LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP: " NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN TRÊN CÁ TRA" ppt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA TH ỦY SẢN

TRẦN THỊ ĐAN THANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ
TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN
TRÊN CÁ TRA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

TRẦN THỊ ĐAN THANH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG
BIỆN PHÁP KIỂM TRA KHÁNG SINH ĐỒ
TRỰC TIẾP TỪ CƠ QUAN BỆNH PHẨM MỦ GAN
TRÊN CÁ TRA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH
ĐẶNG THỤY MAI THY

2009

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


LỜI CẢM TẠ

Trong những năm tháng trên giảng đường đại học những kiến thức được tích
lũy là hành trang quý báu cho tôi trên con đường phát triển nghề nghiệp tương
lai. Vì thế thực hiện luận văn tốt nghiệp chính là sự lựa chọn tốt nhất để tổng
hợp kiến thức trong những năm học của rất nhiều sinh viên trong đó có cá nhân
tơi. Tuy nhiên để có thể hồn thành luận văn ngồi phấn đấu bản thân cịn được
sự ủng hộ từ gia đình và sự tận tâm hướng dẫn của quý thầy cô.
Do vậy đầu tiên tôi muốn gửi những lời biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình đã
ln động viên tơi trong suốt thời gian qua.
Tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ
đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong khoảng thời gian học tập.
Xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cơ Đặng Thị Hồng Oanh và cơ Đặng Thụy
Mai Thy đã tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn cô Bùi Thị Bích Hằng, cơ Trần Thị Tuyết Hoa đã quan
tâm và động viên trong những thời gian qua.
Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ tôi trong
thời gian học tập tại trường.

i
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


TÓM TẮT
Sau khi được phục hồi từ nguồn vi khuẩn trong bộ sưu tập 10 chủng 3B3, E3,
E8, CAF260, T8, A1, CAF255, STL303, CAF258, E223 được kiểm tra kháng
sinh đồ trên 2 loại kháng sinh ampicillin và chloramphenicol. Đồng thời vi
khuẩn cũng được dùng cho thí nghiệm MTT. Kết quả thu được ở cả phương
pháp kháng sinh đồ và MTT đều cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn nhạy với 2
kháng sinh ngoại trừ chủng CAF258, E223 kháng ampicillin và chủng T8
kháng chloramphenicol.
Đề tài cũng tiến hành nghiên cứu thí nghiệm MTT trên mơ thận tươi. Kết quả
thu được cho thấy sau khi sử dụng chloramphenicol mật độ tế bào tồn tại giảm
từ 1-10% so với sử dụng ampicillin. Bên cạnh đó thực hiện thí nghiệm MTT
trên mơ đã giảm được thời gian (còn 1,5 ngày) và hạ giá thành từ 7-8 lần so
với phương pháp kháng sinh đồ.

ii
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ .................................................................................................. i
TÓM TẮT ........................................................................................................ ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... v
Chương I: GIỚI THIỆU .................................................................................. 1
Chuơng II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................... 2

2.1 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra ......................................................... 2
2.2 Bệnh mủ gan .......................................................................................... 2
2.2.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................................. 2
2.2.2 Đường lây truyền ................................................................................... 3
2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý .................................................................................... 3
2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản ......................................... 3
2.3.1 Định nghĩa ............................................................................................. 4
2.3.2 Nguyên tắc phối hợp kháng sinh trong điều trị ..................................... 4
2.3.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh ..................................................... 5
2.3.4 Cơ chế của sự kháng thuốc .................................................................... 7
2.3.5 Những nghiên cứu về kháng sinh trên E.ictaluri................................... 7
2.4 Thí nghiệm MTT ................................................................................... 8
2.4.1 Định nghĩa ............................................................................................. 8
2.4.2 Những điểm đặc trưng của thí nghiệm MTT ......................................... 10
2.4.3 Các nghiên cứu về thí nghiệm MTT ...................................................... 10
CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................... 13
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................... 13
3.2 Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 13
3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu................................................................ 14
3.3.1 Đối tượng thí nghiệm............................................................................. 14
3.3.2 Vật liệu .................................................................................................. 14
3.3.3 Thiết bị ................................................................................................... 14
3.3.4 Hóa chất ................................................................................................. 15
3.4 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 15
3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn Edwardsiella ictaluri............................................... 15
3.4.2 Kháng sinh đồ ........................................................................................ 16
3.4.3 Thí nghiệm MTT ................................................................................... 17
3.4.4 Xử lý số liệu .......................................................................................... 21
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 22
4.1 Kết quả thí nghiệm trên vi khuẩn .......................................................... 22

4.1.1 Kết quả kháng sinh đồ ........................................................................... 22
4.1.2 Kết quả thí nghiệm MTT trên vi khuẩn ................................................. 24
4.1.3 So sánh số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh giữa phương
pháp kháng sinh đồ và thí nghiệm MTT ......................................................... 29

iii
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


4.1.4 So sánh thời gian xác định tính nhạy của kháng sinh giữa thí nghiệm
MTT và phương pháp kháng sinh đồ .............................................................. 33
4.2
Kết quả thí nghiệm trên mơ tươi .......................................................... 34
4.2.1 Sự sai khác giữa mô bệnh và mô bệnh sử dụng kháng sinh .................. 34
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................... 41
5.1 Kết luận.................................................................................................. 41
5.1.1 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo kháng sinh đồ ............. 41
5.1.2 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên vi khuẩn theo thí nghiệm MTT ........ 41
5.1.3 Sự mẫn cảm của kháng sinh trên mơ theo thí nghiệm MTT ................. 41
5.2 Đề xuất ................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 42
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 46

iv
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài......................... 15
Bảng 3.2: Đường kính vịng trịn vơ trùng một số thuốc kháng sinh .............. 16

Bảng 3.3: Sơ đồ bố trí mẫu vi khuẩn vào 7 hàng đầu của đĩa 96 giếng .......... 17
Bảng 3.4: Sơ đồ bố trí mẫu mơ vào đĩa 96 giếng ............................................ 20
Bảng 4.1: Đường kính trung bình vịng vơ trùng của 10 chủng vi khuẩn ....... 22
Bảng 4.2: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh qua phương pháp
kháng sinh đồ ................................................................................................... 23
Bảng 4.3: Sự sai khác của vi khuẩn và vi khuẩn sử dụng kháng sinh qua thí
nghiệm MTT .................................................................................................... 26
Bảng 4.4: Số lượng vi khuẩn tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm
MTT trên vi khuẩn ........................................................................................... 27
Bảng 4.5: Sự sai khác giữa mô bệnh và mơ bệnh sử dụng kháng sinh qua thí
nghiệm MTT .................................................................................................... 36
Bảng 4.6: Số lượng tế bào tồn tại sau sử dụng kháng sinh trong thí nghiệm
MTT trên mơ ................................................................................................... 37

v
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


DANH SÁCH HÌNH

Hình 4.1: Mẫu vi khuẩn & MTT ..................................................................... 25
Hình 4.2: Mẫu vi khuẩn & MTT sau khi ủ 4 giờ ........................................... 25
Hình 4.3: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử
dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ......... 29
Hình 4.4: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử
dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ
......................................................................................................................... 29
Hình 4.5: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 107 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử
dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ......... 30
Hình 4.6: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 107 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử

dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ
......................................................................................................................... 30
Hình 4.7: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử
dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ......... 31
Hình 4.8: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 106 cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh
đồ ..................................................................................................................... 31
Hình 4.9: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 105 cfu/ml còn tồn tại sau khi sử
dụng Ampicillin giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ......... 32
Hình 4.10: So sánh số lượng vi khuẩn ở mật độ 105 cfu/ml còn tồn tại sau khi
sử dụng Chloramphenicol giữa thí nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ
......................................................................................................................... 32
Hình 4.11: Thời gian xác định tính nhạy cảm kháng sinh trên vi khuẩn giữa thí
nghiệm MTT và phương pháp kháng sinh đồ ................................................. 33
Hình 4.12: Mẫu mơ &MTT ............................................................................. 35
Hình 4.13: Mẫu mơ & MTT sau khi ủ 4 giờ ................................................... 35

vi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL
Nafiquaved
MTT
NCCLS
ATCC
E.ictaluri
MIC

MBC
IC50
AM
CH
CK
CB
KS

Đồng Bằng Sông Cửu Long.
Cục Quản lý chất lượng, An toàn vệ sinh và Thú y thủy sản.
(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide).
National Committee for Clinical Laboratory Standards.
American Type Culture Collection
Edwardsiella ictaluri.
Minimum Inhibitory Concentration.
Minimum Bactericidal Concentration.
The half maximal inhibitory concentration.
Ampicillin.
Chloramphenicol.
Cá khỏe.
Cá bệnh.
Kháng sinh

vii
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU
Trong quá trình hội nhập WTO và đồng thời chịu ảnh hưởng do tình hình kinh
tế khó khăn chung của thế giới nhưng xuất khẩu thủy sản Việt Nam vẫn có

những bước đi vững chắc và ổn định. Tháng 7-2008, các doanh nghiệp chế
biến xuất được trên 136.000 tấn thủy sản các loại, đạt kim ngạch gần 476 triệu
USD. Đây là tháng có mức tăng trưởng cao nhất trong 3 năm qua về sản lượng
lẫn giá trị, tạo đà cho xuất khẩu thủy sản về đích (www.atpvietnam.com,
18.11.2008). Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam
(VASEP), 7 tháng đầu năm 2008 xuất khẩu thủy sản cả nước đạt khoảng 2,388
tỷ USD, tăng 20% so cùng kỳ năm ngối, trong đó, sản phẩm cá tra- ba sa
chiếm 31,9%. Riêng tháng 7- 2008, kim ngạch xuất khẩu cá tra, ba sa vào Nga
tăng đến 64 lần so với tháng 7-2007.
Song song với sự phát triển của nghề ni thì vấn đề dịch bệnh ngày càng trở
nên trầm trọng, trong đó tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khá cao
khoảng 61% (Trần Anh Dũng, 2005) và có xu hướng ngày càng tăng. Thiệt hại
do bệnh rất lớn, tỷ lệ cá chết có thể lên đến 90% trên cá tra giống và 50% trên
cá nuôi thương phẩm (Nguyễn Hữu Thịnh, 2007)
Khi bệnh xảy ra, người dân thường sử dụng sản phẩm thuốc thú y- thủy sản
chứa kháng sinh hoặc kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá. Việc sử dụng
kháng sinh bừa bãi, không đúng liều lượng, đôi khi sử dụng với liều lượng
thấp để phòng bệnh dẫn đến dịch bệnh ngày càng diễn biến phức tạp, khó điều
trị hơn, tỷ lệ sống của cá ngày càng thấp (Nguyễn Chính, 2005). Một phương
pháp được sử dụng khá phổ biến hiện nay để xác định các loại kháng sinh và
liều lượng thích hợp trong việc điều trị bệnh mủ gan trên cá tra là phương
pháp lập kháng sinh đồ. Tuy nhiên phương pháp lập kháng sinh đồ truyền
thống đòi hỏi nhiều thời gian để phân lập, ni cấy. Vì vậy đề tài “Nghiên cứu
khả năng ứng dụng biện pháp kiểm tra kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh
phẩm mủ gan trên cá tra” nhằm đánh giá độ tin cậy của biện pháp kiểm tra
kháng sinh đồ trực tiếp từ cơ quan bệnh phẩm mủ gan trên cá tra. Nhờ vào đó
đề xuất việc sử dụng thuốc kháng sinh phù hợp, góp phần tăng năng suất và
sản lượng, hướng đến nghề nuôi cá tra thâm canh bền vững.
Nội dung:
Dùng MTT để ước lượng mật độ vi khuẩn có trong dịch mơ bệnh phẩm và

dịch huyền phù từ khuẩn lạc.
Kiểm tra tính nhạy của vi khuẩn trong 2 biện pháp trên với một số loại kháng
sinh .

1
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình bệnh mủ gan trên cá tra
Phong trào nuôi cá tra tại Việt Nam ngày càng được nhân rộng để phục vụ cho
nhu cầu tiêu thụ trong nước và đặc biệt là xuất khẩu. Từ năm 1996-2006, diện
tích ni cá tra, basa tăng gấp 7 lần; sản lượng tăng 36,2 lần. Tổng diện tích
ni cá tra, cá ba sa trong tồn khu vực ĐBSCL hiện đã lên đến 5.000 ha.
Năm 2001 tổng sản lượng cá tra, cá ba sa của toàn vùng mới chỉ được 110.000
tấn thì đến năm 2006 là 825.000 tấn và dự báo năm 2007 sẽ vượt quá 1 triệu
tấn, bằng sản lượng quy hoạch cho đến năm 2010. Tại TP Cần Thơ, theo dự
báo năm 2007 sẽ tăng thêm khoảng 10% sản lượng sản phẩm cá tra xuất khẩu
(nguồn:www.nafiqaved.gov.vn,14/11/2008). Hiện nay, cá tra đã được xuất
khẩu sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ. Để có sản lượng cao cung cấp cho
xuất khẩu, bên cạnh tăng diện tích ni trồng thì cịn ni thâm canh ở mật độ
cao làm xuất hiện nhiều loại bệnh như đốm trắng nội tạng do Edwardsiella
ictaluri, đốm đỏ do Pseudomonas , bệnh nhiễm huyết do Edwardsiella tarda,
một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra. Theo Lý Thị Thanh Loan (2008) ở
các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long tỉ lệ mủ gan là cao nhất so với các loại
bệnh khác: 52,8%. Tại An Giang bệnh chiếm tỉ lệ cao nhất đạt 66,7%, kế đến
là Cần Thơ: 54,89%; Vĩnh Long 53,8%; Đồng Tháp 36% (www.agriviet.com,
14/11/2008). Cao điểm dịch bệnh thường xảy ra từ tháng 9 đến tháng 12 hằng
năm vào thời kỳ thời tiết chuyển mát (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007); đặc
biệt bệnh xuất hiện không phụ thuộc vào mùa vụ thả giống hay lứa tuổi cá.

Theo Crumlish và ctv (2004) qua phân lập từ 181 mẫu cá tra bệnh thu được
108 dòng vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri). Càng nghiêm
trọng hơn theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) trong
55 mẫu cá tra bệnh phân lập được 97 chủng vi khuẩn thì đã có 47 chủng vi
khuẩn gây bệnh mủ gan.
2.2 Bênh mủ gan
2.2.1 Tác nhân gây bệnh
Fugerson và ctv (2001) đã có cơng trình nghiên cứu đầu tiên mô tả về bệnh mủ
gan trên cá tra nuôi xuất hiện đầu tiên vào cuối năm 1998 ở đồng bằng sông
Cửu Long, Việt Nam. Nguyên nhân gây bệnh được xác định do vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri (Crumlish và ctv, 2002).
Vi khuẩn E. ictaluri lần đầu tiên được phân lập và định danh vào năm 1976
(Hawke, 1979 được trích dẫn bởi Valerie, 1993) thuộc họ Enterbacteriaceae là
vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước 1 x 2- 3μm, khơng sinh bào tử, phản

2
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, khơng oxy hố, lên men trong môi
trường glucose. Vi khuẩn E.ictaluri cho hầu hết các phản ứng âm tính chỉ có 2
phản ứng dương tính là Lysine và Glucose (Crumlish & ctv, 2004).
Edwardsiella ictaluri phát triển chậm trên môi trường BHI, cần 36-48 giờ để
hình thành các khuẩn lạc ở 28-30oC và kém phát triển hay hồn tồn khơng ở
37oC (Valerie và ctv, 1993). Có 1 - 3 plasmid liên kết với E. ictaluri (Speyerer
và Boyle, 1987; Newton và ctv, 1988 được trích dẫn bởi Valerie, 1993). Chức
năng của những plasmid vẫn chưa được xác định rõ nhưng có thể chúng đóng
vai trị quan trọng trong việc đề kháng với kháng sinh (Valerie và ctv, 1993).
2.2.2 Đường lây truyền
Bệnh thường xảy ra nhiều vào mùa mưa lũ kéo dài đến mùa khô. Edwardsella

ictaluri có thể nhiễm cho cá bằng hai đường khác nhau. Vi khuẩn trong nước
có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển
vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não, bệnh lan rộng từ màng não đến
sọ và da (Shotts và ctv, 1986).
E. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá qua niêm mạc ruột vào
máu gây nhiễm trùng máu. Bằng đường này thì vi khuẩn vào mao mạch trong
biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da. Cá còn nhiễm E. ictaluri qua đường
miệng gây nhiễm khuẩn ruột (Shott và ctv, 1986).
2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý
Cá bệnh do nhiễm vi khuẩn E. ictaluri thường thể hiện kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy
yếu , bụng thường chướng to, xung quanh miệng có các đám xuất huyết, gốc
vây xuất huyết, mắt lồi. Giải phẫu bên trong, một số cơ quan nội tạng như gan,
lá lách, thận bị hoại tử tạo thành những đốm màu trắng đục đường kính 0,52,5mm (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).
2.3 Thuốc kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản
Khi bệnh xảy ra trong ao, nông dân thường sử dụng các sản phẩm thuốc thú ythủy sản chứa kháng sinh hoặc kháng sinh nguyên liệu để điều trị cho cá. Tuy
nhiên theo Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) việc sử dụng kháng sinh còn tùy
tiện, khơng đúng về liều lượng và liệu trình điều trị. Nơng dân thường dùng
kháng sinh liều thấp để phịng bệnh cho cá. Vì vậy hiệu quả điều trị kháng
sinh ngày càng giảm và hình thành khả năng kháng thuốc cho vi khuẩn.
Theo Bùi Thị Tho (2003) trong điều trị các bệnh truyền nhiễm nên có chiến
lược sử dụng kháng sinh phù hợp, bao giờ cũng chọn thuốc mà vi khuẩn mẫn
cảm nhất và chỉ nên phối hợp kháng sinh khi bị nhiễm đồng thời nhiều vi
khuẩn hay khi phối hợp sẽ diệt được vi khuẩn kháng thuốc.

3
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


2.3.1 Định nghĩa
Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh

học (do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sản sinh ra) hay do con người tổng hợp
nên, có tác động một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu của sự
biến dưỡng của các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của các nấm (tác nhân
kháng nấm), của các virus (tác nhân kháng virus) (Lê Thị Kim Liên và
Nguyễn Thị Như Ngọc, 2002).
Sự kháng thuốc: tức vi khuẩn gây bệnh không bị ức chế bởi nồng độ thuốc
trong các mô bào (nồng độ này cao hơn nồng độ tác dụng nhưng chưa gây hại
tế bào). Muốn ức chế các vi khuẩn gây bệnh này cần phải dùng nồng độ thuốc
cao hơn (tức liều gây đôc hại tế bào). Trong lâm sàng tuyệt đối không được
dùng các thuốc đã bị vi khuẩn kháng lại để điều trị, khi đó bệnh khơng những
khơng khỏi mà động vật còn chết do độc lực của thuốc (Bùi Thị Tho, 2003).
2.3.2 Nguyên tắc phối hợp kháng sinh trong điều trị
Theo Bùi Thị Tho (2003) có những cơ sở khoa học để xem xét, phối hợp các
thuốc kháng sinh:
a. Dựa trên cơ sở chắc chắn của cơ chế tác dụng
- Sự diệt khuẩn
• Do các chất dinh dưỡng ra khỏi màng tế bào vi khuẩn trong khi vi
khuẩn đang cần phải nhân lên với tốc độ nhanh để gây bệnh
• Do thay đổi tính thấm của màng tế bào
• Các thuốc có tác dụng diệt khuẩn: Ampicillin, vancomycin,
Penicillin…
- Kìm khuẩn
• Do ức chế sinh tổng hợp protein, acid nucleic và chuyển hóa nội bào
của vi khuẩn
• Do vi khuẩn mất cơ chế tự bảo vệ
• Các thuốc có tác dụng kìm khuẩn: Chloramphenicol, tetracycline,
erythromycin, sulfonamid.
b. Sử dụng kháng sinh đúng nguyên tắc hay tuân theo các chỉ định khi
phối hợp kháng sinh:
• Các thuốc ức chế và tiêu diệt vi khuẩn có thể có tác dụng đối kháng, tác

dụng cộng hay tác dụng độc lập.

4
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


• Đối kháng không phải nguyên nhân giữa các thành viên khi phối hợp
(ức chế hay diệt khuẩn).
• Phối hợp những kháng sinh ức chế vi khuẩn chưa bao giờ có tác dụng
hiệp đồng, cộng và độc lập.
• Phối hợp các kháng sinh diệt khuẩn có thể có tác dụng hiệp đồng, cộng
và độc lập.
• Phối hợp điều trị chỉ sử dụng theo chỉ định: nhiễm trùng hỗn hợp, vi
khuẩn hồn tồn kháng thuốc hay đề phịng sự xuất hiện các chủng vi
khuẩn kháng thuốc.
Các phối hợp đã được công nhận có tác dụng tốt trên lâm sàng (Bùi Thị
Tho, 2003):
Ø Chloramphenicol/Gentamicin
Ø Lincomycin/Eythromycin
Ø Chloramphenicol/Ampicillin
Ø Ampicillin/Streptomycin
Ø Ampicillin/Gentamicin
Ø Lincomycin/Streptomycin
2.3.3 Tình hình sử dụng thuốc kháng sinh
Theo Benbrook (2002) tất cả các loại thuốc sử dụng trong nuôi trồng thủy sản
phải được sự phê chuẩn của Trung tâm Thuốc thú y thuộc FDA và hầu hết các
loại kháng sinh được dùng cho cá đều có bổ sung thêm vào cơng thức thức ăn.
Tuy nhiên lượng kháng sinh đó chỉ được cá hấp thụ 75% cịn lại thì vào mơi
trường nước (Goldburg & Triplett, 1997 được trích dẫn bởi Benbrook, 2002).
Có 5 loại thuốc được phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản tại Mĩ, trong đó

có 3 loại kháng sinh: oxytetracycline HCL (Terramycin 10), sulfamerazine và
sự kết hợp giữa sulfadimethozine và ormetoprim (Romet- 30) (Benbrook,
2002). Theo thống kê của NAHMS (1997) tổng lượng kháng sinh sử dụng trị
bệnh ESC (Enteric Septicemia of Catfifh) hàng năm cho cá da trơn khoảng
126.000- 252.000 pound (57.000-115.000 kg); mặc dù đã sử dung thuốc đặc
hiệu nhưng sản lượng cá vẫn thiệt hại ở mức cao 60%.
Bên cạnh đó trong kết quả điều tra gần đây của Benbrook (2002) người nuôi
đã sử dụng kháng sinh 2 hoặc 3 lần trong thời gian nuôi và mỗi lần sử dụng
vài pound cho các bệnh thường gặp trên cá da trơn, trong đó bệnh ESC chiếm
78,1% và các loại kháng sinh thường sử dụng: oxytetracycline HCL, Romet5
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


30. Mặc dù đã có một số trường hợp kháng thuốc xảy ra nhưng kháng sinh
vẫn là phương pháp chữa trị hàng đầu cho những bệnh truyền nhiễm vi khuẩn
(McGeer, 1998 được trích dẫn bởi Gibbs et al, 2006).
Nhóm Macrolid: đây là những kháng sinh có tác động làm kìm khuẩn ở nồng
độ trong huyết tương. Tuy nhiên ở mô nồng độ thường cao hơn và có hiệu lực
diệt khuẩn. Thuốc khơng có hiệu lực đối với phần lớn các vi khuẩn gram âm,
tác động chủ yếu trên cầu khuẩn gram dương (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn
Thị Như Ngọc, 2002). Trong đó các chất thường được sử dụng phổ biến trong
thủy sản: Erythromycin, Spiramycin, Traleandomycin
Nhóm Tetracycline: thuốc có phổ kháng khuẩn rất rộng cho cả vi khuẩn gram
âm và gram dương, có tác động kìm khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở
nồng độ cao. Đại diện và thông dụng trong nuôi trồng thủy sản là Tetracyclin,
Chlotetracyclin và Oxytetracyclin.
Nhóm Quinolon: có tác dụng diệt khuẩn , làm mất hoạt tính enzyme DNA
gyrase vì thế gây ức chế tổng hợp DNA. Đặc biệt với Fluoroquinolon hoạt tính
kháng khuẩn vừa nhanh, vừa mạnh, đặc biệt phổ kháng khuẩn cũng đã được
mở rộng với cả vi khuẩn gram âm và gram dương (Edwardsiella, Aeromonas,

Pseudomonas ngoại trừ norfloxacin (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như
Ngọc, 2002).
Nhóm Aminosid: có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết vi khuẩn gram âm
và một số vi khuẩn gram dương hiếu khí, ít tác dụng đối với vi khuẩn kỵ khí vì
aminoasid thấm qua màng tế bào vi khuẩn một phần nhờ hệ thống vận chuyển
hoạt động phụ thuộc vào oxygen nên vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối khơng chịu tác
động của Aminosid (Trần Thị Thu Hằng, 2006).
Nhóm Phenicol: là những kháng sinh kìm khuẩn, phổ kháng khuẩn rộng và
khả năng phân tán tốt vào các mô cơ thể. Cloramphenicol rất được ưa chuộng
trong trị liệu. Tuy nhiên từ 1950 sự phát triển độc tính đáng kể trên cơ quan
tạo máu đã giới hạn việc sử dụng kháng sinh này (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn
Thị Như Ngọc, 2002) và hiện nay lại cấm sử dụng trong thú y do phát hiện
được những tác hại của thuốc: gây suy tủy, tỷ lệ quái thai cao, gây dị ứng…
Đặc biệt nếu dùng thường xuyên để điều trị bệnh cho động vật sẽ rất nguy hại
do chúng để lại tồn lưu các sản phẩm dùng làm thức ăn cho người từ động vật
(Bùi Thị Tho, 2003).

6
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


2.3.4 Cơ chế của sự kháng thuốc
Theo Dixon (2007) cho rằng một dịng vi khuẩn đã kháng kháng sinh có thể
truyền gen kháng thuốc là plasmid và hiện tượng kháng thuốc có nguy cơ xảy
ra ở hầu hết các loại kháng sinh đã dùng trong nuôi trồng thủy sản. Hiện tượng
kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu được tác động
của các loại kháng sinh. Các gen kháng thuốc thường có sẵn trong các loài vi
sinh vật tạo ra kháng sinh nhằm bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng
sinh này (Ricki, 1995).
2.3.5 Những nghiên cứu về kháng sinh trên E. ictaluri

Một số phương pháp xác định mật độ vi khuẩn thông dụng
Theo Geert Huys, 2002 hiện nay có 2 phương pháp thường được sử dụng xác
định mật độ vi khuẩn.
Thứ nhất: Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu
quang phổ
Nuôi tăng sinh: vi khuẩn sau khi phục hồi và tách ròng cho đến thuần dùng
que cấy tiệt trùng lấy 2-3 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 30ml NB tiệt
trùng, sau đó đặt lên máy lắc 200 vịng/phút 18-24h. Sau 24h chuyển vi khuẩn
sang ống falcol 50ml tiệt trùng và ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Ly
tâm xong loại bỏ phần dung dịch phía trên và rửa vi khuẩn bằng nước muối
sinh lý, quá trình ly tâm được lặp lại 2-3 lần cho đến lần ly tâm cuối; loại bỏ
dung dịch phía trên và cho 25ml dung dịch NB vào, trộn đều bằng máy vortex.
Xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ bước sóng 590nm.
Thứ hai: Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn dựa vào ống chuẩn
McFarland số 3 (9x10 8 cfu/ml):
Vi khuẩn sau khi phục hồi tiến hành tách ròng cho đến thuần. Dùng que cấy
tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho vào 10ml nước muối sinh lý đã tiệt trùng. Trộn
đều và so sánh độ đục với ống McFarlant số 3 (9,7ml H2SO4 1% & 0,3ml 1%
BaCl2). Quan sát nếu độ đục thấp hơn ống chuẩn thì cho thêm khuẩn lạc vào
ống nghiệm cho đến khi độ đục tương đương với ống chuẩn McFarlant. Khi
đó mật số vi khuẩn trong ống nghiệm khoảng 9x108cfu/ml.
Một số kết quả nghiên cứu kháng sinh trên E .ictaluri

7
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


Crumlish & ctv (2002) ghi nhận các chủng E. ictaluri phân lập trên cá tra ở
Việt Nam nhạy cảm hoàn toàn với amoxycillin, florfenicol. E. ictaluri được
phân lập từ cá nheo Mỹ cũng hoàn toàn nhạy cảm với florfenicol. Ngoài ra vi

khuẩn E. ictaluri trên cá tra còn kháng với một số loại thuốc kháng sinh
oxytetracylin, oxolinic acid, sulphonamid (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).
Bên cạnh đó theo Nguyễn Thanh Phương và ctv (2005), 13 chủng E. ictaluri
phân lập trên cá tra tại ĐBSCL đều kháng với oxytetracylin, oxolinic acid và
sulphonamid. Vẫn trên đối tượng E. ictaluri theo Cao Tuấn Anh và ctv
(2006) kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 17 loại kháng sinh trên 8 chủng vi
khuẩn thì tất cả đều nhạy với doxycilin, ofloxacin và kháng với 15 loại kháng
sinh còn lại norfloxacin, oxolonic acid, pefloxacin, colistin, streptomycin,
cefipime,
sulfamethoxazole/trimethroprime,
cetriaxone,
cefazolin,
gentamycin, aztreonam, cefixime, cefotaxime, oxytetracylin và amoxicillin.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thịnh và ctv (2007) 100% chủng E. ictaluri
phân lập được đều đề kháng với sulfamethoxazole, gần như tuyệt đối với
Colistin (97,9%); và tác giả đã nhận xét Edwardsiella ictaluri còn kháng với
các lọai kháng sinh như sau: florphenicol (42,5%), amoxicilin (40,4%),
tetracyclin (31,9%), doxycyclin (27,7%). Cùng với thời gian đó, Huỳnh Chí
Thanh (2007) đã tiến hành nghiên cứu sự mẫn cảm của E. ictaluri phân lập từ
cá tra tại An Giang , nhận thấy rằng vi khuẩn mẫn cảm cao với kháng sinh
cefazoline, doxycilin, cefalexin; kháng với amoxicillin, aztreonam,
sulfamethoxazole/ trimethroprime, streptomycin, oxolinic acid, gentamycin và
mẫn cảm trung bình với enrofloxacin, ofloxacin, norfloxacin, pefloxacin.
Ngoài ra, theo kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của vi khuẩn E. ictaluri gây
bệnh trên cá tra (chủng E223) của Tiết Ngọc Trân (2007) cho rằng vi khuẩn
nhạy với ofloxacin, cefazolin, doxycylin và ceferime (đường kính vịng trịn
vơ trùng > 16mm). Riêng đối với sulfamethoxazole/ trimethroprime và
streptomycine thì dịng 223 có dấu hiệu kháng thuốc (đường kính vịng trịn vơ
trùng là 10mm và 11mm). Tiếp theo những nghiên cứu về kháng sinh đồ trên
chủng vi khuẩn E223, Nguyễn Thị Thúy Hằng (2008) nhận xét rằng vi khuẩn

nhạy với hầu hết các loại kháng sinh: cefixime, doxycylin, cefalexin,
ofloxacin, amoxicillin và pefloxacin.
2.4. Thí nghiệm MTT
2.4.1. Định nghĩa
Theo Mosmann (1983), người đã nghiên cứu thành công kỹ thuật tạo màu thí
nghiệm MTT dựa trên khả năng khử hidro trên ti thể của tế bào sống, nhằm
tách tetrazolium đã làm xanh xám màu vàng của MTT và tạo nên tinh thể
8
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


formazan màu xanh đen. Tinh thể này sẽ ngăn cản sự thấm nước của màng tế
bào, vì thế các sự tích tụ vẫn cịn bên trong các tế bào khỏe. Sau đó chất tẩy
được cho vào để có thể hịa tan các tinh thể tạo thành. Số tế bào tồn tại tương
ứng với lượng formazan sinh ra.
Trong khi đó theo Wikipedia (www.en.wikipedia.org, 1/12/2008) thí nghiệm
MTT là phương pháp kiểm tra và phân tích trong phịng thí nghiệm bằng một
thiết bị đo màu chuẩn (phân tích phạm vi thay đổi màu sắc) làm tiêu chuẩn để
đánh giá hoạt động của những enzim khử MTT tạo formazan màu tía. Hiện
tượng này chủ yếu xảy ra ở ty thể vì thế những thí nghiệm này là tiêu chuẩn để
đánh giá hoạt động của ty thể trên quy mơ lớn. Cũng có thể được sử dụng để
xác định độc tố tiềm tàng bên trong các tác nhân có đặc tính chữa bệnh và
những vật liệu có độc tố khác. Từ đó các tác nhân trên sẽ cho kết quả về các tế
bào có đặc tính độc gây sự hoạt động bất thường của ty thể, làm giảm kết quả
phân tích.

Theo ATCC ( , 1/12/2008) thí nghiệm MTT là phương
pháp thuận lợi để ước lượng mật độ tế bào đồng thời là công cụ quan trọng
cho nhiều lĩnh vực nghiên cứu rộng lớn. Trong thí nghiệm MTT, muối
tetrazolium vàng được biến đổi trong hoạt động chuyển hóa của tế bào hình

thành tinh thể formazan khơng tan màu tía. Sau đó tinh thể này sẽ được hịa
tan khi cho chất tẩy vào. Màu sắc sau đó sẽ được định lượng bởi máy đo phổ.
Ở mỗi loại tế bào, sẽ thiết lập nên mối quan hệ tuyến tính giữa số tế bào và
khả năng hấp thu, vì thế giúp xác định số lượng thay đổi trong tăng trưởng
chính xác và trung thực. Một trong số những ứng dụng cho phương pháp này
là xác định khả năng nhạy của thuốc, độc lực, phản ứng lại các yếu tố tăng
trưởng và hoạt động tế bào.

9
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


2.4.2. Những điểm đặc trưng của thí nghiệm MTT
Theo ATCC ( ) thí nghiệm MTT có những ưu điểm sau:

-

Tính ứng dụng cao: phương pháp này đã được áp dụng rông rãi trong
nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau.

-

Sự đo lường chính xác: phép đo phổ có thể phát hiện những sự thay đổi
rất nhỏ trong sự chuyển hóa của tế bào, nhạy hơn rất nhiều so với sự
nhuộm màu bằng trypan blue.

-

Thuốc thử an tồn: khơng cần trữ và kích hoạt các chất phóng xạ bằng
tay.

-

Dễ sử dụng: thao tác tương đối đơn giản và sử dụng những thiết bị có
sẵn trong hầu hết các phịng thí nghiệm.

-

Thao tác nhanh: thí nghiệm hoạt động trên đĩa 96 giếng và đọc kết quả
bằng máy microtitre plate reader, cho phép đưa một số lượng lớn mẫu
vào trong quá trình thực hiện.

-

Lưu trữ thuận lợi: bộ kit ổn định trong 18 tháng khi trữ vào tủ lạnh
trong tối.

2.4.3. Các nghiên cứu về thí nghiệm MTT
Mshana (1998) đã sử dụng MTT để nghiên cứu khả năng kháng rifampin của
Mycobacterium tuberculosis. Cho 40 µl dung dịch vi khuẩn vào mỗi giếng và
thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau đó cho 10µl dung dịch MTT vào mỗi giếng
và đem ủ 4 giờ ở 37oC. Tiếp theo cho 50 µl dung dịch lysing buffer (20%
sodium dodecyl sulfate trong 50%N1N- dimethylformamide; pH 4,7) vào mỗi
giếng và ủ qua đêm. Sự hấp thu được đo bằng máy đo tự động khả năng hấp
thu miễn dịch liên kết enzim ở bước sóng 570nm. Kết quả phát hiện được khả
năng kháng rifampin của Mycobacterium tuberculosis. Trong đó thí nghiệm đã
thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa mật độ vi khuẩn đã có và sự giảm MTT,
nếu vi khuẩn chết thì khơng có khả năng làm giảm MTT.
Nhiều nghiên cứu về sau đã sử dụng MTT để xác định hàm lượng độc tố trên
các tác nhân gây bệnh. Tiêu biểu là thí nghiệm của Zorrilla (2001) đã sử dụng

MTT để ước lượng độc tố ECPs (sản phẩm ngoại bào) của nhiều tác nhân gây
bệnh có kích thước nhỏ trên cá vền biển (Sparus aurata L). Kết quả thu được
phụ thuộc vào thời gian ủ nhưng khả năng tối ưu nhất để xác định độc tố gây

10
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


hủy hoại 5000 tế bào cá trên mỗi giếng là ủ ở 25oC trong 4-5 ngày, và thời
gian ủ với MTT là 5h. Kết quả khả năng gây độc ECP của các chủng vi khuẩn
khác nhau đều được ước lượng bởi MTT.
Bên cạnh đó Freimoser (1999) cho rằng phương pháp sử dụng thiết bị đo màu
để xác định mật số tế bào bằng cách dùng MTT chính xác và tiết kiệm thời
gian hơn so với việc đếm mẫu máu truyền thống. Một phương pháp khởi đầu
cho việc phát triển một phép phân tích nhanh về sự sinh trưởng và tồn tại tế
bào lympho của động vật hữu nhũ dựa trên sự biến đổi và sự xác định số
lượng của MTT bằng thiết bị đo màu. Tổng số tinh thể có thể được xác định
bằng phép đo phổ từ đó dẫn đến xác định số lượng tế bào sống trong mẫu.
Những điểm đặc trưng này có thể mang đến thuân lợi trong việc phân tích độc
tố hay sự sinh sơi của tế bào, được sử dụng rộng rãi trong miễn dịch học, độc
chất học, sinh học phân tử.
Theo Freimoser (1999) thuận lợi của MTT là phương pháp chính xác, mức độ
tin cậy cao và tiết kiệm được ít nhất 80% thời gian tiến hành thí nghiệm. Đặc
biệt phương pháp MTT có thể xác định mật số tế bào trong thể tích nuôi rất
nhỏ. Cũng cùng nhận xét về ưu điểm của MTT, Zorrilla (2001) cho rằng
phương pháp này giúp việc xác định số lượng và so sánh khách quan về nồng
độ gây độc của các sản phẩm ngoại bào trên các vi sinh vật gây bệnh cho cá.
Vì thế kết quả thu được chính xác hơn so với phương pháp đếm truyền thống
với trypan blue.
Ngoài những ưu điểm trên theo Caviedes (2002) sử dụng MTT để xác định sự

mẫn cảm của kháng sinh cịn giảm được giá thành trong q trình tiến hành thí
nghiệm; tác giả cho rằng kiểm tra khả năng đề kháng kháng sinh của mỗi
chủng Mycobacterium tuberculosis cần 7,54$ nếu sử dụng Alamar Blue,
nhưng với MTT giá thành giảm cịn 5,04$.
Ứng dụng những thành cơng trong các nghiên cứu trước đây về thí nghiệm
MTT, Schrader (2006) cũng đã tiến hành thí nghiệm trên đĩa 96 giếng, tìm
hiểu về khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên
cá da trơn và Flavobacterium columnare. Tác giả nhận xét rằng trước đây các
lọai thức ăn thủy sản thường được tẩm các kháng sinh như oxytetracycline,
sulfadimethoxine/ormetoprim; đến năm 2005 florfenicol lại được xem như
một loại kháng sinh có hiệu quả trong việc điều trị bệnh ESC trên cá trơn. Tuy
nhiên do lạm dụng thuốc kháng sinh dẫn đến đã tồn lưu các chất độc hại ảnh
hưởng đến môi trường nước và sức khỏe con người. Vì vậy MTT đựơc xem
như hóa chất có thể đánh giá hiệu quả sử dụng kháng sinh cá da trơn, khi đó
sự phát triển của vi khuẩn sẽ được đánh giá thông qua mật độ hấp thu. Sau khi

11
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


cho MTT vào và ủ 24 giờ, Schrader đã dùng bước sóng 570nm để xác định
mật độ tế bào tồn tại. Qua việc tạo tinh thể formazan đã xác định được giá trị
MIC, MBC, IC50 nhờ vào các số liệu về khả năng hấp thu. Kết quả IC50 (24
giờ) từ thí nghiệm kết hợp kháng sinh được so sánh với đối chứng vi khuẩn
chỉ sử dụng oxytetracycline , florfenicol. Cùng nhận xét như các tác giả trước
đây, Schrader cho rằng phương pháp này thực hiện nhanh, chính xác và mang
lại giá trị kinh tế do có thể thực hiện thí nghiệm được nhiều mẫu.
Cũng vẫn trên nghiên cứu về MTT, Mashhadian (2007) cho rằng môt trong số
những phương pháp sinh hóa xác định mật số tế bào sống trong mơi trường
ni cấy thì phương pháp MTT được sử dụng rộng rãi nhằm xác định hàm

luợng độc tố trong tế bào. Trong nghiên cứu này, Mashhadian đã tiến hành
trên kháng sinh rifampin được sử dụng trị bệnh lao phổi cho con người. Khác
với những thí nghiệm trước đây, HepG2 (tế bào gây ung thư gan) được nuôi
trong đĩa 96 giếng với mật độ 1000 tế bào/ giếng, ủ với 5% CO2 ở 37oC. Sau
24 giờ Rifampin được thêm vào cho đến khi đạt được nồng độ cuối cùng 5, 10,
2, 50 và 100µM; tiếp tục ủ 48 giờ. Trong thí nghiệm này lượng MTT dùng cao
hơn , 20 µl (5mg/ml) cho mỗi giếng. Các giếng vẫn được ủ 4 giờ (37o C). Sau
đó cho tiếp vào 200 µl dung mơi DMSO (dimethylsulfoxide) và 20 µl glycine,
ủ tiếp ở nhiệt độ phịng trong 30 phút. Kết quả rifampin không làm giảm nhiều
tế bào ở nồng độ 5µM nhưng lại làm giảm tế bào ở các nồng độ cịn lại. Khi
đó số lượng tế bào giảm 12,32%, 37,58%, 55,63% và 77,62% tương ứng ở các
nồng độ 5, 10, 2, 50 và 100µM.
Ngồi ra MTT còn được sử dụng khá phổ biến trong y học, theo nghiên cứu
Trần Quang Tuấn và ctv (www.cimsi.org.vn, 18/11/2008) về mơ hình và
chiều hướng đáp ứng miễn dịch ở bệnh nhân sẩy thai liên tiếp, các tác giả đã
sử dụng chứng nghiệm chuyển dạng lympho bào để đánh giá khả nǎng hoạt
động của tế bào lympho cũng như khả nǎng và chiều hướng đáp ứng miễn
dịch của bệnh nhân.
Trong nghiên cứu của Trần Quang Tuấn đã sử dụng nguyên lý đánh giá kết
quả chuyển dạng lympho bào máu ngoại vi theo phương pháp MTT, áp dụng
kỹ thuật tạo màu do Mosmann mô tả nǎm 1983 và cải tiến theo phương pháp
của Denziot nǎm 1986 với nguyên lý: muối tetrazolium (MTT) màu vàng
được chuyển hóa trong ti thể của tế bào sống tạo thành sản phẩm formazan,
tạo ra tỉ lệ thuận giữa q trình chuyển hóa tế bào và số lượng tế bào đang hoạt
động. Tế bào lympho trong máu của bệnh nhân được nuôi cấy với mật độ 105
tế bào lympho trong 100ml mơi trường khơng có mặt PHA hoặc có mặt PHA
với nồng độ 7,5m g/ml. Sau 48 giờ thêm MTT để có nồng độ cuối cùng là
12
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

1mg/ml và ủ trong 3 giờ. Cuối giai đoạn ủ, loại bỏ mơi trường bằng ly tâm.
Sau đó cho vào mỗi giếng 50ml isopropanol, toàn bộ phiến được lắc mạnh để
hịa tan tồn bộ chất màu formazan do tế bào tạo ra. Kết quả thu được (tính
theo chỉ số OD) đã so sánh khả nǎng hoạt động của tế bào lympho giữa các
nhóm nghiên cứu.

13
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
-

Thời gian: từ tháng 1- 5/2009.

-

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ mơn Sinh học & Bệnh thủy sản.

3.2 Nội dung thực hiện
-

Phục hồi vi khuẩn từ nguồn vi khuẩn liệt kê ở Bảng 3.1

-

Thực hiện kháng sinh đồ 10 chủng vi khuẩn Bảng 3.1 (so sánh mật độ

vi khuẩn với ống McFarland 1, mật độ vi khuẩn khoảng 3x108 cfu/ml)

-

Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩn trong dịch huyền phù từ khuẩn
lạc.

-

Dùng MTT ước lượng mật độ vi khuẩntrong dịch mô bệnh phẩm (cá
bệnh).

-

So sánh hiệu quả sử dụng kháng sinh giữa phương pháp kháng sinh đồ
và thí nghiệm MTT trên vi khuẩn và mơ tươi (cá bệnh).

3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
3.3.1 Đối tượng thí nghiệm
-

Cá tra từ các đề tài nghiên cứu gây cảm nhiễm bệnh mủ gan.

3.3.2 Vật liệu
-

Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn.

-

Ống nghiệm, ống đong, đĩa petri, lame, lamella.

-

Chai nấu mơi trường, bình tam giác.

-

Cá từ, , hộp đầu col, cối nghiền mẫu, cân, bộ tiểu phẫu.

-

Que trãi thủy tinh.

3.3.3 Thiết bị
-

Kính hiển vi.

-

Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy.

-

Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng.

-

Micropipette, microplate, máy microplate reader.

14
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


3.3.4 Hóa chất
-

Cồn 70o, cồn 96o

-

NaCl, nước cất, H2SO4, BaCl2 .

-

Isopropanol,
HCl,
MTT
diphenyltetrazolium bromide).

-

Môi trường phục hồi và nuôi cấy vi khuẩn: Nutrient agar (NA).

-

Kháng sinh: ampicilin (AM), choramphenicol (CH) .

-

Đĩa kháng sinh: ampicillin, chloramphenicol.

(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sử dụng nghiên cứu từ bộ sưu tập vi khuẩn
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri sử dụng nghiên cứu từ bộ sưu tập vi khuẩn của
Bộ môn Sinh học & Bệnh thủy sản. Vi khuẩn được cấy trên môi trường
Nutrient Agar, ủ 48 giờ ở 28-300C. Cho vi khuẩn vào 3 ml nước muối sinh lý
(0.85% NaCl). So sánh mật độ vi khuẩn với ống chuẩn McFarland 1 (mật độ
3x108 cfu/ml) tiến hành pha loãng vi khuẩn ở các mật độ 105, 106, 107và 108
cfu/ml (thí nghiệm MTT). Tương tự, cho vi khuẩn vào 2 ml nước muối sinh
lý. So sánh mật độ vi khuẩn với ống chuẩn McFarland 1 (mật độ 3x108 cfu/ml)
(kháng sinh đồ).

Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn sử dụng cho đề tài
STT

Mã
PTN

Địa điểm

Cơ quan phân
lập

1
2

3
4
5
6
7
8
9
10

3B3
E3
E8
CAF260
T8
A1
CAF255
STL303
CAF258
E223

Ơ Mơn- Cần Thơ
Ơ Mơn- Cần Thơ

Thận
Thận

Châu Phú
Thốt Nốt- Cần Thơ
Hậu Giang
Châu Phú

Thận
Thận
Thận
Thận

Châu Phú
Chủng tham khảo (Từ Thanh Dung, 2002)

Tỳ tạng

15
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version


3.4.2 Kháng sinh đồ
-

Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường TSA và tách ròng để đạt được
vi khuẩn thuần.

-

Kiểm tra độ thuần của vi khuẩn bằng cách nhuộm gram, sau đó cho
khuẩn lạc vào 3ml dung dịch nước muối sinh lý sao cho mật độ vi
khuẩn tương đương với ống chuẩn McFarland 1.

-

Cho 100 µl dung dịch vi khuẩn mật độ tương đương ống chuẩn

McFland 1.

-

Dùng que trãi tiệt trùng trãi đều dung dịch trên mặt thạch, ủ khoảng 1-2
phút.

-

Dùng pel tiệt trùng dán các đĩa kháng sinh lên mặt thạch. Khoảng cách
giữa các đĩa kháng sinh 24mm, giữa vành đĩa Petri và đĩa kháng sinh
10-15mm (Lila và Eleonor, 2004)

-

Ủ 24-48 giờ ở 28-300C.

-

Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vịng vơ trùng (mm).

-

Đường kính vịng trịn vơ trùng đuợc đo bằng mm, dòng vi khuẩn trên
đĩa kháng sinh tương ứng sẽ đuợc xác định là kháng, nhạy hoặc trung
bình dựa theo hướng dẫn của NCCLS (2002)
Nếu đường kính vịng trịn vơ trùng
≤ 11mm: kháng
12-15mm: trung bình
≥16mm: nhạy

Bảng 3.2: Đường kính vịng trịn vơ trùng một số loại thuốc kháng sinh
Thuốc kháng sinh Kháng

Trung bình

Nhạy

Ampicillin

≤ 13 mm

14-16mm

≥17mm

Chloramphenicol

≤ 12mm

13-17mm

≥18mm

Sulfamethoxazol/
Trimethoprim

≤10mm

11-15mm

≥16mm

Enrofloxacin

≤ 16mm

17-22mm

≥23mm

16
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version