Nghiên cứu tương đồng di truyền và xác định độ thuần của một số tổ hợp tằm đang chọn tạo bằng dấu chuẩn phân tử RAPD pptx

NGHIÊN CỨU TƯƠNG ĐỒNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH
ĐỘ THUẦN CỦA MỘT SỐ TỔ HỢP TẰM ĐANG CHỌN TẠO
BẰNG DẤU CHUẨN PHÂN TỬ RAPD
Đặng Đình Đàn, Nguyễn Thị Thanh Bình
SUMMARY
Study on molecular genetic similarity of some selected Vietnamese silkworm
combinations by RAPD markers
Random amplified polymorphic DNA (RAPD) method described by Williams and Welsh &
McClelland in 1990 use primers annealing to homologous target sites randomly distributed in the
genome of Bombyx mori L. The technology has provided a tool for genetic analyses of biological
subjects and it has been applied succefully in genetic selection as well as breeding for many
agriculture subjects. In this research, ten RAPD primers were surveyed to reveal molecular genetic
similarity of five selected Vietnamese silkworm combinations. The results obtained showed that the
coefficients of genetic similarity of silkworm combinations change from 0,62 to 0,93 and the
genotype homomorphism vary from 73,77% on combination C2 to 78,01% on combination A18.
The method has been proved more efficient in comparison with the traditional assessment method.
The possibility for applying the method in selection and breeding practice of Bombyx mori L. was
diccused.
Keywords: Bombyx mori L., genetic similarity, genotype homomorphism, RAPD.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong tạo giống, người ta đã tiến hành
chọn lọc với sự trợ giúp của chỉ thị phân
tử, đã có những giống vật nuôi và cây
trồng trong đó có tằm dâu được chọn tạo
bằng phương pháp này. Ở Việt Nam, nuôi
tằm là một trong những nghề có từ lâu đời,
nhưng việc chọn tạo giống cho đến nay
vẫn tiến hành theo phương pháp truyền
thống nên có một số hạn chế. Vì vậy,
nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật mới vào
công tác giống là vấn đề cần thiết, trong đó

có xác định độ thuần của giống và tổ hợp
lai trên cơ sở phân tích đa hình phân tử của
chúng bằng kỹ thuật RAPD. Đây là một
trong những kỹ thuật đơn giản, dễ thực
hiện, giá thành thấp hơn so với những kỹ
thuật phân tử khác, được nhiều phòng thí
nghiệm trên thế giới sử dụng hiệu quả
trong hướng nghiên cứu trên.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Vật liệu
Năm tổ hợp tằm lưỡng hệ L2, C2,
C21B, A18, A27 đang chọn tạo thuộc đề tài
tạo giống tằm xuân thu của Trung tâm
Nghiên cứu Dâu Tằm Tơ.
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Tách chiết AD: Theo Wiliam và
cộng sự.
2.2. Xác định nồng độ AD: Bằng
phương pháp quang phổ.
2.3. Kiểm tra AD: Trên gel agaroze
0,8% và chụp ảnh ở máy geldoc.
2.4. hân gen: Bằng kỹ thuật PCR,
mồi do hãng Invitrogen tổng hợp. Thể tích
dùng cho mẫu là 20 µl. Chu trình nhiệt theo
tài liệu của Chapterjee và cộng sự.
Sn phNm PCR kim tra trên gel
agaroze 1,3% - 1,5%.
2.5. Phân tích kết quả: Bng Excel,
thng kê sinh hc và phn mm
N TSYS.2.0. H s ng dng ưc tính

theo công thc ca N ei và Li.
III. KT QU VÀ THO LUN
1. Tách chiết và tinh sạch AD từ mẫu
tằm
ADN ưc tách chit t mu tm ca
các t hp lai bng kit ca Fermentas, các
bưc tin hành thc hin theo ch dn ca
nhà sn xut gm nghin mn mu trong
dung dch m tách chit, phân hu protein
bng proteaza K, loi b tp cht bng
phenol:chloroform, ta ADN bng ethanol,
loi ARN bng Rnaza, ta tip bng ethanol
 thu ADN sch. Sn phNm ADN ưc
chy in di kim tra, ánh giá trên gel
agaroze 0,8% và hình 1 là kt qu thu ưc.
Kt qu hình 1 cho thy, sn phNm nhn
ưc ã loi ht ARN , các vch gn và có
trng lưng phân t ln hơn 21,6 kb. ADN
ưc bo qun lnh trong dung dch TE.

Hình 1. Ảnh điện di AD
1 - 5: ADN của 5 mẫu.
M: ADN λ/EcoRI+HindIII
Độ sạch và nồng độ ADN được giới
thiệu ở bảng 1. Kết quả bảng 1 cho thấy tỉ
lệ OD
260 nm
/OD
280 nm
dao động từ 1,79 đến

1,98 chứng tỏ ADN thu được có đủ độ sạch
để làm nguyên liệu cho PCR trong các
nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 1. Kết quả đánh giá độ sạch của AD tách chiết bằng kit
TT OD260/280 TT OD260/280 TT OD260/280 TT OD260/280
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1,84
1,87
1,79
1,96
1,86
1,84
1,86
1,89
1,98
1,87
1,97
1,96

1,97
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
1,82
1,81
1,92
1,98
1,89
1,85
1,90
1,82
1,81
1,92
1,91
1,89
1,98
27
28
29

30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
1,86
1,79
1,85
1,89
1,86
1,96
1,79
1,95
1,92
1,91
1,94
1,92
1,86
40
41
42
43
44
45
46

47
48
49
50
51
52
1,86
1,93
1,92
1,87
1,86
1,85
1,79
1,83
1,79
1,85
1,90
1,81
1,89

2. Phân tích tương đồng di truyền và xác
định độ thuần của các tổ hợp tằm
Sử dụng 10 mồi RAPD đã tuyển chọn
từ đề tài độc lập khác để khuếch đại ADN
của các tổ hợp tằm. Hình 2, 3 là ảnh điện di
21,6 kb
1 2 3 4 5 M
sn phNm PCR ca mt s t hp vi mi
khác nhau. Phân on khuch i ưc ghi
nhn là 1 và không khuch i là 0. Tt c

các phân on ưc ưa vào chương trình
N TSYST 2.0  phân tích quan h di truyn
trong các t hp tm và h s tương ng di
truyn ca các t hp tm ưc trình bày
trong bng 2, 3, 4, 5, 6. Kt qu bng 2 cho
thy, h s tương ng di truyn ca t hp
tm C21B bin ng khong 0,623 n
0,926 và  khong 0,6 có 6 cp chim 16%,
 khong 0,7 có 20 cp chim 44%, khong
0,8 có 12 cp chim 27%, khong 0,9 có 6
cp chim 13%. T hp tm C2 (bng 3) có
h s tương ng di truyn dao ng t
0,624 n 0,892, trong ó  khong 0,6 có
24 cp chim 24%, khong 0,7 có 18 cp
chim 40%, khong 0,8 có 16 cp chim
36%. T hp tm L2 (bng 4) có s thay
i ca h s tương ng t 0,644 n
0,933,  khong 0,6 có 8 cp chim 18%,
khong 0,7 có 14 cp chim 31%, khong
0,8 có 20 cp chim 44% và khong 0,9 có
3 cp chim 0,07%. T hp tm A18 (bng
5) có h s tương ng t 0,684 n 0,948,
 khong 0,6 có 7 cp chim 16%, khong
0,7 có 15 cp chim 33%, khong 0,8 có 18
cp chim 40% và 0,9 có 5 cp chim 11%.
T hp tm A27 (bng 6) ch s này bin
thiên t 0,674 n 0,930,  khong 0,6 có 6
cp chim 13%, khong 0,7 có 24 cp
chim 53%, khong 0,8 có 14 cp chim
31% và khong 0,9 ch duy nht 1 cp

chim 2%.  thun ca ging theo du
chuNn phân t ưc xác nh bng t l các
phân on ng hình trên tng s các phân
on ưc nhân và kt qu ưc trình bày 
bng 7. Kt qu bng 7 cho thy, trong các
t hp ang chn to thì t hp tm C2 có
 thun thp nht t 73,77%, sau ó là t
hp C21B - 74,44%, t hp L2 - 75,00%, t
hp A27 - 77,42% và cao nht là t hp
A18 t 78,01%. Kt qu nhn ưc phù
hp vi cách ánh giá bng phương pháp
truyn thng và công b ca mt s tác gi
khác. Cho n nay, cách ánh giá  thun
c truyn cn nhiu thi gian,  chính xác
hn ch và ph thuc nhiu vào kinh
nghim ca ngưi nuôi. Vi s tr giúp ca
du chuNn phân t có th ch ng và ánh
giá nhanh ch tiêu này. ây là nhng kt
qu ban u ca vic s dng du chuNn
phân t ánh giá  thun ca ging, m ra
kh năng h tr hiu qu cho công tác chn
to ging, góp phn ci thin cht lưng
ging tm trong tương lai.



Hình 2. Sản phm PCR mồi 0P019
M: marker 1 kb
1 - 10: Tổ hợp L2; 11 - 20: Tổ hợp C2
Hình 3. Sản phm PCR mồi HB10

M: marker 1kb
1 - 10: Tổ hợp C21B; 11 - 20: Tổ hợp A18
Bảng 2. Hệ số tương đồng tổ hợp tằm C21B
C21B.1

C21B 2

C21B.3

C21B.4

C21B.5

C21B.6

C21B.7

C21B.8

C21B.9

C21B.10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
C21B.1

1.000
C21B 2

0.926 1.000
C21B.3

0.766 0.798 1.000
C21B.4

0.689 0.818 0.623 1.000
C21B.5

0.768 0.766 0.843 0.926 1.000
C21B.6

0.652 0.778 0.767 0.744 0.768 1.000
C21B.7

0.722 0.926 0.711 0.926 0.667 0.878 1.000
C21B.8

0.812 0.829 0.700 0.656 0.678 0.786 0.822 1.000
C21B.9

0.700 0.722 0.812 0.852 0.926 0.926 0.856 0.812 1.000
C21B.10

0.756 0.744 0.756 0.733 0.767 0.821 0.865 0.724 0.711 1.000
Bảng 3. Hệ số tương đồng tổ hợp tằm C2
C2.1 C2 2 C2.3 C2.4 C2.5 C2.6 C2.7 C2.8 C2.9 C2.10
C2.1 1.000
C2 2 0.742 1.000
C2.3 0.763 0.654 1.000

C2.4 0.785 0.882 0.817 1.000
C2.5 0.796 0.828 0.642 0.654 1.000
C2.6 0.882 0.871 0.721 0.774 0.742 1.000
C2.7 0.682 0.624 0.785 0.796 0.742 0.828 1.000
C2.8 0.684 0.786 0.817 0.648 0.774 0.678 0.860 1.000
C2.9 0.817 0.682 0.652 0.882 0.785 0.882 0.871 0.658 1.000
C2.10 0.892 0.785 0.765 0.774 0.892 0.764 0.892 0.774 0.892 1.000
Bảng 4. Hệ số tương đồng tổ hợp tằm L2
L2.1 L2 2 L2.3 L2.4 L2.5 L2.6 L2.7 L2.8 L2.9 L2.10
L2.1 1.000
L2 2 0.711 1.000
L2 3 0.822 0.856 1.000
L2.4 0.844 0.878 0.822 1.000
L2.5 0,678 0.878 0.822 0.933 1.000
L2.6 0.722 0.778 0.767 0.744 0.744 1.000
L2.7 0.844 0.656 0.711 0.644 0.667 0.811 1.000
L2.8 0.878 0.644 0.700 0.878 0.678 0.822 0.922 1.000
L2.9 0.644 0.722 0.711 0.844 0.689 0.900 0.844 0.878 1.000
L2.10 0.756 0.744 0.756 0.733 0.878 0.878 0.844 0.833 0.867 1.000
Bảng 5. Hệ số tương đồng tổ hợp tằm A18
A18.1 A18.2 A18.3 A18.4 A18.5 A18.6 A18.7 A18.8 A18.9 A18.10

A18.1 1.000
A18.2 0.895 1.000
A18.3 0.843 0.948 1.000
A18.4 0.921 0.921 0.868 1.000
A18.5 0.737 0.842 0.842 0.763 1.000
A18.6 0.816 0.763 0.763 0.842 0.658 1.000
A18.7 0.764 0.763 0.816 0.737 0.658 0.895 1.000
A18.8 0.895 0.947 0.895 0.921 0.789 0.816 0.763 1.000

A18.9 0.895 0.711 0.895 0.684 0.605 0.895 0.737 0.763 1.000
A18.10 0.737 0.684 0.632 0.868 0.948 0.763 0.763 0.868 0.868 1.000
Bảng 6. Hệ số tương đồng tổ hợp tằm A27
A27.1 A27.2 A27.3 A27.4 A27.5 A27.6 A27.7 A27.8 A27.9 A27.10
A27.1 1.000
A27.2 0.744 1.000
A27.3 0.864 0.744 1.000
A27.4 0.884 0.698 0.814 1.000
A27.5 0.837 0.721 0.791 0.884 1.000
A27.6 0.698 0.768 0.698 0.744 0.767 1.000
A27.7 0.791 0.721 0.698 0.884 0.86 0.814 1.000
A27.8 0.721 0.86 0.767 0.767 0.791 0.744 0.791 1.000
A27.9 0.791 0.674 0.744 0.744 0.721 0.721 0.767 0.93 1.000
A27.10 0.721 0.744 0.674 0.721 0.837 0.837 0.837 0.862 0.837 1.000

Bảng 7. Kết quả xác định độ thuần của các tổ hợp tằm
Các tổ hợp C2 L2 C21B A18 A27
Độ thuần (%) 73,77 75,00 74,44 78,01 77,42

IV. KẾT LUẬN
Sử dụng 10 mồi RAPD chọn lọc để
phân tích tương quan di truyền của 5 tổ hợp
tằm đang chọn tạo, hệ số tương quan được
xác định trong khoảng 0,62 đến 0,93 và độ
thuần thay đổi từ 73,77% ở tổ hợp C2 đến
78,01% ở tổ hợp A18, kết quả phù hợp với
cách đánh giá theo phương pháp truyền
thống, cần nghiên cứu hoàn thiện để đưa
ứng dụng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 guyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị
Hằng, ông Văn Hải, 2004. Nghiên cứu
đa hình một số giống tằm dâu bằng kỹ
thuật RAPD. Tạp chí Di truyền học và
Ứng dụng 1/2004, tr. 19 - 24.
2 gô Lê Thương, Trịnh Hữu Hằng,
guyễn Thị Thanh Bình, 2005. Nghiên
cứu đa hình phân tử và nhận biết một số
giống tằm lưỡng hệ Việt Nam bằng kỹ
thuật PCR - RAPD. Hội nghị Khoa học
toàn quốc những vấn đề nghiên cứu cơ
bản trong khoa học sự sống - 11/2005,
tr.1424 - 1427.
3 Trần Duy Dương, Lưu Thị gọc Huyền,
Vũ Đức Quang, Hoàng Tuyết Minh, 1999.
Sử dụng phương pháp RAPD trong
nghiên cứu đa hình một số dòng lúa
phục vụ cho công tác giống. Hội nghị
Công nghệ Sinh toàn quốc. NXB KH &
KT, tr.1452 - 1458.
4 Chatterjee S.., Pradeep A.R, 2003.
Molecular markers (RAPD) associated
with growth, yield and origin of the
silkworm Bombyx mori L. in Indian.
Genetika, 39(12), pp.1612 - 1624.
5 William J.G.K., Kubelik, K.J. Livak,
J.A.F. Rafalski, S.V. Tingey, 1990. DNA
polymorphism amplified by arbitrary
primer are useful as genetic markers.
Nucleic Acids Res, 8, pp.6531 - 6535.

gười phản biện: Trần Duy Quý
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7