Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phương pháp RFLP - PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP


PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN
CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR





NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NIÊN KHÓA: 2001 – 2005
SINH VIÊN THỰC HIỆN: VŨ THỊ QUỲNH CHI



Thành phố Hồ Chí Minh

-2005-



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC















PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM
Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN
CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR

Hội đồng hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN VŨ THỊ QUỲNH CHI
ThS. PHAN THÀNH DŨNG






Thành phố Hồ Chí Minh
-2005-

iii

LỜI CẢM TẠ

Chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những
kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp .
PGS.TS Bùi Cách Tuyến cùng ThS. Phan Thành Dũng – Viện Nghiên Cứu Cao
Su Việt Nam – đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
TS. Bùi Minh Trí và TS. Đinh Duy Kháng đã có những chỉ dẫn, động viên giúp
tôi thực hiện tốt khóa luận này.
KS. Nguyễn Ngọc Mai cùng các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ
Môn Bảo Vệ Thực Vật/Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và
hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt

Nam.
Chị Huỳnh Kim Hưng cùng các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí
Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã
hướng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa
luận.
Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng
tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt
nghiệp.
Và Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên
người, để Con được như ngày hôm nay.

iv

TÓM TẮT

VŨ THỊ QUỲNH CHI. Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Tháng 09/2005. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU
BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR.

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN.
ThS. PHAN THÀNH DŨNG.

Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su là một bệnh mới do nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra nhưng có tác hại rất lớn đến nền
kinh tế của nhiều nước, đặc biệt là những nước sản xuất cao su thiên nhiên. Triệu
chứng biểu hiện của bệnh hiện nay rất biến thiên và dễ nhầm lẫn với các bệnh về lá
khác. Do đó tìm hiểu phương pháp chẩn đoán, phát hiện nhanh bệnh Corynespora
cũng là cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước khi bệnh lây lan. Những nghiên
cứu trên thế giới cho thấy, nấm C. cassiicola có sự phân hóa trong cùng loài,

C. cassiicola trên các dòng vô tính cao su khác nhau có sự khác biệt về di truyền, nhờ
đó có thể nhận biết C. cassiicola qua khả năng gây bệnh cho các dòng vô tính cao su
khác nhau. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở
nước ta là một việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa sự đa dạng di
truyền của C. cassiicola với tính kháng của một số dòng vô tính cao su đang được
trồng ở Việt Nam.

Kết quả đạt được:

Nhận diện được triệu chứng đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora trên cây
cao su.

Thu thập mẫu bệnh trên 32 dòng vô tính cao su khác nhau, tiến hành quy trình
chẩn đoán và phân tích đa hình vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng phương pháp
RFLP – PCR trên 7 dòng vô tính.

Qua phân tích chúng tôi đi đến kết luận:

Quy trình phản ứng PCR đối với nấm C. cassiicola của Silva và cộng sự
(1998) có thể sử dụng để nghiên cứu vùng ITS nấm C. cassiicola ở Việt Nam.

Chẩn đoán bệnh Corynespora bằng cách nhận diện sản phẩm khuếch đại vùng
ITS sử dụng cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả, sản phẩm thu nhận được
không đặc trưng cho nấm C. cassiicola.


v

Không tìm thấy bất cứ sự đa hình nào trong vùng ITS của các mẫu nấm nghiên
cứu khi sử dụng phương pháp RFLP – PCR với các enzyme cắt giới hạn EcoRI, CfoI,

MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI.

Các mẫu nấm được dùng trong phân tích có thể thuộc cùng một chủng nấm
C. cassiicola và đây có thể là chủng duy nhất gây bệnh trên cây cao su ở Việt Nam
hiện nay

vi

MỤC LỤC
PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ .................................................................................................................... i
Tóm tắt ........................................................................................................................ ii
Mục lục ...................................................................................................................... iii
Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... vi
Danh sách các hình ................................................................................................... vii
Danh sách các bảng ................................................................................................... vii
1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu ....................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3
2.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg. ....................................
2.2. Sơ lược về nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ....................................... 4
2.2.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................... 4
2.2.2. Phạm vi phân bố .................................................................................. 4
2.2.3. Phạm vi ký chủ và khả năng gây bệnh ................................................. 5
2.2.4. Đặc tính sinh học của C. cassiicola ..................................................... 5
2.3. Nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su Hevea brasiliensis

Muell. Arg ....................................................................................................... 6
2.3.1. Sự xuất hiện của nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su
Hevea brasiliensis .................................................................................... 6
2.3.2. Tình hình bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su tại một số nước
trồng cao su .............................................................................................. 6
2.3.3. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su ..................... 9
2.4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh do C. cassiicola ............... 9

vii

2.5. Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) .............................................. 10
2.5.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR ........................................................... 10
2.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .......................................... 12
2.6. Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease – RE) ................................. 14
2.6.1. Giới thiệu ............................................................................................ 16
2.6.2. Định danh các enzyme ....................................................................... 15
2.6.3. Trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn ................................. 16
2.6.4. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA .................... 16
2.6.5. Phân tích kết quả của các phản ứng cắt bằng RE ............................... 18
2.6.6. Bản đồ giới hạn ................................................................................... 19
2.7. Vùng ITS và vai trò của nó trong phân tích đa dạng di truyền .................... 19
2.8. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong và ngoài nước ............................ 21
2.8.1. Những nghiên cứu về C. cassiicola ngoài nước ................................. 21
2.8.2. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong nước ................................. 23
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .............................................. 24
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ................................................................... 24
3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 24
3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 24
3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 24
3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 24

3.2.1. Phân lập nấm nguồn nấm C. cassiicola ............................................. 24
3.2.1.1. Hóa chất và dụng cụ .................................................................... 24
3.2.1.2. Phương pháp lấy mẫu .................................................................. 25
3.2.1.3. Phương pháp phân lập ................................................................. 25
3.2.2. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR ........................................... 26
3.2.2.1. Chuẩn bị DNA khuôn mẫu cho phản ứng PCR........................... 26
3.2.2.2. Thực hiện phản ứng PCR ............................................................ 28
3.2.2.3. Đọc kết quả của phản ứng PCR ................................................... 30
3.2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng các enzyme cắt giới hạn (RE) ........... 30

viii

3.2.3.1. Hóa chất và dụng cụ ................................................................... 31
3.2.3.2. Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP .................................. 31
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 32
4.1. Về tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora ................................................ 32
4.2. Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola .................................................... 37
4.3. Kết quả PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola ............................................ 37
4.4. Kết quả phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS ..................................... 40
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 46
5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 46
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 48
7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 52

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PCR: Polymerase Chain Reaction.

RE: Restriction endonuclease.
PDA: Potato Dextrose Agar.
PSA: Potato Saccharose Agar.
EtBr: Ethidium Bromide.
TE: Tris EDTA.
TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA.
RFLP: Restriction Fragments Length Polymorphism.
ITS: Internal Transcribed Spacer.
RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA.
Bp: base pairs
rRNA: ribosomal RNA.
dvt: dòng vô tính.
BVTV: bảo vệ thực vật
VNCCSCN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam

x

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1: Một vài RE và vị trí phân cắt của nó ........................................................ 15
Bảng 2.2: Liệt kê các RE xếp thứ tự theo bản chất vị trí cắt của nó ......................... 17
Bảng 2.3: Trình tự một số primer và trình tự của nó dùng trong nghiên cứu vùng ITS
của nấm ..................................................................................................................... 21
Bảng 3 .1: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR ................................................ 29
Bảng 3.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP ............................................... 31
Bảng 4.1: Các dòng vô tính cao su được lấy mẫu và đặc điểm triệu chứng của bệnh
(đặc trưng/ không đặc trưng)..................................................................................... 33
Bảng 4.2: Một số dòng vô tính cao su phân lập được nấm C. cassiicola ................ 36

xi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1: Một đợt dịch bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su ở Việt Nam .... 8
Hình 2.2: Hình minh họa phản ứng PCR .................................................................. 11
Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS ở nấm .............................................................................. 20
Hình 2.4: Lược đồ các primer trên vùng ITS ............................................................ 20
Hình 3.1: Hình minh họa chu trình nhiệt của phản ứng PCR
dùng trong thí nghiệm ............................................................................................ 29
Hình 4.1: Triệu chứng bệnh đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora ................... 34
Hình 4.2: Triệu chứng biến thiên của bệnh rụng lá Corynespora ............................ 34
Hình 4.3:Triệu chứng của bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum
gloeosporioidies ........................................................................................................ 35
Hình 4.4: Bào tử nấm C. cassiicola dạng đơn dưới kính hiển vi và bào tử nấm
Colletotrichum gloeosporioidies ............................................................................... 35
Hình 4. 5: Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trường PDA ................................ 36
Hình 4.6: Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola từ các nguồn khác nhau ........... 37
Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu nấm C. cassiicola ............... 38
Hình 4.8: Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi giảm lượng primer dùng trong
phản ứng PCR ........................................................................................................... 39
Hình 4.9: Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola và so sánh với
sản phẩm PCR của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae ................. 40
Hình 4.10: Các sản phẩm tạo thành khi phân cắt sản phẩm
PCR bằng enzyme EcoRI .......................................................................................... 41
Hình 4.11: Phân cắt các sản phẩm PCR bằng enzyme MspI .................................... 42
Hình 4.12: Phân cắt sản phẩm bằng enzyme CfoI .................................................... 42
Hình 4.13: Phân cắt sản phẩm bằng enzyme RsaI .................................................... 43
Hình 4.14: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HaeIII ........................................ 43

Hình 4.15: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme Sau3AI ...................................... 44


1

PHẦN I
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Nấm bệnh trên cây trồng, đặc biệt là nấm ký sinh là dịch hại nguy hiểm đối với nền
nông nghiệp của nhiều quốc gia trên thế giới. Trong đó, nấm Corynespora cassiicola
(Berk. and Curt.) Wei có khả năng phân bố và phổ ký chủ rộng đã gây thiệt hại đáng
kể cho nền kinh tế của nhiều nước. Trong phổ ký chủ, Corynespora cassiicola gây hại
đặc biệt nghiêm trọng cho cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.), đây là loại cây
công nghiệp có giá trị kinh tế cao được trồng nhiều ở các nước Đông Nam Á, châu Phi
và Nam Mỹ.
Trên cây cao su, C. cassiicola gây ra bệnh rụng lá – còn được gọi là bệnh rụng lá
Corynespora, bệnh này có thể xảy ra trên cây cao su thuộc mọi lứa tuổi và xảy ra
quanh năm, gây thiệt hại rất lớn về năng suất mủ cao su. Bệnh này đã bùng phát thành
những đợt dịch bệnh và được ghi nhận lần đầu tiên vào những năm 1980 ở Sri Lanka,
Indonesia, Malaysia và Thái Lan trên các dvt mẫn cảm như RRIC 103, RRIM 725,
KRS 21, PPN 2447. Trong khoảng thời gian từ 1980 - 1988, ở Indonesia, khoảng 1200
ha cao su đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng, thiệt hại khoảng 400 ha, ước tính giá trị thiệt
hại lên đến 50 triệu USD (theo CFC/INRO Project Proposal, 1999). Trong những năm
gần đây, khả năng gây hại của nấm C. cassiicola ngày càng lớn và ngày càng có nhiều
dvt cao su bị nhiễm bệnh. Biện pháp phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora bằng hóa
chất khá tốn kém và được nhận định là không kinh tế bằng cách thay thế các dvt mẫn
cảm bằng các dvt có tính kháng (Chee, 1988). Dịch bệnh do nấm C. cassiicola gây ra
thường làm kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản và thời gian phục hồi của những dvt bị
nhiễm bệnh. Trước tình hình đó, người trồng cao su thường được khuyến cáo trồng các

dvt có tính kháng bệnh. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của các dòng C. cassiicola là rất
khác nhau tùy thuộc vào dvt cao su khác nhau và các điều kiện môi trường như nhiệt
độ, độ ẩm, lượng mưa, độ cao và độ màu mỡ của đất. Các nghiên cứu trên thế giới cho
thấy nấm C. cassiicola trên cây cao su có sự phân hóa về di truyền (CFC/INRO Project
Proposal, 1999; Safia và Noor Hisham, 2003). Do vậy, việc xác định sự đa dạng sinh
học, đặc biệt là đa dạng ở mức độ phân tử của C. cassiicola là việc rất cần thiết. Đây


2

chính là tiền đề cho việc xác định các marker phân tử có liên quan đến tính độc của C.
cassiicola và phục vụ cho việc nghiên cứu tính kháng trên các dvt cao su.
Ở Việt Nam, bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su đã được ghi nhận vào tháng
09/1999, gây hại nặng cho các dvt RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Hiện nay, số
lượng dvt cao su bị nhiễm bệnh đã tăng lên nhiều, bệnh đã xuất hiện tại một số công ty
cao su ở miền Đông Nam Bộ (Phan Thành Dũng, 2004) và một số tỉnh phía Bắc như
Hà Tây và Nghệ An (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật, 2000). Những nghiên cứu về bệnh
này ở Việt Nam hiện chưa nhiều và mới chỉ dừng lại ở phân tích, đánh giá tình hình
bệnh cũng như tính kháng của một số dvt cao su đối với nấm C. cassiicola. Việc ứng
dụng các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh và nghiên cứu về nấm C.
cassiicola chưa nhiều trong khi bệnh rụng lá Corynespora ngày càng lan rộng, triệu
chứng bệnh ngày càng biến thiên, càng ngày càng có nhiều dvt cao su bị nhiễm bệnh,
đã trở thành mối lo ngại của nhiều nước trồng cao su.
Xuất phát từ các vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích đa dạng di
truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên
cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phƣơng pháp RFLP – PCR”.
1.2.Mục đích yêu cầu
1.2.1.Mục đích
Thu thập và phân lập nấm C. cassiicola trên lá cao su bị bệnh có biểu hiện các
triệu chứng đặc trưng, không đặc trưng trên các dvt cao su khác nhau, tại một số địa

điểm khác nhau.
Xác định sự khác biệt di truyền giữa các mẫu nấm C. cassiicola phân lập từ các
dvt cao su khác nhau bằng phương pháp RFLP – PCR (Restriction Fragments
Length Polymorphism – Polymerase Chain Reaction).
1.2.2. Yêu cầu
Nhận dạng được các triệu chứng biểu hiện của bệnh rụng lá Corynespora trên
cây cao su.
Nắm vững kỹ thuật nuôi cấy và phân lập nấm C. cassiicola.
Nắm vững kỹ thuật PCR và sử dụng các enzyme cắt giới hạn.



3

PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Sơ lược về cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới, lưu
vực sông Amazone (Nam Mỹ), được H. Wickham du nhập vào châu Á và châu Phi
năm 1876. Hai cây cao su được du nhập vào Việt Nam năm 1877 do Pierre trồng tại
Thảo Cầm Viên (Sài Gòn), nhưng hai cây này sau đó bị chết. Ông Seeligmann gởi về
Sài Gòn 50 cây cao su và chỉ còn sống 5 cây vào tháng 12 năm 1881, tiếp theo đợt 2
vào tháng 6 năm 1883, nhưng tất cả cây cao su nói trên đều không tồn tại và phát triển
được do nhiều nguyên nhân. Đến năm 1897, sau một số lần thất bại tiếp theo của ông
Raul trong việc du nhập và trồng cao su vào nước ta, bác sĩ Yersin đã thành công và
vườn cao su đầu tiên được ông trồng tại Suối Dầu – Nha Trang (Đặng Văn Vinh,
2000).
Đầu thế kỷ 20, các vườn cao su được trồng tại Đông Nam Bộ và đến đầu thập kỷ
50, cây cao su được trồng tại một số vùng Tây Nguyên, miền Trung và một số vùng ở

phía Bắc (Đặng Văn Vinh, 2000). Hiện nay, diện tích cao su của cả nước đạt trên
450.000 ha với sản lượng trên 400.000 tấn /ha (Tổng Công Ty Cao Su Việt Nam,
2004).
Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ và gỗ cho rất nhiều
ngành công nghiệp. Đây cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong các lĩnh vực nông
– lâm – công nghiệp. Trong những năm gần đây, sản lượng mủ không ngừng được
nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật nông nghiệp, quy trình khai thác,…
Tuy nhiên, những thiệt hại do bệnh gây ra cũng gia tăng đáng kể, một phần do việc
chọn lọc chủ yếu dựa theo hướng sản lượng cao, sinh trưởng nhanh đã làm thất thoát
gen kháng bệnh. Mặt khác, do tình hình thời tiết – khí hậu có nhiều thay đổi và diễn
biến phức tạp, cùng với sự phát triển và chuyên canh cây trồng trên diện rộng trong
vùng khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều đã dẫn đến sự phát sinh – phát triển mạnh về cả
chủng loại cũng như mức độ bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến vấn đề canh tác và
hiệu quả kinh tế của nó, thiệt hại sản lượng và gia tăng chi phí sản xuất. Hiện nay, cao
su được phát triển mạnh dưới dạng tiểu điền, nên thiệt hại do bệnh gây ra đã ảnh
hưởng trực tiêp đến đời sống của những người trồng cao su.


4

Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài
có tầm quan trọng về kinh tế. Theo Nguyễn Hải Đường (1997), có 24 loại bệnh gây
hại trên cây cao su tại Việt Nam.

2.2. Sơ lƣợc về nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei
2.2.1. Lịch sử phát hiện
Cooke (1896) ghi nhận Cercospora melonis là tác nhân gây đốm lá dưa hấu và
dưa leo tại Mỹ. Năm 1906, Gusgow ghi nhận loại nấm tương tự trên dưa leo tại
Đức và đặt tên nó là Corynespora maizei. Năm 1980, Lindau khẳng định các tác
nhân nêu trên là cùng loài và đặt tên là Corynespora melonis (Cooke) Lindau. Tại

Trung Quốc nhiều tác giả đã ghi nhận loại nấm này trên cây đậu nành, đậu đũa và
đặt tên là Corynespora vignicola Kawamura. Liu (1948) cho rằng loại nấm gây
bệnh tại Trung Quốc tương tự như loại nấm gây bệnh trên cùng ký chủ tại Mỹ đã
được Olive và cộng sự đặt tên là Helminthosporum vignae Olive Bain và Lefebrve
(Olive et al, 1945; Phan Thành Dũng dẫn nhập, 1995). Sau đó trong báo cáo của
IMI (International Mycological Institute) tại Anh cho biết Helminthosporum
cassiicola (Berk and Curt) là ký chủ của 11 loài cây vùng nhiệt đới, trong đó có cao
su và đu đủ.
Năm 1950, Wei thu thập tất cả các tài liệu liên quan đến nấm này và
phân tích để đi đến kết luận rằng chúng là tác nhân gây bệnh duy nhất thuộc loài
Corynespora cassiicola và đặt tên là Corynespora cassiicola (Berk and Curt) Wei,
tên này được các nhà bệnh cây chấp nhận cho đến nay.
2.2.2. Phạm vi phân bố
C. cassiicola (Berk and Curt) Wei được ghi nhận tại hơn 80 nước trên thế giới
thuộc nhiều vùng khí hậu khác nhau từ vùng ôn đới đới đến nhiệt đới như Trung
Quốc, Nhật, Malaysia, Indonesia, Australia, Austria, Nigeria, Sri Lanka, Cambodia,
Thái Lan, Cameroon, Congo, Cuba, Argentinia…vv (Phan Thành Dũng dẫn
nhập,1995).



5

2.2.3. Phạm vi ký chủ và khả năng gây bệnh
C. cassiicola có khoảng 160 loài ký chủ thuộc các nhóm cây ăn quả, cây công
nghiệp, cây lâm nghiệp, cây ngũ cốc, cây rau màu và nhiều loại cây cảnh khác. Một
số cây ký chủ của C. cassiicola bao gồm cao su (Hevea brasiliensis), đu đủ (Carica
papaya), cà chua (Lycopersicum esculentum)…. Tuy nhiên, C. cassiicola trên cây
cao su là ký sinh chuyên biệt (Phan Thành Dũng dẫn nhập,1995)
C. cassiicola có thể gây hại cho tất cả các bộ phận của cây và gây ra các bệnh:

leaf fire, leaf spot, target spot, frog eye, late blight, ring spot, brown leaf
sprot…(Phan Thành Dũng dẫn nhập, 1995)
2.2.4. Đặc tính sinh học của C. cassiicola
C. cassiicola (Berk and Curt) Wei có khả năng sống ký sinh trên thực vật cũng
như có khả năng sống hoại sinh trên xác bã thực vật (Ellis và Holiday, 1971).
Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu và biến thiên rất nhiều về hình thái,
hình dạng bào tử trên vết bệnh cũng như trong môi trường nhân tạo. Bào tử trên lá
có màu nâu nhạt, dạng hình lưỡi liềm, có chứa nhiều vết ngăn với chiều dài đôi khi
lên đến 700 m.
Ellis và Holiday (1971) mô tả khuẩn lạc của nấm có màu xám đến nâu. Bào tử
dạng đơn hay kết thành chuỗi, biến thiên về kích thước và hình dạng.
Nấm dễ dàng phát triển trên môi trường nhân tạo nhưng rất khó hình thành bào
tử. Sử dụng môi trường PDA cải thiện đáng kể khả năng hình thành bào tử của
C. cassiicola phân lập được từ đậu nành.
C. cassiicola có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 8 – 36
o
C trên môi
trường PDA, thích hợp nhất ở 28
o
C, ngưng phát triển ở nhiệt độ trên 40
o
C.
C. cassiicola trên các ký chủ khác nhau có nhiệt độ phát triển tối ưu khác nhau.
Khuẩn ty của C. cassiicola phát triển tốt trong điều kiện tối. Khuẩn lạc hình
thành thay đổi theo mức độ chiếu sáng, phát triển rộng và mỏng dưới ánh sáng
huỳnh quang, dày và tụ lại trong điều kiện tối.
Đối với C. cassiicola trên cây cao su, khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên môi
trường PDA ở nhiệt độ 28
o
C (Phan Thành Dũng dẫn nhập,1995).

6

2.3. Nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su (Hevea brasiliensis)
2.3.1. Sự xuất hiện của nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su
(Hevea brasiliensis)
Đây là bệnh mới và có tác hại lớn chƣa từng có từ trƣớc tới nay tại các nƣớc trồng
cao su ở Châu Á. Bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại
Sierra Leone (châu Phi) năm 1949. Tiếp theo, bệnh lần lƣợt đƣợc ghi nhận ở Ấn Độ
(1958), Malaysia (1961), Nigeria (1968), Thái Lan, Sri Lanka, Indonesia (1985),
Bangladesh, Brazil năm 1988 và ở Việt Nam năm 1999 (Phan Thành Dũng dẫn nhập,
1995).
Trên cây cao su, nấm C. cassiicola gây hại trên lá, cuống lá và chồi.
2.3.2. Tình hình bệnh do nấm C. cassiicola gây ra trên cây cao su tại các nƣớc
trồng cao su
Sự phát dịch và lây lan của C. cassiicola có liên quan đến các yếu tố môi trường
như độ ẩm, nhiệt độ, lượng mưa, độ cao và độ màu mỡ của đất đai (CFC/INRO
Project Proposal, 1999). Do vậy, tình hình bệnh và diễn biến bệnh ở các quốc gia
khác nhau là khác nhau. Dịch hại do C. cassiicola gây ra được ghi nhận lần đầu tiên
vào năm 1980, chủ yếu tại các nước sản xuất cao su như Indonesia, Malaysia, Sri
Lanka, Thái Lan. Đến nay C. cassiicola đã gây hại ở nhiều nước
.
2.3.2.1. Indonesia
Bệnh bùng nổ lần đầu vào năm 1980 tại trại thực nghiệm Sembawa, Nam
Sumatra. Hiện nay, bệnh gây hại trên tất cả vùng trồng cao su tại Indonesia. Do
cao su tiểu điền chiếm trên 90 % tổng diện tích trồng trong nước nên thiệt hại
do bệnh chưa thống kê đầy đủ. Tuy nhiên, 1.125 ha cao su trong giai đoạn 1980
– 1988 và 400 ha phải nhổ để trồng lại với ước tính thiệt hại khoảng 200 triệu

Rp. Một số dvt kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản 8 – 10 năm và làm giảm sản
lượng 30 – 50 % đối với vườn khai thác (Sinulinga, 1996; Sujanto và Irwan
Suhendry, 2000).
Diễn biến của bệnh trên các dvt theo từng năm được ghi nhận như sau:
- 1980: RRIC 103.
- 1982: PNN 2058, 2444, 2447.
- 1984: GT 1, KRS 21, FX 25, BPM 6, RRIM 725.


7

- 1991: RRIM 600.
- 1995: IAN 873.
- 1999: AV 2037.
2.3.2.2. Malaysia
Ghi nhận tại vườn ương trên dvt RRIC 52 và FX 25. Năm 1985, dịch bệnh
bùng phát gây hại nặng cho RRIC 103, KRS 21 và RRIM 725. Hiện nay bệnh
ghi nhận tại tất cả các vùng trồng cao su trong cả nước, nặng nhất tại Johor Baru
và Trengganu. Các dvt bị nhiễm bệnh bao gồm GT 1, RRIM 600, 701, 702, 703,
712, 725, 901, 2009, 2020, PR 261, IAN 873, PB 217 (Shukhor S.K. and Hidir
S.M., 1996).
2.3.2.3. Sri Lanka
Là nước thiệt hại nặng nề nhất, bệnh lần đầu tiên xuất hiện tại 9 địa phương
trong vườn nhân sau đó gây hại nặng trên toàn quốc. 4.300 ha dvt RRIC 103, là
dvt cao sản được khuyến cáo trồng đại trà (2.400 ha của đại điền và 1.900 ha
của tiểu điền chiếm 3% diện tích trồng cao su cả nước lúc bấy giờ), phải nhổ bỏ
và trồng lại bằng dvt kháng bệnh. Chính phủ phải bồi thường 64 triệu Rp cho
người trồng cao su bị thiệt hại. Các tiến bộ về giống bị khựng lại (thay thế PB
86 bằng các dvt cao sản thuộc RRIC 100’ s series), buộc phải duy trì dvt có sản
lượng thấp nhưng có tính kháng bệnh.

Các dvt mẫn cảm bị bệnh nặng trước đây bao gồm RRIC 103, RRIC 104,
KRS 21, PNN 2444 đã bị loại bỏ từ đầu, một số dvt được đánh giá là kháng
bệnh nay cũng đã bị nhiễm bệnh như là RRIM 600, GT 1, RRIC 110, IAN 873,
PB 260, PB 28/59, PB 235, RRII 105 (Jayashinge,1996 và 2000).
2.3.2.4. Thái Lan
Bệnh ghi nhận tại thí nghiệm trao đổi giống cao su quốc tế 7 năm tuổi ở trạm
Surat Thani. Bệnh gây chết dvt RRIC 103 và rụng lá nặng trên KRS 21. Hiện
nay, bệnh đã xuất hiện tên toàn bộ diện tích cao su tại Thái Lan, nhưng tác hại
không nghiêm trọng (Narisa Chanruang, 2000).
2.3.2.5. Cameroon
Bệnh được ghi nhận trên toàn bộ diện tích trồng cao su trong nước. Các dvt
mẫn cảm bao gồm GT1, RRIM 600, RRIC 110, PB 260. RRIC 110 được trồng
ở quy mô vừa và phải loại bỏ từ 1995 do nhiễm nặng, trong khi PB 260 là dvt
có nhiều triển vọng về sản lượng và kháng bệnh tại Indonesia và Malaysia


8

nhưng bị hại rất nặng tại Cameroon và các nước châu Phi (Gobina, 2000; Phan
Thành Dũng dẫn nhập, 2001).
2.3.2.6. Ấn Độ
Xuất hiện lần đầu tại vườn ương từ 1969 – 1976 và bệnh chỉ xảy ra ở vài
nơi. Cho đến năm 1996 – 1997 dịch bệnh đã bùng phát tại South Canara,
Karnataka làm rụng lá, chết chồi và đôi khi chết cả cây. Bệnh cũng gây rụng lá
và chết chồi tại vùng Trichur và Thodupuzha, miền trung bang Kerala vào năm
1999 – 2000. Các dvt bị nhiễm bệnh bao gồm GT 1, RRIM 600, Tijir 1 và RRII
105, 118. Tại vườn nhân RRII 105, 118, 300,305, PR 107, 255, 261, RRIM 600,
PB 235, 255,260, 311, và GT 1. Dvt RRII 105 mẫn cảm nặng với bệnh gây
nhiều chú ý do trên 80 % cao su tại đây trồng dvt này (Sabu,2000).
2.3.2.7. Việt Nam

Bệnh xuất hiện lần đầu vào tháng 8 năm 1999 tại trại thực nghiệm cao su Lai
Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Dvt LH 88/372, RRIC 103 và RRIC
104 bị hại nặng và phải cưa bỏ và xử lý bằng 0,5 % Benlate C 50 WP. Theo một
số ghi nhận ban đầu, bệnh gây thiệt hại về sinh trưởng và sản lượng do tán lá
không đủ để cây sinh trưởng và duy trì sản lượng. Một số vườn khai thác bị hại
nặng có sản lượng chỉ bằng 1/3 -1/2 so với vườn cây có cùng điều kiện không bị
nhiễm bệnh. Sinh trưởng cũng chậm, tỷ lệ khô miệng cạo và cỏ trong vườn cũng
gia tăng hơn so với vườn cây không bị hại. Ngoài ra, cùng dvt và tuổi cây, bệnh
phân bố khác nhau, trong đó gây hại nặng tại những vùng thấp ẩm ướt hơn so
với vùng cao có điều kiện thông thoáng hơn (Phan Thành Dũng và Nguyễn Thái
Hoan, 1999 và 2000).



9


Hình 2.1: Một đợt dịch bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su ở Việt Nam.
Nguồn: Bộ Môn BVTV/VNCCSVN.
2.3.3. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su
Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu, rất biến thiên về hình thái, hình dạng
bào tử trên vết bệnh cũng như trên môi trường nhân tạo. Bào tử trên lá có màu nâu
nhạt với dạng hình lưỡi liềm chứa nhiều vết ngăn với chiều dài biến thiên, đôi khi
đạt 700 m. Bào tử dạng đơn đôi khi dạng chuỗi dính với nhau ở hai đầu gọi là
hilum, phát tán nhờ gió.
Bào tử phóng thích vào ban ngày và cao điểm từ 8 – 11 giờ sáng. Sau thời gian
mưa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lượng bào tử phóng thích nhiều nhất do nấm
cần ẩm độ cao để hình thành bào tử. Bào tử có khả năng tồn tại trên các vết bệnh
cũng như trong đất với thời gian kéo dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn tại và giữ
nguyên khả năng gây bệnh đến 3 năm (Chee, 1988).

Nấm xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua lớp biểu bì và khí khổng, ngoài ra
còn tiết ra enzyme cellulase giúp phân huỷ màng tế bào. Trong suốt quá trình sinh
trưởng, nấm còn tiết ra độc tố CC toxin (là cassiicoline chứa các amino acid) gây
độc cho cây cao su, cho nên chỉ với một lượng nhỏ ở gân chính của lá cũng đủ gây
rụng lá (Chee, 1988).
Nấm có khả năng tồn tại và phát triển trong phạm vi nhiệt độ lớn, thích hợp nhất
ở 28 2
o
C và ẩm độ bão hoà (Chee, 1987 &1988; Jayashinghe, 2000).


10

Nấm có khả năng gây rụng lá non lẫn lá già, cuống lá và chồi. Hơn nữa, nấm
gây bệnh quanh năm và suốt chu kỳ sống của cao su nên có tác hại rất lớn, nhất là
trên các dvt mẫn cảm.
2.3.4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh
Bệnh xuất hiện trên lá, cuống lá và chồi với các triệu chứng biểu hiện rất khác
nhau.
- Trên lá: Vết bệnh màu đen với hình dạng xương cá dọc theo gân lá, vết bệnh
lan rộng nếu điều kiện thuận lợi, gây chết từng phần, sau đó lá đổi màu vàng cam
và rụng từng lá một. Trên lá non vết bệnh hình tròn màu xám đến nâu với vòng
màu vàng xung quanh, có khi hình thành lỗ. Lá quăn và biến dạng, sau đó rụng toàn
bộ.
- Trên chồi và cuống lá: Các chồi xanh dễ nhiễm bệnh, đôi khi nấm bệnh cũng
gây hại chồi đã hóa nâu. Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có
dạng hình thoi, có mủ rỉ ra sau đó hóa đen, vết bệnh có thể phát triển dài đến 20
cm gây chết chồi, đôi khi chết cả cây. Nếu dùng dao cắt bở lớp vỏ ngoài sẽ xuất
hiện những sọc đen ăn sâu trên gỗ, chạy dọc theo vết bệnh. Trên cuống lá với vết
nứt màu đen có chiều dài 0,5 – 3,0 mm. Nếu cuống lá bị hại, toàn bộ lá chét bị

rụng khi còn xanh mặc dù không có một triệu chứng nào xuất hiện trên phiến lá
(Chee, 1988).

2.4. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)
Kỹ thuật PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1990 được sử dụng rộng
rãi nhất trong số các ứng dụng của sinh học phân tử. Về thực chất đây là phương pháp
tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của các tế bào (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương,
2000)
2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA
dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng
bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme
polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật
này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán phát


11

hiện mầm bệnh trên người, động vật, thực vật, thực phẩm…(Hồ Huỳnh Thuỳ
Dương, 2000)
Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen
(gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy
định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật (Hồ Huỳnh Thuỳ
Dương, 2000)
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch
của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này
được kéo dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên
đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch
đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng

ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên
gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông
tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ
để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000).
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước
như hình 2.2.
Bƣớc 1 (tách sợi đôi DNA, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở điều
kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, ở điều kiện này phân tử
DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn, thường là ở nhiệt độ 94 - 95 C
trong vòng 30 giây đến 1 phút.


12


Hình 2.2: Mô tả phản ứng PCR

Bƣớc 2 (bắt cặp, annealation): trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn
nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch
khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy
thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
Bƣớc 3 (kéo dài, elongation - extension): dưới tác động của DNA polymerase,
các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn.
Mạch mới được tạo thành từ mạch được kéo dài. Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và
thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước như trên được lặp đi lặp lại nhiều
lần, làm số lượng DNA được gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40
chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 10
6

bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm
được nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc


13

gel polyacrylamide, sau đó tiến hành quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm) (Hồ
Huỳnh Thùy Dương, 2000).
2.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả của phản ứng PCR
2.4.2.1. DNA khuôn
DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch, nhưng đôi khi kỹ
thuật này cũng cho phép khuếch đại từ dịch DNA thu nhận trực tiếp từ dịch
chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thường phương pháp này được áp
dụng trong chẩn đoán. Lượng DNA được dùng trong phản ứng PCR là một
lượng cực nhỏ, khoảng 1 g, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho
hiệu quả cao còn có thể giảm lượng DNA khuôn xuống còn 100 ng. Nếu lượng
DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không như mong muốn hay
còn gọi là dương tính giả hay sản phẩm tạp nhiễm. Khuôn DNA có thể được thu
nhận từ các mẫu không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần
2.4.2.2. Enzyme
Thông thường, DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme
chịu nhiệt cao. Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase được
tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus.
Ngày nay, nhiều loại enzyme chịu nhiệt khác nhau đã được phát hiện và đưa
ra thị trường với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn. Như enzyme
Tth polymerase từ Thermus thermophilus, enzyme này hoạt động như một
enzyme phiên mã ngược thông qua sự hình thành cDNA trong điều kiện RNA
làm khuôn và ion Mn
++
, nhưng trong điều kiện DNA khuôn và ion Mg

++
, Tth
polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA.

2.4.2.3. Primer và nhiệt độ lai
Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng
PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:
- Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa
primer xuôi và primer ngược, không có cấu trúc dimer primer do sự bắt cặp bổ
sung giữa các phần khác nhau của một primer.


14

- Nhiệt độ nóng chảy của primer xuôi và primer ngược không cách biệt
quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng, tránh các cặp GC
lặp lại nhiều lần.
- Các primer phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng
với trình tự lặp lại trên gen.
- Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và primer ngược không được quá lớn,
phản ứng PCR tối ưu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb.
2.4.2.4. Các thành phần khác trong phản ứng PCR
- Bốn loại nucleotide thường được sử dụng với nồng độ 200 M/ mỗi loại
nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dương tính
giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng
các lỗi sao chép của polymerase.
- Nồng độ Mg++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại,
nồng độ tối ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường
nồng độ tối ưu này phải được xác định riêng cho từng phản ứng.
2.4.2.5. Số lượng chu kỳ phản ứng

Số lượng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thường không vượt quá 40
chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số
lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu
quả khuếch đại giảm vì những nguyên nhân như sự phân hủy và cạn kiệt các
thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng
khuếch đại, các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với primer mà chúng
tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ còn tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu.