Ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP trong định nhóm HLA ppt

TCNCYH 23 (3) 2003
ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP trong định nhóm HLA

TS. Bạch Khánh Hoà
Labo trung tâm y sinh học, Đại học Y Hà Nội

Phức hệ chủ yếu hoà hợp mô ở ngời chiếm một vùng khoảng từ 4 đến 5 megabaes (Mb) trên
cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 6. Trong lịch sử, kháng nguyên bạch cầu ngời (HLA: Human
leucocyt Antigen) đợc xác định bằng huyết thanh học, sau đó là kỹ thuật tế bào, kỹ thuật tính đa
dạng các mảnh do men hạn chế(Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLP). Ngày nay, kỹ
thuật đợc sử dụng nhiều và có độ tin cậy cao là oligonucleotid probe. Phân tử HLA rất đa dạng,
các kháng nguyên này gây ra cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào.
Trong bài này chúng tôi trình bày kỹ thuật: Phản ứng chuỗi polymerase với những mồi có trình tự
đặc hiệu (PCR- SSP: Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Primers) để định nhóm HLA
nhằm mục đích sử dụng trong lâm sàng chọn hoà hợp ngời cho và ngời nhận tạng mà chúng tôi
đã thực hiện ở Việt Nam từ 2000.

1. Mở đầu: kháng nguyên miễn dịch bạch
cầu của ngời (human leucocyte antigen-
HLA) nằm một phần quan trọng trong hệ thống
di truyền, đợc gọi là hệ thống chủ yếu hoà hợp
mô (complex major histocompatibilite
CMH), hệ thống này nằm trên cánh ngắn của
nhiễm sắc thể số 6 (đoạn 6p21.3). Lần đầu tiên
hệ thống này đợc phát hiện bởi J.Dausset,
1958, và ông đã đợc nhận giải thởng Nobel
về Y học năm 1980 [1]. HLA có vai trò chủ
đạo trong đáp ứng miễn dịch. Tính đa dạng
trong cấu trúc đã dẫn đến những khó khăn
trong xác định kháng nguyên và hiểu biết về
chức năng của nó ứng dụng trong lâm sàng.

Vai trò của HLA trong sự nhận biết cái tôi và
không phải tôi rất quan trọng trong ghép cơ
quan, ghép tuỷ, cũng nh đáp ứng miễn dịch ở
mức độ peptit. Nh vậy, với những cấu trúc và
chức năng khác nhau phân tử HLA giúp cho
chúng ta hiểu ngày càng rõ hơn cơ chế đáp ứng
miễn dịch.
2. Kỹ thuật định nhóm HLA: trải qua
nhiều giai đoạn kể từ khi phát minh ra hệ thống
HLA cho đến nay có rất nhiều kỹ thuật đã đợc
áp dụng trong việc xác định kháng nguyên của
hệ thống này, ngời ta tạm chia nó ra làm hai
nhóm: kỹ thuật huyết thanh học và kỹ thuật
sinh học phân tử nhằm xác định tính đa dạng
của HLA bộc lộ trên bề mặt tế bào.
2.1.Kỹ thuật huyết thanh học: những năm
1954 là những năm đầu tìm hiểu về hệ thống
HLA, ngời ta chỉ dùng phản ứng ngng kết
bạch cầu sau đó tiến thêm một bớc, đó là kỹ
thuật vi độc tế bào tiêu thụ bổ thể. Dùng tế bào
bạch cầu sau khi tách qua Ficoll rồi nhỏ vào
các giếng đã có những huyết thanh mang kháng
thể đặc hiệu đợc biết trớc, sau đó nhỏ thêm
bổ thể thỏ sẽ dẫn đến hiện tợng chết tế bào
nếu có phản ứng kháng nguyên kháng thể và
xác định hiện tợng này thông qua nhuộm tế
bào bằng thuốc nhuộm, đọc kết quả dới kính
hiển vi đảo ngợc. Cho đến nay kỹ thuật này
vẫn đợc sử dụng ở nhiều phòng xét nghiệm.
Trong bài này chúng tôi đề cập đến những

kỹ thuật đang đợc sử dụng nhiều nhất, đó là
những kỹ thuật về sinh học phân tử.
2.2. Sự phát triển ngày càng gia tăng trong
nuôi cấy dòng tế bào thì sự hiểu biết gen của
lớp I (1980) và lớp II (1982) cũng ngày càng
sâu sắc hơn giúp cho giải thích đợc ADN bổ
sung và bộ gen (genomique) cho phép chúng ta
sử dụng sonde thứ hai của HLA.Ngời ta có thể
sử dụng sond này trong phản ứng lai với ADN
của bộ gen để nghiên cứu tính đa dạng của loci
Tiến sĩ, phó trởng Labo Trung tâm Y sinh học trờng Đại học Y Hà Nội.

130
TCNCYH 23 (3) 2003
hay của allen. Kỹ thuật sinh học phân tử đầu
tiên đợc áp dụng trong định nhóm HLA dựa
trên sự phân tích số lợng và kích thớc đoạn
ADN lai với sond đặc hiệu của HLA sau khi
nó bị cắt bởi enzym giới hạn. Kỹ thuật này gọi
tên là " tính đa dạng các mảnh do men hạn chế
(RFLP) [2]. Đây là kỹ thuật định nhóm HLA
đợc sử dụng chủ yếu trong workshop-HLA
1997, và cho thấy có nhiều tiến bộ quan trọng,
nhất là trong xác định và nghiên cứu tính đa
dạng của lớp II, trong ghép cơ quan và tổ chức.
Kỹ thuật RFLP cũng lần đầu tiên cho phép xác
định HLA-DP mà không cần đến kỹ thuật tế
bào và giải thích những hiện tợng không
giống nhau của DP trong nuôi cấy hỗn hợp hai
quần thể tế bào (culture mixte) [3]. Nó cũng

còn là một cuộc cách mạng về mối liên quan
giữa HLA và bệnh, miễn dịch kháng bạch cầu
giữa mẹ và con [4]
Kỹ thuật phản ứng chuỗi khuyếch đại gen
(polymerase chain reaction - PCR) là một cuộc
cách mạng cho mọi nghiên cứu về gen, giải
trình tự gen, và nhất là nghiên cứu về tính đa
dạng. Kỹ thuật này có độ nhạy cao, đặc hiệu và
đơn giản trong những nghiên cứu về gen. Điều
quan trọng trong là sự chọn lựa đoạn mồi sao
cho đạt đợc những yêu cầu về tính đặc hiệu.
Dựa trên những nguyên tắc chính mà ngời ta
tạm chia nó làm 3 nhóm phơng pháp nh sau:
Phản ứng chuỗi polymerase với những
oligosondes đặc hiệu đánh dấu phóng xạ hoặc
enzym của allele hay trình tự gen (PCR-SSO:
Polymerase Chain Reaction -Sequence Specific
Oligoprobes)
Tính đa dạng các mảnh do men hạn chế
(RFLP).
Phản ứng chuỗi polymerase với những mồi
có trình tự đặc hiệu (PCR- SSP)
Kỹ thuật PCR cho phép đánh dấu sự tiến bộ
trong xác định tính đa dạng của gen HLA lớp II
và nhận biết đợc chính xác những alleles khác
nhau của DRB1 và DPB1. Tính đa dạng của lớp
I cũng gặp những khó khăn khi sử dụng kỹ
thuật PCR vì lý do giàu pseudogenes cùng
khuyếch đại trong vùng của lớp I.
2.3. Kỹ thuật PCR-SSP: ngày nay trong

nhiều phòng thí nghiệm hoà hợp mô trên thế
giới ngời ta sử dụng kỹ thuật PCR là kỹ thuật
thờng quy để định nhóm kháng nguyên bạch
cầu, 1999 Phạm Đăng Khoa, Vũ Triệu An và
cộng sự của bộ môn Miễn dịch- Sinh lý bệnh
trờng Đại học Y Hà Nội đã thực hiện kỹ thuật
này để định nhóm DRB1 [2]. Từ tháng 10-
2000 tại phòng thí nghiệm Y Sinh học của
trờng Đại học Y Hà Nội, chúng tôi cũng đa
vào thực hiện kỹ thuật PCR-SSP để định nhóm
cho HLA- A, B, DR, DQ. Loại kit chúng tôi sử
dụng là Độ phân giải thấp (Low resolution)
của Dynal, nó cho kết quả tơng đơng với kết
quả làm huyết thanh học. Kỹ thuật PCR-SSP
đợc sử dụng để chọn lựa ngời cho và ngời
nhận trong ghép tuỷ, ghép cơ quan, tìm mối
liên quan giữa HLA với một số bệnh Đối với
kít Độ phân giải cao (High resolution) xác
định đợc allele có mặt trên nhiễm sắc thể sẽ
cho kết quả có độ phân tích cao hơn nhng giá
thành đắt. Vì vậy chúng tôi lựa chọn kỹ thuật
PCR-SSP độ phân giải thấp dựa trên những
điểm sau:
- Chất lợng kỹ thuật: không cho hoặc rất ít
hiện tợng dơng tính giả
- Thời gian thực hiện kỹ thuật ngắn
- Giá thành xét nghiệm không cao
- Trang thiết bị trong phòng thí nghiệm của
chúng tôi đảm bảo thực hiện đợc kỹ thuật này
Không gây độc nhiều cho ngời thực hiện

do hoá chất sử dụng gây ra.
Vì vậy, chúng tôi nhận thấy kỹ thuật này
phù hợp với tình hình thực tế ở Việt Nam
Kỹ thuật PCR-SSP là kỹ thuật sử dụng
những mồi đợc khuyếch đại từ phía đầu tận
3. Phản ứng chỉ bao gồm 2 giai đoạn chính là
PCR và điện di trên gen agarose để đọc kết
quả.
Các bớc tiến hành nh sau:
. Tách ADN từ máu toàn phần theo kỹ thuật
perchlorate sodium (kỹ thuật S.A. Miller, D.D.
Polesky- 1988).
.Thực hiện phản ứng PCR bằng kit Dynal:
trong mỗi tube đã có sẵn mồi đặc hiệu và nhỏ

131
TCNCYH 23 (3) 2003
thêm 10 àl bao gồm: 0.1 àl Amplitaq DNA
polymerase, 8,9àl đệm SSP-PCR Maaster mix,
1àl DNA cần xác định, trộn kỹ và chạy trên
máy khuyếch đại gen Gene Amp PCR system
9700 với chu kỳ: 96
o
C trong 2 phút, tiếp đến 10
chu kỳ: 96
o
C trong 15 giây, 65
o
C trong 60 giây,
và 20 chu kỳ: 96

o
C trong 10 giây, 61
o
C trong
50 giây, 72
o
C trong 30 giây
. Điện di trên gen agarose 2% trong đệm
TAE 0.5M, 100vol trong 15phút
. Chụp ảnh và phân tích kết quả bằng phần
mềm của Dynal bán kèm theo kit.
Chúng tôi cũng xin trình bày sơ lợc về quy
định danh pháp quốc tế: do có sự tiến bộ trong
kỹ thuật định nhóm HLA nên các quy định về
danh pháp cũng thờng xuyên đợc thông qua
ở các hội nghị quốc tế về HLA, nó cho phép
phân biệt kỹ thuật sử dụng trong định nhóm
HLA là huyết thanh học hay sinh học phân tử
[4]. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử ngời ta
quy định cách viết nh sau:
HLA + locus + * + alen (2 hoặc 4 con
số).

Hình 1: Kết quả sản phẩm PCR-SSP sau điện di trên gen agarose 2%
2 con số đầu tơng ứng với tính đặc hiệu
của kháng nguyên đợc xác định
(A* 01 là kháng nguyên A1) điều này đôi
khi không đúng với một số alen ví dụ trong
nhóm alen B*15 thì B*1502 tơng ứng với
kháng nguyên đợc xác định bằng huyết thanh
học là B75, ngợc lại có trờng hợp có những
alen đợc phát hiện bằng kỹ thụât sinh học
phân tử mà kỹ thuật huyết thanh học không
phát hiện đợc.
Các áp dụng chính trong việc định nhóm
HLA bằng kỹ thuật PCR-SSP: đối với kỹ thuật
PCR-SSP chúng tôi đã ứng dụng trong lâm sàng
với một số trờng hợp sau:
HLA và bệnh: tuỳ thuộc vào lớp I hay lớp
II mà ngời ta đã đa ra những mối liên quan
giữa HLA và một số bệnh nh : viêm cột sống
dính khớp, đái đờng không phụ thuộc insulin
týp Ivà dựa vào mối liên quan này ngời ta
đã đa ra những cơ chế mà trong đó peptid của
phân tử HLA giữ vai trò chủ yếu.
Định nhóm HLA trong ghép: dựa trên nhóm

HLA đợc xác định giữa ngời cho và ngời
nhận để quyết định có ghép thận cho bệnh nhân
hay không?
Tóm lại: do chức năng trình diện đặc hiệu
kháng nguyên peptid, do tính đa dạng của các
phân tử đợc biểu lộ, vai trò phân định danh

132
TCNCYH 23 (3) 2003
mục của lymphô T nên hệ thống HLA đóng
một vai trò chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch.
Điều này giải thích những đóng góp của hệ
thống này trong ghép , trong mối liên quan của
nó với một số bệnh, trong cảnh giác với phát
triển u, trong truyền máu và trong nghiên cứu
quần thể hay trong pháp y.
Nếu việc mô tả tính đa dạng của phân tử và
gen học đã cho những thành công liên tục trong
ghép (đặc biệt trong ghép tuỷ xơng). Những
nghiên cứu về trình tự kháng nguyên và gen
còn giải thích đợc ngày càng rõ hơn sự liên
quan trong tính nhạy cảm hay đề kháng của
một số bệnh (đặc biệt là bệnh tự miễn). Điều
này đã giúp các thầy thuốc lâm sàng trong
miễn dịch trị liệu nhằm khôi phục lại những
hoạt động bình thờng của hệ thống miễn dịch.
Tài liệu tham khảo
1. Vũ Triệu An, J.C.Homberg : Miễn dịch
học. 1997, 105: 120-123.
2. S.A.Miller, D.D.Dykes and H.F. Polesky:

A simple salting out procedure for extracting
DNA from humain nucleated cells. Nucleic
acids research. 1988, 16: 1215-1218.
3. Wake CT, Long EO, Mach B: Allelic
polymorphism and complexity of the genes for
HLA-DR chains direct analysis by DNA-
DNA hybridization. Nature. 1982, 300: 372-
374.
4. Bignon JD, Semana G, Tiercy M et al:
DNA- RFLP analysis: HLA-DR workshop
report. In : Dupon B, ed. Immunology of HLA.
Newyork: Springer-Verlag. 1989, 851-860.
5. Williams F et al.: Development of PCR
SSOP for the identification of HLA-A* 02
subtypes and determination of HLA- A* 02
frequencies within different ethnic populations.
TISSUE Antigens. 1997, 49: 129-133.
6. Bodmer JG et al: Nomenclature for
factors of the HLA system 1998. Tissue
Antigens. 1999, 53: 407- 446.


Summary
Genotyping for HLA

The major histocompatibility complex in humans (MHC), located on the short arm of
chromosome 6, spans a distance of approximately about 4 to 5 megabase (Mb). Historically, HLA
antigens have been defined by serologic techniques, and cellular techniques, DNA analyses using
restriction fragment length polymorphisme (RFLP) and now is oligonucleotid probe (used in
conjunction with the polymerase chain reaction or another process that amplifies the relevant gene

copy). HLA molecules contain multiple alloepitopes that are capable of inducing humoral and
cellular responses during alloimmunization.
This paper, we present the clinical HLA testing: HLA typing (PCR-SSP) to identify HLA
specificities to determine compatibility between a specific donnor- recipient pair.

133