Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật QFPCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST

B GIO DC V O TO B Y T
TRNG I HC Y H NI
**********************



NGUYN HOI NAM




NGHIÊN CứU ứng dụng kỹ thuật qf-pcr
trong chẩn đoán trớc sinh một số
hội chứng lệch bội nhiễm sắc thể




LUN VN THC S Y HC



H NI - 2011



B GIO DC V O TO B Y T
TRNG I HC Y H NI
**********************

NGUYN HOI NAM



NGHIÊN CứU ứng dụng kỹ thuật qf-pcr
trong chẩn đoán trớc sinh một số
hội chứng lệch bội nhiễm sắc thể

Chuyờn ngnh : Húa sinh Y hc
Mó s : 60.72.04


LUN VN THC S Y HC

Hng dn khoa hc:
TS . HONG TH NGC LAN



H NI - 2011



Lời cảm ơn
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
TS. Hoàng Thị Ngọc Lan người thầy đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và
cho tôi nhiều kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để
hoàn thành luận văn này.

TS. Trần Vân Khánh – Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, trường
Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ, động viên tôi trong
quá trình thực hiện luận văn.
PGS.TS. Tạ
Thành Văn –Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein–
Cán bộ giảng dạy bộ môn Hóa sinh trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi nhiều
kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài.
Tiếp theo tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới:
Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứ
u.
Các thầy cô bộ môn Hóa sinh, trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi
những kiến thức quý báu trong quá trình học tập.
Các thầy cô bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội
đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn.
Các anh chị Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, trường Đại học Y Hà
Nội đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tại Trung tâm.
Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghi
ệp đã giành cho tôi sự ủng hộ nhiệt tình,
chia sẻ với tôi những lúc thành công cũng như khó khăn.
Cuối cùng, tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng của bố mẹ .
Sự yêu thương, động viên từ những người thân trong gia đình là chỗ dựa vững
chắc giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, tháng 10 năm 2011
Nguyễn Hoài Nam


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng lệch bội NST” là đề
tài do bản thân tôi thực hiện. Các số liệu là hoàn toàn trung thực và chưa
từng được công bố.
Tác giả

Nguyễn Hoài Nam




DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFP Alfa feto-protein
AF Amniotic fluid
BP Base pair
ΒhCG Beta_human chronic gonadotropin
CVS Chrionic villus sample
DNA Deoxyribonucleic acid
DTBS Dị tật bẩm sinh
FISH Fluorescent in situ hybridization
NST Nhiễm sắc thể
PAPP-A Pregnancy – associated plasma protein A
PCR Polymerase chain reaction
PGD Preimplantation Genetic Diagnosis
PUBS Percutaneous umbilical blood sampling
QF-PCR Quantitative fluorescence – polymerase chain reaction
RNA Ribonucleic acid
SRT Short tandem repeat
Taq Theramus aquaticus

TOP Termination of pregnancy
uE
3
Unconjugated Estriol- Estriol không liên hợp


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Khái niệm và đặc điểm hội chứng trisomy 13, 18, 21 và bất thường số
lượng nhiễm sắc thể X,Y 3
1.1.1. Hội chứng Down (Trisomy 21) 3
1.1.2. Hội chứng Patau (Trisomy 13) 4
1.1.3. Hội chứng Edwards (Trisomy 18) 5
1.1.4. Hội chứng Klinefelter (XXY) 6
1.1.5. Hội chứng XYY 6
1.1.6. Hội chứng Trisomy X (Hội chứng siêu nữ) 6
1.1.7. Hội chứng Monosomy X (Hội chứng Turner) 7
1.2. Một số phương pháp sàng lọc trước sinh 8
1.2.1. Siêu âm thai: 8
1.2.2. Test sàng lọc bộ ba (triple test : AFP, βhCG,uE
3
) 10
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH 12
1.3.1. Lấy mẫu di truyền 12
1.3.2 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào 14
1.3.3. Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào - phân tử . 15
1.3.4. Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền phân tử: 16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 23

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: 23
2.1.2. Địa điểm lấy mẫu: 23
2.1.3. Địa điểm phân tích mẫu: 23
2.2. Thời gian nghiên cứu 23
2.3. Phương tiện nghiên cứu 23
2.3.1. Dụng cụ: 23


2.3.2. Hóa chất: 24
2.4. Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng 24
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu: 24
2.4.2. Kỹ thuật sử dụng: 24
2.5. Xử lý và phân tích số liệu 30
2.6. Vấn đề đạo đức của đề tài 31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32
3.1. Kết quả tách chiết DNA từ dịch ối 32
3.2. Kết quả của kỹ thuật QF-PCR 33
3.3. Minh họa kết quả QF-PCR của một số trường hợp 38
3.3.1. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 12 38
3.3.2. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 21 41
3.3.3. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 17 43
3.3.4. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 11 45
3.3.5. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 13 47
3.3.6. Kết quả
QF-PCR của bệnh nhân số 27 49
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 53
4.1. Quy trình áp dụng kỹ thuật QF – PCR: 53
4.2. Giá trị của kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội
chứng lệch bội 55
4.2.1. Trường hợp chẩn đoán khác nhau giữa Karyotyp và QF-PCR 55

4.2.2. Độ chính xác của QF-PCR trong chẩn đoán bất thường lệch bội NST 59
4.3. Số lượng marker cần sử dụ
ng trong chẩn đoán các hội chứng lệch bội
NST và việc sử dụng các extra marker. 60
4.4. Một số ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật QF – PCR 62
KẾT LUẬN 63
KIẾN NGHỊ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Những dấu hiệu bất thường hay gặp trên siêu âm ba tháng giữa và
các rối loạn NST tương ứng [19] 9
Bảng 1.2. Kết quả nghiên cứu chẩn đoán trước sinh bất thường NST sử dụng
QF – PCR [23] 20
Bảng 2.1: Các marker được sử dụng trong bộ kit Aneufast[12] 26
Bảng 2.2: Các marker được sử dụng trong từng lọ 28
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng 28
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng QF-PCR 29
Bảng 2.5. Hóa chất dùng cho 1 mẫu điện di 29
Bảng 2.6. Cách đọc kết quả tỉ lệ đỉnh [12] 30
Bảng 3.1. Kết quả tách chiết DNA từ dịch ối 32
Bảng 3.2. Kết quả của kỹ thuật QF-PCR 33
Bảng 3.3. Độ chính xác của kỹ thuật QF – PCR so với kỹ thuật di truyền tế
bào 34
Bảng 3.4. Độ chính xác của từng marker trong chẩn đoán trisomy 21 35
Bảng 3.5. Độ chính xác của từng marker trong chẩn đoán trisomy 18 36
Bảng 3.6. Độ chính xác của từng marker trong chẩn đoán trisomy 13 37

Bảng 4.1. Kết quả các nghiên cứu chẩn đoán lệch bội nhiễm sắc thể bằng kỹ
thuật QF – PCR [23] 60



DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Kết quả điện di huỳnh quang trên máy ABI 17
Hình 1.2. Hai alen đồng hợp tử 17
Hình 1.3. Hai alen dị hợp tử với tỉ lệ 1:1 18
Hình 1.4. 3 alen dị hợp tử với tỉ lệ 1:1:1 18
Hình 1.5. 3 alen dị hợp tử tỉ lệ 2:1 19
Hình 1.6. Ba alen đồng hợp tử 19
Hình 2.1. Kết quả đo nồng độ DNA bằng máy quang phổ Nanodrop 25
Hình 3.1. Kết quả
QF-PCR của bệnh nhân số 12 38
Hình 3.2. Kết quả Karyotyp bệnh nhân số 12 40
Hình 3.3. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 21 41
Hình 3.4. Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 21 42
Hình 3.5. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 17 43
Hình 3.6. Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 17 44
Hình 3.7. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 11 45
Hình 3.8. Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 11 46
Hình 3.9. Kế
t quả QF-PCR của bệnh nhân số 13 47
Hình 3.10. Kết quả Karyotyp của bệnh nhân số 13 48
Hình 3.11. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 27 với các marker thường
dùng 49
Hình 3.12. Kết quả QF-PCR của bệnh nhân số 27 với các extra marker trong
lọ XY 50

Hình 3.13. Kết quả karyotyp của bệnh nhân số 27 52
Hình 4.1. Kết quả karyotyp mẫu bệnh nhân kết luận 46,XY 56
Hình 4.2. Kết quả QF-PCR của mẫu bệnh nhân karyotyp kết lu
ận 46,XY 57

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dị tật bẩm sinh (DTBS) là một trong những bất thường hay gặp ở thai
nhi và trẻ sơ sinh, nhiều nghiên cứu thống kê đã xác định DTBS là một trong
những nguyên nhân chính gây nên tử vong và bệnh tật của trẻ trong những
năm đầu tiên của cuộc sống. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO)
dị tật bẩm sinh chiếm khoảng 3 - 4% tổng số trẻ được sinh ra bao gồm cả trẻ

sống và trẻ chết lúc sinh [34]. Theo nghiên cứu của Phan Thị Hoan (2001) ở
nhóm dân cư thuộc 4 tỉnh đồng bằng Sông Hồng cho thấy tỷ lệ DTBS chiếm
1,96% dân số điều tra [6]. Một số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể (NST)
thường gặp như: hội chứng Down, hội chứng Patau, hội chứng Edwarrd và
một số hội chứng bất thường NST giới như: Klinefelter, Tuner. Đa số
trẻ sinh
ra mắc những hội chứng này đều ảnh hưởng tới khả năng sống và sự hòa nhập
cộng đồng. Hiện nay việc điều trị các bệnh di truyền còn gặp nhiều khó khăn,
vì vậy phòng và hạn chế bệnh di truyền cho trẻ sinh ra là việc cấp thiết nhằm
giảm bớt gánh nặng về kinh tế cũng như tâm lý cho gia đình và xã hội. Việc
chẩn đ
oán sớm các DTBS thời kỳ phôi thai là cần thiết để có các biện pháp xử
lý phù hợp.
Gần đây người ta phát hiện ra các trình tự lặp ngắn STR (short tandem
repeat) có tính đa hình cao ở một số locus nhất định trên NST số 13, 18, 21,

X, Y. Nhờ đó khi tiến hành phản ứng nhân gen PCR những locus này, chúng
ta có thể xác định được số lượng các alen trên hình ảnh điện di. Do bất thường
số lượng alen tương ứng với bất thường các NST nên phương pháp này có th
ể
ứng dụng để chẩn đoán hội chứng bất thường NST một cách nhanh chóng và
chính xác mà không cần phải nuôi cấy tế bào. Kỹ thuật QF – PCR
(quantitative fluorescence – polymerase chain reaction) được gọi là phản ứng
chuỗi polymer huỳnh quang định lượng dùng để khuếch đại các STR. Đây là
2

phương pháp xác định các dị tật về gen và NST hiệu quả nhanh chóng hơn so
với các phương pháp khác.
Hiện nay ở Việt Nam, tại một số trung tâm lớn đã triển khai áp dụng kỹ
thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh các bệnh di truyền. Tuy nhiên
chưa có đề tài nào đánh giá độ chính xác của kỹ thuật này trong chẩn đoán
trước sinh và chuẩn hóa quy trình để áp dụng vào điều kiện Việt Nam. Xuất
phát từ yêu cầu
đó, chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu ứng dụng kỹ
thuật QF-PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội chứng
lệch bội NST"
với 2 mục tiêu sau:
1. Ứng dụng kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh một số hội
chứng lệch bội NST.
2. Đánh giá giá trị của kỹ thuật QF - PCR trong chẩn đoán trước sinh một
số hội chứng lệch bội NST.

3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

1.1. Khái niệm và đặc điểm hội chứng trisomy 13, 18, 21 và bất thường
số lượng nhiễm sắc thể X,Y
Trong thực tế lâm sàng, bất thường NST gặp ở 50% các trường hợp gây
sẩy thai, 10% các trường hợp đẻ sống. Trong đó các bất thường thường gặp và
gây ảnh hưởng tới khả năng hòa nhập cộng đồng và trí tuệ của trẻ là các hội
chứng Down, Patau, Edward, hội chứng Kilinefelter, h
ội chứng Tuner và hội
chứng trisomy X.
1.1.1 Hội chứng Down (Trisomy 21) [7][10]
Là một trong những hội chứng rối loạn NST dạng lệch bội thường gặp
nhất, tỷ lệ trung bình mắc hội chứng Down trong quần thể là 1/700 lần sinh.
Cơ chế di truyền của bệnh: 92,5% là do 3 NST 21, 4,8% là do chuyển
đoạn của NST 21 với các NST tâm đầu khác, một tỷ lệ thấp khoảng 2,7% thể
khảm. Trong những n
ăm gần đây, người ta đã biết rõ rằng 80% trường hợp
không phân ly của cặp NST 21 xảy ra ở lần phân chia thứ nhất của quá trình
giảm phân (Meiosis Ι), trong đó tỷ lệ ở mẹ chiếm 66,2% , ở cha 13,8%. Còn
20% trường hợp không phân ly của các cặp NST 21 là xảy ra ở lần phân chia
thứ hai của quá trình giản phân (Meiosis ΙΙ), trong đó tỷ lệ ở mẹ chiếm 11%,
còn ở cha chiếm 9%. Cũng có trường hợp c

ặp NST 21 không phân ly xảy ra
trong những lần nguyên phân đầu tiên của hợp tử gây nên tình trạng khảm của
thai hội chứng Down.
Tiên lượng sống của bệnh nhân phụ thuộc vào việc có hay không có
các dị tật nội tạng, đặc biệt loại dị tật ở tim kèm theo. Đồng thời còn phụ
4

thuộc vào việc bệnh nhân có mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội hay không,
mắc nhiều hay ít. Tỷ lệ chết trong 5 năm đầu là 50%. Có 8% sống được tới
40, 2,6% sống trên 50 tuổi.
Hiện nay chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu tuy nhiên để khắc phục
tình trạng phát triển thể chất kém người ta dùng hormon tăng trưởng.
1.1.2. Hội chứng Patau (Trisomy 13) [7]
Lần đầu tiên được Patau cùng các cộng sự mô tả
đầy đủ vào năm 1960.
Bệnh gặp với tần số 1/5000 đến 1/10000 trẻ sinh ra. Tỷ lệ bệnh gặp ở nữ
nhiều hơn nam.
Các trẻ mắc hội chứng Patau có trọng lượng khi sinh thấp hơn mức
trung bình khoảng 900g và thường sinh thiếu tháng. Các dấu hiệu lâm sàng
bên ngoài của hội chứng này rất điển hình đến mức có thể dựa vào đó để nhận
dạng và chẩn đ
oán bệnh.
Các bất thường đặc trưng biểu hiện ở sọ và mặt: chu vi hộp sọ thường
bị giảm, đầu bé cùng với trán thấp và nghiêng, khe mắt hẹp, gốc mũi rộng, tai
mọc thấp với vành tai biến dạng, khoảng cách giữa hai mắt giảm, da đầu
thường bị loét, có u mạch máu ở vùng đầu và chẩm.
Một trong những dấu hiệu điển hình nhất của hộ
i chứng Patau là khe hở
môi trên và vòm miệng, các khe hở thường là ở cả hai phía. Trong số các bất
thường của hệ thống cơ xương, hay gặp nhất là tật nhiều ngón ở cả hai tay và

hai chân. Những biến đổi của vân da tay được thấy là góc atd lớn.
Ngoài ra, các DTBS ở tim chiếm 80% các trường hợp, ở hệ thống bài
tiết trên 60%, ở hệ thống cơ quan sinh sản 75%.
Do có quá nhiều dị tật nặng nề, nên những tr
ẻ Trisomy 13 không sống được
lâu, 90% bệnh nhân bị chết trong vòng 1 tuổi, trong đó 40% là chết chu sinh.
5

1.1.3. Hội chứng Edwards (Trisomy 18) [7]
Lần đầu tiên được một nhóm các nhà di truyền học người Anh đứng
đầu là Edwards mô tả đầy đủ năm 1960. Đây là hội chứng do rối loạn NST
đứng thứ 2 sau hội chứng Down.
Trẻ Trisomy 18 được sinh ra thường thiếu cân (trọng lượng trung bình
khoảng 2kg), trong khi thai lại thường bị già tháng. Các biểu hiện lâm sàng ở
hội chứng này cũng đa dạng như ở hội chứng Patau.
Các tổn thương cấu tạo của mặt và hệ thống cơ xương là ổn định, ở các
trường hợp kinh điển, sọ não có dạng kéo dài nghiêng dần từ xương trán tới
vùng thóp, hàm dưới và lỗ mi
ệng bé, các khe mắt hẹp và ngắn. Vành tai bị
biến dạng và trong phần lớn các trường hợp có tai mọc thấp. Các tật ở chi trên
là sự xếp lộn xộn của xương bàn, bất thường khớp giữa ngón Ι, bất thường ở
bàn chân cũng có tới 80% các trường hợp. Khe hở môi được gặp ở 50% các
trường hợp, nhưng khác với hội chứng Patau ở chỗ thường chỉ khe hở môi ở

một phía.
Để góp phần chẩn đoán hội chứng Edwards, các đặc tính vân da có ý
nghĩa đáng kể, vì ngoài những bất thường thấy ở các nếp lòng bàn tay, tỷ lệ
vân cung ở các đầu ngón tay rất đặc trưng: có tới 95% bệnh nhân có tần số
vân cung từ 5% trở lên, trong khi tần số bình thường là 2,5%. Các trường hợp
bất thường ở tim và mạch máu lớn chiếm tới 90,8% các trường hợp. Thường

là, các tổn thương
ở vách liên thất và các tật của van tim. Ngoài ra, còn gặp
những DTBS ở hàng loạt các cơ quan khác như: hệ thần kinh, tiêu hóa, hô
hấp, bài tiết, sinh dục…
Do có nhiều dị tật ở nhiều hệ thống cơ quan, nên thời gian sống của các
trẻ Trisomy 18 không được lâu. Có tới 60% các trường hợp bị chết trước 3
tháng (trong đó 30% là trước 1 tháng). Chỉ 1 trong 10 trẻ bị bệnh là sống được
đến 1 tuổi.
6

1.1.4. Hội chứng Klinefelter (XXY)[7]
Là dạng bệnh NST giới tính hay gặp nhất ở nam giới với tần số khoảng
1:1000 lần trẻ sơ sinh nam và thường gặp trong các trường hợp người mẹ lớn
tuổi, trung bình là 32,3 tuổi. Những biểu hiện lâm sàng ở tuổi niên thiếu của
bệnh nhân Kinefelter thường chỉ là giảm trí tuệ nhẹ, học đọc viết khó khăn,
người yếu nhưng lại thườ
ng có chiều cao cao hơn các trẻ cùng lứa tuổi do
chân dài. Ở tuổi trưởng thành mới thấy rõ những dấu hiệu phát triển lệch lạc
về giới tính đàn ông như tinh hoàn bé, mào tinh đôi khi lớn hơn tinh hoàn,
mềm bóp không đau, không thấy tinh trùng trong tinh dịch nên vô sinh. Ngoài
ra, còn thấy các bất thường của sự phát triển các dấu hiệu sinh dục phụ kiểu
nữ như: tuyến vú phát triển ở 25 - 50% các trường hợp, lớp mỡ dướ
i da dày,
vai hẹp, hông rộng.
1.1.5. Hội chứng XYY
Được Evans và cộng sự phát hiện năm 1977 khi phân tích, định loại
NST ở các bé trai sơ sinh. Tần số người có 47,XYY trong quần thể là 1/1000
nam giới nhưng tần số này tăng cao ở nơi giam giữ các phạm nhân, vì vậy
NST Y thừa được gắn cho cái tên là NST tội phạm. Lúc nhỏ, biểu hiện ngoài
bình thường, thường có nhiều mụn trứng cá ở mặt. Lúc dậy thì hầu hết trẻ

lớn
nhanh, dậy thì muộn hơn trẻ bình thường khoảng 6 tháng. Răng lớn, gốc mũi
nhô cao và không cân xứng, tai thấp. Mặc dù người cao nhưng có xu hướng
kém phát triển cơ ngực, cơ vai và cơ thắt lưng. Có trường hợp sinh dục kém
phát triển, tinh hoàn nhỏ, tinh hoàn lạc chỗ và lỗ đái lệch thấp. Hầu hết có trí
tuệ bình thường, một số chậm phát triển trí tuệ.
1.1.6. Hội chứng Trisomy X (Hội ch
ứng siêu nữ)[7]
Đặc điểm chung:
Hội chứng Trisomy X được gặp trong dân cư với tần số chung là
khoảng 1,3: 1000 lần sinh con gái. Những biểu hiện bên ngoài rất khó phân
7

biệt người bệnh với những người bình thường do không có những biến đổi rõ
ràng về hình thái cũng như trí tuệ và thể lực. Tuy nhiên, ở những người bệnh
cũng có một số bất thường về chức năng sinh sản ở phụ nữ như vô kinh thứ
phát, rối loạn kinh nguyệt, mãn kinh sớm, tỷ lệ mắc bệnh tâm thần phân liệt
cao. Những phụ nữ Trisomy X vẫn có kh
ả năng sinh đẻ bình thường song
nguy cơ các bất thường các NST ở con cái cao hơn những người khác.
1.1.7. Hội chứng Monosomy X (Hội chứng Turner),[33][7]
Đặc điểm chung:
Hầu hết các trường hợp thai mắc hôi chứng Turner bị sảy thai tự nhiên,
chỉ có một số ít sống đến khi sinh. Tần số gặp ở 1/5000 trẻ sơ sinh gái.
Người bệnh có kiểu hình là nữ giới thường đi khám vì các triệu chứng
như lùn, vô kinh nguyên phát, các biểu hiện của bệnh ở các giai đoạn khác nhau:
Ở trẻ sơ sinh: có thể nhận biết được qua các biểu hiện: trọng lượng khi
sinh thấp, phù bạch huyết ở mu bàn tay, bàn chân, phù cứng, không viêm và
thường đến tuổi thứ hai thì hết phù, tai vểnh ra phía sau.
Ở trẻ em gái và thanh niên: người lùn chậm lớn và có những biểu hiện

bất thường như khe mắt cụp, sụp mi, mép xệ, khẩu cái hình cug nhọn. Tai thấp
và v
ểnh ra sau, tóc mọc thấp. Cổ ngắn và rộng vì có nếp da hình cánh bướm
nối liền từ xương chũm đến mỏm cùng vai. Cẳng tay cong ra ngoài, ngắn đốt
thứ tư. Lồng ngực hình lá chắn, hai núm vú kém phát triển và xa nhau.
Cơ quan sinh dục có rất ít hoặc không có lông mu, không có lông nách,
đôi khi có dấu hiệu nam hóa với âm vật phì đại. Tuyến sinh dục không phát
triển, soi ổ bụng thấy 1 dải nhỏ màu trắng nhạt, trường hợp điển hình thấ
y tổ
chức xơ. Tử cung nhỏ, có thể chẻ đôi. Giới tính thứ cấp không phát triển,
tuyến vú không phát triển, vô kinh nguyên phát.
Xét nghiệm: không có nội tiết tố nữ: estrogen và pregnandiol, tăng
FSH, 17-cetosteroid thường thấp.
8

Nguyên nhân và cơ chế phát sinh:
Nguyên nhân: do rối loạn NST giới tính X về số lượng hoặc cấu trúc
+ Khoảng trên 50% kiểu gen ở hội chứng Turner dạng 45,X;
+ Dạng khảm dòng tế bào 45,X với dòng tế khác gặp 15-20%số bệnh
nhân mắc hội chứng Turner. Các dạng thể khảm là 45,X/46,XX hoặc
45,X/47,XXX. Ngoài ra có thể gặp thể 45,X/46,XY, người bệnh bất thường
cơ quan sinh dục ngoài, biểu hiện hoặc có hình thái nam hoặc mơ hồ giới tính
hoặc hình thái nữ hoàn toàn.
+ Dạng rối loạn cấu trúc NST X: NST X mất nhánh ngắn, nhánh dài…
Cơ chế phát sinh: 75% trường hợp 45,X là do rối loạn phân bào ở bố,
số còn lại có nguồn gốc từ mẹ.
1.2. Một số phương pháp sàng lọc trước sinh
Trên thế giới và Việt Nam đã và đang áp dụng các phương pháp sau:
1.2.1. Siêu âm thai:
Trong chẩn đoán trước sinh, siêu âm được sử dụng lần đầu tiên vào

những năm 1972. Sau đ
ó siêu âm ngày càng được sử dụng rộng rãi và đã trở
thành một phương tiện chẩn đoán quan trọng và không thể thiếu trong chương
trình chăm sóc trước sinh. Đây là phương pháp không xâm phạm thai, tương
đối an toàn nên được xem là một trong những công cụ chủ yếu để sàng lọc và
phát hiện các dị tật của thai.
Giai đoạn 3 tháng đầu: để đo độ mờ da gáy (dày da gáy)
Độ dày khoảng mờ da gáy được tính là chiều dày tối
đa của khoảng mờ
dưới da, là chiều dày từ mặt ngoài da gáy tới xương trên đốt sống cổ. Sự tăng
độ dày khoảng mờ da gáy liên quan đến các hội chứng bất thường NST như
Turner, hội chứng Down, các lệch bội NST khác. Sàng lọc sử dụng kết hợp
tuổi của mẹ với độ dày khoảng mờ da gáy của thai tuần 10 - 14 ở nhóm thai
phụ có nguy cơ cao đã được thực hiệ
n vào những năm 1990, khoảng 80% thai
9

Trisomy 21 liên quan với tăng khoảng mờ da gáy (≥ 3mm). Độ dày da gáy tăng
theo tuổi thai nếu đo không chính xác sẽ gây nên kết quả dương tính giả [3].
Giai đoạn 3 tháng giữa:
Trong giai đoạn 3 tháng giữa siêu âm theo dõi sự phát triển của thai, rà
soát có hệ thống toàn bộ giải phẫu của thai. Giai đoạn này, siêu âm có thể
phát hiện hầu hết các bất thường ở các cơ quan, định hướng tới tất cả các bệnh
c
ủa thai từ đó có các chỉ định xét nghiệm chẩn đoán tìm nguyên nhân. Ngoài
ra siêu âm còn có ý nghĩa chẩn đoán xác định các dị tật hình thái để có thể
đưa ra quyết định chấm dứt thai kỳ[4], [2].
Bảng 1.1. Những dấu hiệu bất thường hay gặp trên siêu âm ba tháng giữa
và các rối loạn NST tương ứng [19]
Bất thường Trisomy 18 Trisomy 21 Trisomy 13 Turner

Giãn não thất + + +
Não trước không phân chia +
Nang đám rối mạch mạc +
Hội chứng Dandy Walker + +
Khe hở môi + +
Cằm nhỏ +
Giảm sản xương mũi +
Phù da gáy + + +
Nang bạch huyết +
Thoát vị hoành + +
Dị tật tim + + + +
Thoát vị rốn + +
Hẹp tá tràng +
Hẹp thực quản + +
10

Dị tật thận + + + +
Ngắn xương chi + + +
Thiếu ngón +
Ngón tay chồng nhau +
Thừa ngón +
Dính ngón
Bàn chân vẹo + +
Thai chậm phát triển + +

1.2.2. Test sàng lọc bộ ba (triple test : AFP, βhCG,uE
3
)
+ AFP (Alpha feto - protein) [24], [29], [11]
AFP là một protein đặc biệt của thai,được phát hiện lần đầu tiên vào năm

1956 bởi Bergstrand và Czar. AFP được sản xuất từ túi noãn hoàn và gan của
thai. Túi noãn hoàn bị teo ở cuối của giai đoạn bào thai, từ tuần thứ 10 hoặc
tuần thứ 11 của thai và AFP chủ yếu do gan tổng hợp. AFP được định lượng
trong huyết thanh thai, trong dịch ối hoặc trong huyết thanh mẹ. Định lượng
AFP chủ yếu là ở
huyết thanh mẹ vì khi thực hiện xét nghiệm này không xâm
phạm đến thai, tránh được những rủi ro có thể đến với thai và với mẹ.
AFP trong huyết thanh mẹ tăng từ tuần thai thứ 10 tới tuần thai 30 - 32
rồi giảm dần. AFP có nguồn gốc từ thai, khuyếch tán từ huyết thanh của thai
hoặc từ dịch ối qua bánh rau vào vòng tuần hoàn của mẹ. AFP tăng cao trong
huyết thanh mẹ từ tuần thứ 12 - 14. Nồng độ
MSAFP ổn định thường từ tuần
thai 15 - 18, vì vậy người ta cũng thường định lượng MSAFP trong khoảng
tuần thai này. Giá trị trung bình của AFP ở tuần thai 15 - 18:
Huyết thanh thai : 1.510.000 ng/ml
Dịch ối : 10200 ng/ml
Huyết thanh mẹ : 30,6 ng/ml
11

Nồng độ AFP thấp trong những trường hợp bất thường NST. Ngoài ra
nồng độ AFP huyết thanh mẹ còn phụ thuộc đặc điểm sinh lý và bệnh lý của
mẹ do đó cần hiệu chỉnh yếu tố này trong sàng lọc trước sinh.
+ hCG (human chorionic gonadotropin)[24], [14], [8]
hCG là 1 glycoprotein gồm 2 chuỗi α và β do tế bào lá nuôi tiết ra ngay
sau khi có hiện tượng trứng làm tổ. Vào ngày thứ 8 sau khi thụ thai có thể
thấy hCG trong nước tiểu, hCG tăng nhanh và tăng tố
i đa vào tuần thai 8-9
sau đó giảm dần đến tuần 11-12 và duy trì nồng độ như vậy cho đến khi gần
đẻ. Nồng độ hCG tăng cao trong chửa trứng đặc biệt trong ung thư rau thai.
Nam giới và phụ nữ không mang thai có nồng độ hCG trong huyết thanh

không quá 5mIU/ml.
Quá trình phân hủy hCG diễn ra mạnh hơn ở những thai bất thường,
các bệnh lý về rau hoặc ung thư và những ngày sau sinh. Trong sàng lọc trước
sinh, định lượng hCG toàn phần, βhCG
được sử dụng như một dấu hiệu để
phát hiện thai có nguy cơ bất thường NST[21].
+ uE
3
( unconjugated Estriol hay Estriol không liên hợp )[24], [16]
uE
3
do hoàng thể và rau thai bài tiết, từ tháng thứ 4 trở đi chỉ còn rau
thai bài tiết. Nồng độ uE
3
tăng dần trong máu mẹ, cao nhất vào tháng thứ 9 và
giảm dần khi chuyển dạ. Nồng độ uE
3
giảm chứng tỏ tình trạng suy yếu của
bánh rau và thai nhi. uE
3
đi qua bánh rau vào vòng tuần hoàn mẹ vì vậy có
thể định lượng nồng độ uE
3
trong máu mẹ. Trong quá trình có thai, nồng độ
estriol liên hợp và estriol không liên hợp tăng dần, cao nhất vào khoảng tuần
thứ 36. Cuối thời kỳ thai nghén nồng độ uE
3
là 15ng/ml và estriol toàn phần là
250ng/ml. Sau tuần 40, nồng độ estriol giảm đều khoảng 12%/tuần. Thời gian
bán hủy của estriol trong máu mẹ khoảng 30 - 60 phút điều này liên quan đến

bảo quản mẫu để định lượng estriol. Nồng độ estriol thấp kéo dài hoặc nồng
độ estriol giảm đột ngột gợi ý đến thai bệnh lý[13], [21].
12

Ngoài ra người ta còn sử dụng 1 số chất khác trong xét nghiệm sàng lọc như:
- Inhibin
Inhibin là 1 glycoprotein gồm 2 chuỗi α và β (gồm 2 loại β
A
β
B
).
Ở những người phụ nữ không có thai buồng trứng là nguồn cung cấp
inhibin. Khi có thai bánh rau và màng rau là nguồn bài tiết chủ yếu inhibin.
Nếu chuỗi α liên kết với β
A
gọi là inhibin–A ,hoặc chuỗi α liên kết với β
B
gọi
là inhibin–B. Inhibin–A được sử dụng như 1 chất chỉ điểm huyết thanh và sàng
lọc được 70% hội chứng Down với ngưỡng nồng độ 1,79 MoM.
- PAPP - A (Pregnancy – associated plasma protein A)
PAPP - A là 1 glycoprotein có nguồn gốc từ bánh rau. Nồng độ của nó
trong huyết thanh mẹ tiếp tục tăng trong quá trình có thai. Với thai Down
PAPP – A trong huyết thanh người mẹ giảm trong 3 tháng đầu của thai kì
[14]. Định lượng PAPP – A được sử dụng trong 3 tháng đầu của thai để thay
thế
cho định lượng AFP.
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH
1.3.1. Lấy mẫu di truyền
Muốn chẩn đoán bất thường NST trước hết phải lấy được mẫu di truyền

từ thai nhi, có thể dùng các phương pháp sau.
1.3.1.1. Lấy mẫu xâm phạm thai
+ Chọc hút dịch ối (Amniocentesis):
Thời gian chọc hút nước ối lý tưởng ở tuần thai thứ 16 - 18. Phương
pháp này được lựa chọn nhiều nhấ
t hiện nay vì thu được tế bào có nguồn gốc
từ thai nhi giúp cho chẩn đoán di truyền thu được kết quả chính xác, ít gây tai
biến cho thai nhi cũng như cho người mẹ. Dưới sự hướng dẫn của siêu âm,
người ta đưa kim từ bụng dưới thai phụ vào khoang ối bên trong tử cung và
hút khoảng 10 -20 ml dịch ối. Dịch ối có các tế bào ối, da, phổi và tế bào biểu
bì đường tiết niệu của thai nhi. Các tế bào này sẽ được tách DNA trự
c tiếp
13

hoặc nuôi cấy trên các môi trường thích hợp để thu được lượng tế bào thai nhi
nhiều hơn và giúp loại bỏ các tế bào máu của người mẹ lẫn vào. Tuy nhiên
phương pháp này cho chẩn đoán muộn (tuổi thai từ 15 - 18 tuần tuổi trở lên)
và gây ra những tai biến nhất định như :
- Sẩy thai: khoảng 0,5-1%. Theo trường Đại học Thực hành Sản phụ
khoa Mỹ, tỷ lệ sẩy thai do chọc ối vào khoảng 1/300-1/500[15].
- Chảy máu bánh rau: bánh rau ch
ảy máu gây nhiễm tế bào máu mẹ
trong dịch ối dẫn đến tình trạng khảm khi phân tích. Biến chứng này ít xảy ra
khi bánh rau nằm phía sau.
- Biên chứng do bất đồng nhóm máu mẹ con Rh: 2 - 3% trường hợp
chọc ối ba tháng giữa có thể gây chảy máu từ thai sang mẹ gây phản ứng miễn
dịch đối với trường hợp mẹ Rh (-). Để tránh biến chứng này, có thể phòng
bằng cách tiêm 100 - 300µg kháng thể RhD cho mẹ trước khi chọc ối.
- Nhiễm trùng m
ẹ: rất hiếm gặp và có thể phòng tránh nếu đảm bảo

nghiêm ngặt điều kiện vô trùng.
- Rỉ ối hoặc thấm máu âm đạo: gặp khoảng 2 - 3%. Nước ối chảy ra vài
giờ sau khi chọc, sau đó tự cầm[3].
+ Sinh thiết tua rau (chrionic villus sample, CVS):
Sinh thiết tua rau được biết đến từ cuối những năm 1960, nhưng cho tới
năm 1983 khi có sự hướng dẫn của siêu âm, chọc hút tua rau mới trở thành
m
ột kỹ thuật phổ biến để chẩn đoán trước sinh ở ba tháng đầu của thai. Với
mục đích phân tích karyotyp, tua rau sinh thiết có thể được sử dụng để nuôi
cấy ngắn hạn qua đêm, nuôi cấy kinh điển (1 - 2 tuần) hoặc phân tích NST
trực tiếp. Phương pháp phân tích NST trực tiếp hoặc nuôi cấy ngắn hạn qua
đêm cho kết quả trong vài giờ hoặc 1 ngày tuy nhiên phương pháp này cho kỹ
thuật băng kém nên ít
được sử dụng[25].
14

Hạn chế của kỹ thuật sinh thiết tua rau là tỷ lệ sẩy thai cao hơn, tăng
0,8% so với chọc hút dịch ối kinh điển. Theo nghiên cứu của Dunn K.L.,
Golmilow L., tỷ lệ sẩy thai của sinh thiết tua rau là 1,9 - 2,1%. Một trong
những hạn chế khác của sinh thiết tua rau là tình trạng khảm do lẫn tế bào mẹ
hoặc sự phát triển quá nhanh của tế bào cytotrophoblast của rau[25].
+ Chọc hút máu cuống rốn (Percutaneous Umbilical Blodd Sampling):
Được thực hiện t
ừ tuần thai thứ 18 bằng cách đưa một cây kim vào
cuống rốn dưới sự hướng dẫn của siêu âm. Tỷ lệ sẩy thai là khoảng 1 đến 2%
cao hơn so với phương pháp chọc ối. Vì vậy ngày nay, chọc hút máu cuống
rốn chỉ áp dụng chẩn đoán các bệnh về máu.
+ Kỹ thuật PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis)
Kỹ thuật này được áp dụng cho những phôi thai hành thành từ phương
pháp thụ tinh trong ống nghiệm nhằm giúp việ

c chọn lọc phôi không bị rối
loạn di truyền (loạn dưỡng cơ Duchenne, xơ nang tụy, hội chứng Down,…)
trước khi cấy phôi vào tử cung .
1.3.1.2. Lấy mẫu không xâm phạm thai
Hiện nay, các nhà khoa học đang quan tâm đến phương pháp lấy mẫu
thai nhi bằng phương pháp không xâm phạm thai. Phương pháp lấy mẫu
không xâm phạm thai giúp tránh được nguy cơ có thể xảy ra đối với thai và
đối với người mẹ. Có hai phương pháp lấy mẫu không xâm phạ
m thai đó là:
+ Thu thập tế bào thai nhi từ máu mẹ.
+ Tách DNA thai nhi tự do lưu hành trong máu người mẹ.
1.3.2 Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào:
Các mẫu tế bào ối và tế bào tua rau sẽ được tiến hành xét nghiệm NST
theo phương pháp nuôi cấy tế bào kinh điển.
1956 Tjio và Levan đã xác định được chính xác số lượng NST người là
46 bằng kỹ thuật nuôi cấy lympho máu ngoại vi. Có 2 phương pháp xét
15

nghiệm NST: phương pháp trực tiếp và phương pháp nuôi cấy. Trong phương
pháp nuôi cấy gồm: phương pháp nuôi cấy ngắn hạn (24h) áp dụng cho những
mô phân chia mạnh và phương pháp nuôi cấy dài hạn (48 - 72h) áp dụng cho
những mô phân chia kém hoặc không phân chia (trong môi trường nuôi cấy
có bổ sung chất kích thích PHA- phytohemagglutinin)[20].
Trước năm 1970 kỹ thuật nhuộm giêmsa thông thường chủ yếu phát
hiện rối loạn số lượng NST. Tuy nhiên, các nhà di truyền tế bào cũng chưa thể
xác định được chính xác t
ừng chiếc, đặc biệt là những biến đổi về hình thái,
cấu trúc của các NST trong cùng một nhóm.
Sau năm 1970 kỹ thuật nhuộm băng G và băng R đã được phát hiện và
ứng dụng trong việc xác định NST[22]. Phương pháp nhộm băng G cho phép

xác định được các vùng của từng NST, các rối loạn của NST: Trisomy, đứt
đoạn, Trisomy từng phần. Mặc dù hiện nay đã phát triển kỹ thuật băng G với
độ phân giải cao nh
ưng vẫn chưa phát hiện được những rối loạn NST như
nhân đoạn, mất đoạn nhỏ.
Đối với băng R, mục đích và ý nghĩa sử dụng cũng giống như với băng
G, chỉ khác là hình ảnh các băng đậm nhạt ngược với băng G. Hai phương
pháp nhuộm đều có giá trị như nhau trong việc phát hiện rối loạn cấu trúc NST,
tuy nhiên trong một số trườ
ng hợp người ta có thể kết hợp cả hai phương pháp
nhuộm để có hiệu quả hơn trong việc pháp hiện các rối loạn cấu trúc NST.
1.3.3. Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền tế bào - phân tử:
Từ cuối những năm 80 kỹ thuật FISH (Fluorescent in situ
hybridization) đã được ứng dụng rộng rãi trên thế giới để xác định những bất
thường NST, đặc biệt là những rối loạ
n nhỏ. Đây là một kỹ thuật đặc biệt có ý
nghĩa trong chẩn đoán trước sinh vì nó có thể thực hiện trên nhân tế bào gian
kì, không cần thời gian nuôi cấy, vì vậy cho kết quả sau một thời gian ngắn
(24 - 48h), đáp ứng được yêu cầu cấp thiết của chẩn đoán trước sinh. Mẫu tế
bào ối có thể được lấy sớm từ tuần thứ 12 [28], [30], [32].
16

Kỹ thuật FISH sử dụng một trình tự ngắn của chuỗi DNA sợi đơn, gọi
là DNA dò (các DNA dò này được đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ hoặc
bằng phương pháp hóa học). Các DNA dò sẽ được lai với trình tự của DNA
trên tiêu bản NST ở kì giữa, đầu kì giữa hoặc gian kì. Qua sự lai của DNA dò
với trình tự bổ sung, ta có thể phát hiện và định vị được trình tự ấy qua phân
tích dưới kính hiể
n vi huỳnh quang [5], [17].
Kỹ thuật FISH có những hạn chế như: giá thành của kỹ thuật cao hơn

nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy thông thường. Kết quả phụ thuộc vào chất
lượng cũng như số lượng DNA mẫu, sự chuẩn bị tiêu bản và khả năng nhận
biết màu sắc tín hiệu huỳnh quang của người đọc kết quả, có thể có hiện
tượng âm tính giả
. Mặt khác kỹ thuật FISH đòi hỏi thiết bị và chuyên môn cao
nên không thể triển khai rộng rãi trên quy mô lớn [9].
1.3.4. Chẩn đoán trước sinh bằng phương pháp di truyền phân tử:
Năm 1993, Manfield lần đầu tiên ứng dụng kỹ thuật QF – PCR
(Quantitative fluorescence – polymerase chain reaction) để xác định bất
thường số lượng NST. Từ năm 1998 đến năm 2001 một số phòng thí nghiệm
ở Anh và Châu Âu đã thực hiện thành công kỹ thuật này trong chẩn đoán
trướ
c sinh bất thường số lượng NST.
1.3.4.1. Nguyên tắc của kỹ thuật QF - PCR:
¾ Khái niệm về STR (short tandem repeat)
STR là đoạn trình tự lặp ngắn từ 2-3 bp, nằm ở các đoạn intron với số
lần lặp lại tùy thuộc vào mỗi cá thể và mỗi vùng khác nhau trên NST, đoạn
STR có tính đa hình rất cao và được phân bố khắp trong bộ gen, số lần lặp lại
đặc trưng cho từng cá thể sẽ di truy
ền cho thế hệ sau.
¾ Nguyên tắc của kỹ thuật QF-PCR
Kỹ thuật QF – PCR sử dụng đoạn mồi có gắn huỳnh quang để khuếch
đại các vùng STR. Các vùng STR được khuếch đại sẽ tạo ra các sản phẩm PCR