Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR điện di phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPNDEMS ở tôm

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM
TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐIỆN DI PHÁT
HIỆN TÁC NHÂN GÂY HỘI CHỨNG AHPND/EMS Ở TƠM

CHỦ NHIỆM NDNC
(Ký tên)

PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương

ThS. Đồn Thị Quỳnh Hương
CƠ QUAN QUẢN LÝ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận)

CƠ QUAN CHỦ TRÌ
(Ký tên/đóng dấu xác nhận)


2


TĨM TẮT ĐỀ TÀI
Hội chứng tơm chết sớm - EMS (Early Mortality Syndrome) hay là bệnh hoại tử
gan tụy cấp – AHPND (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) mới xuất hiện trên
tôm nhưng đã nhanh chóng lan rộng ra và ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của ngành
thủy sản của nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Để góp phần giảm thiểu tác hại của
dịch bệnh, nghiên cứu này đã được tiến hành nhằm xây dựng phương pháp PCR điện di

phát hiện tác nhân gây bệnh AHPND trên tôm với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Khi áp
dụng trên mẫu thực tế, các phương pháp PCR định tính này cho thấy có sự tương đồng rất
cao giữa phương pháp PCR với các phương pháp phát hiện AHPND khác hiện có.
Từ khóa: Bệnh hoại tử gan tụy cấp, AHPND/EMS, PCR điện di,

ABSTRACT
Early Mortality Syndrome – EMS or Acute Hepatopancreatic Necrosis DiseaseAHPND has appeared on shrimp in recent years, which spreads quickly and causes
serious effects on the development of aquaculture industry in many countries, including
Vietnam. To reduce the effects of this disease, two sensitive and specific PCR methods
namely electrophoresis PCR were developed to detect pathogens causing AHPND on
shrimp. When being applied in experimental samples, it was shown that PCR method
produced highly similar results to other available AHPND detection methods.
Key word: Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND/EMS, electrophoresis
PCR

i


MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa
Tóm tắt đề tài

i

Mục lục

ii

Danh sách các chữ viết tắt

iv

Danh sách bảng, đồ thị

v

Danh mục hình

vii

THƠNG TIN ĐỀ TÀI

ix

MỞ ĐẦU

x

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ni tơm tại Việt Nam

1

1.2. Hội chứng tơm chết sớm - hoại tử gan tụy cấp (EMS/AHPND)

2

1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu

5

Chương 2 – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung 1: Xây dựng qui trình PCR điện di phát hiện tác nhân gây
hộichứng AHPND/EMS ở tôm

7

2.2. Nội dung 2: Xác định các thông số kỹ thuật của qui trình PCR điện di
phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm

12

2.3. Nội dung 3: Bước đầu đánh giá hiệu quả sử dụng của phương pháp
PCR điện di phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS trên mẫu tôm
bệnh

13

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nội dung 1: Xây dựng quy trình PCR điện di phát hiện tác nhân gây
16

hội chứng EMS/AHPND ở tôm
3.1.1. Kiểm tra các cặp mồi phát hiện EMS theo cơng trình của Tim Flegel

16

3.1.2. Thiết kế chứng nội IC – Internal Control

22

3.1.3. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR

23

3.2 Nội dung 2: Xác định các thơng số kỹ thuật của qui trình PCR điện di
phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm
ii

25


3.3 Nội dung 3: Bước đầu đánh giá hiệu quả sử dụng của phương pháp
PCR điện di phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS trên mẫu tôm
bệnh

33

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
38
4.1 Kết luận
4.2 Kiến nghị

38

TÀI LIỆU THAM KHẢO

39

PHỤ LỤC

iii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VIẾT TẮT
EMS
AHPND

OIE

THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT
Early Mortality Syndrome - Hội chứng tôm chết sớm
Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - Chứng hoại tử gan
- tụy cấp

World Organisation for Animal Health - Tổ chức chăm sóc
sức khỏe thú y quốc tế

IC

Internal Control - Chứng nội

LOD

Limit of Detection - Giới hạn phát hiện

FDA

Food and Drug Administration

iv


DANH SÁCH BẢNG, ĐỒ THỊ
Số

Tên bảng

Trang

1.1

Tổng hợp diện tích ni của cả nước trong 10 tháng đầu năm 2014.

1

1.2

Các tỉnh trọng điểm về nuôi tôm tại Đồng bằng Sông Cửu Long năm
2014
Trình tự các cặp mồi phát hiện EMS theo cơng trình của Tim Flegel

2

Trình tự các Amplicon chứng dương

7
8

2.3

Thành phần và nồng đơ ̣ hóa chất phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ lai

9

2.4

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ lai

10

2.5

Thành phần và nồng đơ ̣ hóa chất phản ứng PCR tối ưu hóa nồng độ
Mg2+

10

2.6

Chu trình nhiệt củaphản ứng PCR tối ưu hóa nồng độ Mg2+

11

2.7

Thành phần và nồng đơ ̣ hóa chất phản ứng PCR so sánh độ nhạy của

11

2.1
2.2

phản ứng AP3 có IC và khơng có IC
2.8

Thành phần và nồng đơ ̣ hóa chất phản ứng PCR so sánh độ đặc hiệu

12

của phản ứng AP3 có cặp mồi chứng nội IC
2.9

Các mẫu dùng trong kiểm tra độ đặc hiệu

13

3.1

Thông số trên lý thuyết của 3 cặp mồi AP1R – AP1F, AP2R – AP2F,
AP3R – AP3F

16

3.2

Tổng hợp kết quả kiểm tra hoạt động thực tế của 3 cặp mồi AP1, AP2,
AP3

20

3.3

Kết quả đánh giá độ nhạy phân tích – LOD50 của qui trình PCR điện di

25

phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm
3.4

Kết quả đánh giá độ đặc hiệu phân tích của qui trình PCR điện di phát
hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm

28

3.5

Kết quả đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát hiện tác

29

v


nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 1).

3.6

Kết quả đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát hiện tác

30

nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 2).
3.7

Kết quả đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát hiện tác

31

nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 3).
3.8

Kết quả đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát hiện tác

32

nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 4)
3.9

Kết quả so sánh phương pháp phát hiện AHPND/EMS bằng PCR sử
dụng cặp mồi AP3 với Kit IQ 2000 và phương pháp soi gan

vi

34

DANH SÁCH HÌNH
Số

Tên hình ảnh

Trang

1.1

Bản đồ thể hiện các tỉnh trọng điểm về nuôi tôm tại Việt Nam

2

1.2

Bản đồ dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm năm 2012, 2013 và 9
tháng đầu năm 2014 tại Việt Nam

3

1.3

Cấu trúc mơ gan tụy của tơm khi phân tích bằng kỹ thuật mô bệnh
học

4

1.4

Dấu hiệu tôm thẻ chân trắng nhiễm bệnh Hoại tử gan tụy

5

3.1

Kết quả BLAST cặp mồi AP1 trên NCBI

17

3.2

Kết quả BLAST cặp mồi AP2 trên NCBI

17

3.3

Kết quả BLAST cặp mồi AP3 trên NCBI

18

3.4

Kết quả kiểm tra hoạt động thực tế của cặp mồi AP1

19

3.5

Kết quả kiểm tra hoạt động thực tế của cặp mồi AP2

19

3.6

Kết quả kiểm tra hoạt động thực tế của cặp mồi AP3

20

3.7

Kết quả sắp gióng cột trình tự của sản phẩm PCR với trình tự chuẩn

22

3.8

Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của cặp mồi AP3

23

3.9

Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ của cặp mồi AP3

24

3.10

Kết quả so sánh phản ứng có IC và khơng có IC của cặp mồi AP3

24

3.11

Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR có cặp mồi chứng
nội IC

25

3.12

Kết quả điện di đánh giá độ đặc hiệu phân tích của qui trình PCR điện
di phát hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm

29

3.13

Kết quả điện di đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát
hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 1).

30

3.14

Kết quả điện di đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát

31

vii


hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 2).
3.15

Kết quả điện di đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát
hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 3).

32

3.16

Kết quả điện di đánh giá độ lặp lại của qui trình PCR điện di phát
hiện tác nhân gây hội chứng AHPND/EMS ở tôm (lần 4).

33

3.17

Hình điện di kết quả khảo sát các mẫu tơm thực địa bằng phương
pháp PCR với cặp mồi AP3 đã tối ưu

36

viii


THÔNG TIN ĐỀ TÀI

1. Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR điện di phát hiện tác nhân gây
hội chứng AHPND/EMS ở tôm
2. Chủ nhiệm đề tài/dự án: PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương, ThS. Đoàn Thị Quỳnh
Hương
3. Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Nông nghiệp Công nghệ Cao
TP. HCM
4. Thời gian thực hiện: 12 tháng,từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2015.
5. Kinh phí được duyệt: 108.933.000 đồng
6. Mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng phương pháp PCR điện di phát hiện tác nhân gây hội
chứng AHPND/EMS ở tôm
7. Sản phẩm của đề tài /dự án:
- Bài báo khoa học
- Quy trình cơng nghệ đáp ứng được nhu cầu phát hiện chính xác và sớm tác nhân
gây AHPND/EMS ở tôm.

ix


MỞ ĐẦU
Ngành thủy sản đã và đang chiếm vị trí đặc biệt quan trọng trong chiến lược phát
triển kinh tế-xã hô ̣i của Việt Nam. Tại Quyết định số 332/QĐ-TTg ngày 03/03/2011 của
Thủ tướng Chính phủ phê duyệt Đề án phát triển nuôi trồng thủy sản đến năm 2020 đã đề
ra mục tiêu “phát triển nhanh nuôi trồng thủy sản theo hướng cơng nghiệp hóa, hiện đại
hóa, có hiệu quả, sức cạnh tranh cao và phát triển bền vững; trở thành ngành sản xuất chủ
lực cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất khẩu và tiêu dùng trong nước, đồng thời tạo
nhiều việc làm, tăng thu nhập cho nông, ngư dân, đảm bảo an sinh xã hội, góp phần xóa
đói giảm nghèo và bảo vệ an ninh quốc phòng vùng biển, đảo của Tổ quốc”. Mục tiêu cụ
thể tại Quyết định 332 gồm: Đến năm 2015 sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 3,60 triệu
tấn, trên diện tích 1,10 triệu ha; giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 3,5 - 4,0 tỷ USD, giải
quyết việc làm cho khoảng 3,0 triệu lao động; đến năm 2020 sản lượng nuôi trồng thủy

sản đạt 4,5 triệu tấn, trên diện tích 1,2 triệu ha; giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 5,0 - 5,5 tỷ
USD, giải quyết việc làm cho khoảng 3,5 triệu người.
Tuy nhiên, ngành ni tơm và xuất khẩu tơm có nguy cơ bị đe dọa nghiêm trọng
bởi các loại dịch bệnh và tình hình ơ nhiễm mơi trường vùng ni. Cụ thể, một số bệnh
nguy hiểm trên tôm bao gồm: bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm (AHPND), bệnh đốm
trắng (WSD), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (IHHND) đã và đang
gây ra thiệt hại trầm trọng cho người sản xuất, nuôi tôm. Theo báo cáo của các địa
phương, tổng diện tích ni tơm bị các bệnh nêu trên có chiều hướng gia tăng giữa qua
các, cụ thể: năm 2012 có 36.738 ha; năm 2013 19.014 ha; trong năm 2014 có hơn 28.126
ha có diện tích bị bệnh; diện tích bị thiệt hại do ơ nhiễm môi trường cũng tăng qua các
năm. Hiện nay, công tác phòng chống dịch bệnh thủy sản đã và đang được thực hiện theo
những quy định tại Pháp lệnh Thú y năm 2004, Nghị định số 33/2005/NĐ-CP ngày
15/03/2005 của Chính phủ, Thông tư số 17/2014/TT-BNNPTNT ngày 20/6/2014 của Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT)...
Hiện nay, các phương pháp chẩn đốn bệnh AHPND/EMS dựa vào hình thái và giải
phẩu bệnh chỉ có thể giúp xác nhận tình trạng gan phát triển bất thường ở tơm. Bên cạnh
đó, phương pháp phân lập chủng V. parahaemolyticus từ dịch nuôi tôm cũng chỉ xác
nhận sự xuất hiện của chủng vi khuẩn này trong ao ni mà khơng phân biệt được đó là
x


chủng V. parahaemolyticus có mang AHPND hay khơng. Do đó, các phương pháp này
đều chưa thể giúp xác nhận được tác nhân gây AHPND/EMS ở tơm ni một cách chính
xác. Trong khi đó, cơng cụ hữu hiệu giúp chẩn đốn sớm và chính xác tác nhân gây
AHPND/EMS ở tơm bằng kỹ thuật PCR với độ đặc hiệu và độ nhạy lâm sàng có thể áp
dụng và triển khai sử dụng trong điều kiện Việt Nam, góp phần vào nhiệm vụ kiểm soát
bệnh dịch và hạn chế các thiệt hại mà căn bệnh này gây ra cho ngành nuôi trồng thủy sản
và nền kinh tế quốc gia.

xi

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tình hình ni tơm tại Việt Nam
Theo Tổng cục Thủy sản, đến thời điểm 31/10/2014, cả nước đã thả ni 675.830 ha,
trong đó diện tích nuôi tôm sú là 582.514 ha, tôm chân trắng là 93.316. Sản lượng thu hoạch
568.668 tấn, trong đó sản lượng tôm sú đạt 240.937 tấn, tôm chân trắng 327.731 tấn. Năm
2013, theo báo cáo của Tổ ng cu ̣c Thủy sản, cả nước có khoảng 29 tỉnh/thành ni tơm nước
lợ, với tổng diện tích thả ni 652.612 ha, sản lượng đạt 475.854 tấn. Diê ̣n tić h nuôi chủ yế u
tâ ̣p trung ở khu vực đồ ng bằ ng Nam bô ̣ (chiế m 93% so với tổ ng diê ̣n tích cả nước) và đóng
góp 84,4 % tổ ng sản lươ ̣ng cả nước. Về cơ cấ u tỷ lê ̣ nuôi tôm, đã có sự dich
̣ chuyể n lớn về
diê ̣n tích nuôi tôm sú sang nuôi tôm chân trắ ng. Về phương thức nuôi tôm nước lơ ̣ đã có xu
thế tăng dầ n diê ̣n tić h nuôi bán thâm canh và bán thâm canh giảm dầ n diê ̣n tić h nuôi quảng
canh.
Bảng 1.1. Tổng hợp diện tích ni của cả nước trong 10 tháng đầu năm 2014.
(Số liệu do Tổng cục Thủy sản báo cáo tại Hội nghị tổng kết nuôi tôm nước lợ năm 2014 và xây dựng
kế hoạch năm 2015 được tổ chức tại tỉnh Bến Tre vào ngày 04/11/2014)

Đơn
vị
tính

Kế
hoạch

Thực hiện
10 tháng
2014

Ước thực
hiện năm
2014

So sánh
KH
2014
(%)

So sánh cùng
kỳ 2013
(Tỷ lệ %
tăng, giảm)

tấn

550.000

568.668

660.000

120,0

105,1

1

Sản lượng ni

Tơm nước lợ
Tơm sú

//

250.000

240.937

260.000

104,0

89,9

2

Tơm chân trắng

//

300.000

327.731

400.000

133,3

120,1

II

ha

670.000

675.830

685.000

102,2

104,4

1

Diện tích ni
Tơm nước lợ
Tôm sú

//

600.000

582.514

590.000

98,9

100,0

2

Tôm chân trắng

//

70.000

93.316

95.000

135,7

146,4

TT

I

Chỉ tiêu

1


Hình 1.1. Bản đồ thể hiện các tỉnh trọng điểm về nuôi tôm tại Việt Nam.
Bảng 1.2. Các tỉnh trọng điểm về nuôi tôm tại Đồng bằng Sông Cửu Long năm 2014

Diện tích ni Tơm
nước lợ (ha)
Sản lượng ni tơm
nước lợ (tấn)

Cà Mau

Bạc Liêu

Sóc Trăng

Bến Tre

Kiên Giang

267.000

124.471

52.487

52.000

90.389

116.000

95.700

67.312

35.953

51.430

1.2. Hội chứng tơm chết sớm - hoại tử gan tụy cấp (EMS/AHPND)
Tôm là một đối tượng dễ nuôi trồng nhưng mang lại giá trị kinh tế cao cho nông dân và
các nhà sản xuất. Tuy nhiên, tôm cũng là đối tượng rất dễ nhiễm bệnh và là nguyên nhân lây
lan nguồn bệnh giữa các đầm tôm, đặc biệt là con tôm giống, một trong hai nguồn (môi trường
và con giống) lây nhiễm bệnh chủ yếu cần phải được kiểm sốt. Hội chứng tơm chết sớm
(Early Mortality Syndrome - EMS) cũng còn gọi là chứng hoại tử gan - tụy cấp (Acute
Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHPND) là bệnh thiệt hại nghiêm trọng cho tôm nuôi
2


tại Việt Nam (cả tôm thẻ chân trắng lẩn tôm sú) dù là nuôi thâm canh hoặc bán thâm canh.
Bệnh được ghi nhận lần đầu tiên ở Trung Quốc năm 2009. Trong năm 2010, bệnh đã được
phát hiện trong khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long của Việt Nam. Trong năm 2011, phát hiện
bệnh này tại Malaysia. Ở miền đông Thái Lan bùng phát bệnh này vào năm 2012 [6]. Năm
2010, Phòng nghiên cứu Bệnh học Thuỷ sản, Trường Đại học Arizona (Phòng nghiên cứu của
GS. Donald Lightner - UAZ-AP) nghiên cứu và chỉ rõ nguyên nhân gây bệnh.
Bệnh AHPND đã gây tổn thất nghiêm trọng đến ngành thủy sản do có tỉ lệ tơm bệnh
chết có thể lên đến 100% tổng lượng tôm nuôi chỉ sau vài ngày các triệu chứng bệnh được ghi
nhận [8], trực tiếp làm giảm sản lượng tơm ở các quốc gia có dịch, và gián tiếp gây ảnh hưởng
xấu đến thị trường xuất nhập khẩu tơm trên khắp thế giới, trong đó có Việt Nam. Ở Thái Lan,
theo Hiệp hội Thực phẩm đông lạnh của Thái cho biết AHPND làm giảm sản lượng hàng năm
của họ xuống một nửa trong năm 2013, nghĩa là giảm đi 300.000 tấn. Bên cạnh đó, tập đồn
CP báo cáo lợi nhuận quý 1 giảm đi 70% so với cùng kì năm trước do thiệt hại của bệnh
AHPND gây ra, tương đương với mức giảm 109,9 triệu đô la Mỹ. Ở Việt Nam, dịch bệnh hoại
tử gan tụy cấp tính diễn ra vào hầu hết các tháng trong năm, nhưng tập trung vào giai đoạn từ

tháng 4 đến tháng 8, do đây là khoảng thời gian ni tơm chính vụ. Dịch bệnh diễn ra ở hầu
hết các vùng trọng điểm ni tơm, trong đó, các tỉnh ni tơm chủ yếu ở ĐBSCL bị thiệt hại
nặng nề nhất.

Năm 2012

Năm 2013

9 tháng đầu năm 2014

Hình 1.2. Bản đồ dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm năm 2012, 2013 và 9 tháng đầu năm
2014 tại Việt Nam
3


EMS thường xuất hiện trong vòng 45 ngày sau khi thả tơm giống. Tơm nhiễm bệnh có
biểu hiện hơn mê (lờ đờ, bơi tấp bờ), bỏ ăn, tỷ lệ chết lên đến 100%, chết tồn bộ ao ni. Giai
đoạn cấp tính được thể hiện bằng sự thay đổi bất thường của các tế bào biểu mô ống lượn gan
tuỵ, với sự bong tróc cấp tính các tế bào cấu thành ống lượn. các tết bào B (tế bào tiết men tiêu
hoá), tế bào R (tế bào dự trữ), và tế bào F (tế bào chuyển tiếp) có sự sụt giảm đáng kể về số
lượng; tế bào E (tế bào phôi) có sự hư hại về chức năng, thể hiện qua mức độ phân bào bị suy
giảm rõ rệt và nhân tế bào có thể bị trường phồng (karyomegaly).
Hiện nay có 2 nhóm phương pháp giúp chẩn đốn bệnh AHPND gồm phương pháp
chẩn đốn bệnh dựa vào hình thái và giải phẫu tế bào gan cùng với phương pháp Polymerase
Chain Reaction (PCR). Quan sát hình thái có thể nhận biết các dấu hiệu bệnh AHPND/EMS
trên tôm bằng cách kiểm tra màu sắc, kích thước gan tụy tơm ngay tại ao ni. Phân tích mơ
học của các mẫu bệnh phẩm tơm bị nhiễm bệnh EMS cũng cho thấy cấu trúc bất thường của
các tế bào mô gan, tụy và sự xuất hiện các ổ viêm tụ khu trú trong gan tụy. Tôm bị nhiễm bệnh
có gan tụy sẫm màu, kích thước to lên, sau đó chuyển sang tái xanh và co lại. Một số gan thì
gan tụy trong nhìn thấy cả mơ, tương tự như màu gelatin có dịch [8, 9]. Tỷ lệ chết liên tục xảy

ra giai đoạn này, gan tụy bị hủy hoại mất hình dạng. Tuy nhiên, một nhược điểm lớn của
phương pháp tế bào học là chỉ có thể xác nhận được về hình thái tế bào học của gan tơm, chứ
khơng thể xác nhận chính xác tác nhân gây nhiễm AHPDN/EMS là có hay khơng.

mơ gan tụy tơm khỏe

mơ gan tụy bị phá hủy bởi AHPND/EMS

Hình 1.3. Cấu trúc mơ gan tụy của tơm khi phân tích bằng kỹ thuật mô bệnh học [8]

4


Hình 1.4. Dấu hiệu tơm thẻ chân trắng nhiễm bệnh Hoại tử gan tụy [8]
(A, B) tôm bị nhiễm bệnh, gan tụy (HP) teo, màu nhợt nhạt, dạ dày (ST) và ruột (MG)
khơng có thức ăn; (C, D) tơm khỏe, HP có kích thước bình thường với màu da cam hơi tối,
dạ dày và ruột đầy thức ăn.
1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu
Hiện nay, một vài quốc gia như Cộng Hịa Dominica, Ecuador, Mexico, Nicaragua,
Philippines, Mỹ… đã hỗn hoặc cấm nhập khẩu tôm sống và/hoặc tất cả các sản phẩm từ tơm
từ những nước có AHPND. Chính vì AHPND có thể gây tác động xấu đến sự phát triển của
ngành ni tơm nói riêng và sự phát triển nền kinh tế của nhiều quốc gia nói chung, nên kể từ
năm 2011, nhiều cơ quan và viện nghiên cứu đã nỗ lực trong việc tìm ngun nhân và giải
pháp góp phần giúp kiểm soát tốt bệnh dịch và hạn chế các thiệt hại mà căn bệnh này gây ra
cho ngành nuôi trồng thủy sản và nền kinh tế quốc gia [1].
Trong năm 2012 và 2013, các nhóm nghiên cứu của D.Lightner đã tìm ra ngun nhân
gây bệnh AHPND chính là một loại vi khuẩn được tìm thấy trong dạ dày tơm bệnh chính là
chủng Vibrio parahaemolyticus. Tuy nhiên, chủng V.parahaemolyticus lại là nhóm vi khuẩn
sống khá phổ biến trong đường ruột của nhiều lồi sinh vật chủ trong mơi trường nước lợ/mặn
và cả trên tơm; do đó, tơm bệnh hay khơng bệnh, đều có thể mang vi khuẩn này. Cộng đồng

khoa học thế giới đã phân biệt có đến hàng trăm dịng Vibrio parahaemolyticus khác nhau
thuộc lồi này, tuy nhiên chỉ có một thiểu số các dịng có mang độc lực để có thể gây bệnh
(trên người) và dịng vi khuẩn gây bệnh EMS trên tôm [8]. Điều này tương tự như việc vi
khuẩn Escherichia coli là hết sức phổ biến trong đường ruột của người nhưng chỉ có thiểu số
các dịng của lồi vi khuẩn này gây được bệnh, ví dụ như Escherichia coli O157:H7. Có rất
nhiều dịng vi khuẩn cùng loài sống hạnh phúc trong đường ruột của vật chủ nhưng không gây
bệnh được gọi là “commensal bacteria”. Việc phát hiện vi khuẩn V. parahaemolyticus một
5


cách chung chung khơng được coi là cách chẩn đốn phát hiện bệnh EMS. Do đó, vấn đề cốt
lõi trong chuẩn đoán bệnh Hoại tử gan tụy hiện nay là tìm được dịng vi khuẩn mang độc lực.
Chủng V.parahaemolyticus gây ra bệnh AHPND cho tơm, là chủng V.parahaemolyticus đặc
biệt có khả năng tiết ra các protein độc chất làm rối loạn chức năng gan tụy, các protein độc tố
này được mã hóa bởi các trình tự DNA, được dự đốn là có thể đang nằm trên các plasmid của
vi khuẩn V.parahaemolyticus gây ra [9]. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có hình dấu phẩy
hơi cong và ngắn, Gram - và có lơng nên rất di động. Chúng lên men D-mannitol, maltose,
L.arabinose, không lên men saccharose, oxydase dương tính và kỵ khí tùy tiện.
Từ 2013, D.V. Lightner và cộng sự đã sử dụng phương pháp PCR điện di như là một
công cụ hữu hiệu để phát hiện tác nhân gây AHPDN/EMS. Theo các cơng bố của nhóm,
phương pháp PCR này được xây dựng dựa vào trình tự DNA nằm ngồi nhân (extrachromosomal DNA) chỉ xuất hiện đặc hiệu ở vài chủng khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây
bệnh EMS trên tôm [6, 8, 4, 5]. Tuy nhiên sau đó, phương pháp PCR này hiện đã được thương
mại hóa bởi cơng ty Cơng nghệ sinh học GeneReach, Đài Loan, (bộ kit IQ 2000).
Cùng lúc đó đó ở Thái Lan, giáo sư T.W. Flegel và cộng sự cũng đã thiết kế 2 cặp mồi
lần lượt là AP1, AP2 sử dụng cho phương pháp PCR điện di khác để phát hiện các chủng vi
khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND với độ nhạy của cả 2 phương pháp chẩn đoán
của cả 2 phương pháp là 100%, tuy nhiên độ đặc hiệu chẩn đoán của phương pháp PCR với
cặp mồi AP1 và AP2 là chưa cao (93% và 97,7%)[6]. Đến tháng 6 năm 2014, giáo sư T.W.
Flegel tiếp tục công bố rộng rải một phương pháp PCR điện di mới với cặp mồi AP3 cải tiến,
cho thấy cả độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đoán của phương pháp cải tiến này đều đạt 100% [2],

[3].
Sau này, phó GS H. Kondo và I. Hirono ở Đại học KHKT Hải dương Tokyo
(TUMSAT) cũng tuyên bố phương pháp PCR phát hiện tác nhân gây AHPND/EMS của họ
phát triển có độ chính xác là 100%, tuy nhiên họ khơng cơng bố các trình tự mồi sử dụng trong
phương pháp PCR này [5].
Nhiều nghiên cứu quốc tế gần đây cho thấy phương pháp PCR đang trở thành một công
cụ hiệu quả hơn phương pháp chẩn đốn bệnh dựa vào hình thái và giải phẫu tế bào gan, vì
phương pháp PCR giúp phát hiện nhanh, nhạy và chính xác tác nhân gây bệnh AHPND/EMS
ở tơm trên thế giới, và đặc biệt là các phương pháp PCR này hồn tồn có thể áp dụng được
trong điều kiện của Việt Nam hiện nay.
6


CHƯƠNG 2
NỘI DUNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung 1: Xây dựng qui trình PCR điện di phát hiện tác nhân gây hộichứng
AHPND/EMS ở tôm.
- Kiểm tra các các cặp mồi phát hiện EMS theo cơng trình của Tim Flegel
 Kiểm tra độ đặc hiệu in silico: trình tự các bộ mồi AP1, AP2 và AP3 sau được
kiểm tra thông số vật lý, khả năng tự bắt cặp, bắt cặp 2 mồi bằng công cụ Oligo analyzer của
hãng IDT-Mỹ và kiểm tra độ đặc hiệu của mồi trên ngân hàng dữ liệu GenBank bằng cơng cụ
BLAST.
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi phát hiện EMS theo cơng trình của Tim Flegel
Kích thước mồi
(số nucleotide)

Tên mồi – trình tự của mồi
AP1F
5’ -CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATG- 3’
AP1R

5’ -GCAAACTATCGCGCAGAACACC- 3’
AP2F
5’ -TCACCCGAATGCTCGCTTGTGG- 3’
AP2R
5’ -CGTCGCTACTGTCTAGCTGAAG- 3’
AP3F
5’ -ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC- 3’
AP3R
5’ -GTGGTAATAGATTGTACAGAA- 3’

22
22
22
22
26
21

 Kiểm tra độ hoạt động thực tế của mồi: Sau khi mồi được tổng hợp, phản ứng
PCR điện di được thực hiện với các thành phần phản ứng cơ bản với các mẫu tôm bệnh được
thu nhận từ các tỉnh Sóc Trăng, Cà Mau để xác nhận khả năng hoạt động thực tế của mồi.
 Kiểm tra độ đặc hiệu của sản phẩm PCR: Các sản phẩm PCR của các cặp mồi
được giải trình tự, xác nhận trình tự nucleotide có phù hợp với các trình tự công bố hay không.
- Thiết kế chứng nội (IC-internal control) cho hỗn hợp PCR điện di:
Bổ sung vào hỗn hợp PCR 1 cặp mồi mã hóa cho vùng 18S RNA 143F 5’và

TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG-3’
7

145R

5’-


TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-3’, có kích thước sản phẩm PCR 848bp đặc hiệu cho
bộ gen của nhóm sinh vật giáp xác do Tổ chức chăm sóc sức khỏe thú y quốc tế OIE (World
Organisation for Animal Health - OIE) công bố. Cặp mồi này có vai trị là cặp mồi chứng nội
để nhân bản trình tự chứng nội, giúp kiểm sốt q trình tách chiết DNA và quá trình PCR về
sau.
- Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR như sau:


Nhiệt độ lai: khảo sát từ 50-55oC



Nồng độ Mg2+ : từ 2 – 5.0mM



Nồng độ mồi IC từ 100 – 200nM
Bảng 2.2. Trình tự các Amplicon chứng dương

Amplicon
chứng
dương cho
cặp mồi
AHPND1
(B1)

Amplicon

chứng
dương cho
cặp mồi
AHDNP2
(B2)

CCTTGGGTGTGCTTAGAGGATGATGAAGATGACTATGTCCTCGAA
CGATTTGAGTTGCGAGTTCACGGTCGTAAACCACTCGTTCTCAAT
CGCCCCTCGTTTTCCAAACTCATGTTCGTCACCCAGCAGTATCTCC
ACACGTCACAGGAAACCACCAAGCGAATATTAAGAGCCACCATC
TTAGAAAGTGCTGAGCCCTTCACGGCGGATGAACACTGCCGATTG
GTCTCTGCACTCGAAAGGCACTTAGCTGACGTCCATGAATGAAAA
AACCCGATAACATCATCATGTTATCGGGCTATTTGGTGTCATCAG
TGTGTTTGTGTTTGGCGGTTTTACAACCATTCTTCAGCACATTCAT
GTGTTATCGCATCAGTGGTTTCAGTGATCGTGGCAGACTGAAACC
CGCCGACGATGGGATTTAACGCTAAATTCGCTACTCTCTTCGCCT
CATCAAAGCAAGGAAGCACTGCAACGTACTCCTTACCCCAACTCA
CTTCAAGCGTAACTCGGCAAGCACCTTTATACCCAACCGAAACAT
GAACTTCTGCATCAAGCCGGTGTTCATCGCCGTTCAATAATGAAT
TCATCAGCGCGCCCTCGTTAAAGAGCATTAGAAGTGATGCACTGG
AATGTTAAACCAACACACCAATGCATCGTAGAACGCCGAAATAA
CAGGGTGTTCTGCGCGATAGTTTGC
TCACCCGAATGCTCGCTTGTGGCTCAGCGAGCATGGGGTCACGCC
TCTATAAGTGCAAAAACTCTGGCTGTACCTACTACACCAAATACC
TCAATCAAAGCTGTAAGTCTCGAGCTTGCTGCAGTGGTGGCGTCA
AATCCACCGAAAGGTGGATGGTTGCTTAATCGATTATTCAAATGC
GCGTCCAACATTTTAACGACTTGGGCGAAACGGCAAGACTTAGTG
TACCCAGAGCCAAAACCTCATCGAAAATCAGGATTGTTGCTTCCT
ACGTTGAAAGACCGGCGTTATCAGCTTCATATCCCCCACCTCTGT
CACGCCTGCGTGGATCGCTGAATGACTGTAAAAAATGACAATAA

8


AGATTGATCAATCTCAGAAACGTTTTGGGACAAAAATGGTTCAAC
AATATCTGCTGGGTATGTGGCTATCCAAACAATATTCTTGATAAA
GGCTGGGAAATGGAAAATTCACTCTCCAAATACACCAAATTAGTA
CAGAAATTTATACAATTACAGTAACATGAATCCGTCATACTGGCA
GCAAGGAGTTCATGTGAGCCAACAAGAAGAAAAATACCCGGCCA
GCGCCATATCCTCCTGGAGCGGCTTTGTTTACCAAGGAAAAGTCG
CACTATATCACTCACTTAAGCTTATTCTCGATGATGATTTGGACTT
CGAACTTCAGCTAGACAGTAGCGACG
Amplicon
chứng
dương cho
cặp mồi
AHDNP3
(B3)

ATGAGTAACAATATAAAACATGAAACTGACTATTCTCACGATTGG
ACTGTCGAACCAAACGGAGGCGTCACAGAAGTAGACAGCAAACA
TACACCTATCATCCCGGAAGTCGGTCGTAGTGTAGACATTGAGAA
TACGGGACGTGGGGAGCTTACCATTCAATACCAATGGGGTGCGCC
ATTTATGGCTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATGTGGTACA
ACGTGATGAAACTTACCATTTACAACGCCCTGATAATGCATTCTA
TCATCAGCGTATTGTTGTAATTAACAATGGCGCTAGTCGTGGTTTC
TGTACAATCTATTACCAC

- Mẫu chứng dương chuẩn là đoạn amplicon nhân tạo do hãng IDT-Mỹ tổng hợp dài
333bp dựa theo trình tự do T.W.Flegel cơng bố năm 2014.
Bảng 2.3. Thành phần và nồng đơ ̣ hóa chất phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ lai

Thành phần

Thể tích/1 pu (µl)

h-Tag buffer 10X

2,5

dNTP 10mM

0,5

MgCl2 25mM

1,5

Primer AP3 25µM

0,2

h-Tag

0,25

H2 O

15,05

DNA mẫu

5

Tổng thể tích

25 µl

9


Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ lai
Bước

Nhiệt độ (oC)

Thời gian

Số chu kỳ

1

95oC

15 phút

1

2

95oC

20 giây

3

50 → 55 oC

30 giây

4

72 oC

30 giây

5

72 oC

5 phút

40 chu kỳ

1

Bảng 2.5. Thành phần và nồng đơ ̣ hóa chất phản ứng PCR tối ưu hóa nồng độ Mg2+
Phản ứng

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

h-Tag buffer 10X

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

dNTP 10mM

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

MgCl2 25mM

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Primer AP3 25µM

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

h-Tag

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

H2 O

16,05

15,55

15,05

14,55

14,05

13,55

13,05

DNA mẫu B3

5

5

5

5

5

5

5

Tổng

25 µl

25 µl

25 µl

25 µl

25 µl

25 µl

25 µl

10


Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR tối ưu hóa nồng độ Mg2+
Bước

Nhiệt độ (oC)

Thời gian

Số chu kỳ

1

95oC

15 phút

1

2

95oC

20 giây

3

53 oC

30 giây

4

72 oC

30 giây

5

72 oC

5 phút

40 chu kỳ

1

Bảng 2.7 Thành phần và nồng đơ ̣ hóa chất phản ứng PCR tối ưu hóa nồng độ mồi
Phản ứng

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

h-Tag buffer 10X

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

dNTP 10mM

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

MgCl2 25mM

2

2

2

2

2

2

2

2

2

Primer AP3 25µM

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

h-Tag

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

H2O

14.55

14.45

14.35 14.25

14.15

14.05

13.95

13.85

13.75

DNA mẫu B3 E3

5

5

5

5

5

5

5

5

5

Tổng

25 µl

25 µl

25 µl

25 µl

25 µl

25 µl

25 µl

25 µl

25 µl

Dựa vào các kết quả, nồng độ IC được lựa chọn là 100nM và thí nghiệm khảo sát độ
nhạy, độ đặc hiệu giữa phản ứng có mồi IC.

11


Bảng 2.8. Thành phần và nồng đơ ̣ hóa chất phản ứng PCR so sánh độ nhạy của phản ứng AP3
có IC và khơng có IC
Phản ứng

Có IC

Khơng có IC

h-Tag buffer 10X

2,5

2,5

dNTP 10mM

0,5

0,5

MgCl2 25mM

2

2

Primer IC 10µM

0,25

0

Primer AP3 25µM

0,5

0,5

h-Tag

0,4

0,25

H2 O

13,85

14,25

DNA mẫu B3

5

5

Tổng

25 µl

25 µl

Bảng 2.9. Thành phần và nồng đơ ̣ hóa chất phản ứng PCR so sánh độ đặc hiệu của phản ứng
AP3 có cặp mồi chứng nội IC
Phản ứng

Có IC

h-Tag buffer 10X

2,5

dNTP 10mM

0,5

MgCl2 25mM

2

Primer IC 10µM

0,25

Primer AP3 25µM

0,5

h-Tag

0,4

H2 O

13,85

DNA mẫu

5

Tổng

25 µl

12