bài giảng thí nghiệm hóa sinh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI GIẢNG
THỰC HÀNH
HÓA SINH
TS. Nguyễn Hoài Hương
CN. Bùi Văn Thế Vinh
Dùng cho sinh viên ngành Môi trường và Công nghệ Sinh học
Năm xuất bản: 2009
2
MỤC LỤC
Trang
Giới thiệu môn học
4
Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm Hóa
sinh
5
1.
An toàn khi làm việc với axit và kiềm
5
2.
Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm
6
Bài 1
Cách pha chế các dung dịch dùng trong thí
nghiệm Hóa sinh
8
I
Lý thuyết
8

1.
Dung dịch
8
2.
Dung dịch đệm
14
II
Thực hành
20
III
Bài nộp
20
Bài 2
Định lượng đường khử bằng phương pháp Acid
dinitro-salicylic (DNS)
21
I
Lý thuyết
21
1.
Định nghĩa
21
2.
Nguyên tắc
21
3.
Xử lý mẫu
21
II
Thực hành

22
1.
Dụng cụ - hóa chất
22
2.
Tiến hành thí nghiệm
23
3.
Tính kết quả
24
III
Bài nộp
24
Bài 3
Định lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp
Kjeldahl
25
I
Lý thuyết
25
1.
Định nghĩa
25
3
2.
Nguyên tắc
26
II
Thực hành
26

1.
Dụng cụ - hóa chất
26
2.
Tiến hành thí nghiệm
27
3.
Tính kết quả
28
III
Bài nộp
28
Bài 4
Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
30
I
Lý thuyết
30
1.
Định nghĩa
30
2.
Nguyên tắc
30
II
Thực hành
31
1.
Dụng cụ - hóa chất
31

2.
Tiến hành thí nghiệm
31
3.
Tính kết quả
32
III
Bài nộp
32
Bài 5
Phương pháp xác định hoạt tính enzyme
33
I
Lý thuyết
33
1.
Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme
33
2.
Phương pháp xác định hoạt tính enzyme
34
3.
Enzyme amylase và phương pháp xác định hoạt
tính
35
II
Thực hành
36
1.
Dụng cụ - hóa chất

36
2.
Tiến hành thí nghiệm
36
3.
Tính kết quả
38
III
Bài nộp
Tài liệu tham khảo
38
39
4
GIỚI THIỆU MÔN HỌC
Bài giảng “Thực hành sinh hoá” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Môi
trường & Công nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM.
Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí
nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính của
học phần lý thuyết hóa sinh cơ sở.
1. Giới thiệu phòng thí nghiệm hóa sinh, cách pha chế các dung dịch dung
trong thí nghiệm hóa sinh ;
2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS);
3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl;
4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford;
5. Xác định hoạt tính enzyme amylase.
5
QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA
SINH
I. An toàn khi làm việc với axit và kiềm
1. An toàn khi làm việc với axit:

Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản
ứng với các hơi axit tự do.
Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp.
Giữ để axit không bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng tay và
kính bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn.
Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng.
H
2
SO
4
: Luôn cho acid vào nước khi pha loãng, sử dụng khẩu trang và găng tay
để tránh phòng khi văng acid
Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo hộ.
2. An toàn khi làm việc với kiềm
Kiềm có thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp.
Mang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc.
Thao tác trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm.
Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da, mang găng tay cao su, khẩu trang,
thiết bị bảo vệ hệ thống hô hấp. Hơi amoniac dễ cháy, phản ứng mạnh với chất oxy
hoá, halogen, axit mạnh.
Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kim loại nặng: Ag,
Pb, Zn và muối của chúng.
Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO
2
, halogen, axit
mạnh, dẫn xuất clo của hydrocacbon. Tạo hơi ăn mòn khi cháy. Cần mang dụng cụ
bảo vệ da mắt. Chỉ sử dụng cồn khô khi tạo dung dịch natri alcoholate, cho vào từ từ.
Tránh tạo tinh thể cứng khi hoà tan. Tương tự khi hoà tan với nước, đồng thời phải
làm lạnh nhanh.
Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ da mắt, đường

hô hấp do dễ nhiểm bụi oxit.
6
Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước. Các biện pháp
an toàn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ không được làm ngược lại.
II. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm
1. Hoá chất thí nghiệm:
Các hoá chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, trong phòng thí
nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm.
Hoá chất có thể ở dạng rắn (Na, MgO, NaOH, KCl, (CH
3
COO)
2
; lỏng (H
2
SO
4
,
aceton, ethanon, chloroform, ) hoặc khí (Cl
2
, NH
3
, N
2
, C
2
H
2
) và mức độ tinh khiết
khác nhau:
- Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90%

- Sạch phân tích (PA): độ sạch < 99%
- Sạch hóa học (PC): độ sạch > 99%
Hóa chất có độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khác
nhau và chỉ nên sử dụng hóa chất còn nhãn hiệu.
2. Nhãn hiệu hoá chất:
Hóa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi
tên hoá chất, công thức hóa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng
phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản.
3. Cách sử dụng và bảo quản hoá chất:
Khi làm việc với hóa chất, nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức
cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. Những điều
cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hóa chất được tóm tắt như sau:
- Hóa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vô cơ,
muối, acid, bazơ, kim loại, ) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm.
- Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước
khi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu.
- Chai lọ hóa chất phải có nắp. Trước khi mở chai hóa chất phải lau sạch nắp,
cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hóa chất đựng trong chai.
- Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai
lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối.
7
- Dụng cụ dùng để lấy hóa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay,
không dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hóa chất.
- Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa. Khi
cần sử dụng các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi, phải đưa vào tủ hút, chú ý đậy kín nắp
sau khi lấy hóa chất xong.
- Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ, không ngửi hay nếm
thử hóa chất.
- Khi làm việc với acid hay base mạnh:
Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha loãng (không được đổ nước

vào acid hay base);
Không hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống
bóp cao su.
Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bôi lên vết
bỏng NaHCO
3
1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH
3
COOH 1% (nếu bỏng base). Nếu
bị bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%.
Trường hợp bị hóa chất vào miệng hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệng và
uống nước lạnh có MgO, nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh có CH
3
COOH
1%.
Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm:
8
BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH
DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM HÓA SINH
I. Lý thuyết
1.1. Dung dịch
Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về
mặt vật lý và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi. Nếu chất
hòa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất.
Tùy theo tính chất của dung môi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch
khan. Phần lớn các dung dịch acid, base, muối trong phòng thí nghiệm là dung dịch
nước, dùng dung môi là nước. Một số chất khác tan trong dung môi hữu cơ.
Hàm lượng chất hòa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. Có
nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị, phân
tích và tính toán khác nhau.

1.1.1. Các đơn vị nồng độ dung dịch
a) Nồng độ phần trăm, (%)
i) Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan có
trong 100g dung dịch.
Ví dụ: dung dịch NH
4
Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH
4
Cl
ii) Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung
dịch.
Ví dụ: dung dịch CuSO
4
10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO
4
iii) Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất có trong
100ml dung dịch.
Ví dụ: dung dịch glycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerine.
b) Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch.
c) Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam
(hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch KH
2
PO
4
M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam
KH
2
PO
4

.
9
d) Nồng độ đương lượng (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1
lit dung dịch.
Số đương lượng chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)
Hệ số đương lượng (z): phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà
chất đó tham gia.
i) Nếu phản ứng là phản ứng acid, base: z là số ion H
+
hay OH
-
mà 1 phân tử,
ion của chất đó tác dụng vừa đủ.
Ví dụ: Phản ứng giữa HCl và NaOH
H
2
SO
4
+ 2 NaOH → Na
2
SO
4
+ 2 H
2
O
H
2
SO
4
→ 2 H

+
 z = 2
NaOH → 1 OH
-
 z = 1
ii) Nếu phản ứng là phản ứng ôxy – hóa khử: z là số electron mà 1 phân tử, ion
của chất đó cho hay nhận.
Ví dụ: 2 Na
2
S
2
O
3
+ I
2
→ Na
2
S
4
O
6
+ 2 NaI
I + 1e → I
-
 z = 1
S
2+
- 1e → S
+
 z = 1

e) Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan
có mặt trong dung dịch.
f) Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng :
- Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch
- Miligam phần trăm, mg%: mg chất hòa tan trong 100g dung dịch.
- Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hòa tan trong 100g dung dịch.
- Phần nghìn,
0
/
00
: số g chất hòa tan trong 1000g dung dịch.
- Phần triệu, ppm: số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch.
- Phần tỷ, ppb: số µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch.
1.1.2. Cách pha dung dịch có nồng độ xác định
a) Pha dung dịch có nồng độ phần trăm theo khối lượng, % (w/w)
i) Chất tan là chất rắn khan:
Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w)
100g dung dịch cần 40g NaOH
500g dung dịch cần X g?
10
Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g
Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml)
Vậy, cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất, hòa tan ta được 500g dung
dịch NaOH 40%
ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO
4
.5H
2
O; Na
2

HPO
4
. 12H
2
O; )
Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn.
Ví dụ: Pha 320g dung dịch CuSO
4
10% (w/w) từ CuSO
4
.5H
2
O
M(CuSO
4
) = 160 và M(CuSO
4
.5H
2
O) = 250
Lượng CuSO
4
khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g
Lượng CuSO
4
.5H
2
O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g
Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml)
Vậy, cân 50g CuSO

4
.5H
2
O, đong 270ml nước cất, hòa tan ta được 320g dung
dịch CuSO
4
10%.
b) Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn:
Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10%
Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g
Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g
Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g
Vậy, đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%, hòa tan ta được 500g
NaOH 5%
c) Pha dung dịch bão hoà:
Lấy chất tan cần pha vào becher, thêm một ít nước cất và khuấy cho tan. Nếu
sau khi khuấy, chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung
dịch bão hòa. Nếu chất tan tan hết, thêm chất tan và tiếp tục khuấy, cứ như thế cho
đến khi chất tan không còn tan được nữa.
d) Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích
i) Chất tan là chất rắn khan
Cân lượng chất tan cần thiết, chuyển sang bình định mức, dùng nước cất hòa
tan và định mức đến thể tích đúng.
Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v)
Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g
11
Vậy, cân 50g NaCl, hòa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất, ta được 1 lít
dung dịch NaCl 5%.
ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO
4

.5H
2
O; Na
2
HPO
4
. 12H
2
O; )
Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh có sẵn giống như ở
phần a.
iii) Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H
2
SO
4

Việc cân không thuận lợi, có thể đưa về đơn vị thể tích theo công thức
V = M/d
V: Thể tích chất lỏng; M: khối lượng chất lỏng cần cân; d: tỷ trọng chất lòng
Chú ý: Các hóa chất lỏng bán trên thị trường thường không ở dạng nguyên chất
mà là các dung dịch đậm đặc. Giới hạn hòa tan tối đa được tính bằng % thể tích và
thay đổi tùy theo loại hóa chất. Ví dụ như H
2
SO
4
: 95-98%; HCl: 37%; H
3
PO
4
: 65-

85%; NH
4
OH: 25%. Do đó khi pha các dung dịch từ các loại hóa chất này ta phải chú
ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc.
Ví dụ: Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml)
Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4,4g
Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4,4)/37 = 11,9g
= 11,9/1,19 = 10 ml
Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml
Vậy, dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%, và 430ml nước cất ta được
440 ml HCl 1%
Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí
nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm
được pha chế theo nồng độ khối lượng - thể tích (w/v).
e) Pha dung dịch nồng độ phân tử gam
i) Chất tan là chất rắn khan
Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó, ta tính khối lượng phân
tử chất đó (hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan, qua phễu
cho vào bình định mức có dung tích 1 lít. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ, lắc để
hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức. Chuyển dung dịch sang bình chứa, lắc để
trộn đều đồng nhất.
12
Khi phải đun nóng dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có toả nhiệt thì
phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch
định mức.
Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch KOH 1M
Phân tử lượng của KOH: M
KOH
= 39 +16 +1 =56
Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g

Vậy, cân 56g KOH, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 1000. Đây
là phản ứng tỏa nhiệt, cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít.
Nếu muốn pha dung dịch 2M; 3M hay 0,1M; 0,05M ta cũng tiến hành tương tự
với lượng cân tương ứng.
Ví dụ: Pha 500ml dung dịch KCl 3M
Phân tử lượng của KCl: M
KCl
= 39 +35,5 = 74,5
Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74,5 *3*500)/1000 =
111,75g
Vậy, cân 111,75g KCl, hòa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 500,
định mức đến vạch.
ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước: khi tính lượng chất tan cần cân phải tính
luôn cả khối lượng các phân tử nước.
iii) Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào
nồng độ dung dịch đó.
Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37%
Phân tử lượng HCl: M
HCl
= 1+35,5 = 36,5
Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36,5*100)/37 = 98,65g
Hay 98,65/1,19 = 83ml
Vậy, đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 có sẵn 1 ít nước.
Định mứ c thành 1 lít. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc
hại.
f) Pha nồng độ đương lượng (N)
Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách pha
dung dịch nồng độ phân tử gam (M).
1.1.3. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
13

Khi pha hóa chất, có nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch không
chính xác như việc cân đong không chính xác, các hóa chất không tinh khiết hay bị
hút ẩm. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa, bị oxy hóa, dung môi bay
hơi, vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung
dịch có nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal)
a) Dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và
được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. Các chất dùng
trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng không thay đổi
nhanh chóng theo thời gian.
Pha dung dịch chuẩn, ta phải dùng ống chuẩn. Ống chuẩn là một ống ampun
thủy tinh hay nhựa đóng kín. Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc
dung dịch chất tan. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha
thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn có nồng độ đã ghi trên nhãn ngoài ống.
Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn :
- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức,
dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm
nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức.
- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl,
AgNO
3
, acid oxalic, có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác
chất cần pha, pha loãng và định mức tới thể tích đúng.
- Đối với các chất như NaOH, HCl, Na
2
S
2
O
3
, không thể pha ngay được dung

dịch chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy
sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ.
Ví dụ: NaOH thường nhiễm một lượng Na
2
CO
3
rất dễ chảy nước, HCl dễ bay
hơi, Na
2
S
2
O
3
dễ bị mất nước tinh thể khi để ngoài không khí.
b) Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung
dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh
nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp.
14
Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0,1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn
H
2
SO
4
0,1N để chuẩn độ lại.
Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lại
phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Xét một phản ứng trung hòa acid - base, 1 ion gam H
+
sẽ phản ứng với 1 ion

gam OH
-
. Do đó:
C
1
V
1
= C
2
V
2
Nếu gọi C
p
là nồng độ dung dịch định pha và C
t
là nồng độ thực của dung dịch
ta có hệ số hiệu chỉnh K:
K= C
p
/C
t
= V
p
/V
t
Ví dụ: Dung dịch chuẩn là H
2
SO
4
0,1N, dung dịch định pha là NaOH 0,1N.

Lấy 10ml H
2
SO
4
0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien,
dùng burette chuẩn độ bằng NaOH được 11 ml NaOH
Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : C
t
= (10*0,1)/11 = 0,091 N
Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,91
1.2. Dung dịch đệm:
1.2.1. Định nghĩa dung dịch đệm
pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acid
có mạch nhánh phân ly (COO
-
và NH
4
+
tạo liên kết ion). Họat động tối ưu của protein
phụ thuộc vào cấu trúc không gian nhất định trong môi trường, nghĩa là phụ thuộc vào
tỉ lệ phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nói tóm lại là phụ thuộc vào pH môi
trường.
Dung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắm khi một lượng
nhỏ acid (H
+
) hoặc base (OH
-
) được thêm vào. Như vậy, dung dịch đệm bao gồm một
cặp acid base liên hợp (acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu và muối của
base này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch.

Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số
phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau.
Thí dụ, để có đệm pH ở giá trị 4.75, chọn cặp acid - base CH
3
COOH
(0,1M)/CH
3
COONa (0,1M). Nếu thêm vào dung dịch 0.001 mol HCl thì pH của hệ
vẫn chỉ ở mức 4.748 gần bằng 4.75. Nghĩa là pH thay đổi rất ít.
15
Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng, ví dụ như ổn định
pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate.
Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm có các khoảng đệm khác nhau thành 1
dung dịch là không có vấn đề gì. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào còn tùy thuộc vào
ứng dụng sao cho thành phần của đệm không phản ứng với các cấu tử trong hệ phản
ứng khảo sát theo chiều hướng có hại. Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết
tủa hay tạo phức hoặc oxy hóa khử.
Có dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nó (Ví
dụ: muối natri acetate), dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau:
CH
3
COOH + H
2
O > CH
3
COO
-
+ H
3
O

+
Có dung dịch khác chẳng hạn, chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: ammoniac) với
muối của nó (Ví dụ: muối amoni clorua),trong dung dịch cân bằng có dạng sau:
NH
3
+ H
2
O > NH
4
+
+ OH
-
Dung dịch đệm có pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base.
Khi thêm một lượng acid mạnh (H
3
O
+
), base liên hợp kết hợp với nó cho acid yếu
(cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch)  pH của dung dịch giảm không đáng kể.
Trái lại, khi thêm một lượng base mạnh (OH
-
), acid điện li cho H
3
O
+
(cân bằng
chuyển dịch theo chiều thuận), ion hidroni H
3
O
+

trung hòa OH
-
cho base yếu H
2
O. Kết
quả pH của dung dịch tăng không đáng kể.
Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liên
hợp có trong hỗn hợp.
1.2.2. Cách pha một số dung dịch đệm thường dùng
a) Dung dịch đệm borat:
- Dung dịch acid boric (a): 12,404 g H
3
BO
3
hòa tan và định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch borat (b): 19,108 g Na
2
B
4
O
7
.10H
2
O hòa tan và định mức đến 1000
ml
Dung dịch đệm borat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và
dung dịch (b) theo bảng dưới đây:
A
b
pH

a
b
pH
16
9,80
0,2
6,60
6,50
3,50
8,20
9,70
0,6
6,77
6,00
4,00
8,31
9,40
0,6
7,09
5,50
4,50
8,41
9,00
1,0
7,36
5,00
5,00
8,51
8,75
1,25

7,50
4,50
5,50
8,60
8,50
1,50
7,60
4,00
6,00
8,69
8,00
2,0
7,78
3,00
7,00
8,84
7,70
2,30
7,88
2,00
8,00
8,98
7,50
2,50
7,94
1,00
9,00
9,11
7,00
3,00

8,08
0,00
10,0
9,24
b) Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2)
- Dung dịch acid citric 0,1M (a): 21,01 g C
6
H
8
O
7
.H
2
O hòa tan và định mức đến
1000 ml.
- Dung dịch trinatri citrate 0,1M (b): 29,41 g C
6
H
5
O
7
Na
3
.2H
2
O hòa tan và dẫn
nước đến 1000 ml.
Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch
(a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau:
A

b
pH
A
b
pH
46,5
3,50
3,0
23,0
27,0
4,8
43,8
6,20
3,2
20,5
29,5
5,0
40,0
10,0
3,4
18,0
32,0
5,2
37,0
13,0
3,6
16,0
34,0
5,4
35,0

15,0
3,8
13,7
36,3
5,6
33,0
17,0
4,0
11,8
38,2
5,8
31,0
19,0
4,2
9,5
40,5
6,0
28,0
22,0
4,4
7,2
42,8
6,2
25,5
24,5
4,6
-
-
-
17

c) Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,7 – 8,0)
- Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH
2
PO
4
hòa tan và
định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na
2
HPO
4
.7H
2
O hoặc
71,7 g Na
2
HPO
4
.12H
2
O hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm phosphate có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a)
và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml.
a
b
pH
A
b
pH
93,5

6,50
5,6
45,0
55,0
6,9
92,0
8,00
5,8
39,0
61,0
7,0
90,0
10,0
5,9
33,0
67,0
7,1
87,7
12,3
6,0
28,0
72,0
7,2
85,0
15,0
6,1
23,0
77,0
7,3
81,5

18,5
6,2
19,0
81,0
7,4
77,5
22,5
6,3
16,0
84,0
7,5
73,5
26,5
6,4
13,0
87,0
7,6
68,5
31,5
6,5
10,5
89,5
7,7
62,5
37,5
6,6
8,50
91,5
7,8
56,5

53,5
6,7
7,00
93,0
7,9
51,0
49,0
6,8
5,30
94,7
8,0
d) Dung dịch đệm Na
2
HPO
4
– KH
2
PO
4
(pH = 5,0 – 8,0)
- Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23,9 g Na
2
HPO
4
.12H
2
O hòa tan
và định mức đến 1000 ml.
- Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9,07 g KH
2

PO
4
hòa tan và định
mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml
dung dịch (b).
18
a
b
pH
a
b
pH
10
990
5,0
372
628
6,6
18
982
5,2
492
508
6,8
30
970
5,4
612
388

7,0
49
951
5,6
726
274
7,2
79
921
5,8
818
182
7,4
121
879
6,0
885
115
7,6
184
816
6,2
936
64
7,8
264
736
6,4
969
31

8,0
e) Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6)
- Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến 1000
ml.
- Dung dịch HCl 0,2 M (b): 16,8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml.
Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml
dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.
X
pH
X
pH
5,0
3,6
16,8
2,8
6,4
3,4
24,2
2,6
8,2
3,2
32,4
2,4
11,4
3,0
44,0
2,2
f) Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6)
- Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hòa tan và định mức đến 1000
ml.

- Dung dịch NaOH 0,2 M (b): 8 g NaOH hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm Glycine có pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml
dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml.
19
X
pH
X
pH
4,0
8,6
22,4
9,6
6,0
8,8
72,2
9,8
8,8
9,0
32,0
10,0
12,0
9,2
38,6
10,4
16,8
9,4
45,5
10,6
g) Dung dịch đệm acetate (pH = 3,6 – 5,6)
- Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH

3
COOH đặc và định mức đến
1000 ml.
- Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH
3
COONa hoặc 27,2 g
CH
3
COONa.3H
2
O được hòa tan và định mức đến 1000 ml.
Dung dịch đệm có pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml
dung dịch (b) và định mức đến 100 ml.
a
b
pH
A
b
pH
46,3
3,7
3,6
20,0
30,0
4,8
44,0
6,0
3,8
14,8
35,2

5,0
41,0
9,0
4,0
10,5
39,5
5,2
36,8
13,2
4,2
8,8
41,2
5,4
30,5
19,5
4,4
4,8
45,2
5,6
25,5
24,5
4,6
h)Dung dịch đệm vạn năng 0,1M
- Dung dịch acid acetic 0,1M (a): 5,7 ml CH
3
COOH đặc và định mức bằng
nước cất đến 1000 ml.
- Dung dịch acid phosphoric 0,1M (b): 6,45 ml H
3
PO

4
đậm đặc và định mức
bằng nước cất đến 1000 ml.
- Dung dịch acid ortho-boric 0,1M (c): hòa tan 6,18 g acid ortho-boric trong
nước cất và định mức đến 1000 ml.
20
- Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hòa tan 40 g NaOH trong nước cất và định
mức đến 1000 ml.
Trộn lẫn các dung dịch (a), (b), (c) với thể tích bằng nhau nhận được dung dịch
đệm 0,1M có pH = 1,8. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong khoảng pH =
1,8 đến pH = 12,0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d). Các dung dịch đệm
vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự.
II. Thực hành
Sinh viên pha dung dịch đệm và một số dung dịch sử dụng trong các bài thí
nghiệm sau theo hướng dẫn của giảng viên.
III. Bài nộp
1. Ghi chép phương pháp pha các dung dịch thực chuẩn bị.
2. Làm các bài tập sau:
1. Pha 1 L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân … g NaOH khô
2. Pha 0,5 L dung dịch H2SO4 2M cần bao nhiêu ml H2SO4 đậm đặc, biết rằng H2SO4
đđ là acid 97% có M=98 g/mol, tỉ trọng d=1,84 g/ml.
Nồng độ mol của H2SO4 đđ là:
Thể tích H2SO4 cần sử dụng là:
Lượng nước cần bổ sung là :
3. Pha 250 ml dung dịch CuSO 4 1 M, cân …….g CuSO4.5H2O
4. Pha 1 L dung dịch H2SO4 0.1N từ dung dịch H2SO4 2M:
5. Pha 500 g dung dịch NaOH 10% từ dung dịch NaOH 40%
Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X =
Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y =
Lượng nước cất thêm vào:

6. Pha 500 ml dung dịch HCl 2% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml)
Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X=
Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y =
Lượng nước cất thêm vào:
21
BÀI 2. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO - SALICYLIC (DNS)
I. Lý thuyết
1. Định nghĩa
Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) như
glucose, fructose, arabinose, maltose, lactose; trong khi đó saccharose, trehalose
không phải đường khử.
2. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc
thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với
nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng
540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính
được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:
Acid dinitrosalicylic 3-amino, 5- dinitrosalicylic acid
3. Xử lý mẫu
Tùy vào đối tượng nghiên cứu (hạt, quả, ) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên
cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như
sau:
- Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc
inulin, có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. Cân và cho vào cối sứ 1 g
nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô, đã
được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi). Nếu là nguyên liệu tươi (như
hoa, quả tươi) thì cân 5 – 10 g. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30
22

ml nước cất nóng 70 – 80
o
C. Chuyển tồn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích
1000 ml. Đun cách thủy 70 – 80
o
C trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất
bằng dung dịch chì acetate [Pb(C
2
H
2
O
2
)
2
.3H
2
O] hoặc chì nitrate [Pb(NO
3
)
2
] 10%.
Tránh dùng q dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Sau đó loại bỏ lượng chì
acetate dư bằng dung dịch Na
2
SO
4
bão hòa, để n hỗn hợp 10 phút. Tiếp đó thêm
nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khơ. Nước lọc dùng
làm dung dịch thí nghiệm.
- Trường hợp ngun liệu chứa q nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang,

sắn, khoai tây, cần chiết đường bằng rượu 70 – 80
o
C, đun hỗn hợp cách thủy trong
bình cách thủy có lắp ống làm lạnh khơng khí. Trong trường hợp này khơng cần kết
tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch khơng nhiều.
- Trường hợp các ngun liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua, dứa, chanh,
khế, cần chú ý là trong q tình đun khi chiết, đường saccharose có thể bị thủy phân
một phần. Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose. Trước khi đun
cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na
2
CO
3
bão hòa tới pH 6,4 –
7,0.
II. Thực hành
1. Dụng cụ - hóa chất:
a) Dụng cụ, thiết bị
- Máy so màu hoặc quang phổ kế
- Cuvette d= 1 cm, V = 4 ml
- Ống nghiệm có nắp và các dụng cụ thủy tinh thơng thường khác
- Bếp điện
b) Hóa chất - ngun liệu
- Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt, dứa)
- Thuốc thử DNS
Cân 5g DNS và 300 ml nước cất vào cốc, hòa tan ở 50
0
C, sau đó cho thêm 5ml
dung dòch NaOH 4M. Cuối cùng cho thêm 150g muối tartrat kép hòa tan rồi cho
vào bình đònh mức và thêm nước cất đủ 500ml, đựng trong lọ thủy tinh sẫm màu.
Chuẩn 3 ml thuốc thử DNS bằng HCl 0.1N với chỉ thò là phenolphtalein, nếu hết 5 -

6 ml HCl là được.
23
- Dung dịch glucose chuẩn: pha sẵn dung dịch glucose chuẩn 10 mg/ ml (bảo quản tủ
lạnh vài ngày).
2. Tiến hành
a) Chiết xuất đường trong thực vật
- 5g rau cải ngọt → nghiền nhỏ → cho vào becher 100ml + 10ml cồn 90
0
→ đun cách
thủy (sôi 3 lần) → khuấy đều bằng đũa thủy tinh → để nguội → lọc (chỉ gạn lấy phần
trong).
- Cho tiếp 10ml cồn 80
0
vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên nồi đun cách
thủy→ Để nguội → lọc (lặp lại 2 lần)
- Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nóng (80
0
)
- Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phòng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ. Sau
khi cho bay hơi rượu, mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.
- Cặn khô trong cốc được pha loãng thành thể tích V = 50ml với nước cất ta được
dung dịch đường gốc. Pha lõang dung dịch đường gốc với một hệ số pha lõang n thích
hợp.
b) Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường
- Cho vào 6 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sau:
Hoá chất
Ống
ĐC
Ống 1
Ống 2

Ống 3
Ống 4
Ống 5
Glucose 10
mg/ml (ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Nước cất (ml)
10
9.8
9.6
9.4
9.2
9.0
Nồng độ
(mg/ml)
OD
540nm
(Sinh viên điền nồng độ glucose chuẩn vào bảng trên)
- Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 6 ống nghiệm khác và thêm vào mỗi
ống 3ml thuốc thử DNS.
- Đun sôi đúng 5 phút (có đậy nút).
24
- Làm lạnh đến nhiệt độ phòng.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với mẫu trắng pha từ ống đối chứng.
Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD

540nm
), trục hoành là nồng
độ glucose. Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y =
OD
540nm
; x = [glucose] (mg/ml) và hệ số tương quan R
2
nhờ phần mềm Excel.
- Tương tự hút 1 ml dung dịch đường pha lõang X cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml
DNS, đun sôi 5 phút. Sau khi để nguội đo mật độ quang (OD), sử dụng mẫu trắng ở
trên.
Chú ý: tiến hành các mẫu dựng đường chuẩn và mẫu thí nghiệm đồng thời.
3. Tính kết quả:
- Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được X mg/ml đường khử trong dung
dịch đường pha lõang.
- Nhân với hệ số pha lõang n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc.
- Chọn hệ số pha lõang n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn.
- Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) =
V = thể tích dịch đường gốc (ml)
m = khối lượng mẫu cân (g)
III. Bài nộp:
1. Vẽ đường chuẩn glucose
2. Viết phương trình đường chuẩn y = ax + b
3. Tính R
2
=
4. Biện luận các hệ số pha lõang.
25
BÀI 3. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

I. Lý thuyết
1. Định nghĩa
Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số.
Nitơ có trong thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong
thành phần protein như của các muối vô cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các
peptide, urea và các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các base purine và pyrimidine,
là nitơ phi protein.
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
Đạm tổng số hay protein tổng số là nitơ tổng số nhân với hệ số chuyển đổi. Hệ
số này phụ thuộc vào hàm lượng nitơ trong protein. Thông thường nitơ chiếm 16%
protein nên hệ số chuyển đổi thường được sử dụng là 100/16 = 6.25.
Đạm tổng số = Nitơ tổng số x hệ số chuyển đổi
Bảng dưới đây biểu diễn hệ số chuyển đổi cụ thể cho nhiều đối tượng mẫu khác
nhau.
Mẫu
Hệ số chuyển đổi
Nguồn gốc động vật
6.25
Hạt bông
5.30
Đậu phộng
5.46
Đậu nành
5.71
Hạt hướng dương
5.3
Cơm dừa
5.3
Hạt mè
5.3

Bắp
6.25
Gạo
5.95
Lúa mì
5.83