hạch amiđan, phổi, hạch phổi.
 Xác định sự hiện diện của virus PRRS từ bệnh tích tế bào MARC-145 sau gây
nhiễm bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction).
Sau thời gian thực hiện, chúng tôi có các kết quả sau:
o Thời gian một lần cấy chuyển ở lọ 25cm
2
với những lƣợng tế bào: 7.10
5
, 10
6

lần lƣợt là 72,56 giờ và 46 giờ.
o Tế bào MARC-145 sau khi đƣợc hồi phục từ nitơ lỏng vẫn phát triển bình
thƣờng.
o Phân lập virus PRRS từ hạch phổi, phổi, huyết thanh trên môi trƣờng tế bào
MARC-145. Ghi nhận đƣợc 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào là 2 mẫu hạch
phổi và 1 mẫu phổi chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11).
o Bằng kỹ thuật RT-PCR, trong 3 mẫu có bệnh tích tế bào có 1 mẫu cho kết quả
dƣơng tính chiếm tỷ lệ 33,33% trên mẫu xét nghiệm.

v

SUMMARY
Graduating thesis: " Isolating PRRS virus by MARC-145 cell and confirming the
virus by RT-PCR technology". The thesis have been done from March to August,
2007 at Microbiology And Infectious Diseases Dept. of Faculty Of Animal Science
Veterinary and Center For Chemical And Biological Analysis And Experiment of
Nong Lam university Hồ Chí Minh city.
Purpose of this reseach: Isolate PRRS virus from different specimens and
determine its appearance by RT-PCR technology. The contain is concerned about:
 Reviewing the cell and determine how long once transfer, length of time for
cells grows to make monolayer, in flash with the amount of 7.10
5
and 10
6
.
 Observating MARC-145 cell`s pathology after infecting the cells with
different specimens such as: serum, lung, lympho nodes.
 Determine virus` appearance from MARC-145 cell's pathology after days
postinfection by RT-PCR technology (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain
Reaction).
Finally, we have results:
o The average period of one transfer with the amount of 7.10
5
cells is 72,565
hours, 10
6
cells is 46 hours.

o MARC-145 after reviewing from liquid nitrogen grow normally.
o Isolating PRRS virus from lung, lympho nodes, serum in MARC-145 cell
invironment. 3 specimens have MARC-145 cell's pathology postinfection: 2
lymphonotes, 1 lung (3/11 specimens).
o We detect the positive form of PRRS RNA by RT-PCR: lympho node.






vi

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM TẮT iv
SUMMARY v
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH x
DANH SÁCH CÁC BẢNG xi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii
Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích - Yêu cầu 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN 3
2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào 3
2.1.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật 3

2.1.2. Thành phần cơ bản của môi trƣờng nuôi cấy 4
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 6
2.1.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế 6
2.2. Phƣơng pháp PCR 6
2.2.1. Nguyên tắc 7
2.2.2. Thực nghiệm 7
2.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 8
2.2.4. Phƣơng pháp RT-PCR 9
2.3. Sơ lƣợc về căn bệnh, bệnh do virus 10
2.3.1. Lịch sử bệnh 10
2.3.2. Căn bệnh học 11
2.3.2.1. Phân loại 11
2.3.2.2. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc 12

vii
2.3.2.3. Đặc điểm nuôi cấy 14
2.3.2.4. Sức đề kháng 16
2.3.3. Dịch tễ học bệnh PRRS 16
2.3.3.1. Loài mắc bệnh 16
2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan 16
2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập 17
2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh 17
2.3.4. Triệu chứng lâm sàng 20
2.3.5. Chẩn đoán 20
2.3.5.1. Chẩn đoán lâm sàng 20
2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng 21
2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể 21
2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên 22
2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS 23
2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào 23

Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 25
3.1. Thời gian và địa điểm 25
3.2. Đối tƣợng và số lƣợng mẫu 25
3.3. Nội dung nghiên cứu 25
3.4. Vật liệu và dụng cụ 26
3.4.1. Thiết bị và dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus 26
3.4.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC-145 26
3.4.3. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR 27
3.4.4. Vật liệu và hoá chất cho chiết tách RNA 27
3.4.5. Vật liệu và hoá chất sử dụng cho RT-PCR 27
3.4.6. vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR 28
3.5. Phƣơng pháp tiến hành 28
3.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 28
3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 28

viii
3.5.2.1. Hồi phục tế bào 28
3.5.2.2. Cấy chuyển tế bào 29
3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus 30
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 34
4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 35
4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 37
4.4. Kết quả RT-PCR 40
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44
5.1. Kết luận 44
5.2. Tồn tại 44
5.3. Đề nghị 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
PHỤ LỤC

ix

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS 19
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS 31
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR 33

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1. Virus PRRS 12
Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng 15
Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS 15
Hình 2.4. Triệu chứng bệnh tai xanh 20
Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS 20
Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer 30
Hình 4.1. Đối chứng âm 40
Hình 4.2. Mẫu không có bệnh tích tế bào 40
Hình 4.3. Đối chứng dƣơng 40
Hình 4.4. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP 41
Hình 4.5. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2 41
Hình 4.6. Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào 42

xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 34
Bảng 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 36
Bảng 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 38
Bảng 4.4. Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau gây nhiễm 46

xii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AMV: Avian Myeloblastosis Virus

cDNA: Complement Deoxynucleotide Acid
DEPC: Diethyl Pyrocarbonate
DNA: Deoxynucleotide Acid
dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate
EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetate
ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EMEM: Eagle Minimum Essential Medium
FA: Florescent Antibody Staining
HRPO: Horseradish Peroxidase
IFA: Immuno Peroxidase Monolayer Assay
IHC: Immunohistochemistry Staining
IPMA: Immuno peroxidase Monolayer Assay
LAH: Lactalbumin Hydrolysate
MSD: Mystery Swine Disease
Nu: Nucleotide
ORF: Open Reading Frame
PAM: Porcine Alveolar Macrophage
PBS: Phosphate Buffer Saline
PBSA: Phosphate Buffer Saline Solution A
PCR: Polymerase Chain Reaction
PRRS: Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome
RNA: Ribonucleotide Acid
RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SN: Serum Neutralization
TBE: tris Borate EDTA
µl: Microlit


1
Chƣơng 1

MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Từ nhiều năm nay, ngành chăn nuôi chiếm một vai trò quan trọng trong nền
kinh tế ở nƣớc ta vì nƣớc ta là một nƣớc nông nghiệp. Nó đã cung cấp một phần nhu
cầu thực phẩm thiết yếu của cuộc sống con ngƣời. Trong đó ngành chăn nuôi heo
không ngừng phát triển để cung cấp đủ số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng cho ngƣời
tiêu dùng. Do nhu cầu xã hội phát triển nên số lƣợng heo nuôi ngày càng tăng cao.
Song song với quá trình phát triển của ngành chăn nuôi heo thì giới chăn nuôi cũng
phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những bệnh ảnh hƣởng trực tiếp đến
thành tích sinh sản và tăng trƣởng của heo nhƣ: bệnh FMD, bệnh dịch tả heo, bệnh
đóng dấu son, bệnh giả dại…và gần đây nhất là một vấn đề đang làm đau đầu giới
chăn nuôi, nó ảnh hƣởng không nhỏ đến hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi là hội
chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and
respiratory syndrome).
Bệnh do virus PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu
chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi. Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ
cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh yếu, heo con chết
trƣớc khi sinh, còi cọc, chậm lớn. Những nghiên cứu về PRRS trƣớc đây chỉ dừng lại
ở việc điều tra tỷ lệ nhiễm bằng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus
PRRS. Mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trƣờng tế bào khó, tuy nhiên
xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dƣơng tính và các mẫu lâm sàng
là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này.


2
Xuất phát từ thực tế trên, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh
Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của ThS.
Trần Thị Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 và xác định
virus bằng kỹ thuật RT- PCR”.

1.2. Mục đích – Yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Xác định sự hiện diện của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 bằng kỹ
thuật RT- PCR góp phần hoàn thiện dần quá trình chẩn đoán bệnh PRRS trên heo
và lấy đó làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này.
1.2.2. Yêu cầu
Khảo sát đặc tính của tế bào MARC-145 bằng cách hồi phục tế bào và xác
định thời gian một lần cấy chuyển.
Phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch phổi của heo nghi ngờ bệnh
trên môi trƣờng tế bào MARC-145.
Ghi nhận bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuôi cấy.
Dùng kỹ thuật RT- PCR (Reverse Trascriptase - Polymerase Chain Reaction)
để xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào nuôi cấy.


3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể
sống nhƣng vẫn thực hiện đầy đủ các chức năng biến dƣỡng và chức năng chuyên
biệt của tế bào. Quá trình nuôi cấy tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai trò nhƣ
những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá trình nguyên phân và quần thể tế
bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi cấy hay sự cạn kiệt
dinh dƣỡng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào năm 1907 bởi
Harrison. Ngày nay kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y
học để nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân
lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình
thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt là sản xuất vaccine. Quá trình nuôi cấy
thƣờng gồm những tế bào thuộc cùng một loại.

2.1.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật
Tính cơ học yếu: tế bào động vật không vách và kích thƣớc tế bào khá lớn
(khoảng 10 µm) nên tính bền cơ học yếu. Do đó, khi nuôi cấy, tế bào động vật rất
dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào nhƣ khuấy trộn để tách tế bào, di
chuyển mẫu tế bào.
Tăng trƣởng và phân chia chậm: thời gian tăng trƣởng gấp đôi của tế bào
trung bình là 30 giờ. Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 30 phút.
Tính cần giá đỡ: hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống
và phân chia. Thông thƣờng, tế bào phát triển tốt khi gắn vào bề mặt rắn. Tế bào sẽ
ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt dụng cụ nuôi.
Tuy vậy một số tế bào nhƣ tế bào ung thƣ có thể sinh trƣởng và phân chia ở trạng
thái lơ lửng không cần giá đỡ.


4
Tế bào động vật có thể đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196
0
C, ở
nhiệt độ này tế bào có thể giữ đƣợc khả năng sống không hạn định và sẽ phát triển
trở lại trên môi trƣờng nuôi cấy khi hồi phục.
Ngoài ra tế bào còn có các đặc tính khác nhƣ: kém thích nghi với môi
trƣờng, nhạy cảm với các ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh,
hormone tăng trƣởng để phân chia (Phan Kim Ngọc, 2002).
2.1.2. Thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy tế bào
Môi trƣờng nuôi cấy tế bào phức tạp và giàu chất dinh dƣỡng để tạo điều
kiện tốt nhất cho sự phát triển của tế bào. Môi trƣờng có thể đƣợc cung cấp dƣới
dạng dung dịch để sử dụng ngay hay dƣới dạng dung dịch đậm đặc hoặc dạng bột.
Dạng dung dịch đậm đặc có thể sử dụng sau khi pha loãng với nƣớc cất tiệt trùng,
trong khi dạng bột phải đƣợc hoà tan trong nƣớc và tiệt trùng bằng cách lọc qua lƣới
lọc 0,22µm.

Thành phần cơ bản của môi trƣờng nuôi cấy:
Carbonhydrate: glucose (5-10mM) đƣợc dùng trong hầu hết các công thức để
cung cấp nguồn năng lƣợng cũng nhƣ tiền chất cho tổng hợp sinh học, nhƣ ribose
cần cho tổng hợp acid nucleic. Có thể dùng fructose thay thế cho glucose. Glucose
có trong hầu hết môi trƣờng là nguồn ly giải tạo pyruvate vào chu trình acid citric
và sinh ra CO
2
.
Amino acid (0,1-0,2mM) cũng đƣợc dùng nhƣ là nguồn tiền chất cho tổng
hợp protein. Ngƣời ta thƣờng sử dụng glutamine, tuy nhiên, ammoniac đƣợc thành
lập từ chuyển hoá glutamine có thể ức chế sự sinh trƣởng trong một số quá trình
nuôi cấy.
Muối cũng đƣợc dùng để làm cho môi trƣờng có tính đẳng trƣơng, duy trì sự
cân bằng với phần bên trong tế bào.
Bicarbonate (NaHCO
3
) cũng đƣợc dùng để đóng vai trò nhƣ hệ thống đệm
trong sự kết hợp với 5-10% CO
2
đƣợc cung cấp bởi tủ ủ. Điều này cho phép môi
trƣờng duy trì có pH từ 7,2-7,4.


5
Vitamin và hormone hiện diện ở nồng độ tƣơng đối thấp và đƣợc dùng để
kích thích sinh trƣởng. Lƣợng vitamin và hormone thay đổi nhiều giữa các công
thức môi trƣờng khác nhau. Điều này cho thấy nhu cầu vitamin của các dòng tế bào
là khác nhau.
Huyết thanh: đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cải thiện sự sinh
trƣởng của tế bào, giúp tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh và phát triển mạnh hơn.

Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum- FBS) thƣờng đƣợc sử dụng bổ sung vào
cho môi trƣờng nuôi cấy, nhƣng lại đắt tiền và hiếm. Nồng độ huyết thanh thƣờng
đƣợc dùng từ 5- 20%. Những dòng tế bào liên tục có xu hƣớng thích nghi với môi
trƣờng có nồng độ huyết thanh thấp. Xu hƣớng hiện nay là sử dụng môi trƣờng
không huyết thanh nhƣng chỉ mới thành công trong nuôi cấy tế bào Hela và L292.
Các protein trong huyết thanh nhƣ albumin, fibronectin, globulin giúp tế bào bám
dính và phát triển.
+ Những bất lợi của môi trƣờng có huyết thanh
- Thay đổi huyết thanh cần làm nhiều xét nghiệm nên tốn kém.
- Khi cấy nhiều loại tế bào cần nhiều loại huyết thanh.
- Nguy cơ lan truyền mầm bệnh.
- Huyết thanh thƣờng nhiễm virus và Mycoplasma, do đó ảnh hƣởng đến kết
quả nuôi cấy.
- Giá thành đắt.
+ Bất lợi của môi trƣờng không có huyết thanh
- Tế bào phát triển và sinh sản chậm.
- Môi trƣờng đƣợc pha chế sẵn, khó kiểm tra chất lƣợng và đắt tiền.
Kháng sinh thƣờng đƣợc cho vào môi trƣờng nuôi cấy trong thời gian ngắn
nhằm làm giảm nguy cơ tạp nhiễm. Nồng độ tối ƣu của kháng sinh đƣợc xác định
theo kinh nghiệm của ngƣời tiến hành nuôi cấy. Kháng sinh thƣờng đƣợc dùng dƣới
dạng kết hợp. Có thể sử dụng Penicilin G, Streptomycin và Amphotericin B để ức
chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm và chống nấm (Butler, 2004).
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy


6
Hầu hết tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 37
0
C và
pH 7,4. Nếu ở nhiệt độ thấp hơn một chút so với 37

0
C thì tốc độ sinh trƣởng sẽ
giảm xuống nhƣng tế bào không bị phá hủy. Tuy nhiên nhiệt độ cao hơn, từ 39-
40
0
C sẽ phá huỷ tế bào. Do vậy, việc đảm bảo rằng nhiệt độ không tăng trong tủ cấy
là rất quan trọng (Butler, 2004).
2.1.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế
Nguyên nhân chính của sự thất bại trong nuôi cấy tế bào là sự tạp nhiễm. Sự
tạp nhiễm thƣờng do tiệt trùng dụng cụ không đạt yêu cầu và thƣờng bắt nguồn từ
sự tiếp xúc của con ngƣời nhƣ là từ bàn tay, hơi thở, tóc. Môi trƣờng và thiết bị
ngày nay đƣợc cung cấp sẵn nhằm hạn chế tới mức tối đa những nguy cơ tạp nhiễm
này. Nguy cơ này cũng có thể đƣợc giảm bớt hơn nữa bởi sự quan tâm cẩn thận tới
từng chi tiết khi tiến hành nuôi cấy. Nhằm giảm bớt các nguồn tạp nhiễm, cần chú ý
các điểm sau:
Rửa tay với xà phòng diệt khuẩn trƣớc và sau quá trình có liên quan đến cấy
tế bào. Có thể dùng găng tay nhựa.
Hạn chế những con đƣờng tới phòng thí nghiệm khi thí nghiệm đang tiến
hành.
Làm sạch bề mặt làm việc trƣớc và sau mỗi quá trình nuôi cấy.
Dùng không gian tiệt trùng (ví dụ tủ cấy tiệt trùng) cho tất cả các thao tác.
Dùng ống nghiệm nuôi cấy bằng plastic đƣợc tiệt trùng và chỉ dùng một lần.
Mua môi trƣờng và huyết thanh từ nhà cung cấp đáng tin cậy để đảm bảo
rằng sự tạp nhiễm không phát sinh từ nguồn này (Butler, 2004).
2.2. Phƣơng pháp PCR
Phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) là phƣơng pháp khuếch đại
nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phƣơng pháp này
đƣợc K.Mullis đƣa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Sự khác biệt giữa
tạo dòng và phƣơng pháp PCR là ở chỗ phƣơng pháp PCR đƣợc thực hiện hoàn
toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản

sao DNA. Trong khi đó phƣơng pháp tạo dòng phải đƣợc thực hiện trong tế bào


7
sinh vật. Kỹ thuật PCR có thể đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét
nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di
truyền, tạo giống mới với các đột biến định hƣớng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh
vật ở mức độ phân tử,….
2.2.1. Nguyên tắc
Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện in vitro với sự hiện diện của enzyme DNA
polymerase để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự có mặt của
những mồi chuyên biệt.
Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới. Nếu ta cung
cấp 2 mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ
tổng hợp đƣợc đoạn DNA nằm giữa 2 đoạn mồi. Điều đó nghĩa là để khuếch đại
một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các
mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi
ngƣợc (antisens primer).
2.2.2. Thực nghiệm
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm 3 giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Đây là giai đoạn biến tính (denaturation). Ở giai đoạn này
thƣờng sử dụng điều kiện nhiệt độ biến tính, thƣờng ở 94
0
C- 95
0
C trong 30- 60
giây, làm đứt các cặp base và tách DNA sợi đôi tạo thành các sợi đơn để đóng vai
trò nhƣ khuôn mẫu quá trình tổng hợp DNA.

 Giai đoạn 2: Đây là giai đoạn bắt cặp (annealation). Giai đoạn này thƣờng
đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 40
0
C- 70
0
C trong 30-60 giây tuỳ thuộc vào
primer sử dụng cho phản ứng. Ở nhiệt độ này, primer sẽ tiến hành gắn kết với DNA
mẫu. Việc xác định nhiệt độ lai này là rất quan trọng, nó quyết định độ nhạy và độ
đặc hiệu của phản ứng PCR. Nếu nhiệt độ lai trong giai đoạn này quá thấp sẽ dẫn
đến sự bắt cặp không đặc hiệu, dẫn đến kết quả khuếch đại bị sai. Nếu nhiệt độ lai
quá cao sẽ dẫn đến độ nhạy của phản ứng kém vì primer sẽ không bắt cặp đƣợc.


8
Nhiệt độ này có thể đƣợc tính thông qua Tm. Tm là nhiệt độ mà ở đó việc lai bắt
cặp đúng phân ly. Thông thƣờng nhiệt độ lai đƣợc sử dụng thấp hơn.
 Giai đoạn 3: Đây là giai đoạn kéo dài (elongation). Giai đoạn này thƣờng
đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 72
0
C- 74
0
C trong 30 giây đến vài phút tuỳ thuộc vào
chiều dài đoạn DNA cần tổng hợp. Điều kiện nhiệt độ này sẽ giúp cho Taq
polymerase (là emzyme chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ một loại vi khuẩn suối nƣớc
nóng, Thermus aquaticus) hoạt động và tiến hành tổng hợp sợi DNA mới (Hồ
Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 1998).
2.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR
2.2.3.1. DNA mẫu
Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nhiều kỹ thuật
chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận đƣợc trực tiếp từ dịch

chiết tế bào. Lƣợng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hƣớng giảm (1µg xuống còn
100ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao.
2.2.3.2. Enzyme
Taq polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nƣớc
nóng Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá vỡ ở nhiệt độ biến tính. Ngày
nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đƣợc đƣa ra thị trƣờng với nhiều chức năng
chuyên biệt và hoàn thiện hơn. Tth polymerase là một enzyme tách chiết từ
Thermus themophilus, có khả năng hoạt động nhƣ một enzyme phiên mã ngƣợc khi
có mạch RNA khuôn và ion Mg
++
, nhƣng với sự hiện diện của DNA khuôn và
Mg
++
, Tth polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA.
2.2.3.3. Primer và nhiệt độ lai
Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí
nghiệm PCR. Nếu primer đƣợc thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang
lại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh DNA đơn. Việc lựa chọn primer cần
tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:
Độ dài của đoạn mồi khoảng từ 17-30 Nu. Các đoạn mồi không nên chứa
hơn 3 Nu giống nhau xếp liên tiếp.


9
Tỷ lệ GC lý tƣởng trong đoạn mồi vào khoảng 50% để nhiệt độ bắt cặp
của đoạn mồi là không quá thấp.
Hai đoạn mồi không đƣợc có trình tự Nu bổ sung lẫn nhau.
Nhiệt độ lúc bắt đầu phản ứng, nghĩa là lúc đã cho enzyme tổng hợp DNA
vào, không nên thấp hơn nhiệt độ bắt cặp cặp của đoạn mồi.
Nhiệt độ nóng chảy của 2 mồi không nên cách nhau quá xa.

Đoạn gene cần khuếch đại không nên lớn hơn 3kb và chiều dài lý tƣởng là
nhỏ hơn 1kb.
2.2.3.4. Các thành phần khác của phản ứng
Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20- 200µM/mỗi nucleotide.
Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong các
nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.
Nồng độ ion Mg
++
cũng là nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến phản ứng PCR. Nồng
độ tối ƣu phải đƣợc xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.
2.2.4. Phƣơng pháp RT-PCR
RT- PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) là một phƣơng
pháp dùng để khuyếch đại cDNA đƣợc tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã
ngƣợc. RT- PCR thƣờng đƣợc sử dụng để tạo ra thƣ viện cDNA (complementary
DNA) lớn từ một lƣợng rất nhỏ mRNA, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến
và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngƣợc và sử dụng trong việc định
lƣợng mức độ phân tử của gene. Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng quan
trọng nữa đó là chúng đƣợc sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus RNA.
 Nguyên tắc
Trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzyme tổng hợp chuỗi
oligonucleotide: enzyme phiên mã ngƣợc ( reverse transcriptase) và DNA
polymerase. Enzyme reverse transcriptase cần cho quá trình tổng hợp sợi cDNA từ
RNA và enzyme cần cho sự tổng hợp sợi DNA từ cDNA. Do enzyme reverse
transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mã ngƣợc để tạo ra cDNA phải


10
đƣợc thực hiện ở nhiệt độ thấp (thƣờng khoảng từ 42-450C). Điều này gây ra những
trở ngại:
Sự tạo thành các sản phẩm khuếch không mong muốn do sự bắt cặp không

đặc hiệu của các primers.
Giảm hiệu quả kéo dài chuỗi gen do sự hình thành RNA cấu trúc bậc hai.
Tuy nhiên những trở ngại này có thể đƣợc giải quyết nhờ vào việc sử dụng
enzyme DNA polymerase chịu nhiệt đƣợc chiết từ vi khuẩn Thermus thermophilus.
Enzyme này trong những điều kiện nhất định, có đặc tính sinh học đặc biệt là có thể
thực hiện cùng lúc 2 chức năng: chức năng của reverse transcriptase và chức năng
của DNA polymerase.
2.3. Sơ lƣợc về căn bệnh, bệnh do virus PRRS
Trong chăn nuôi heo, một trong những bệnh mới xuất hiện trong thời gian
gần đây và đƣợc nhắc đến nhiều đó là hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo
(porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS). Bệnh xuất hiện lần đầu
tiên ở Bắc Mỹ vào đầu những năm 1980, sau đó bệnh xuất hiện ở Châu Âu và Châu
Á và đƣợc xác định là do một loại virus thuộc họ Arteriviridae, có khả năng xâm
nhiễm vào đại thực bào và mô. Virus PRRS là một virus RNA có vỏ bọc, gây cả
thiệt hại về sinh sản trong đàn lợn giống và về các triệu chứng hô hấp trong đàn heo
thịt. Heo nái biểu hiện kém ăn, thở khó và có thể kèm theo sốt ngắn. Sảy thai, đặc
biệt là cuối thời kỳ chửa, tăng số lƣợng con chết khi đẻ, heo vẹo chân, heo yếu và
xảy ra tử vong ở heo con. Ở heo nuôi thịt, mức độ bệnh hô hấp tăng lên, thƣờng kết
hợp với các bệnh khác (Thanh Thuận, 2001). Ở ổ dịch cấp tính, ƣớc tính giảm sản
lƣợng 5-20%, giảm từ 1-3.8 heo con/nái/năm, thiệt hại từ 100-155$/nái/năm (dẫn
liệu của Hoàng Văn Năm, 2001). Thể mãn tính làm cho heo thịt chậm lớn, tăng chi
phí thuốc để điều trị các bệnh kế phát.
2.3.1. Lịch sử bệnh
Năm 1987, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ với tên gọi “bệnh thần bí
trên heo” (Mystery Swine Disease - MSD).


11
Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên xảy ra ở Đức và lan tràn nhanh
chóng sang các quốc gia khác ở Châu Âu.

Mùa đông năm 1990- 1991, lần lƣợt các quốc gia Châu Âu nhƣ Hà Lan, Bỉ,
Pháp và Tây Ban Nha đã báo cáo về hội chứng này với nhiều tên gọi khác nhau:
“Bệnh tai xanh” (Blue-eared Pig Disease), “Hội chứng hô hấp và sảy thai trên heo”
( Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome -PEARS), hay “Hội chứng
hô hấp và vô sinh” (Swine Infertility and Respiratory Disease - SIRD).
Năm 1991, lần đầu tiên Wenvoort và cộng sự đã phân lập đƣợc căn bệnh ở
Viện thú y trung ƣơng Lelytad – Hà Lan đã phân lập đƣợc căn bệnh và đặt tên cho
loại virus này là “Lelystad”.
Năm 1992, Collins và cộng sự ở Mỹ cũng báo cáo về việc phân lập đƣợc virus
gây bệnh và sử dụng tên gọi VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ. Cũng
trong năm 1992, hội nghị quốc tế và tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí đặt tên
cho bệnh này là “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” (porcine
reproductive and respiratory syndrome- PRRS) (Võ Thị Đan Thanh, 2006)
Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ
(10/51 con có huyết thanh dƣơng tính). Các nghiên cứu về bệnh trên những trại
giống lớn tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dƣơng tính với
bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở các nƣớc khác, tỷ lệ đàn trong vùng
bệnh có huyết thanh dƣơng tính rất cao, nhƣ ở Anh là 6-75%, Mỹ là 36%,… (Phòng
Dịch tễ-Cục Thú y)
2.3.2. Căn bệnh học
2.3.2.1. Phân loại
Virus PRRS thuộc:
Bộ Nidovirales.
Họ Arteriviridae.
Giống Arterivirus.




12

Hình 2.1. Virus PRRS
(Nguồn: http//www. agraroldal.hu)
2.3.2.2. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc
Virus PRRS có cấu trúc RNA mạch đơn dƣơng, có đƣờng kính 40-70 nm, có
vỏ bọc, kích thƣớc genome dài 14,5 kb mã hoá cho việc tái tạo virus (Jeong-Ki Kim
và cs, 2005).
Bộ gene của virus PRRS gồm có 8 khung độc mở (ORFs) mã hoá cho các
thành phần khác nhau của virus. Tuy nhiên chỉ có 3 khung ORFs có ý nghĩa quan
trọng trong định danh virus, đó là ORFs 7,6 và 5 quy định tổng hợp các protein
tƣơng ứng: nucleocapsid (N) 15-kDa, matrix (M) 19-kDa và glycoproteins envelope
(protein GP
5
) 25-kDa. Đây là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm
90-95% lƣợng protein cấu trúc của virus.
Protein N là một protein nhỏ (15 kDa) và có tính kiềm cao, điều này có thể
giúp nó tƣơng tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA. Protein N hiện diện ở mức độ cao
trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20- 40% lƣợng protein của
phân tử virus. Hiện nay protein N đƣợc dùng nhƣ là một kháng nguyên để phát hiện
kháng thể trong huyết thanh của heo.
Protein M có trọng lƣợng phân tử khoảng 18 kDa. Mặc dù chức năng của nó
đƣợc biết rất ít nhƣng nó đƣợc xem nhƣ có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên
tế bào đích, vì protein M kết hợp GP
5
tạo phức hợp M-GP

5
để kết hợp với thụ thể
trên tế bào đích (Delputte và cs, 2001).


13
Protein GP
5
có trọng lƣợng phân tử khoảng 25 kDA, là nguyên nhân gây ra
hiện tƣợng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế
bào đích (Nathalie và cs, 2003).
Về mặt di truyền, khi phân tích gene của các dòng virus PRRS gây bệnh khác
nhau, ngƣời ta xác định đƣợc 2 dòng virus riêng biệt: dòng Châu Âu (Lelystad) và
dòng Châu Mỹ (VR-2332). Hai dòng virus này không những khác biệt về đặc tính
gây bệnh mà khác nhau về mức độ nhất định về kiểu gene.
Qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự Nu của các dòng PRRS,
ngƣời ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn định rất
cao, chúng gần nhƣ không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus này,
tuy nhiên, sự khác biệt giữa dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở
này là rất rõ, chẳng hạn sự tƣơng đồng về trình tự axit amin của ORFs 7 giữa 2
dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORFs 6 là 70-81%. Trong khi đó,
khung đọc mở ORFs 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1 dòng Châu
Mỹ và chỉ tƣơng đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-59%. Sự tƣơng đồng về trình
tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORFs 2, 3 và 4 giữa các dòng Châu Mỹ
và Châu Âu tƣơng ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Phân
tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hoá do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp
trong gen (Trần Đức Minh). Sự khác biệt về kiểu gene đƣơng nhiên sẽ liên quan đến
sự khác biệt về kiểu hình và nhƣ vậy có thể dựa vào đặc điểm gene để chẩn đoán
dòng virus và ngƣợc lại. Nhƣ vậy, trên cơ sở về kiểu gene, dịch tễ học phân tử cho
phép xác định chính xác bản đồ dịch tễ của một căn bệnh, quá trình xuất hiện, phát

triển của virus PRRS (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định đƣợc khả năng sản
xuất và sử dụng virus nhƣợc độc để làm văcxin. Ngƣời ta đã ghi nhận nhiều trƣờng
hợp hội chứng PRRS trở nên trầm trọng hơn sau khi đàn heo đƣợc tiêm vắcxin virus
PRRS nhƣợc độc vì cấu trúc gene của virus nhƣợc độc thay thế glycine bằng
arginine ở vị trí 151 của ORFs 5 sẽ hoàn nguyên rất nhanh bộ gene của chúng so