Tìm hiểu kỹ thuật nhân sinh khối tế bào sâu khoang (S. litura) docx

TèM HIU K THUT NHN SINH KHI T BO
SU KHOANG (S. litura)
Lờ Vn Trnh
SUMMARY
Identification of culture technologies on cell propagation of S. litura
Some trials to identify necessary factors for insect cell culture of Spodoptera litura have been done
in last year. The result of trails had indicated that the medium of Ex-Cell 14420 with 10% FBS was
appropriate for development of insect cell culture with density of cells reached to 4,2 x 10
10
cells
per mililit. When cell culture with this medium including 10% FBS at pH= 7,0, the density of cells
was as 3,6 x 10
10
after six days of culturing. If cells cultured in medium with pH were 6,5 and 7,5,
the density of cells was significantly decreased. Among of 5 mediums without FBS have been
tested, it was identified that the medium of Ex- Cell 14420 was considered to be most appropriate
for cell culture with its density up to 3,2 x 10
10
cell/ml.
Keywords: Spodoptera litura, insect cell culture, cell propagation
I. ĐặT VấN Đề
Cỏc ch phNm sinh hc s dng tỏc nhõn
vi rỳt NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) u
rt chuyờn tớnh v cú hiu qu cao trong
phũng tr sõu khoang núi riờng v cỏc sõu
hi cõy trng nụng, lõm nghip núi chung.
Tuy nhiờn, cỏc loi vi rỳt ch cú th tn ti,
phỏt trin c trong cỏc t bo sng v
trong iu kin mụi trng thớch hp. Vỡ
vy, vic sn xut ch phNm vi rỳt ũi hi
phi c thc hin trờn c th sõu sng

hoc trờn cỏc mụ, t bo sõu hi cũn sng.
Lõu nay, vic sn xut NPV vn tin
hnh theo phng phỏp th cụng, bng cỏch
nuụi sõu sng s lng ln, sau ú nhim vi
rỳt NPV ca loi sõu tng ng, ri nghin
lc v em ra s dng. Theo cỏch ny thỡ
sn xut ch phNm NPV tr sõu hi khú
cú th thc hin vi qui mụ cụng nghip, vỡ
nuụi c s lng ln mt loi sõu hi
phc v sn xut ch phNm l mt vn
ht sc khú khn v phi cú iu kin v
nh xng, trang thit b.
ng dng cụng ngh nuụi nhõn sinh
khi t bo cụn trựng sn xut ch phNm
NPV vi qui mụ cụng nghip ó v ang
bt u phỏt trin ti mt s nc trờn th
gii. Trong thi gian qua, chỳng tụi ó tỡm
hiu theo nh hng ny, kt qu thu c
bc u cú nhiu trin vng, m ra nh
hng mi trong vic ng dng cụng ngh
t bo phỏt trin ch phNm sinh hc bo
v cõy trng.
II. VậT LIệU Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU
1. Vt liu nghiờn cu
- Thc liu dũng t bo sõu khoang
c phỏt trin t mụ phụi ca sõu khoang.
- Cỏc loi mụi trng nuụi nhõn t
bo cụn trựng, cỏc loi khỏng sinh c
dng (nh Gentamicine, Fujione) v huyt
thanh ph tr FBS (fetal bovin serum)

trong nuụi nhõn do Cụng ty In-Vitrogen
cung cp.
- Dng c nuụi cy t bo, nh: Bỡnh
nuụi cy lc khuNn loi 25 cm
2
v 75 cm
2
.
2. Phương pháp nghiên cứu
Vic nghiên cu k thut nuôi nhân
sinh khi t bào ưc tin hành theo
phương pháp ca Granados et al. (2007) và
Agathos (1994). Các thí nghim ưc tin
hành vi các công thc môi trưng có b
sung thành phn b tr FBS khác nhau.
Nhc li 5 ln, mi ln nhc li là 1 bình.
T bào ưc nuôi cy trong bình c vch
Corning lc khuNn có din tích 25 cm
2
.
Ngun t bào cho thí nghim có hàm lưng
1,5 x 10
7
t bào/ml. Sau 6 ngày nhân nuôi 
nhit  n nh tùy theo tng thí nghim.
Sau ó, theo dõi mt  t bào trong các ln
nhc li.
III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN
1. Tỷ lệ thành phần huyết thanh bổ trợ
cho phát triển tế bào

Tin hành thí nghim nuôi nhân t bào
sâu khoang trên 2 loi môi trưng có cha
các thành phn huyt thanh b tr khác
nhau. Kt qu nêu trong bng 1 cho thy khi
nuôi nhân t bào trên môi trưng Ex-Cell
14420 có cha 10% cht b tr FBS thì hàm
lưng t bào t mc cao nht, t ti 4,2 x
10
10
t bào trong 1 mililit. ng thi, có t
l t bào sng t ti 97,2% và t l t bào
có hình dng tiêu chuNn t ti 82,3%.
Trong khi ó, nu nuôi nhân t bào
trong môi trưng Ex-Cell 14420 có cha
10% huyt thanh bò thì cũng t hàm lưng
t bào khá cao, ti 3,1 x 10
10
t bào/ml, t l
t bào sng t ti 92,5% và t l t bào
tiêu chuNn t ưc là 72,6%. Trong khi ó,
nu không có 10% cht b tr (FBS hoc
huyt thanh bò) mà ch có môi trưng Ex-
Cell 14420 thì cũng ch t hàm lưng t
bào là 2,7 x 10
10
t bào/ml và t l t bào
sng t 96,6% và t l t bào tiêu chuNn
t 80,3%.
Khi nuôi nhân trên môi trưng Schneider
0146 cũng din ra xu hưng tương t như i

vi vic nuôi nhân t bào trong môi trưng
Ex-Cell 14420. Khi nuôi nhân t bào trong
môi trưng Schneider 0146 có b sung 10%
FBS thì hàm lưng t bào t khá cao, lên ti
2,6 x 10
10
t bào/ml và t t l t bào sng
ti 95,5% và t l t bào tiêu chuNn ti
78,3%. Còn s dng 10% huyt thanh bò thì
hàm lưng t bào t 2,4 x 10
10
t bào/ml và
t l t bào sng t 89,1% và t l t bào tiêu
chuNn t 65,6%. Nu ch dùng môi trưng
nuôi nhân là Schneider 0146 không có 10%
thành phn b tr thì ch t hàm lưng 1,2 x
10
10
t bào/ml vi t l t bào sng là 94,5%
và t l t bào có hình dng tiêu chuNn ch t
78,0%.
Bảng 1. Hàm lượng tế bào sau nuôi nhân trên các môi trường chứa huyết thanh khác nhau
(Viện BVTV, 2010)
Công
thức
Môi trường nuôi nhân
Hàm lượng tế
bào (tb/ml)
% tế bào
sống

% tế bào tiêu
chuẩn
1 Ex-Cell 14420 chứa 10% FBS 4,2 x 10
10
d 97,2 82,3
2 Ex-Cell 14420 chứa 10% huyết thanh bò 3,1 x 10
10
c 92,5 72,6
3 Schneider 0146 chứa 10% FBS 2,6 x 10
10
b 95,5 78,3
4 Schneider 0146 chứa 10% huyết thanh bò 2,4 x 10
10
ab 89,1 65,6
5 Ex-Cell 14420 (Đ/c 1) 2,7 x 10
10
b 96,6 80,3
6 Schneider 0146 (Đ/c 2) 1,2 x 10
10
a 94,5 78,0

Bng 1 cho thy, môi trưng Ex-Cell
14420 có cha 10% thành phn b tr là
FBS hoc huyt thanh bò  nuôi nhân t
bào sâu khoang là rt thích hp hơn so vi
môi trưng Schneider. Vi các môi trưng
này vic nuôi nhân t bào sâu khoang có th
cho phép t tương ng là 3,1 x 10
10
và 4,2 x

10
10
t bào/ml. Tuy nhiên, trong thc t nu
s dng huyt thanh bò s găp nhiu khó
khăn trong vic m bo tiêu chuNn cht
lưng n nh.
2. Điều kiện pH của môi trường nuôi nhân
iu kin pH ca môi trưng nhân nuôi
có nh hưng rt ln n kh năng phát
trin ca t bào. Theo Freshney (1987) và
Weiss et al. (1981), hu ht các loi t bào
côn trùng trong quá trình phát trin s
lưng u yêu cu pH môi trưng  mc
trung tính. Nu iu kin ca môi trưng
ch t pH ≤ 6,0 kt hp vi nhit  nuôi
cy thp ≤ 20
0
C thì các enzym tái t hp
không hot ng và quá trình phân chia t
bào không din ra. Ngưc li, nu pH cao
(pH ≥ 7,2) kt hp nhit  ≥30
0
C thì quá
trình phân chia t bào b c ch vì các
enzym b phân rã.
Nghiên cu kh năng phát trin s
lưng t bào trong iu kin pH môi
trưng nuôi nhân khác nhau và ưc iu
chnh trưc khi nuôi nhân bng NaOH. T
bào ưc nuôi cy trong môi trưng Ex-

Cell 14420 và Schneider có cha 10%
thành phn b tr FBS. Ngun t bào khi
ưa vào thí nghim có hàm lưng 2,1 x 10
6

t bào/ml theo t l dch t bào và môi
trưng là 1: 3.
Kt qu thu ưc sau 6 ngày nhân
nuôi (Bng 2) cho thy khi pH môi trưng
nuôi nhân là 7,0 hoc 7,5 thì hàm lưng t
bào tăng lên rõ rt  c 2 loi môi trưng.
Vi môi trưng nuôi nhân là Ex-Cell
14420 có hoc không b sung FBS thì sau
6 ngày  iu kin pH = 6,5 t hàm
lưng t bào tương ng là 6,9 x 10
9
và 5,9
x 10
9
t bào/ml. Nhưng khi nuôi nhân 
môi trưng pH = 7,0 thì hàm lưng t bào
tăng lên mt cách áng k, t ti 3,6 x
10
10
và 3,2 x 10
10
t bào/ml (tương ng)
và khi pH = 7,5 thì mt  t bào có gim
i, t 1,2 x 10
10

và 1,0 x 10
10
t bào/ml
(tương ng)
Còn vi môi trưng nuôi nhân t bào là
Schneider 0146 thì hàm lưng t bào  pH
môi trưng là 7,0 và 7,5 cũng cao hơn áng
k so vi hàm lưng t bào thu ưc khi
nuôi nhân  môi trưng có pH = 6,5. Tương
ng vi pH = 6,5 thì hàm lưng t bào  môi
trưng Schneider có thêm 10% FBS là 1,4 x
10
9
t bào/ml và không b sung thêm 10%
FBS là 1,0 x 10
9
t bào/ml. Khi nuôi nhân
bng môi trưng này có b sung 10% FBS 
pH = 7,0, thì sau 6 ngày hàm lưng t bào
t ưc là 2,1 x 10
9
t bào/ml và  môi
trưng không có FBS thì hàm lưng t bào
t ưc là 1,3 x 10
9
t bào/ml. Khi pH = 7,5
thì s liu tương ng là 0,8 và 0,7 x 10
10
t
bào/ml.

Như vy, tùy theo tng loi môi trưng
nuôi cy khác nhau hàm lưng t bào thu
ưc có khác nhau, nhưng iu kin pH ca
môi trưng nuôi nhân thích hp là 7,0. iu
này cũng phù hp vi công b ca
Freshney R. (1987).
Bảng 2. Hàm lượng tế bào thu được khi môi trường nuôi nhân có pH khác nhau
(Vin BVTV, 2010)
Công
thức
Môi trường nuôi nhân
Hàm lượng tế bào (tb/ml)
pH = 6,5 pH = 7,0 pH = 7,5
1 Ex-Cell 14420 + 10% FBS 6,9 x 10
9

3,6 x 10
10
1,2 x 10
10

2 Ex-Cell 14420 5,6 x 10
9
3,2 x 10
10
1,0 x 10
10

3 Schneider 0146+ 10% FBS 1,4 x 10
9

2,1 x 10
10
0,8 x 10
10

4 Schneider 0146 1,0 x 10
9
1,3 x 10
10
0,7 x 10
10


3. Môi trường thích hợp cho nuôi nhân
tế bào sâu khoang
Tin hành ánh giá kh năng phát trin
sinh khi t bào  các môi trưng khác
nhau không có 10% huyt thanh b tr
FBS. Kt qu theo dõi nêu  bng 3 cho
thy  nhit  nuôi nhân là 27
0
C t bào
phát trin tt  môi trưng Ex- Cell 14420
t ti mt  3,02 x 10
10
t bào/ml, sau ó
là môi trưng Schneider 0146 t mt 
1,46 x 10
10
t bào/ml. Vi các môi trưng

IPL-41; TNM- FH và môi trưng TC-100
cho hiu qu nhân sinh khi t bào thp
hơn, vi mt  t bào tương ng là 1,60 x
10
9
; 1,68 x 10
9
và 0,96 x 10
9
t bào/ml.
Bảng 3. Mật độ tế bào ở các môi trường nuôi nhân khác nhau (Viện BVTV, 2010)
Công thức thí nghiệm

Môi trường nuôi nhân Mật độ tế bào sau 6 ngày nuôi nhân (tế bào/ml)
1 Ex- Cell 14420 3,02 x 10
10
c
2 Schneider 0146 1,46 x 10
10
d
3 IPL- 41 1,60 x 10
9
b
4 TNM- FH 1,68 x 10
9
b
5 TC-100 0,96 x 10
9
a

Như vy, trong s 5 loi môi trưng tham
gia thí nghim, khi nhân nuôi t bào  Ex-
Cell 14420 nhit  27
0
C thì môi trưng Ex-
Cell 14420 cho hiu qu nhân sinh khi t
bào tt nht. Sau ó là môi trưng Schneider
0146. Còn các môi trưng IPL-41; TNM-FH
và TC-100 cho hiu qu thp hơn hn. Kt
qu thí nghim này cũng chng t vic b
sung huyt thanh b tr là cn thit giúp cho
quá trình phát trin sinh khi ca t bào sâu
khoang t hiu qu cao như ca Granados và
Mc Kenna (1995) ã ch rõ.
IV. KÕT LUËN
1. Khi nuôi nhân t bào trên môi
trưng Ex-Cell 14420 có cha 10% cht
b tr FBS thì hàm lưng t bào t mc
cao nht, t ti 4,2 x 10
10
t bào trong 1
mililit, t l t bào sng t ti 97,2% và
t l t bào có hình dng tiêu chuNn t
ti 82,3%.
2. Vi môi trưng nuôi nhân là Ex-
Cell 14420 có hoc không b sung FBS thì
sau 6 ngày  iu kin pH = 6,5 t hàm
lưng t bào tương ng là 6,9 x 10
9
và 5,9

x 10
9
t bào/ml. N hưng  môi trưng pH =
7,0 thì hàm lưng t bào t ti 3,6 x 10
10

khi có b sung 10% FBS và t 3,2 x 10
10

t bào/ml nu không b sung 10% FBS và
khi pH = 7,5 thì mt  t bào gim i, ch
t 1,2 x 10
10
và 1,0 x 10
10
t bào/ml
(tương ng).
3. Trong s 5 loi môi trưng tham gia
thí nghim, thì môi trưng Ex- Cell 14420 t
cao nht, ti mt  3,02 x 10
10
t bào/ml.
Sau ó là môi trưng Schneider 0146, t
1,46 x 10
10
t bào/ml. Các môi trưng IPL-
41; TN M- FH và môi trưng TC-100 cho
hiu qu nhân sinh khi t bào thp hơn, vi
mt  t bào tương ng là 1,60 x 10
9

; 1,68 x
10
9
và 0,96 x 10
9
t bào/ml.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Viện Bảo vệ thực vật. 2001. Báo cáo
tng kt  tài khoa hc cp Nhà nưc
KHCN.02.07B (1996-2000): Nghiên
cu áp dng công ngh vi sinh (vi
khuNn, vi nm, virut)  sn xut ch
phNm sinh hc BVTV trong phòng tr
sâu hi cây trng. 134 trang.
2. Việt H. T., Cảm .V. và nnk. 2002. Mt
s kt qu nghiên cu v N PV (N uclear
Polyhedrosis Virus) và kh năng s
dng trong phòng tr sâu hi cây trng.
Tuyn tp công trình nghiên cu bo v
thc vt 2000- 2002. N XB N ông
nghip, Hà N i, Trang 113- 130.
3. Agathos S.. 1994. Large scale insect
cell production. Book: Inscet Cell
Biotechnology by Editors:
Maramorosch K. and Mclntosh. CRC
Press, Tokyo. Pg. 89- 103.
4. Elanchezyan K. 2009. Insect cell culture
and biotechnology. Current Biotica.
Vol.3. N o.3. 2009. Tamil N adu
Agriculturl University Publising House.

Pg. 458- 489.
5. Freshney R. 1987. Culture of animal
cell. Manual of basic technique. Second
edited; Wiley- Liss, N ew York. 397
pages.
6. Granados R.R. and Mc Kenna K.A.
1995. Insect cell culture methods and
their use in virus research. Baculorvirus
expression systems and biopesticides.
Editors: Shuler M.L., Wood H.A.,
Granados R.R., Hammer D.A. Wiley -
Liss, Inc. N ew York. 1995. Pg. 13-40.
7. Maiorella B., Inlow D., Shauger A. Ad
Harano D. 1988. Large scale insect cell
culture for recombinant protein
production. Biotechnology Journal. N o.
6 (1988). Pg. 1406-1410
8. Weiss S.A., Smith G.C., Kalter S.S. and
Vaughn J.L. 1981. Improved method for
the production of insect cell cultures in
large volume. In Vitro Jounal. N o. 17.
Pg. 495- 502.
Người phản biện:
TS. Nguyễn Văn Vấn
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
6
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
7