do an chuyen mon pdf

ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học như một thân cây mà những rễ chính của cây này là vi sinh
vật học, di truyền học, sinh hóa học, điện tử học, nông học, công nghệ học…và trên
vòm lá với hàng nghìn quả đó là các loại sản phẩm phục vụ trồng trọt, chăn nuôi, y
học, năng lượng mới, vật liệu mới, tuyển khoáng, bảo vệ môi trường
Nhờ ứng dụng các thành tựu mới mẻ của công nghệ sinh học như kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp di truyền, người ta có thể tạo ra được những giống
cây trồng không những có năng suất cao mà còn chống chịu được với sâu bệnh, hạn
hán và điều kiện nghèo phân bón. Nhờ bỏ qua được việc lai chéo và khắc phục được
sự tương khắc sinh sản mà việc lai tạo giống rút ngắn được nhiều thời gian. Kỹ thuật
tái tổ hợp AND và các kỹ thuật in vitro mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng
nhanh tính đa dạng di truyền.
Đối với các loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô đã
đem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt.
Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách
rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị
kinh tế cao.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học trẻ có nhiều triển vọng, được
ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế. Ý thức được triển vọng to lớn của ngành
khoa học hiện đại này, chúng tôi xin giới thiệu quyển sách công nghệ nuôi cấy mô tế
bào thực vật nhằm phục vụ sinh viên, học viên sau đại học và các cơ quan có liên
quan.
Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã không ngừng
phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Kỹ thuật này ra đời nhanh chóng có vị
trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất giống cây trồng. Ưu điểm
nổi bật của phương pháp này là có thể nhân nhanh, giữ được đặc điểm di truyền ổn
định, có thể sản xuất với số lượng cá thể lớn trong thời gian ngắn. Cây nuôi cấy mô
thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom
lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể làm đâm sâu xuống đất như cây mọc từ
hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis). Vì thế nuôi cấy mô tế bào

SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 1
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
còn là một biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dù nuôi cấy mô đòi
hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là
phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá
phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp. Từ những thực tế nêu trên tôi chọn đề tài: “Tìm
hiểu về tổng quan các phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống cho cây thân gỗ”
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 2
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ
1.1. Khái niệm nuôi cấy mô và nhân giống cây thân gỗ
Nuôi cấy mô là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên
liệu thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo ở điều
kiện môi trường.
Nhân giống in vitro hay còn gọi vi nhân giống được sử dụng đặc biệt cho việc
ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ
phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng ở điều kiện vô trùng trong
các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác.
Thực tế, các nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro và nuôi cấy
mô thay đổi cho nhau để chỉ cho mọi phương thức nhân giống thực vật trong điều kiện
vô trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro.
Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture). Vi nhân giống
(micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ
phận nhỏ được tách khỏi cây (George, 1930) đang được dùng phổ biến để nhân giống
thực vật, trong đó có cây thân gỗ. Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có thể là chồi
bất định, chồi bên, chồi đỉnh, bao phấn, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non,
thân mầm. Song nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định (Preece, 1997, Tripepi,
1997) là những phương pháp chính được dùng trong nhân giống cây rừng mà không đề
cập các nội dung khác.
Nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt,

thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại
thường không có rễ cọc, rễ cây không thể đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và
thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis) như đã đề cập ở trên. Ví dụ: cây
mô keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng như các loài cây bố mẹ là Keo tai tượng và
Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá giả, lại có rễ theo
kiểu rễ cọc như những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây hom cũng của giống này lại
chỉ có lá giả của cây trưởng thành và không có rễ cọc (nghĩa là tính trẻ hoá bị hạn chế,
còn tính bảo lưu cục bộ thì biểu hiện rõ rệt). Vì thế nuôi cấy mô còn là biện pháp trẻ
hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dầu nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp,
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 3
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom,
tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm
nghiệp.
Tuy vậy, tính trẻ hoá của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ hạt,
Brand và Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hoá của cây mô, cây
hom lấy từ cành của cây trưởng thành và cây ghép của cây Bulô (Betula sp.) đã thấy
rằng sau 1 tháng cây nuôi cấy mô có các băng protein giống như cây mọc từ hạt, sau 4-
8 tháng lại giống với cây trưởng thành, còn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây
trưởng thành sau 4-8 tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt nhanh
nhất cũng phải sau 8 năm mới có hoa (Grosdova, 1985). Điều đó chứng tỏ cây nuôi
cấy mô tuy có mức độ trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây
trưởng thành (chứ không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hoá) song không thể trẻ như
cây mọc từ hạt.
1.2. Lịch sử phát triển
Năm 1838, nhà thực vật học Matthias Jacob Schleiden và năm 1839 nhà động vật
học Theodor Schwann mới chính thức xây dựng học thuyết tế bào. Học thuyết khẳng
định rằng: Mỗi cơ thể động thực vật đều bao gồm những thể tồn tại hoàn toàn độc lập,
riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bào.
Haberlandt (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy tế bào

thực vật để chứng minh cho tính toàn thể của tế bào. Theo ông mỗi tế bào bất kì của
một thể sinh vật đa bào đều có tiềm tàng để phát triển nhanh thành một cá thể hoàn
chỉnh. Năm 1898 Ông bắt đầu những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn tách từ nhu mô
lá, tượng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật nhưng không thu
được kết quả nào. Năm 1934, White nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua
(Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng có bổ sung muối khoáng, glucose,
đầu rễ sinh trưởng khá mạnh và tạo nên hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Nhưng sự sinh trưởng
này chỉ diễn ra trong một thời gian rồi chậm dần và ngừng hẳn mặc dù đã chuyển sang
môi trường mới. Cùng trong thời gian này, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của
IAA, 1 hormone thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng
trưởng và phân chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và
White đã đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công . Năm 1955, Miller và cs đã phát minh
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 4
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin- một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong
phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám
phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự
phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi). Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng
độ kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi nồng độ
IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ nồng độ
auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh.
Năm 1949, Limmasets và Cornuet đã phát hiện rằng virus phân bố không đồng
nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng đỉnh sinh trưởng. Năm 1952,
Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng. Ngày nay, kỹ thuật này với một số cải tiến đã trở thành phương pháp loại
trừ bệnh virus được dùng rộng rãi đối với nhiều loài cây trồng khác nhau. Năm 1952,
Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công. Kỹ thuật được ứng
dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống sạch bệnh virus và tương tự virus ở nhiều cây
trồng nhân giống bằng phương pháp vô tính khác nhau, đặc biệt là tạo giống cây ăn
quả sạch bệnh. Năm 1960, Morel đã thực hiện kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

trong nhân nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực
vật.
Năm 1960, Cocking tách được tế bào trần. Năm 1971, Takebe và cs đã tái sinh
được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá. Năm 1972, Carlson và cs lần đầu tiên
thực hiện lai tế bào sôma giữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài
thuốc lá Nicotiana glauca và N. langsdorfii. Năm 1978, Melchers và cs tạo được cây
lai soma "Cà chua Thuốc lá" bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này. Đến nay, việc tái
sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần đã thành công ở nhiều loài
thực vật.
Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn
bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura. Kỹ thuật này sau đó đã được nhiều tác giả
phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng đơn bội (1x), dòng thuần nhị bội kép
(2x), cố định ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng lai F1 để tạo giống
thuần mang tính trạng ưu thế lai).
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 5
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
Năm 1959, Tulecke và Nickell đã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật quy
mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm. Năm 1977, Noguchi và cs đã nuôi cấy tế bào
thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20,000 lít. Năm 1978, Tabata và cs đã nuôi tế
bào cây thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin. Họ đã chọn lọc được
dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn. Năm 1985,
Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở
Hyoscyamus muticus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự
nhiên. Hiện nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ, mô rễ của nhân sâm) trong
các bioreactor dung tích lớn đã được thương mại hoá ở mức công nghiệp để sản xuất
sinh dược.
1.3. Nguyên lý thực hiện
1.3.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào
1.3.1.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào

thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di
truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genome). Đặc tính của
thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển
phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào.
Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi
trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn
chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ.
1.3.1.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và phản phân
hoá tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện chức
năng cụ thể khác nhau. Các mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất định nhờ vào
sự phân hoá.
Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của
mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân hoá
có thể diễn như sau:
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 6
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức năng
Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả
năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp,chúng lại
có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hoá,
quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào.

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá
gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được
hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Quá
trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử
DNA của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế
bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen được

hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn
trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994).
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết
quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét
cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi
nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng
dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năngcủa tế bào
thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ
sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là Auxin
và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo
ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật được biểu thị ở sơ đồ bên. Theo sơ
đồ, khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4-
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 7
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô
nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi cấy sẽ theo hướng
tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus).
1.2. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá trình
này có thể chia thành các nhân tố sau:
1.2.1. Môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được xem
là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy được
xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng
và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Cho đến nay, đã có nhiều môi
trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ thuộc vào
đối tượng và mục đích nuôi cấy. Vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp cho cây sinh
trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nôi cấy mô là rất quan trọng. Môi
trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối khoáng đa lượng, vi
lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hoà sinh trưởng (cũng có thể bổ

sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước dừa …) tuỳ từng loài,
giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ thể mà dinh dưỡng cần
cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau. Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn môi
trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô
trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất phải cần độ chính xác
cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể.
Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau:
+ Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng
hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất
các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991). Nguồn
cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp mô tế bào thực vật
tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài ra nó đóng vai trò là
chất thẩm thấu chính của môi trường. Người ta thường sử dụng 2 loại đường đó là
saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994).
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 8
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
+ Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển mô.
Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là NH
4
+
và NO
3
-
(nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO
3
-
của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so
với NH
4
+

. Nhưng đôi khi NO
3
-
gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải
pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất.
+ Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg, Ca… cần
thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy. Nhìn chung, các nguyên tố này được sử dụng
ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Các nguyên tố này có chức năng cung cấp
nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc giúp
cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường được thuận lợi.
Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể lựachọn
sử dụng. Nói chung, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho việc hình thànhchồi,
còn môi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn. Thành phần
khoáng của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng nồng độ của những ion
khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l). Việc lựa chọn thành
phầnvà hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất khó đòi hỏi người làm
công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với dinh
dưỡng khoáng.
+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất quan
trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóngvai trò quan
trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so
với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây
(Nguyễn Văn Uyển, 1993).
+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được Vitamin, nhưng
không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số
Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ
mô và giai đoạn nuôi cấy. Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những
Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp
khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994).
+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm

men, cà rốt, chối, khoai tây được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 9
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ
năm 1941 và được sử dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro.
Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và DNA.
Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô
như: Myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin
(Nguyễn Văn Uyển, 1993).
+ Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của tảo có
khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thoáng khí của môi trường thạch có ảnh
hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động trong
khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy.
1.4.2. Các chất điều hoà sinh trưởng
Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển của
thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của
thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá trình
lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon có thể chia thành 5
nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu tố quan
trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy.
+ Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA (Indol
acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật Auxin
thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo,
kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
+ Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế
bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp chất
thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6-
Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì
Kenitin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành rẻ.
Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các nồng độ

khác nhau. Ở nồng độ thấp (10-7- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở
nồng độ 10-6- 10-5M chúng kích thích sự phân hoá chồi. Trong nuôi cấy
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 10
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
mô để kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 10-6-
10-4 (Lê Văn Chi, 1992).
+ Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan trọng
nhất là GA3 (Gibberellin acid 3). GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại
hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó GA3 còn có tác dụng
phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ (Street,
1973). Ngoài ra, có còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật
và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây.
+ Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn được dùng
trong nuôi cấy tế bào in vitro. ABA có ảnh hưởng âm tính đến mô nuôi cấy, khi ABA
tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ (lê Văn Chi,
1992).
+ Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở giai đoạn
sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn. Trong một số trường
hợp, Ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường hợp nó lại
kìm hãm quá trình này (Nguyễn Văn Uyên, 1993).
Ngoài ra, cần phải chú ý tới độ pH của môi trường vì nó ảnh hưởng khá rõ nét tới
khả năng hoà tan các chất khoáng trong môi trường. Sự ổn định của môi trường,
khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây. Nếu pH thấp (<4,5) hặc (>7,0) đều gây ức
chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro. Nên việc xác định được độ
pH ban đầu của môi trường cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mô cấy là cần
thiết. Độ pH thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6
-6.
1.4.3. Môi trường vật lý
Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó là
ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ.

+ Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của các
mô nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng,
cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng.
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 11
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi
cấy. Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày. Cường độ
ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Cường độ ánh sáng
cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi
(Ammirato, 1986). Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ
1000 - 7000 lux (Moresin, 1974). Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng
thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi
cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn
ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh
trưởng của mô sẹo.
Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn
huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux.
+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình
trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của Auxin,
do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Theo kết quả nghiên cứu của
Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 200C/150C hoặc 200C/180Ctỷ lệ ra rễ
đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn. Ở nhiệt độ trung bình thì
hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Còn ở nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế bào không
có tổ chức. Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban ngày từ
25 - 300C và ban đêm từ 17 - 200C.
+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên ta không
cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô.
1.2.4. Vật liệu nuôi cấy
Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân
giống in vitro. Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá đều có tính toàn

năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công. Thực tế cho thấy các loài tế bào và các
loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau. Một nguyên tắc cơ bản
trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng
nuôi cấy thành công càng cao. Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi
đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non,
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 12
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
tượng tầng… sau đó là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai
đoạn non (Nguyễn Đức Thành, 2000); (Nguyễn Quang Thạch, 1995).
1.4.5. Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy in
vitro. Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ
bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại.
Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt
đối. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng mẫu thích
hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn nuôi cấy vô trùng. Chọn đúng
phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ
đạt tốc độ sinh trưởng nhanh.
Phương tiện khử trùng
• Nồi hấp tiệt trùng: sử dụng cho việc khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ
nuôi cấy bằng hơi nước có áp suất và nhiệt độ cao (1,2 - 1,5 atm, 120 -1300C).
• Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy
• Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người ta thường
sử dụng các dung dịch như HgCl2 (clorua thuỷ ngân), Na0Cl (Hypoclorit natri),
Ca (0Cl)2 (Hypoclorit canxi), H202 (ôxi già) (Street, 1974)…cồn dùng để khử trùng
mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.
• Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng được ở
nhiệt độ cao như dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà sinh trưởng. Hiện nay,
người ta thường sử dụng một hệ thống bơm khử trùng dung tích lớn để thanh trùng
các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền phù tế bào.

• Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng phải
được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp chiếu
đèn tử ngoại.
• Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box. Thiết bị
này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô
trùng về phía người ngồi thao tác.
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 13
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
1.2.6. Buồng nuôi cấy
Buồng nuôi cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng cấy cần phải đảm
bảo các điều kiện:
- Nhiệt độ: 25 - 300C
- Ánh sáng đạt 2000 - 3000 lux.
- Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài.
1.3. Mục đích nuôi cấy mô
1.3.1. Ưu điểm của vi nhân giống
Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể tạo ra một
quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương
mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền.
Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi
nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo
thành hàng triệu cây.
Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân
dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay
đồng hợp.
Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm,
không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây
tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và
trong nhà kính theo phương pháp truyền thống.
Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để

loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo
ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc.
Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác nhau
có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro (trong ống nghiệm) hoặc
trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ.
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 14
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ
dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là
sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế.
Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời gian
nào, không phụ thuộc mùa vụ.
1.3.2. Hạn chế của vi nhân giống
Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải
tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống. Nhiều cây
trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu
thương mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy
và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp.
Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo.
Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như
chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác
với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ
được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân
giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng
các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục
nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền.
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CHO CÂY THÂN GỖ
2.1. Đặc điểm cây thân gỗ
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 15

ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
Nhân giống nuôi cấy mô để cho cây thân gỗ ở Việt Nam còn mới, một số cây
thân gỗ như: cây thông đỏ, cây bạch đàn, cây keo lai, cây tre… Mục đích đem lại của
việc tạo là thường tạo ra để chống xói mòn, sạt lở đất do thiên tai hay lấy nguồn gỗ
cho nhiều nguồn có giá trị kinh tế cao.
Cây thân gỗ là sống lâu năm, thường một số cây nhân giống có nguồn gốc xuất
xứ từ các nước du nhập vào trong nước, như cây keo lai có nguồn gốc ở Australia
được trồng phổ biến ở Đông Nam Á, ở Việt Nam cây được trồng rộng rãi trên toàn
quốc trong những năm gần đây. Cây thân gỗ mọc tốt ở hầu hết các dạng đất, thích nghi
cao, thường tận dụng các loại đất bạc màu, khô cằn. Bằng các kỹ thuật hiẹn đại các
nhà nhân giống thường tạo ra các giống cây để thích nghi với các điều kiện khắc
nghiệt của khí hậu.
Trên thực tế cây thân gỗ cho năng suất còn rất thấp, sản phẩm tạo ra không
những ít mà còn phát triển cũng khó khăn. Nguyên nhân là do phần gỗ quá nhiều làm
tế bào thiếu nước, trong cây thường chứa nhiều chất hạn chế quá trình phản phân hóa
chủa tế bào. Khi thực hiên nuôi cấy trên cây thân gỗ cần nghiên cứu chính xác từng
loại cây để taaoj ra năng suất như mong muốn.
2.2. Phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống
2.2.1. Vi nhân giống cây thân gỗ còn non
Cây còn non là cây trồng từ hạt được một năm tuổi. Nhân giống thông qua hai
con đường nuôi cấy cơ quan và nuôi cấy phôi. Thông dụng là nuôi cấy cơ quan. nuôi
cấy cơ quan và nuôi cấy phôi khác nhau ở chỗ phát sinh chồi ngọn hay chồi bên đầu
tiên và sau đó phát triển rễ, cây hoàn chỉnh được tái tạo.
Trong nuôi cấy phôi thì phôi phát sinh đầu tiên sau đó hình thành lá mấm và rễ,
là giai đoạn nảy mầm thành cây hoàn chỉnh.
2.2.1.1. Nuôi cấy cơ quan
Các bước nhân giống và môi trường 4 bước
- Hình thành chồi từ mẫu cây đưa vào nuôi cấy
- Vươn thân và nhân giống
- Tạo rễ

SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 16
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
- Thuần hoá cây con in vitro
Chọn môi trường nuôi cấy cho từng bước phụ thuộc vào từng loại cây, từ nồng
độ thấp đến cao. Thường người ta bổ sung môi trường cơ bản được chọn lựa trước phù
hợp cho từng loại cây và từng bước nhân giống.
+ Tạo chồi:
Mẫu đang phát triển cho khả năng tạo chồi cao
Mẫu non và chứa nhiều dinh dưỡng có nhu mô phân sinh có khả năng tạo chồi
cao. chồi mầm cây từ hạt còn non có khả năng tạo chồi nhiêu hơn cây già. Phôi hợp tử
trưởng thành,lá mầm, phần trên lá mầm và chồi bên của lá, các bộ phận này chứa
nhiều mô phân sinh, tạo được chồi ngọn hay chồi bên.
Chồi thường được tạo trên môi trường có Cytokinin với nồng độ 0,5-5%, trên
5% phương pháp chồi ngọn và chồi bên xuất hiện chậm lại sau 4-6 tháng.
+ Vươn thân và nhân giống
Môi trường cho vươn thân giống môi trường nhân giống nhưng không có
cytokinin. Sử dụng than hoạt tính (0,5-1%) rất cần thiết cho sự vươn thân. Đường
Sacaroza 3% thích hợp cho sự vươn thân và nhân giống, 2% cho tạo rễ. Môi trường
lỏng hay môi trường lỏng trên lớp agar thích hợp cho vươn thân.
Hình 2.1. Vi nhân giống cây caphe
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 17
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
Nhân giống được thực hiện bằng hai phương pháp:
1. Phưong pháp cắt đốt có thể có hay không có cytokinin
2. Phương pháp nhân theo cụm chồi, có sử dụng cytokinin kích thích chồi phát
sinh và phát triển. phương pháp này thường dùng đối với cây thân gỗ.
+ Tạo rễ và thuần hoá
Sự tạo rễ chịu ảnh hưởng của Auxin, cách xử lí Auxin, chất lượng chồi. Tuổi sinh
lý, giống cây và nhiệt độ. Để tạo rễ cây thường được cấy vào môi trường có Auxin như
IBA, NAA hay cả hai loại với nồng độ 0,1-5 phương pháp cho IBA và 0,1-5 phương

phápm cho NAA. Nồng độ và thời gian xử lí phọ thuộc vào giống. Tạo rễ và thuần hoá
thường đi đôi với nhau. Trong thời gian thuần hóa cây non cần được duy trì ở tình
trạng tự dưỡng, giảm độ ẩm từ 90% đến xuống 30-50%, lá dày lên và rễ phát triển.
2.2.1.2. Nuôi cấy phôi
+ Các bước nhân giống và môi trường
Tạo cây từ phôi trải qua 5 bước
Tạo phôi
Nhân phôi
Phát triển và trường thành phôi
Nảy mầm của phôi
Thuần hoá cây con in vitro
Môi trường nuôi cấy giống như môi trường nuôi cấy cơ quan. Thêm ABA vào
trong môi trường cho sự phát triển phôi trưởng thành là cần thiết
+ Phát sinh phôi và nhân phôi:
Phôi hợp tử chưa trường thành, 3-5 tuần được dùng làm nguyên liệu tạo phôi. BA
(0,5-5 phương phápm) và 2,4D (1-10phương phápm) được dùng để tạo phôi. Auxin rất
cần thiết cho sự phát sinh và phát triển phôi trưởng thành đồng nhất. Nhân phôi bằng
môi trường lỏng được sử dụng phổ biến hiện nay.
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 18
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
+ Sự phát triển và trường thành của phôi
Để phôi phát triển và trưỏng thành cần có ABA (10-20phương phápm). ABA
kích thích sự hình thành nơi dự trữ lipít, protein, và carbohydrat trong sự phát triển
phôi là cần thiết cho phôi nảy mầm. môi trường có áp suất thẩm thấu cao, sự trao đỏI
tốt O
2
và CO
2
cảI thiện chất lượng và số lượng phôi được tạo ra. Dùng đường
Saccaroza 12% tạo áp suất thẩm thấu lớn, tăng sự trưởng thành và làm khô phôi. Đối

với cây thân gỗ, sự hình thành phôi trên môi trường không có Auxin.
+ Sự nảy mầm của phôi.
Sự nảy mầm của phôi thường được thực hiện trên môi trường agar, nhưng khă
năng tái sinh cây từ phôi cây thân gỗ là thấp. Tái sinh phôi trên cầu giấy đặt trên môi
trường lỏng có ẩm độ cao cảI thiện được khả năng tái sinh.
Đưa cây ra đồng ruộng
Thể nhân giống được tâi sinh từ chồi hay in vitro phải được đưa ra thử nghiệm
trên đồng ruộng so sánh với cây từ hạt và giâm cành. Nhưng sinh trưởng và phát triển
của thể nhân giống đôi khi khác về sinh lý và di truyền xuất hiện trong quá trình nhân
giống. Nên rất cẩn thận khi nuôi cấy thể nhân giống trên đồng ruộng trước khi nhân
hàng loạt.
+ Nhân thể nhân giống qua phát sinh cơ quan
- Nhân giống cây thân gỗ sinh trường như cây từ hạt
- Thể nhân giống từ những chồi non có trạng thái chín cây tốt và có khuynh
hướng tạo những chồi ngọn sát nhau, có chiều cao giống nhau, đường kính cây hơi
nhỏ hơn.
- Cây từ giâm cành thường tốt hơn thể nhân giống.
+ Nhân thể nhân giống qua phát sinh phôi:
Sự hình thành thể nhân giống qua phát sinh phôi vẫn chưa được thử nghiệm hoàn
chỉnh.
2.2.2. Vi nhân giống cây thân gỗ trưởng thành
Nhân giống vô tính cây trưởng thành khó hơn cây còn non
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 19
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
Có hai loại mẫu được dùng:
1. Mô non ở gần gốc
2. Chồi trưởng thành ở đỉnh cây
2.2.2.1.Nuôi cấy cơ quan:
+Xử lí cây mẹ
Cây mẹ có tuổi trưởng thành lớn tuổI được đem đi giâm cành, chiết cành trước

khi đưa vào nuôi cấy in vitro nhằm để tạo mô non hoá.
+ Có 4 bước nhân giống
1. Tạo chồi
2. Vươn thân và nhân giống
3. Tạo rễ
4. Thuần hoá cây in vitro
Môi trường nhân giống như nuôi cấy cây còn non. Trên môi trường bổ sung
than hoạt tính giúp vươn thân
+ Tạo chồi:
Chọn mẫu đang tăng trưởng, có nhu mô đỉnh hay chồì bên được kích thích tạo
chồi, trên mẫu cấy có sẵn 1-2 mm. Chọn những chồi non vươn ra ánh sáng thì khả
năng tạo chồi cao.
+ Vươn thân và nhân giống
Môi trường chồi vươn thân không có chất kích thích sinh trưởng và bổ sung than
hoạt tính (0,5-2%), khi vươn thân có rễ thì đem nhân giống. ĐốI với nhiều cây thân
gỗ,khi chồi xuất hiện, thường được tách ra và cấy trên môi trường có nồng độ chất
sinh trưởng thấp như BA (0,202 ppm) BA+IBA, BA+IBA+GA
3
. Tuy nhiên mẫu được
nuôi cấy trên môi trường có cytokinin+ than hoạt tính hay không có cytokinin thì cây
được trẻ hoá.
+ Tạo rễ và thuần hoá
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 20
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
Đối với mẫu già, Auxin cần thiết cho tạo rễ thường dùng IBA hay IBA+ NAA để
tạo rễ. Nhân tố quyết định đến sự ra rễ: Dùng chồi có chất lượng, cơ chất xốp, phun
sương giữ ẩm và giảm nhiệt độ ban ngày, tách mô sẹo ở gốc và môi trường nuôi cấy
tạo rễ có 6% đường Sacaroza.
+ Thử ngiệm trên đồng ruộng và trẻ hoá:
Khả năng làm trẻ lại có thể được thực hiện khi xử lí cây mẹ bằng các kĩ thuật

nông học, chọn mẫu nuôi cấy, nuôi cấy in vitro và môi trường hay những xử lí mang
tính chất vật lí khác
Phụ thuộc vào mục tiêu sử dụng thể nhân giống:
1. Trẻ lại hay trẻ lại ở mức độ nào đó, cây có tc hình thái trẻ hơn cho thấy cần thiết
trồng trên các khu rùng.
2. Các thể nhân giống chín hơn cần thiết để ra hoa kết hạt.
+ Chỉ thị hoá sinh:
Để tránh nhiều tháng chờ đợi và đôi khi hàng nhiều năm để quan sát những ảnh
hưởng của các xl khác nhau trên hình thái, sinh lý, tập tính tái sinh của những thể nhân
giống tử cây trưởng thành, những phương pháp chỉ thị hoá sinh được sử dụng để
nghiên cứu.
Nghiên cứu tỉ lệ K/Ca trong mô chịu ảnh hưởng của cytokinin và mức độ trẻ
của chồi trong nuôi cấy.
Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để nghiên cứu những ảnh hưởng của
trưởng thành đến những đặc tính hình thái và quang hợp ở cây trưởng thành giúp ta
phát hiện những chỉ thị trẻ lại.
2.2.2. Sơ đồ quy trình
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 21
Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc
Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô
trùng
Chuyển cây ra đất trồng
Tạo rễ
Nhân nhanh chồi
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
2.2.2. Thuyết minh qui trình
Quá trình vi nhân giống thông thường gồm năm giai đoạn chính, mỗi một giai
đoạn có những yêu cầu riêng.
2.2.2.1. Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc
Chọn cây mẹ để lấy mẫu, thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao.

- Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non,
lá non v.v…
- Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ
được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định. Tùy điều kiện, giai đoạn này có
thể kéo dài 3 - 6 tháng.
2.2.2.2. Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng
- Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
- Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi.
Giai đoạn nuôi cấy này gọi là cấy mẫu in vitro.
- Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ
trong phòng với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất định, từ
mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc
phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính. Giai đoạn 2 thường yêu cầu 2 - 12
tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển.
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 22
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu
sau:
- Tỷ lệ nhiễm thấp.
- Tỷ lệ sống cao.
- Tốc độ sinh trưởng nhanh.
Kết quả bước cấy gây này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu. Quan trọng nhất
vẫn là đỉnh sinh truởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá,
rễ…
Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh
dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh.
2.2.2.3. Nhân nhanh chồi
- Thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu hóa nhằm đạt mục đích
nhân nhanh.
- Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1- 2 tháng tùy loại cây. Hệ số

nhân nhanh là 2 - 8 lần/ 1 lần cấy chuyển. Nhìn chung giai đoạn 3 thường yêu cầu 10-
36 tháng và cũng không nên kéo dài quá lâu. Ví dụ từ đỉnh sinh trưởng của 1 cây chuối
chọn lọc ban đầu, người ta chỉ nên nhân khoảng 2000 - 3000 chồi sau 7 - 8 lần cấy
chuyển để tránh biến dị sôma. Đối với các cây khác như mía, hoa cúc, phong lan sau 1
năm có thể nhân được trên 1 triệu chồi từ 1 cây mẹ ban đầu.
 Những khả năng tạo cây đó là:
- Phát triển chồi nách.
- Tạo phôi vô tính.
- Tạo đỉnh sinh trưởng mới.
 Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan,
đặc biệt là chồi như:
- Bổ sung tổ hợp phytohormone mới (tăng cytokinin giảm auxin). Tăng tỷ lệ
auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh
chồi.
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 23
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
- Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu 1.000 lux. Trong thực tế
nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng khỏi
ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng. Ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích
phân hóa mạnh. Ánh sáng đỏ có ảnh hưởng giống cytokinin (cytokinin-like effect), nó
tạo nên sự tích lũy cytokinin trong mô của một số loài, chính lượng cytokinin này đã
góp phần kích thích quá trình phát sinh cơ quan và tạo chồi từ những mô nuôi cấy in
vitro.
- Bảo đảm chế độ nhiệt độ trong khoảng 20-30
o
C. Trường hợp những loài có
nguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vào khoảng từ 32-35
o
C. Ngược lại,
đối với những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo cụm chồi

phải < 30
o
C.
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân
nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích.
2.2.2.4. Tạo rễ
- Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhưng
thông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích
thích tạo rễ. ở một số loài khác, các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra đất.
Giai đoạn 4 thông thường cần 2 - 8 tuần.
2.2.2.5. Chuyển cây ra đất trồng
- Đây là giai đoạn đầu tiên, trong đó cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của
phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên. Đối với một số loài có thể chuyển chồi chưa có rễ
ra đất, nhưng đa số chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra
vườn ươm. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây cần sự chăm sóc đặc
biệt. Vì cây chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều
kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần phải đáp ứng các yêu cầu:
+ Cây được che phủ bằng nilon, tưới phun sương đảm bảo cung cấp độ ẩm và
làm mát
+ Giá thể trồng cây có thể là đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất,
mùn cưa và bọt biển. Giai đoạn 5 thường đòi hỏi 4 - 16 tuần
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 24
ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ 1 GVHD: ĐẶNG ĐỨC LONG
Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải được
chăm sóc và bảo bệ trước những yếu tố bất lợi sau:
- Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô.
- Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn.
- Cháy lá do nắng
2.3. Một số quy trình cụ thể
2.3.1. Qui trình nhân giống cây keo lai

Keo lai là loài cây trồng quan trọng và rất có triển vọng trong nhiều chương trình
trồng rừng ở Việt Nam, đặc biệt trên những vùng đất bị thoái hóa.Trong quản lý giống
cây lâm nghiệp thì yếu tố chất lượng di truyền của giống là quan trọng nhất vì nó
quyết định năng suất và chất lượng của rừng trồng. Cây keo lai nhân giống bằng công
nghệ nuôi cấy mô có những ưu điểm:
Các cây con đồng nhất về mặt di truyền, mang đây đủ những ưu thế lai của cây mẹ.
• Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất.
• Nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1 m2 nền có
thể để được tới 18.000 cây.
• Cây được làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm
các cây giống sạch bệnh, khoẻ mạnh.
• Cây keo lai cấy mô sau khi trồng có tốc độ sinh trưởng nhanh và đồng đều, thân
lên thẳng, ít phân nhánh, không chẻ thân, có rễ cọc chắc chắn, thân không giòn, chịu
được gió mạnh, ít đổ ngã nên có thể trồng thành cây lâu năm lấy gỗ, nâng cao giá trị
kinh tế.
2.3.1.1. Vào mẫu
1. Nguyên liệu và cách tiến hành:
• Chọn mẫu là những cành bánh tẻ từ những cây có chồi và lá phát triển đều, cân
đối.
SVTH: NGUYỄN THANH NHIỀU_LỚP 12SHLT 25