PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƯƠNG) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***





NGÔ QUANG HƢỞNG

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR


LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***





PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH
TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR


Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học


Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGÔ QUANG HƢỞNG
ThS. PHAN THÀNH DŨNG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000***





STUDYING GENETIC DEVERSITY OF Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei POPULATION, DESTRUCTIVE FUNGAL
PATHOGEN OF Hevea brasiliensis Muell. Arg.
AT LAI KHE (BEN CAT – BINH DUONG), WAS CARRIED
OUT BY USING RFLP – PCR


Graduation thesis
Major: Biotechnology


Professor: Student:
PhD. BUI CACH TUYEN NGO QUANG HUONG
MSc. PHAN THANH DUNG Term: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006


LỜI CẢM TẠ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
Thầy PGS.TS. Bùi Cách Tuyến - hiệu trưởng trường Đại học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh.
ThS. Phan Thành Dũng - trưởng Bộ môn bảo vệ thực vật, Viện nghiên
cứu cao su Việt Nam.
Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận
tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ
Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt
những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
- Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp .
- KS. Nguyễn Ngọc Mai, KS. Vũ Thị Quỳnh Chi cùng tập thể cô chú, anh
chị làm việc tại Bộ môn bảo vệ thực vật - Viện nghiên cứu cao su Việt Nam đã
nhiệt tình giúp đỡ, động viên và ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận.
- ThS. Nguyễn Văn Cường cùng các anh chị làm việc tại Trung tâm phân

tích thí nghiệm hoá sinh - Đại học Nông Lâm TP. HCM đã giúp đỡ tôi vượt qua
khó khăn để hoàn thành tốt khóa luận .
Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 28 - Trường ĐH.
Nông Lâm TP. HCM đã luôn ở bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẽ vui
buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận.
Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng
dục con nên ngƣời, để Con đƣợc nhƣ ngày hôm nay.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006.
Sinh viên Ngô Quang Hưởng.




TÓM TẮT

NGÔ QUANG HƢỞNG, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh,
tháng 8/2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora
cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis
Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) bằng kỹ thuật RFLP –
PCR”.

Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến
ThS. Phan Thành Dũng

Thời gian thực hiện từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006, tại Viện Nghiên Cứu
Cây Cao Su Việt Nam, Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương và tại Trung tâm Phân
tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Vấn đề bảo vệ thực vật luôn nhận được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội.
Đối với một nước sản xuất cao su thiên nhiên như Việt Nam, những nghiên cứu
về vi sinh vật, côn trùng, sâu hại trên cây cao su là vô cùng cấp thiết. Bệnh rụng

lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra là một bệnh mới và vô
cùng nguy hiểm. Nó gây ra những thiệt hại rất lớn về kinh tế. Để tạo những tiền
đề cho các nghiên cứu về loại bệnh này, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP
– PCR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể nấm C. cassiicola tại
Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương.

Nôi dung nghiên cứu:
- Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Corynespora cassiicola.
- Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS bằng 2 primer ITS A và
ITS B.
- Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR thu được.
Các kết quả đạt được:
- Phân lập được 65 dòng nấm và tách đơn bào tử 24 dòng nấm
C. cassiicolai trên các dòng vô tính cao su khác nhau.

- Dùng PCR khuếch đại được vùng gene nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S
và đầu 5’ của rDNA 28S, với kích thước là 540 bp.
- Phân cắt sản phẩm PCR với 7 loại enzyme cắt là Hae III, Sau3A I,
EcoR I, Nde II, Cfo I, Rsa I, Alu I. Kết quả là không tìm thấy băng đa hình khi
cắt bằng 7 loại enzyme trên.
Việc sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa dạng di truyền nấm
C. cassiicola chưa cho kết quả như mong muốn. Không tìm thấy bất cứ sự
khác biệt nào khi phân cắt bằng 7 loại enzyme trên. Do đó, cần có những
nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự để có những kết luận chính xác về mức
độ đa dạng di truyền của quần thể nấm này.

MỤC LỤC

PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt x
Danh sách các bảng xi
Danh sách các hình xii
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu 2
1.2.1. Mục đích 2

1.2.2. Yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg 3
2.1.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg
trên thế giới và tại Việt Nam 3
2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng mưa, tốc độ gió đến
sự phát triển của cây cao su 4
2.1.3. Tình hình bệnh hại trên cây cao su 5
2.2. Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 6
2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt. ) Wei 6
2.2.2. Đặc điểm phân loại học của nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 6
2.2.3. Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 7
2.2.4. Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố và triệu chứng
của bệnh rụng lá Corynespora 8

2.2.5. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nước trồng nhiều
cao su trên thế giới 9
2.3. Giới thiệu về phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 10
2.3.1. Sơ lược về kỹ thuật PCR 10
2.3.2. Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng
đến kết quả phản ứng PCR 10
2.3.3.1. DNA mẫu 10
2.3.3.2. Primer và nhiệt độ lai 11
2.3.3.3. Enzyme 12
2.3.3.4. Mg
2+
12

2.3.3.5. dNTPs 12
2.3.3.6. Số lượng chu kỳ 12
2.3.3.7. Nhiệt độ và pH 13
2.3.3.8. Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR 13
2.3.4. Các bước thực hiện một phản ứng PCR 13
2.3.5. Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR 14
2.3.6. Ứng dụng của kỹ thuật PCR 14
2.4. Giới thiệu về kỹ thuật RFLP 15
2.4.1. Sơ lược về enzyme cắt giới hạn 15
2.4.1.1. Giới thiệu chung 15
2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn 15
2.4.1.3. Các loại RE 16
2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE 17
2.4.2. Sơ lược về phương pháp RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) 17
2.4.2.1. Giới thiệu chung 17
2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP 17
2.4.2.3. Sơ lược về kỹ thuật RFLP – PCR 18
2.6. Giới thiệu về vùng ITS 19
2.7. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora
cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nước và ngoài nước 20

3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 22
3.1.1. Thời gian 22
3.1.2. Địa điểm 22
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu 22
3.2. Nội dung nghiên cứu 22
3.3. Vật liệu và phương pháp 22
3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối 22

3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 22
3.3.1.2. Phương pháp lấy mẫu 23
3.3.1.3. Phương pháp phân lập nấm 23
3.3.1.4. Phương pháp tách đơn bào tử 23
3.3.1.5. Phương pháp nhân sinh khối 24
3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA của nấm 24
3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 24
3.3.2.2. Phương pháp tách chiết DNA 24
3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di 25
3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích 25
3.3.2. Khuếch đại vùng ITS của nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei bằng kỹ thuật PCR 26
3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 26
3.3.2.2. Thực hiện phản ứng PCR 26
3.3.2.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di 27
3.3.3. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 28
3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 28
3.3.3.2. Thực hiện phân tích RFLP 28
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola
trên một số dòng vô tính cao su 29
4.1.1. Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây

bệnh rụng lá Corynespora 29
4.1.2. Kết quả phân lập 32
4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử 32
4.1.4. Kết quả nhân sinh khối 35
4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm 36
4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR 37

4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola 40
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
5.1. Kết luận 46
5.2. Đề nghị 46
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
7. PHỤ LỤC 52




















DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism.
CLFP: Corynespora leaf fall disease.

cm: centimét.
dNTPs: deoxyribonucleotide – 5 – triphosphate.
ITS: Internal Transcribed Spacer.
Kb: Kilobase pair.
m: mét.
mm: milimét.
Nu: Nucleotide.
PCR: Polymerase Chain Reaction.
PDA: Potato Dextrose Agar.
PGA: Potato Glucose Agar.
PSA: Potato Sucrose Agar.
R – M: Restriction – Modification.
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA.
rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid.
RE: Restriction Endonuclease.
RFLP – PCR: Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase
Chain Reaction.
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism.
rRNA: ribosome Deoxyribonucleotide acid.
TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate.
TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate.
Tm: melting Tempereture.
VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam





DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Một vài RE và vị trí cắt của nó 16
Bảng 3.1. Thành phần phản ứng PCR 26
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng enzyme cắt 28
Bảng 4.1. Tình hình nhiễm bệnh tại một số vườn
trên địa bàn Lai Khê – Bình Dương 30
Bảng 4.2. Các dòng nấm được tách đơn bào tử 33
Bảng 4.3. Thành phần phản ứng PCR đã có thay đổi 39
Bảng 4.4. Kích thước các đoạn DNA sau khi phân cắt bằng các enzyme giới hạn 44

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Hình dạng bào tử nấm C. cassiicola 7
Hình 2.2. Mô tả phản ứng RFLP 18
Hình 2.3. Sơ đồ vùng ITS của nấm 19
Hình 4.1. Triệu trứng bệnh rụng lá Corynespora 31
Hình 4.2. Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trường nhân tạo
(3 ngày sau khi cấy) 32
Hình 4.3. Bào tử nấm C. cassiicola 32
Hình 4.4. Sự khác biệt giữa 2 khuẩn lạc từ 2 đơn bào tử của một dòng nấm 34
Hình 4.5. Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc 35
Hình 4.6. Kết quả li trích 24 dòng nấm khác nhau 36
Hình 4.7. DNA tổng số đã tinh sạch 37
Hình 4.8. Sản phẩm PCR theo quy trình cũ của Silva và cộng sự (1998) 38
Hình 4.9.Sản phẩm PCR theo quy trình mới 39
Hình 4.10. Sản phẩm PCR cắt bằng Hae III 41
Hình 4.11. Sản phẩm PCR cắt bằng EcoR I 41
Hình 4.12. Sản phẩm PCR cắt bằng Sau3A I 42
Hình 4.13. Sản phẩm PCR cắt bằng Alu I 42
Hình 4.14. Sản phẩm PCR cắt bằng Cfo I 43
Hình 4.15. Sản phẩm PCR cắt bằng Nde II 43
Hình 4.16. Sản phẩm PCR cắt bằng Rsa I 43

PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đối với thực vật thì những tác nhân gây thiệt hại về năng suất, chất lượng
chủ yếu là sâu hại, virus hoặc nấm gây ra. Trên cây cao su cũng vậy, đặc biệt là
các loại bệnh do nấm và vi khuẩn. Ngay từ khi xuất hiện, bệnh rụng lá do nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra đã gây thiệt hại rất lớn đối
với năng suất và chất lượng của nhiều cây trồng khác nhau (khoảng trên 11 loại
cây vùng nhiệt đới) như đậu nành, đu đủ, cao su…Từ đó, ảnh hưởng rất lớn đến
nền kinh tế của các quốc gia, đặc biệt là các quốc gia có thu nhập chính từ nông
nghiệp, trong đó có Việt Nam.
Đối với cây cao su bệnh rụng lá do nấm Corynespora cassiicola gây ra hay
còn gọi là bệnh rụng lá Corynespora (CLFD) đã gây thiệt hại rất nghiêm trọng
đối với ngành cao su ở nhiều quốc gia, lãnh thổ trên thế giới. Đợt dịch bệnh
bùng phát đầu tiên trên cây cao su vào năm 1985 đã gây rất nhiều sự chú ý của
các nhà khoa học. Cho đến nay, tính chất của bệnh rụng lá Corynespora càng
ngày càng nghiêm trọng, quy mô và phổ ký chủ càng ngày càng mở rộng. Đồng
thời nấm Corynespora cassiicola có khả năng biến đổi sinh hóa rất lớn. Bệnh
này làm rụng lá trên quy mô lớn ảnh hưởng đến năng suất mủ của cây cao su.
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên trên cây cao su vào tháng 9/1999
tại các nông trường cao su ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên. Nó đã gây ra cho
ngành cao su những mối lo mới và ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của
ngành cao su. Lúc mới xuất hiện, bệnh chỉ xuất hiện trên một số ít dòng vô tính
như RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Tuy nhiên, ngày càng có nhiều dòng
vô tính bị nhiễm bệnh này.
Hiện trên thế giới đã có rất nhiều những nghiên cứu về nấm Corynespora
cassiicola. Tuy nhiên những nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ hình
thái cũng như đặc điểm sinh lý của nấm, còn những nghiên cứu về mặt sinh học

phân tử thì rất ít.
Để chuẩn bị cho những nghiên cứu sâu hơn về mặt sinh học phân tử của
nấm C. cassiicola tại Việt Nam, đồng thời được sự đồng ý của Bộ Môn Công

Nghệ Sinh Học, của thầy PGS.TS. Bùi Cách Tuyến, ThS. Phan Thành Dũng và
đặc biệt là sự giúp đỡ của Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, tôi thực
hiện đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora
cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis
Muell. Arg) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) bằng phƣơng pháp RFLP
– PCR”.

1.2. Mục đích yêu cầu
- Phân lập thành công các dòng nấm gây bệnh trên các dòng vô tính cây cao
su khác nhau.
- Đánh giá được sự sai khác về mặt di truyền của một số dòng nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei phân lập từ các dòng vô tính cao
su khác nhau bằng kỹ thuật RFLP – PCR.

1.3. Yêu cầu
- Phân biệt được bệnh do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei
gây ra trên cây cao su với những bệnh do các nấm khác.
- Nắm vững quy trình nuôi cấy, phân lập và tách đơn bào tử nấm
C. cassiicola.
- Nắm vững quy trình kỹ thuật PCR và kỹ thuật RFLP.

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg
2.1.1. Sơ lƣợc về cây cao su Hevea brasiliensis Mull. Arg trên thế giới và tại
Việt Nam
Cây cao su có tên khoa học là Hevea brasiliensis Mull. Arg., thuộc họ
Euphorbiaceae (họ thầu dầu) có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 36. Đây là loại
cây công nghiệp dài ngày (chu kỳ khai thác là 20 – 30 năm), có giá trị tổng hợp
trong tất cả các lĩnh vực nông – lâm – ngư nghiệp. Cây cao su có nguồn gốc từ
vùng nhiệt đới và lưu vực sông Amazone (Nam Mỹ). Sau đó đến năm 1876, cây
cao su được du nhập vào Châu Á và Châu Phi bởi H. Wickham. Khi Pháp đô hộ
nước ta thì ngoài những thay đổi về mặt chính trị thì các nhà tư bản Pháp khi
vào Việt Nam cũng đã làm biến đổi cả cơ cấu cây trồng, đặc biệt là các cây
công nghiệp. Cây cao su cũng là một loại trong số đó, năm 1877 hai cây cao su
đầu tiên do một người Pháp tên là Pierre đem về trồng tại Thảo Cầm Viên (Sài
Gòn) nhưng sau đó hai cây này đã bị chết.
Sau nhiều nỗ lực trong việc đưa cây cao su vào Việt Nam thì cuối cùng
vườn cây cao su đầu tiên cũng đã được trồng tại Suối Dầu – Nha Trang do bác
sĩ Yersin (Theo Đặng Văn Vinh, 2000). Có được thành công đó phải kể đến nỗ
lực của Seeligmann khi ông liên tiếp trong 2 năm 1881 và 1883 đã gửi cây cao
su về Sài Gòn trồng.
Yếu tố chính trị quyết định rất lớn đến sự phân bố và phát triển của cây cao
su trên thế giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng. Sau khi người Pháp đã
thành công trong việc đưa cây cao su vào trồng tại Việt Nam, thì hàng loạt
vườn cao su đã được trồng với mục đích thí nghiệm trong khoảng thời gian

1900 – 1920. Trong khoảng thời gian đầu thế kỷ 20 từ năm 1920 – 1945, cao su
được trồng chủ yếu tại Đông Nam Bộ với diện tích là 10.000 ha, chủ yếu trong
các đồn điền của người Pháp. Đến trước những năm 1945, khi mà các công ty
tư bản Pháp khuyến khích người dân trồng cao su làm cho diện tích tăng lên
138.000 ha, với sản lượng bình quân là 77.400 tấn/năm (Hourt Borek, 2003).

Trong giai đoạn 1945 – 1954, đây là giai đoạn cả Việt Nam và Pháp đều tập
trung cho cuộc chiến do vậy mà diện tích cây cao su không những không tăng
mà còn giảm đáng kể.
Trong những năm đầu thập niên 50, cây cao su đã được trồng tại một số
vùng Tây Nguyên, miền Trung và một số tỉnh miền Bắc (Đặng Văn Vinh,
2000). Đến năm 1955, diện tích cây cao su đã giảm xuống chỉ còn 24.000 ha
với sản lượng 15.000 tấn/năm, chủ yếu do tư nhân quản lý. Cuối năm 1960,
diện tích cây cao su đã tăng nhanh lên 142.000 ha và sản lượng đạt
76.650 tấn/năm (Hourt Borek, 2003) (trích Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005). Sau đó,
diện tích không tăng do cuộc chiến giữa Pháp và Việt Nam bước vào giai đoạn
quyết liệt. Cuối thời kỳ chiến tranh khoảng những năm 1970 – 1975, thì diện
tích cây cao su giảm mạnh chỉ còn 25.000 ha và sản lượng chỉ còn 21.000
tấn/năm. Sau giải phóng (năm 1975) theo tài liệu của cục thống kê tháng 5/1975
thì diện tích cây cao su cả nước còn khoảng 75.200 ha. Trong đó, Tổng công ty
cao su Việt Nam quản lý 55.790 ha, số còn lại do tư nhân và địa phương quản
lý. Đến năm 1995, trên thế giới có khoảng 9,5 triệu ha, trong đó cao su tiểu điền
chiếm từ 75% - 95% (theo Báo cáo nghiên cứu phát triển cây cao su tiểu điền -
Tổng công ty cao su Việt Nam từ 28/10/1995 – 1/11/1995, Malaysia –
Indonesia – Thái Lan).
Ở Việt Nam, diện tích cao su cả nước khoảng 450.000 ha và sản lượng đạt
400.000 tấn /năm (Tổng công ty cao su Việt Nam, 2004). Trong số này, Tổng
công ty cao su quản lý 219.600 ha, trong đó có 173.700 ha đang khai thác mủ.
Năng suất năm 2003 bình quân đạt 0,52 tấn/ha/năm, trong đó năng suất ở khu
vực Đông Nam Bộ là cao nhất với 1,56 tấn/ha/năm.

2.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ, lƣợng mƣa, tốc độ gió đến sự phát triển cây
cao su
Nhiệt độ tốt nhất đối với cây cao su là 25 – 30
o
C, trên 40
o
C cây sẽ khô héo,
còn dưới 10
o
C trong thời gian dài cây sẽ héo, rụng lá, rụng chồi… Còn nếu
nhiệt độ ở 5
o
C thì cây sẽ chết.

Lượng mưa thay đổi tùy theo tình trạng đất. Thông thường lượng mưa thuận
lợi nhất là từ 1.500 – 2.000 mm/năm, còn ở những vùng đất không thuận lợi thì
lượng mưa cần là 1.800 – 2.000 mm/năm.
Tốc độ gió có lợi cho cây cao su là từ 1 – 2 m/giây. Nếu tốc độ gió cao từ
8 – 13,8 m/giây sẽ làm lá cây bị rách, bị co lại, phiến lá dày lên. nhỏ lại.
Nhiệt độ, lượng mưa và tốc độ gió thuận lợi cho sự phát triển cây cao su thì
cũng thuận lợi cho sự phát triển của nấm.
2.1.3. Tình hình bệnh hại trên cây cao su
Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, rất nhạy cảm với thời tiết. Do
vậy, cây cao su bị rất nhiều côn trùng và vi sinh vật gây hại. Hiện nay, trên cây
cao su có rất nhiều bệnh như bệnh về lá, bệnh về thân cành, bệnh rễ (Kỹ thuật
bảo vệ thực vật cây cao su – Phan Thành Dũng, 2004). Các bệnh này ảnh hưởng
rất lớn đến sản lượng và phẩm chất mủ. Đặc biệt là các bệnh về lá như bệnh
phấn trắng do nấm Oidium heveae Steinm gây ra, bệnh héo đen đầu lá do nấm
Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) gây ra, bệnh rụng lá mùa mưa do nấm
Phytophthora spp. Và nghiêm trọng nhất là bệnh rụng lá Corynespora do nấm

Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. gây ra (Báo cáo tại hội thảo
chuyên đề “Bảo vệ thực vật cây Cao su Việt nam - Hợp tác nghiên cứu và đào
tạo giữa Đại học Nông Lâm và Ngành Cao su Việt Nam” – Phan Thành Dũng,
2006). Bệnh rụng lá Corynespora là một bệnh mới, mức độ tàn phá của nó trên
cây cao su và nhiều loại cây trồng khác là vô cùng lớn.
Ngoài các bệnh do vi sinh vật gây ra, trên cây cao su còn có các bệnh do côn
trùng gây ra. Các loại côn trùng gây hại cây cao su có thể kể đến như: mối, sâu,
sùng hại rễ, nhện, ốc sên, rệp… (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan
Thành Dũng, 2004).
Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có
24 loài có tầm quan trọng về kinh tế (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su –
Phan Thành Dũng, 2004). Theo Nguyễn Hải Đường (1997), có 24 loại bệnh gây
hại trên cây cao su ở Việt Nam.



2.2. Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei
2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei
Do nấm Corynespora có phổ ký chủ rộng nên đã có rất nhiều nhà khoa học
tìm thấy loại nấm này trên nhiều ký chủ khác nhau. Đầu tiên, vào năm 1896 nó
Cooke phát hiện nấm này trên cây dưa leo và cây dưa hấu tại Mỹ, đặt tên là
Cercospora melonis. Sau đó, Gusgow (1906) đã đặt tên là Corynespora maizei
khi ông tìm thấy chúng trên cây dưa leo tại Đức. Đến năm 1948, các nhà khoa
học Trung Quốc cho rằng loại nấm họ tìm được trên cây đậu nành, đậu đũa tại
Trung Quốc tương tự như những loại nấm gây bệnh trên cùng loại ký chủ ở Mỹ
trước đó và họ đặt tên là Corynespora vignicola Kawamura. Liu.
Mặc dù có rất nhiều tên gọi khác nhau nhưng cuối cùng Wei cũng đã thu
thập, phân tích tất cả những tài liệu về nấm này và khẳng định chúng đều
thuộc một loài là Corynespora cassiicola. Và ông đã đặt tên cho chúng là
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. Hiện nay, các kỹ thuật sinh học

phân tử phát triển, càng khẳng định nhận định của Wei là hoàn toàn đúng.
Nấm C. cassiicola ký sinh trên rất nhiều loài ký chủ khác nhau nhờ khả
năng biến đổi sinh hóa rất nhanh. Nhưng mãi đến năm 1949, bệnh mới được
phát hiện trên cây cao su đầu tiên ở Sri Lanka. Sau đó chúng xuất hiện rất nhiều
ở các quốc gia trồng cao su khác như Thái Lan, Indonesia, Braxin…Tuy xuất
hiện sớm nhưng đợt dịch bệnh đầu tiên gây nhiều sự chú ý của các nhà khoa
học xảy ra vào năm 1985 tại Sri Lanka. Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu
tiên tại một số nông trường cao su ở Đông Nam Bộ và Tây Nguyên vào năm
1999.
2.2.2. Đặc điểm phân loại học của nấm Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei
Nấm C. cassiicola có hệ thống phân loại học như sau:
- Ngành: Ascomycota.
- Lớp: Ascomycetes.
- Bộ: Pleosporales.
- Họ: Corynesporascaceae.
- Giống: Corynespora.

2.2.3. Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei
Trong môi trường tự nhiên, nấm phát triển trên thực vật bằng cách thức ký
sinh hay hoại sinh trên xác bã thực vật. Chúng phát triển rất nhanh nhờ phát
sinh bào tử. Khuẩn ty của nấm có màu sắc biến thiên từ màu xám trắng đến
xám đen và nâu. Hình dạng bào tử cũng rất đa dạng từ hình lưỡi liềm đến hình
que. Bào tử có màu nâu nhạt, ở dạng đơn nhưng đôi khi ở dạng chuỗi dính có
chứa nhiều vách ngăn chiều dài khoảng 700 m (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây
cao su – Phan Thành Dũng, 2004).
Bào tử của nấm được phát tán nhờ gió và mưa. Nó được phóng thích vào
ban ngày và cao điểm từ 8 – 11 giờ (Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su – Phan
Thành Dũng, 2004). Trong môi trường tự nhiên, số lượng bào tử phụ thuộc

nhiều vào thời tiết, nhiều nhất là sau khoảng thời gian nắng ráo sau những trận
mưa dài. Cũng như các nấm khác, bào tử nấm Corynespora có khả năng tồn tại
lâu trong vết bệnh cũng như trong đất mà vẫn giữ được khả năng gây bệnh.

Hình 2.1: Hình dạng bào tử nấm C. cassiicola
(Nguồn: )

Đây là loại nấm sinh độc tố cassiicoline gây rụng lá rất nhanh. Nấm
Corynespora cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới của lá qua lớp biểu bì và
khí khổng.
Trái với ngoài tự nhiên, nấm này rất khó sinh bào tử trên môi trường nhân
tạo. Chúng chỉ sinh bào tử ở những điều kiện rất đặc biệt về nhu cầu ánh sáng,

nhiệt độ hay dinh dưỡng…Trong đó môi trường PDA cải thiện đáng kể khả
năng sinh bào tử của nấm. Hình dạng và màu sắc khuẩn lạc thay đổi tùy vào
điều kiện nuôi cấy, nó phát triển dàn mỏng và rộng trong điều kiện ánh sáng
huỳnh quang và thường tụ lại và dày lên khi phát triển trong môi trường tối.
Nấm phát triển ở nhiệt độ 8 – 36
o
C, thích hợp nhất ở 28
o
C và ngưng phát triển ở
nhiệt độ trên 40
o
C (Phan Thành Dũng, 1995).
Các yếu tố phát sinh nguồn bệnh, gồm 3 yếu tố:
- Dòng vô tính cao su mẫn cảm: Tính mẫn cảm của cây cao su đối với
bệnh rụng lá Corynespora tùy thuộc vào từng dòng và tùy thuộc vào điều kiện
khí hậu từng nước.
- Nấm hình thành loài mới: Nấm C. cassiicola là một loài nấm có khả

năng thích nghi với điều kiện môi trường cao. Trong những điều kiện khác nhau
nấm dễ dàng biến đổi sinh hóa để hình thành nòi mới. Ngoài yếu tố môi trường
thì yếu tố ký chủ và các dòng vô tính mẫn cảm cũng là các yếu tố giúp phát sinh
nòi mới.
- Môi trƣờng thuận lợi: Trong môi trường thuận lợi nấm sẽ phát triển
nhanh và gây hại trên diện rộng.
2.2.4. Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố và triệu chứng của bệnh rụng lá
Corynespora
Nấm Corynespora cassiicola gây bệnh trên rất nhiều loại ký chủ và trên
phạm vi toàn thế giới. Nấm tấn công nhiều loại cây trồng từ các cây rau màu
như rau diếp, dưa gang, cà chua hay các cây công nghiệp như đu đủ, cao su, cây
gai…Trong đó, nấm Corynespora cassiicola gây bệnh trên cây cao su mang
tính chuyên biệt cao.
Do khả năng thích ứng rất lớn đối với thời tiết mà bệnh do nấm này gây ra
đã được ghi nhận ở rất nhiều nước, từ các nước ở vùng ôn đới đến các nước ở
vùng nhiệt đới như Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Sri Lanka, Việt Nam…
Bệnh này tấn công trên cả lá non, chồi và lá trưởng thành, đặc biệt là gân lá.
Triệu chứng của bệnh cũng biến đổi tùy thuộc vào loại ký chủ và vị trí gây
bệnh.

- Triệu chứng trên lá: Đầu tiên, xuất hiện các đốm nâu hơi vàng sau đó
vết bệnh lan rộng thành đốm tròn hoặc phân nhánh theo hình xương cá. Trên lá
trưởng thành, nấm sẽ gây chết từng phần tại các vết bệnh, sau đó lá chuyển sang
màu vàng và bị rụng. Trên lá non, nấm sẽ làm lá quăn và rụng.
- Trên chồi và cuống lá: Chồi xanh dễ bị nhiễm hơn chồi đã hóa nâu.
Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ
rỉ ra và sau đó hóa đen. Vết bệnh phát triển dài đến khoảng 20 cm sẽ gây chết
chồi, đôi khi chết cả cây. Nếu bệnh phát triển trên chồi thì sẽ gây rụng hết lá
chét ngay khi còn xanh (Phan Thành Dũng, 2004).
2.2.5. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nƣớc trồng nhiều cao su

trên thế giới
Hiện nay, bệnh rụng lá Corynespora đã xuất hiện và gây thiệt hại ở hầu hết
các quốc gia trồng cao su.
- Tại Indonesia: Bệnh bùng phát lần đầu tiên vào năm 1980, do đa số
(90%) diện tích trồng cao su là cao su tiểu điền nên những thiệt hại chưa được
thống kê một cách đầy đủ. Ảnh hưởng rõ nhất là làm tăng thời kỳ kiến thiết cơ
bản và làm giảm sản lượng mủ ở vườn khai thác. Một số dòng vô tính cây cao
su bị nhiễm bệnh từ năm 1980 đến năm 1999 là: RRIC 103 (1980); PNN 2058,
2444, 2447 (1982); GT 1, KRS 21, FX 25, BPM 6, RRIM 725 (1984); RRIM
600 (1991); IAN 837 (1995); AV 2037 (1999). Đối với các dòng bị bệnh thì đa
số phải nhổ bỏ và trồng mới.
- Tại Malaysia: Dịch bệnh bùng phát vào năm 1985 trên một số dòng vô
tính như RRIC 103, KRS 21, RRIM 725 đã gây thiệt hại nặng về kinh tế. Hiện
nay, đã có thêm rất nhiều dòng vô tính bị nhiễm bệnh như GT 1, RRIM 600,
701, 702, 703…
- Tại Thái Lan: Đầu tiên bệnh xuất hiện và gây chết đối với dòng vô tính
RRIC 103 và rụng lá nặng trên dòng vô tính KRS 21. Hiện bệnh đã xuất hiện
trên toàn bộ diện tích cao su của Thái Lan.
- Tại Sri Lanka: Đợt dịch bùng phát vào năm 1985 trên dòng vô tính cao
su RRIC 103 đang được trồng đại trà, do đó đã gây thiệt hại lớn về kinh tế.

Hiện nay đã có thêm rất nhiều dòng vô tính bị nhiễm bệnh như RRII 105,
RRIM 600, GT 1…
- Tại Việt Nam: Bệnh được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1999 trên một
số dòng vô tính như LH 88/372, RRIC 103, RRIC 104, do chưa có biện pháp
chữa trị và phòng ngừa nên đã tiến hành chặt bỏ và khuyến cáo không trồng các
dòng mẫn cảm với nấm C. cassiicola.

2.3. Giới thiệu về phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.3.1. Sơ lƣợc về kỹ thuật PCR

Việc triển khai các ứng dụng của sinh học phân tử thường vấp phải nhiều trở
ngại về số lượng vật liệu di truyền cần sử dụng. Mặc dù đã có những phương
pháp để làm tăng số lượng vật liệu di truyền như tạo dòng nhờ vi khuẩn, tuy
nhiên các kỹ thuật này thường phức tạp và cần nhiều thời gian. Do đó, việc phát
minh ra kỹ thuật PCR là một bước tiến vĩ đại trong lịch sử nghiên cứu sinh học
phân tử.
Năm 1985, Kary Mullis và cộng sự đã phát minh ra kỹ thuật PCR và đến
năm 1988 thì Saiki đã hoàn thiện kỹ thuật này. Việc sử dụng enzyme Taq DNA
polymerase trong phản ứng PCR là một bước tiến cực kỳ quan trọng trong các
thí nghiệm sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Kỹ thuật PCR về bản chất là phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự
hiện diện của tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Phương pháp PCR sẽ
khuếch đại đoạn DNA nằm giữa cặp primer. Theo nguyên tắc trên thì yêu cầu
của phản ứng PCR là phải biết được trình tự đoạn DNA, đặc biệt là trình tự hai
đầu của đoạn DNA cần khuếch đại (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.3.2. Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả
phản ứng PCR
2.3.2.1. DNA mẫu
Ưu điểm lớn nhất của phản ứng PCR là có độ nhạy cao. Kết quả phản ứng
PCR tối ưu khi DNA sử dụng có độ tinh sạch cao. Mặc dù vậy phản ứng PCR
cũng cho kết quả tốt đối với những mẫu thu trực tiếp mà không qua tinh sạch
hay DNA thu được từ những mẫu không được bảo quản tốt, những mẫu đã bị

phân hủy một phần như máu khô hóa thạch, tóc, móng tay người chết… Tuy
nhiên, khi mẫu không sạch có lẫn protein sẽ làm cho hiệu quả phản ứng PCR
giảm theo (Khuất Hữu Thanh, 2003).
Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm từ 1 g xuống còn 100 ng, khi
giảm nồng độ DNA ban đầu sẽ hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo
những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Việc
sử dụng nồng độ DNA quá cao sẽ tạo ra những kết quả dương tính giả.

2.3.2.2. Primer và nhiệt độ lai
Primer là yếu tố quyết định đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR.
Một phản ứng PCR chuẩn gồm 2 loại primer: primer xuôi và primer ngược.
Trong đó, primer xuôi bắt cặp bổ sung trên sợi sen, còn primer ngược bắt cặp
trên sợi antisen của phân tử DNA mẫu. Việc thiết kế primer đòi hỏi phải đáp
ứng được những nhu cầu sau:
- Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa
primer xuôi và primer ngược, không có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ
sung giữa các thành phần khác nhau của một primer (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
- Thành phần các nucleotide phải cân bằng. Nếu tỉ lệ G, C cao thì số lượng
nucleotide của mỗi primer sẽ giảm từ 15- 30 nu xuống còn 18 – 20 nu (Bùi Chí
Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Tỉ lệ các nu sẽ ảnh hưởng đến nhiệt độ bắt
cặp của primer, nhiệt độ này được tính theo công thức:
Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C).
Đồng thời nhiệt độ bắt cặp của hai primer không cách biệt quá xa.
- Trình tự được khuếch đại là trình tự DNA nằm giữa hai primer xuôi và
ngược, trình tự này không được quá lớn. Phải nhỏ hơn 1 Kb đối với phản ứng
PCR chuẩn (Khuất Hữu Thanh, 2003) (trích Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005).
- Các primer phải đặc trưng cho trình tự được khuếch đại, không bắt cặp bổ
sung với nhiều trình tự trên hệ gene.
Trong phản ứng PCR thì nồng độ primer khoảng 1 – 25 pM cho phản ứng
25 – 50 l (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).


2.3.2.3. Enzyme
Enzyme được sử dụng lần đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I
(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Tuy nhiên, hiệu quả mang lại không cao do
enzyme này bị bất hoạt ở nhiệt độ cao. Việc phát minh và sử dụng enzyme Taq
DNA polymerase trong phản ứng PCR là một bước ngoặc cực kỳ quan trọng

trong các thí nghiệm về sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,
1999).
Enzyme Taq polymerase được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus.
Đây là vi khuẩn sống ở suối nước nóng, vì vậy chịu được nhiệt độ cao. Enzyme
Taq polymerase thu được từ vi khuẩn này cũng chịu đựng được nhiệt độ cao,
đặc điểm này rất phù hợp với điều kiện của phản ứng PCR.
2.3.2.4. Mg
2+

Là thành phần trong dung dịch đệm, là chất xúc tác của enzyme DNA
polymerase. Do đó, Mg
2+
ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR. Nồng độ
cao hay thấp của Mg
2+
ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của enzyme Taq
polymerase, ảnh hưởng đến quá trình tách mạch đơn của phân tử DNA. Nếu
nồng độ enzyme thấp sẽ ức chế hoạt động của enzyme, còn nếu nồng độ cao tuy
giúp mạch kép của DNA ổn định hơn nhưng lại ức chế sự biến tính hoàn toàn
chuỗi DNA. Nồng độ Mg
2+
ở mức quá cao sẽ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa
primer và khuôn. Nồng độ tối ưu của Mg
2+
cho từng phản ứng phải được xác
định qua nhiều phản ứng thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.3.2.5. dNTPs
Nồng độ và thành phần các nucleotide cũng ảnh hưởng đến kết quả PCR.
Nồng độ dNTPs thường sử dụng là 20 – 200 M. Nồng độ dNTPs cao sẽ dẫn
đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide

sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
2.3.2.6. Số lƣợng chu kỳ
Tuy về mặt lý thuyết thì số lượng chu kỳ là không giới hạn, nhưng trên thực
tế thì số lượng chu kỳ thường không vượt quá 40 chu kỳ. Khi số lượng chu kỳ
quá lớn thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ bị giảm theo số lượng chu kỳ.