Các phương pháp phân loại lai phân tử

Thực vật có hoa
NXB Đại học quốc gia Hà Nội 2006.
Tr 78 – 100.


Từ khoá: Phương pháp phân loại, nhiễm sắc thể, tế bào, izoenzym, giải phẫu.
Tài liệu trong Thư viện điện tử ĐH Khoa học Tự nhiên có thể được sử dụng cho mục
đích học tập và nghiên cứu cá nhân. Nghiêm cấm mọi hình thức sao chép, in ấn phục
vụ các mục đích khác nếu không được sự chấp thuận của nhà xuất bản và tác giả.


Mục lục

Chương 7 Các phương pháp phân loại 3
7.1 Phương pháp phân loại hình thái 3
7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu 3
7.2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì lá 3
7.2.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu gỗ 3
7.3 Phương pháp phân loại bào tử phấn hoa 8
7.4 Phương pháp nghiên cứu tế bào 10
7.4.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 10
7.4.2 Hình thái thể nhiễm sắc 16
7.4.3 Kiểu nhân 17
7.5 Phương pháp phân loại izoenzym 18
7.5.1 Định nghĩa izoenzym 18
7.5.2 Phương pháp phân tích izozym bằng kỹ thuật điện di 19
7.6 Phươ

ng pháp phân loại bằng ADN 23
Chương 7. Các phươn
g
pháp phân loại


Nguyễn Nghĩa Thìn



7.6.1 Kỹ thuật phản ứng trùng hợp - PCR 23
7.6.2 Phân loại dựa trên kỹ thuật cắt giới hạn - RFLP 24
7.6.3 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân ngẫu nhiên ADN đa hình - RAPD 24
7.6.4 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân đoạn AFLP 25
7.6.5 Phân loại dựa trên kỹ thuật tiểu vệ tinh là các đoạn ADN ngắn có một số lượng
các chuỗi nucleotid lặp lại - SSR 26




3
Chương 7

Các phương pháp phân loại
7.1 Phương pháp phân loại hình thái
(Xem chương 9 và 10)
7.2 Phương pháp phân loại giải phẫu
7.2.1 Nghiên cứu cấu trúc biểu bì lá
Biểu bì lá là một dấu hiệu có ý nghĩa trong phân loại đã được nhiều người sử dụng trước
hết cấu trúc của các kiểu tế bào biểu bì ví dụ ở Vulpa (hình 7.3) hay các kiểu lông trên bề mặt,

ví dụ ở Combretum (hình 7.1). Các kiểu lông tùy theo điều kiện chúng ta có thể xem dưới
kính hiển vi thường hay kính hiển vi quét (hình 7.2).
Bên cạnh nghiên cứu cấu tạo lông, người ta sử dụng lưỡi dao để bóc các lớp biểu bì để
xem cấ
u tạo hệ thống lỗ khí hoặc người ta dùng parafin lo•ng tráng qua bề mặt lá rồi sau đó
bóc ra để xem cấu tạo các tế bào quanh lỗ khí. Ba mươi lăm kiểu lỗ khí đã tìm thấy trong thực
vật có mạch (hình 7.1) có ý nghĩa lớn trong phân loại. Những kiểu đó thường có ý nghĩa ở các
bậc taxôn cao. Ví dụ như ở Acanthaceae đặc trưng kiểu diacytic, trong khi đó có liên quan
chặt chẽ với Scrophulariaceae với kiểu monomocytic… Trong họ Poaceae hoa tiêu giảm
mạnh và các dấu hiệu đặc trưng rất hạn chế. Do đó người ta quan tâm các dấu hiệu giải phẫu
cơ quan dinh dưỡng và tế bào học hơn trong đó các tế bào biểu bì được quan tâm.
7.2.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu gỗ
Cấu tạo giải phẫu gỗ được nghiên cứu trên các bản cắt ngang, tiếp tuyến, xuyên tâm và
tiêu bản làm mủn. Nó có ý nghĩa lớn trong tiến hóa (hình 7.3 – 7.8). Dụng cụ nghiên cứu là
kính hiển vi hai mắt với vật kính x8, x20, x40; thị kính x7, máy ảnh, trắc vi thị kính, trắc vi
vật kính.
7.2.2.1 Làm tiêu bản lát cắt
Theo tính chất của gỗ cứng hay mềm để có cách xử lý khác nhau, nếu là gỗ mềm thì cắt
trực tiếp ngay, không cần qua các bước x
ử lý cũng được. Nếu là gỗ cứng thì xử lý bằng
glyxerin và cồn hoặc đun trong nước sôi và để vài tiếng đồng hồ mới tiến hành cắt. Mục đích
cho tống hết các bọt khí làm cho gỗ mềm ra và tiêu bản nguyên vẹn.
Chuẩn bị mẫu:



4

Hình 7.1.
Các dạng tế bào quanh lỗ khí (theo Dilcher, 1974)

A. anomocytic, B. cycocytic; C. amphicyclocytic; D. actinocytic, E. anisocytic,
F. amphianisocytic, G. adiacytic, H. amphidiacytic, I.paracytic, J. amphiparacytic,
K. brachyparacytic, L. amphibrachyparacytic, M. hemiparacytic, N. paratetracytic,
O. amphitetracytic, P. brachyparacytic, Q. amphibrachyparatetracytic, R.
staurocytic,
S. anomotetracytic, T. parahexacytic-monopolar, U. parahexacytic-dipolar,
V. brachyparahexacytic-monopolar, W. brachyparahexacytic-dipolar, X. polocytic,
Y. copolocytic, Z. axillocytic, AA. coaxillocytic, BB. desmocytic, CC. pericytic, DD.
copericytic, EE. amphipericytic

Hình 7.2.
Các dạng lông tuyến của chi Combretum: 6 tuyến có cuống và các tuyến khác
dạng khiên (theo Dilcher, 1974)


5
* Khử nước ở nguyên liệu: Vật mẫu lấy ra khỏi dung dịch làm mềm phải được rửa thật
kỹ bằng nước thường rồi ngâm lần lượt vào cồn 70o, cồn 96o, cồn tuyệt đối lần thứ nhất, lần
thứ hai và lần thứ ba. Thời gian ngâm mẫu khoảng từ 15 - 30 phút hoặc hơn tùy theo độ dày
của vật mẫu.
* Chuyển vào dung môi trung gian: sau khi lấy mẫu ra khỏi cồn tuy
ệt đối lần thứ ba,
chuyển mẫu vào metylbenzoat lần thứ nhất, rồi lần thứ hai, mỗi giai đoạn để 1 - 2 giờ sau đó
đưa vào xylen lần thứ nhất và lần thứ hai, mỗi giai đoạn không quá 30 phút.
* Chuyển vào parafin: từ trong môi trường xylen ta chuyển tiếp như sau:
Xylen - parafin (tỷ lệ 3: 1), để ở nhiệt đồ bình thường trong 1 - 2 giờ.
Xylen - parafin (tỷ lệ 1: 1), giữ ở 40o trong khoảng 1 - 2 giờ.
Xylen - parafin (tỷ l
ệ 1: 3), giữ ở 40o trong khoảng 1 - 2 giờ, sau đó cho vào parafin nóng
chảy trong tủ sấy ở nhiệt độ tủ cao không quá 62oC. Thời gian để phụ thuộc vào bề dày của

mẫu và bản chất của mô, có thể để từ 10 - 12 giờ đến vài ngày. Nhiệt độ tủ sấy phải giữ đều.

Hình 7.3.
Các dạng tế bào biểu bì của Vulpia alopecuros: A.
Mặt bụng; B. Mặt lưng và
V. tenuis: C. Mặt bụng; D. Mặt lưng (theo Cotton và
Stace, 1977). Tế bào silic có màu đen
* Đúc khối parafin để dựng vật mẫu:
Khi parafin đã ngấm hoàn toàn vào vật mẫu thì đem đúc thành khối, sau đó để nguội.
Chú ý: Nên đặt vật mẫu vào giữa khối parafin. Nếu cần, điều chỉnh vật mẫu sau khi
parafin đã đông đặc thì phải dùng một kim sắt hơ nóng để cho parafin chảy nóng trở lại.
• Chuẩn bị khối parafin đựng vật mẫu: trong khối parafin nói trên thường chứa nhi
ều vật
mẫu do đó phải chia mỗi mẫu nằm trong một khối parafin nhỏ riêng. Sửa các khối parafin
mang vật mẫu thành hình thang cụt có đáy vuông. Các cạnh đối diện của mặt cắt phải song
song với nhau.
Gắn khối parafin này lên một miếng gỗ nhỏ bằng cách hơ nóng lưỡi dao mổ trên đèn cồn
rồi làm chảy parafin ở hai mặt cắt gắn với nhau. Sửa lại khối parafin một l
ần nữa để cho mặt
cắt phải thật phẳng, các cạnh thật vuông góc với nhau và để cho các lát cắt vào ngay với mặt
cắt.


6
- Tiến hành cắt: Có thể cắt bằng tay hoặc bằng
máy cắt. Sau khi gỗ đã được làm mềm tiến hành cắt
theo 3 mặt phẳng: ngang, tiếp tuyến và xuyên tâm.
Với độ dày vừa phải (khoảng 15 - 18 *m) để vừa
mỏng vừa giữ được các yếu tố nguyên vẹn. Sau đó
sửa thành các mảnh một cách cân đối (vuông hay chữ

nhật).
- Loại parafin ở lát cắt: để có thể nhuộm và
quan sát được vi ph
ẫu, cần loại hết parafin trên lát cắt.
Phương pháp loại parafin như sau: chuyển các mẫu
qua lần lượt các ống Boren đựng các dung dịch dưới đây.
Xylen (lần thứ nhất) Thời gian 10 phút
Xylen (lần thứ hai) Thời gian 5 phút
Xylen - cồn tuyệt đối (3:1) Thời gian 5 phút
Xylen - cồn tuyệt đối (1:1) Thời gian 5 phút
Xylen - cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian 5 phút
Cồn tuyệt đối (1:3) Thời gian 5 phút
Cồn 96o Thời gian 5 phút
Cồn 70o Thời gian 5 phút
Cồn 50o Th
ời gian 5 phút
Cồn 30o Thời gian 5 phút
Nước cất: Thời gian 5 phút
Sau đó chuyển tiêu bản vào các chậu đựng thuốc nhuộm tùy theo yêu cầu nghiên cứu.
* Nhuộm màu:
Thuốc nhuộm safranin 1 - 9% trong cồn tuyệt đối, khi dùng ta phải pha lo•ng gấp đôi.
Cách nhuộm: Lấy các lát cắt ra thấm
khô và tiến hành nhuộm bằng thuốc nhuộm
safranin từ 5 phút đến 2 giờ. Sau đó cố định
trong HCl và rửa bằng nước cất cho sạch.
Chuyển sang giai đ
oạn loại nước.
Loại nước: Để loại hết nước các bản
cắt được ngâm trong các dung dịch cồn từ
nồng độ thấp đến cao. Vì cồn tan trong

nước và sẽ rút dần dần nước ra. Sau đó
chuyển sang dung dịch cồn + xylen. D•y
các dung dịch xylen nồng độ cao dần để
loại hết cồn ra (do keo canada chỉ tan trong xylen). Cuối cùng chuyển sang dung dịch xylen +
cacbon có tác dụng khử trùng. Vật mẫu ngâm trong các dung dịch v
ới khoảng thời gian từ 15
đến 30 phút hoặc hơn.

Hình 7.4.
Các giai đoạn tiến hóa của phiến rây từ kép
đến đơn (Takhtajan 1964)

Hình 7.5.
Lát cắt xuyên tâm gỗ của Tetracentro sinensis
(Takhtajan 1964)


7
* Dán tiêu bản:
Chuẩn bị lamen và lam kính sạch. Đặt
các lát cắt đã loại hết nước và ngâm trong
dung dịch xylen + cacbon lên lam kính, sửa
đúng hướng, nhỏ vài giọt keo canada và đậy
từ từ lamen tránh cho bọt khí xuất hiện.
7.2.2.2 Làm tiêu bản ngâm mủn
Dựa trên nguyên tắc một số hóa chất có
tác dụng phá hủy màng gắn giữa các tế bào,
làm cho các tế bào tách rời nhau ra. Phương pháp này thường dùng để nghiên cứu từng tế bào
nguyên vẹn mà không làm hư hạ
i chúng.

Phương pháp tiến hành như sau:
* Làm mủn: Cũng lấy ở mẫu gỗ ban
đầu chẻ vài que nhỏ bỏ vào ống nghiệm,
cho một vài tinh thể KCIO3, thêm HNO3
và sau đó thêm một ít nước cho ngập gỗ
và đun bằng đèn cồn khoảng 15 - 20
phút. Khi thấy các que gỗ đã trắng ra,
dùng đũa thủy tinh đánh cho gỗ tơi ra, để
lắng và dùng nước cất rửa axit, sau đó
ngâm trong cồn khoảng 15 phút. Tiến
hành quá trình nhu
ộm.
* Nhuộm mẫu: Dung dịch nhuộm là
safranin 1 - 9% trong cồn. Thấm khô mẩu
gỗ mủn bằng giấy thấm, cho vài giọt
thuốc nhuộm safranin (cho ướt hết mẫu)
để khoảng 5 phút, cố định bằng HCl, rửa nước và sau đó tiến hành loại nước.
• Loại nước: Ngâm trong dung dịch cồn 90o khoảng 15 phút, chuyển sang cồn tuyệt đối
lần thứ nhất, lần thứ hai để rút nước ra, sau đó là quá trình rút cồ
n khỏi tế bào bằng xylen (vì
keo canada chỉ tan trong xylen chứ không tan trong cồn). Quá trình này tiến hành bằng cách
chuyển mẫu sang dung dịch cồn + xylen lần thứ nhất, lần thứ hai và cuối cùng là cacbon
xylen tương tự như trên tiêu bản cắt lát.

Hình 7.6.
Các giai đoạn tiến hóa của bản thủng lỗ từ kiểu hình
thang của kiểu trung gian và từ kiểu đối nhau tới kiểu
cách nhau (Takhtajan 1964)

Hình 7.7.

Các giai đoạn tiến hóa của bản thủng lỗ hình thang từ kiểu
thủng lỗ nguyên thủy có nhiều vách ngang tới kiểu thủng lỗ
chuyên hóa chỉ có một số vách ngang (Takhtajan 1964)


8
• Dán tiêu bản: Sau khi mẫu đã
được loại nước và thấm xylen lấy một ít
mủn, dùng kim mũi mác dàn đều trên lam
kính đã sạch và khô, nhỏ vài giọt keo
canada và từ từ đậy lamen.











7.2.2.3 Quan sát
* Quan sát bằng mắt thường
cấu tạo chung của gỗ.
* Quan sát trên kính hiển vi
và mô tả.
* Đo đạc trên kính hiển vi
dựa trên trắc vi vật kính và trắc vi
thị kính các yếu tố cần mô tả.

* Chụp ảnh và mô tả.
7.2.2.4 Đánh giá và phân
loại
Căn cứ trên bản mô tả và các
sơ đồ tiến hóa, chúng ta phân tích,
đánh giá các mức độ tiến hóa khác
nhau, có thể lập thành khóa xác định.
7.3 Phương pháp phân loại bào tử phấn hoa
Phấn hoa là một dấu hiệu được nhiều nhà phân loại sử dụng bởi tính ổn định của nó, dễ
lấy mẫu, phương pháp đơn giản, ít tốn kém và thời gian tiến hành ngắn phù hợp với nghiên
cứu trong phân loại. Mặt khác chúng thể hiện các mức độ tiến hóa một cách rõ ràng qua các
dấu hiệu về hình dạng, kích thước, cấu trúc bề mặt rất đa dạng của chúng cũng như sự
có mặt
rãnh, số lượng rãnh, sự có mặt các lỗ, số lượng của chúng trên rãnh, cấu trúc rãnh (hình 7.10 -
7.12).

A

B
1
2
3
4
5 6
9
8
7

Hình 7.8.
Sơ đồ tiến hóa của các kiểu chính của tia (A) và nhu mô gỗ

(B) 1. Dị hình hỗn hợp với tần cùng dài; 2. Dị hình hỗn hợp
với tận cùng ngắn; 3. Dị hình một dãy; 4. Đồng hình hỗn
hợp; 5. Đồng hình nhiều dãy; 6. Đồng hình một dãy; 7. Nhu
mô phân tán; 8. Không dính mạch trong giải (gian mạch);
9. Nhu mô quanh bó (Takhtajan 1964)

Hình 7.9.
Các giai đoạn tiến hóa của các thành phần mạch với kiểu thủng lỗ
đơn, ở phần mạch đầu tiên trên bản thủng lỗ dưới còn lại một vạch
ngang (Takhtajan 1964)


9

4 3 2 1

Hình 7.10.
Hình thái hạt phấn
1. Hình bầu dục đứng; 2. Hình cầu gai; 3. Hình ngũ giác gai thấp;
4. Hình bầu dục đứng rộng bề mặt mạng lưới (Webster)
Phương pháp này tiến hành theo các bước sau:
+ Lấy mẫu nghiên cứu: mẫu hạt phấn lấy từ hoa đã trưởng thành của các mẫu cho vào
một túi giấy nhỏ và ghi rõ tên khoa học của tiêu bản, số hiệu và nơi lưu giữ.
+ Xử lý mẫu: hiện nay có nhiều phương pháp để xử lý
mẫu bào tử phấn hoa nhưng phương pháp axetolyza được
sử dụng phổ biến, nhuộm và làm sáng. Các bước tiế
n hành
như sau:
* Cho mẫu chứa phấn hoa vào ống nghiệm, khẽ
nghiền nhỏ.

* Pha hỗn hợp axetoliza: cho vào ống đo 4,5 ml
alhydric, sau đó cho thêm vào 5 ml H2SO4 đậm đặc.
* Đổ hỗn hợp trên vào ống nghiệm chứa mẫu phấn
hoa, sau đó đun sôi trên nồi cách thủy ở nhiệt độ 70 –
100oC, vừa đun vừa khuấy đều bằng đũa thủy tinh, rồi đưa
ra ly tâm 3 phút với vận tốc 300 vòng/phút, đổ dị
ch trong
đi.
* Rửa vật mẫu nhiều lần bằng cách cho hỗn hợp cồn
95o và nước cất theo tỷ lệ 3:1 vào ống nghiệm rồi ly tâm và
đổ nước đi, cho thêm một ít nước cất vào ống nghiệm, lọc
mẫu.
* Chia vật mẫu thành 3 phần A,B,C và xử lý tiếp như
sau:
• Phần A cho thêm vào ống nghiệm hỗn hợp cồn 95o
với nước cất theo tỷ lệ 3:1, ly tâm và gạn nước trong đ
i.
• Phần B nhuộm màu. Cho vào ống nghiệm chứa mẫu phấn hỗn hợp và nước cất và 1
giọt fusxin, để yên từ 2 - 5 phút; quay ly tâm gạn nước trong và rửa vật mẫu bằng hỗn hợp
cồn và nước cất rồi ly tâm gạn nước trong.
• Phần C làm mẫu sáng. Rửa vật mẫu trong hỗn hợp cồn và nước cất, ly tâm gạn nước
trong. Đổ hỗn hợp làm sáng mẫu vào ống nghiệm để yên 2 phút sau đ
ó ly tâm 5 phút gạn
nước trong. Hỗn hợp làm sáng gồm có: Axit axetic đặc (8ml), NaClO3 30% (12 giọt), HCl
(1ml).

A

B

Hình 7.11.
Ảnh hiển vi cấu trúc bề mặt hạt phấn
A: một loài trong họ Cúc -
Compositae; B: một loài trong họ
Thầu dầu – Euphorbiaceae


10
Đổ phần B và phần C vào phần A, cho vào ống nghiệm một ít nước cất khuấy đều, ly tâm
5 phút rồi gạn nước trong.
Rửa vật mẫu bằng cồn 95o và nước cất, ly tâm và gạn nước trong. Cho vào ống nghiệm
một ít glyxerin đặc, khuấy đều rồi để yên.
+ Làm tiêu bản hiển vi hạt phấn: hút mẫu bằng pipet, nhỏ một ít dịch mẫu lên lam kính để
soi, quan sát (chụp ảnh, mô tả, đo kích thước trên các tiêu bản t
ạm thời với kính hiển vi quang
học ở các vật kính *20, *40.
+ Phương pháp đo hiển vi: để đo kích thước hạt phấn gồm đo trục xích đạo và trục cực
của hạt phấn dùng thước đo vật kính và thước đo thị kính. Mỗi chỉ số đo ít nhất 30 mẫu, các
số đo kích thước được xử lý theo phương pháp thống kê để tính được kích thước trung bình
và độ lệch chu
ẩn của mỗi mẫu.
+ Phương pháp mô tả: đối với mỗi loài cần có một bản mô tả. Đây là phần tư liệu cơ sở
của nghiên cứu, sơ đồ mô tả gồm: Tên khoa học, họ; địa điểm thu mẫu, người thu, số hiệu,
nơi lưu giữ như Bảo tàng hay phòng mẫu; kiểu hạt phấn, kích thước và các đặc điểm khác
+ Phương pháp chụ
p ảnh hiển vi: phương pháp này nhằm mục đích minh hoạ cho phần
mô tả hình thái hạt phấn, đòi hỏi phải phản ánh chính xác hình dạng, cấu trúc hạt phấn ở các
vị trí khác nhau trong đó cơ bản là hai vị trí: cực và xích đạo, đôi khi cả vị trí nghiêng nếu

cần. Phải làm rõ cấu trúc phân lớp của vỏ hạt phấn bằng các ảnh phân tích sáng.
Các quan sát để chụp ảnh tiến hành trên các tiêu bản tạm thời g
ắn trong glyxerin với kính
hiển vi quang học. Hiện nay với kỹ thuật hiện đại người ta có nhiều cách chụp khác nhau để
thể hiện một cách đầy đủ các chi tiết của đối tượng.
+ Đánh giá và lập khóa định loại: trên cơ sở những thông số mô tả chúng ta căn cứ trên
những dấu hiệu liên quan đến tiến hóa để xây dựng khóa phân loại.
7.4 Phương pháp nghiên cứu tế bào
7.4.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của hệ thống học tế bào thực vật là bộ thể nhiễm sắc của toàn bộ
các taxôn thực vật bậc thấp cũng như bậc cao. Để nghiên cứu bộ thể nhiễm sắc phục vụ cho
hệ thống học thực vật người ta thường tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc ở giai đoạn phân
bào nguyên nhiễm cụ thể ng
ười ta thường sử dụng mầm non của lá, đỉnh sinh trưởng của thân,
đỉnh rễ non của cây hoặc đỉnh rễ chính của hạt vừa nẩy mầm vì đó là vùng đang ở giai đoạn
phân chia mạnh nhất và vùng phân chia ở ngay ở dưới lớp bao của các cơ quan đó. Bên cạnh
đó người ta còn tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc ở giai đoạn phân bào giảm nhiễm cụ thể
ngườ
i ra dùng bông non đối với họ Lúa (Poaceae) ngay sau hay khi mới nhú bông hoặc nụ
hoa đối với các loài khác lúc chưa có màu đặc trưng hoặc từ hạt phấn cho nẩy mầm trong ống
nghiệm.
Phương pháp thông thường tiện lợi và dễ chủ động nhất là gieo hạt trong đĩa petri ở nhiệt
độ 23 – 25oC cho hạt nẩy mầm. Thời gian nẩy mầm tuỳ theo từng loại 1 - 2 ngày đến vài tuần
lễ. Độ dài của rễ từ 0,8 - 2 cm là dùng
được. Người ta tiến hành dùng panh hay kim mũi mác
ngắt một đoạn cách đỉnh rễ khoảng 2 mm và nhúng vào dung dịch cố định. Bên cạnh gieo hạt
trong đĩa petri người ta còn có thể tiến hành trồng cây trong chậu với đất ẩm và tơi xốp. Đối


11

với các loài cây gỗ có hạt to và có vỏ cứng tốt nhất lấy trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng của thân
hay lá non hoặc có thể trồng thành cây con và sau đó lấy trực tiếp từ đỉnh rễ non. Trước khi
lấy 1 - 2 giờ hoặc từ đêm hôm trước cần tưới nước cho đất đủ ẩm để kích thích rễ phát triển.
Thời gian lấy rễ tốt nhất trong khoảng 8 - 10 giờ sáng tùy mùa, đối vớ
i các loài cây sinh sản
bằng căn hành, thân củ hay bằng hom v.v. thì phải đặt hom, củ hay căn hành trong cát ướt
hoặc trong lọ đựng nước có hỗn hợp chất dinh dưỡng nhân tạo.

Hình 7.12.
Hình thái rãnh trên bề mặt hạt phấn (Webster)
1., 2. Hạt phấn 3 rãnh, 3. Hạt phấn 4 rãnh; 4. Hạt phấn nhiều rãnh; 5. Hạt phấn 4
rãnh;
6. Hạt phấn 3 rãnh; 7. Hạt phấn 1 rãnh; 8.Hạt phấn không rãnh
7.4.1.1 Xử lý các đối tượng trước lúc cố định
Trong một số trường hợp khó đếm số lượng thể nhiễm sắc hoặc thể nhiễm sắc quá dài thì
trước khi cố định phải xử lý rễ hay mầm lá, đỉnh sinh trưởng của thân qua một số thuốc như 8
- oxyquinolin, chloranhydrat, consixin, paradichlorobenzen hoặc làm lạnh.
Đối tượng sau khi ngắt khỏi cơ thể thực vật phải cho ngay vào dung dịch 8 - oxyquinolin
ở nồ
ng độ 0,002 M ở nhiệt độ 10-14oC trong khoảng 3 giờ. Trong trường hợp này người ta
pha dung dịch như sau: dùng 0,58 g 8 - oxyquinolin hòa vào 200 ml nước cất ấm. Xử lý bằng
chất này để làm tăng độ lớn của thể nhiễm sắc lên 1,5 lần mà không làm thay đổi chiều dài
của chúng, đồng thời làm cho các eo sơ cấp và thứ cấp hiện rõ hơn.
Muốn xem thể nhiễm sắc dễ dàng và chính xác thì trước khi xử lý đối tượng cần làm lạnh
ở 0oC trong 24 giờ vì lúc đó thể nhiễm sắc sẽ co ngắn đáng kể. Kagava đã ngâm trong dung
dịch chloranhydrat 0,3 - 1% để làm ngắn thể nhiễm sắc sau đó cho vào nước cất để rửa trong
một giờ và tiếp tục cho vào buồng ấm 2 - 4 giờ rồi mới cho vào dung dịch cố định. Những
năm gần đây người ta sử dụng dung dịch Consixin 0,01 - 0,05% để xử lý trong thời gian 2 giờ
trước khi cố đị
nh.

Đối với lá non người ta ngâm trong dung dịch consixin 0,2% trong 1 - 2 giờ.
Người ta cũng có thể dùng dung dịch paradiclorobenzen đậm đặc để xử lý rễ ở nhiệt độ
12 - 16oC trong 2 - 3 giờ. Để có dung dịch này chúng ta lấy 5 - 10 g tinh thể
paradiclorobenzen hòa tan trong 500 ml nước cất để trong bình đậy kín đặt vào tủ ấm ở nhiệt
độ 60oC trong 10 - 12 giờ.
Để phân tích kiểu nhân người ta thường xử lý dung dịch consixin kết hợp với hỗn hợp
dung dịch paradiclorobenzen đậm đặc và 8 - oxyquinolin 0,002 M theo tỷ l
ệ 1:1 trong thời
gian 2 giờ. Hai dung dịch này pha trong tủ ấm ở 60oC.


12
Để nghiên cứu hình thái thể nhiễm sắc đôi khi trước khi cố định người ta xử lý theo một
trong các phương pháp sau:
1. Ngâm vào dung dịch cumarin 2% trong 2 giờ ở nhiệt độ 12-16oC
2. Ngâm vào hỗn hợp dung dịch cumarin 2% và 8 - oxyquinolin 0,002 M theo tỷ lệ 1:1
trong thời gian 2 giờ ở nhiệt độ 16oC (Nikolop Daxcalop, 1966).
7.4.1.2 Cố định vật mẫu
Vật mẫu sau khi đã được xử lý được chuyển vào dung dịch cố định trong một khoảng
thời gian nhất
định tùy thuộc vào các dung dịch khác nhau. Khi tiến hành cố định cần chú ý
một số nguyên tắc:
1. Lượng dung dịch để cố định phải nhiều hơn khối lượng của vật mẫu cố định 50 - 100
lần.
2. Cố định vật mẫu ngay sau khi vừa tách vật mẫu ra khỏi cơ thể cây, không được tiến
hành việc cố định ngoài ánh nắng.
3. Đối với vật mẫu lớn phả
i tách nhỏ hoặc bỏ những bộ phận không cần thiết trước khi
cố định.
4. Trước khi lấy mẫu ra khỏi cây phải tạo mọi điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, về độ ẩm

để thúc đẩy quá trình phân chia tế bào như tưới nước, để ở nhiệt độ 20 - 25oC.
5. Phải chuẩn bị các ống nghiệm, tốt nhất là các lọ penicilin hay lọ nút nhám có nh•n đầ
y
đủ. Nh•n trên lọ phải khớp nh•n trên đĩa petri, trên chậu hay trên đồng ruộng.
6. Nếu cây trồng trong chậu thì dùng tay trái lật ngược chậu lên và dùng tay phải bỏ chậu
ra. Các rễ mới mọc sẽ bám trắng xung quanh bồn đất. Dùng kéo cắt các rễ non trắng nõn,
khoắng vào chậu nước cho sạch đất rồi nhúng ngay vào dung dịch xử lý hay dung dịch cố
định. Nếu gieo hạt trong đĩa petri thì dùng panh và kim mũi mác để ngắt rễ. Mỗi lần ngắt
xong cho ngay vào dung d
ịch xử lý hay dung dịch cố định.
Hiện nay có nhiều loại dung dịch cố định khác nhau. Về nguyên tắc các dung dịch này có
tác dụng làm cho tế bào thực vật chết một cách nhanh chóng mà không gây ảnh hưởng đến số
lượng và hình thái thể nhiễm sắc của tế bào. Để nghiên cứu thể nhiễm sắc người ta thường
dùng nhất dung dịch Navasin và Cacnua. Tất cả các thuốc cố định hoặc được pha trong cồn
hoặc
được pha trong nước. Thuốc pha trong cồn thường ngấm nhanh hơn nên chỉ giữ vật mẫu
trong đó từ 30 phút đến 12 giờ, còn thuốc pha trong nước mức độ ngấm vào mô chậm hơn do
đó có thể giữ trong đó đến 24 giờ hay lâu hơn nữa.
* Dung dịch Navasin 10:4:1
Dung dịch này được sử dụng phổ biến hiện nay. Thời gian cố định các rễ non là 24 giờ
trong tối.
Thành phần:
• Axit cromic 10% : 10 phần
• Foocmalin 16% tức là foocmalin th
ị trường 40% : 4 phần
• Axit axêtic đã kết băng: 1 phần
Thuốc này chỉ pha ngay trước khi dùng vì rất nhanh hỏng. Đây là thuốc có tác dụng rất
dịu và giữ được cấu trúc của thể nhiễm sắc tốt.

13
* Dung dịch Cacnua 6 : 3 : 1 :
Dung dịch này được sử dụng phổ biến hơn. Thời gian cố định từ 2 - 12 giờ.
Thành phần:
• Cồn êtylic 96% hay 100%: 6 phần
• Clorôphooc: 3 phần
• Axit axêtic đã kết băng: 1 phần
* Dung dịch Clac (còn gọi là dung dịch Cacnua cải tiến 3 : 1)
Thời gian cố định 2 - 12 giờ đôi khi có thể để lâu hơn, nhiệt độ 0-3oC
Thành phần:
• Cồn êtylic 96 độ hay 100 độ : 3 phần
• Axit axêtic đã kết băng : 1 phần
Ba loại dung dịch trên đây được sử dụng phổ biến nhất hiện nay vừa đơn giản, vừa dễ
kiếm. Ngoài ra hiện nay đối với đối tượng thực vật có thể dùng các công thức sau (Sacma,
1965):
1) - Axit propionic: 1 phần
- Cồn êtylic 95 độ: 3 phần
hoặc : - Axit propionic: 100 ml
- Cồn êtylic 95 độ: 100ml
- Hydroxit sắt : 0,4 g
2) - Axit propionic: 1phần
- Clorophooc: 4 phần
- Cồn êtylic 95 độ: 8 phần
3) - Phoocmalin: 1 phần
- Cồn êtylic 95 độ: 15 phần
- Axit propionic: 1 phần
Dung d
ịch thứ 3 này có tác dụng trong 1 - 2 giờ và được dùng cho thực vật lẫn động vật.
7.4.1.3 Rửa vật mẫu
Sau khi cố định xong vật mẫu cần được rửa sạch thuốc cố định. Đối với thuốc pha trong

nước người ta cho vật mẫu lẫn nh•n vào túi vải màn rồi cuộn lại ngâm vào trong cốc thủy tinh
chứa nước và phía trên được đặt một vòi nước chảy liên tục. Thời gian rử
a 1 - 2 giờ trong mùa
hè, 2 - 3 giờ trong mùa đông. Sau khi rửa xong phải làm mất nước bằng cách cho vào dung
dịch cồn êtylic theo từng mức độ 20%, 40%, 60%, 80%. Mỗi lần ngâm trong thời gian 30
phút mục đích để cho vật mẫu không bị quăn lại trong khi làm mất nước. Sau khi làm mất
nước người ta có thể giữ vật mẫu lâu dài trong cồn 80%.
Đối với thuốc cố định pha cồn thì vật mẫu sau khi cố định xong được rửa sạch trong cồn
80% mỗi lần 1 - 2 giờ cho đến khi hết mùi axit axêtic. Muốn thế người ta dùng vải màn bịt lọ
rồi đổ thuốc ra và đổ cồn 80% vào, sau 1 - 2 giờ lại thay cồn 1 lần. Vật mẫu đã rửa sạch có thể
giữ lâu dài trong cồn 80%. Để đơn giản người ta có thể rửa vật mẫu bằng nước cất rồi giữ vật
mẫu trong tủ lạnh.


14
7.4.1.4 Làm mủn vật mẫu
Giai đoạn này rất quan trọng nhất là đối với vật mẫu chuẩn bị làm tiêu bản ép. Để làm
mủn người ta dùng axit axêtic 45%, axit propionic 40 - 45%, chloranhydrat, axit chlohydric
1N hoặc các enzym. ở đây chúng tôi giới thiệu phương pháp đơn giản và dễ làm như sau: Sau
khi rửa vật mẫu bằng nước cất liền cho vật mẫu ngâm vào dung dịch HCl 1N trong 5 phút
(dung dịch HCl 1N được chuẩn bị như sau: Lấy 82,5 ml HCl tỷ trọng 1,19 cho nướ
c cất vào
tới mức 1000 ml) Sau đó tiếp tục cho vật mẫu vào dung dịch HCl: H2O (tỷ lệ 1 : 1) trong thời
gian 20 phút. Rửa vật mẫu trong nước theo phương pháp trên.
7.4.1.5 Nhuộm vật mẫu
Phương pháp nhuộm vật mẫu để nghiên cứu bộ thể nhiễm sắc có nhiều, ở đây chúng tôi
chỉ giới thiệu hai phương pháp chính dễ sử dụng và cho kết quả tốt:
1. Nhuộm bằng axêtôcacmin
Chuẩ
n bị thuốc nhuộm: lấy 1 g cacmin hòa vào 45 ml axit axêtic đã kết băng và 55 ml

nước cất. Việc hòa tan được tiến hành trong bình cầu có thiết bị làm nguội, đặt bình cầu trên
bếp, đun cách thủy trong thời gian 30 - 60 phút, nếu không có thiết bị làm nguội thì đậy bằng
một cái phễu trước khi đặt lên bếp.
Dung dịch axêtocacmin có màu đỏ tối, sau khi làm lạnh thì được lọc và đổ vào lọ đậy nút
nhám (cặn trên giấy lọc có thể sử dụ
ng lại cho lần sau).
Theo Snao (1953) có thể chuẩn bị cacmin trong cồn êtylic có thêm HCl. Muốn vậy thì lấy
4 g cacmin hòa tan vào 15 ml nước nóng cho thêm 1ml HCl để nguội rồi đổ vào 95 ml cồn
85% rồi lọc.
Cách nhuộm: Cho vật mẫu vào dung dịch thuốc nhuộm trong 5 phút, rửa trong nước rồi
chuyển vào dung dịch phèn sắt amôni 3 - 5% và hơ nóng cho đến bốc hơi.
2. Nhuộm bằng hêmatôxylin:
Chuẩn bị thuốc nhuộm: Thuốc nhuộm hêmatôxylin có nhiều công thức nhưng để nghiên
cứu b
ộ thể nhiễm sắc, chúng tôi giới thiệu công thức của Gormôri vừa đơn giản vừa dễ làm:
* 1 g hêmatôxylin hòa tan trong 100 ml nước;
* 3 g phèn crôm hòa tan trong 100 ml nước;
* 4 ml crômat kali hoặc bicrômat kali;
* 4 ml H2S04 5%.
Nếu hêmatôxylin có dạng hạt, trước hết hòa tan với một ít cồn sau khi đã hòa tan riêng
biệt từng loại một ta lần lượt hỗn hợp lại 4 thứ với nhau theo thứ tự như sau: Phèn crôm -
hêmatôxylin - crômat kali - H2S04 dung dịch được để yên 2 - 3 ngày sau mới được sử dụng.
Thờ
i gian sử dụng thuốc từ 4 - 8 tuần lễ.
Cách sử dụng: Vật mẫu sau khi đã làm mủn trong HCl rửa vật mẫu bằng nước cất rồi cho
ngâm vào dung dịch hêmatôxylin để trong tủ ấm 60oC trong thời gian 20 - 30 phút.
7.4.1.6 Làm tiêu bản tạm thời
Sau khi nhuộm vật mẫu, vớt vật mẫu ra cho vào lọ nước cất và có thể giữ lâu dài ở đó
trong nhiệt độ 30oC. Vật mẫu được vớt lên bả
n kính đặt trong một giọt axit axêtic 45% gạt bỏ

phần thừa rồi đậy phiến kính lên một cách nhẹ nhàng tránh các bọt khí, dùng que diêm hay


15
đầu của kim mũi mác ấn nhẹ làm cho vật mẫu dát mỏng đều đặn và từ từ. Nếu vật mẫu cứng
khó dát mỏng thì trước đó cần hơ qua trên đèn cồn để cho vật mẫu mềm ra (chú ý khi hơ tránh
làm khô nước axit axêtic dưới phiến kính). Khi dát xong trên phiến kính, quan sát từ bộ giác
nhỏ đến bộ giác lớn để tìm những tế bào đang có các thể nhiễm sắc tách rời nhau rõ nhất và
có bộ thể
nhiễm sắc hiện cấu trúc rõ nhất và đầy đủ nhất.
7.4.1.7 Chuyển tiêu bản tạm thời thành tiêu bản cố định
Trong thực tế có nhiều phương pháp chuyển tiêu bản tạm thời thành tiêu bản cố định.
Phương pháp đơn giản nhất dùng khí cacbonic để làm rắn tiêu bản. Quá trình tiến hành như
sau: Sau khi đã quan sát thấy rằng tiêu bản tạm thời tốt thì chuyển ngay sang giai đoạn cố
định b
ằng cách mở van bình khí cacbonic xì vào mặt lưng của tiêu bản, nước trong tiêu bản,
kết tinh lại và tiêu bản hóa đá, lấy lưỡi dao cạo râu tách phiến kính ra khỏi bản kính, dùng cặp
con kẹp lấy phiến kính rồi cho cả bản kính và phiến kính vào lọ cồn 96o - 100o. Sau 10 - 30
phút vớt ra hong khô bằng không khí trong phòng. Vật mẫu được dán bằng Euparon. Nếu
không có Euparon thì phải dán bằng keo Canada.
Cách tiến hành có thể thay đổi như sau: Vật mẫu ngâm trong cồn 96o từ 2 - 3 phút rồi
chuyển sang cồ
n 100o trong 2 - 5 phút, cồn 100o và Xylen từ 2 - 5 phút, cuối cùng chuyển
vào Xylen, sau đó dán tiêu bản bằng keo Canađa.


1 2 3
4

5

6
C


Hình 7.13.
Hình ảnh NST từ tiêu bản (A), vẽ lại (B) và sơ đồ hóa (C) (theo Stace 1996)

7.4.1.8 Xác định vị trí tế bào và đo đếm, chụp ảnh thể nhiễm sắc
Sau khi đã dán tiêu bản và hong khô cho tiêu bản lên kính hiển vi có đầy đủ 3 vật kính.
Quan sát từ vật kính nhỏ đến vật kính lớn để xác định các tế bào chứa các thể nhiễm sắc rõ và
thể hiện cấu trúc tốt nhất rồi dựa vào thước đo trên bàn kính hiển vi để đánh dấu số hiệu mẫu
nghiên cứ
u và số hiệu của vị trí các tế bào tốt được ghi vào một nh•n con được dán vào một
đầu của bản kính.
Các bước nghiên cứu trước hết tiến hành đếm số lượng thể nhiễm sắc trên nhiều tế bào
của một tiêu bản và trên nhiều tiêu bản để khẳng định một cách chính xác. Mỗi loài cần được
thu mẫu và tiến hành nghiên cứu trên nhiều địa điểm cách xa nhau, ít nhất từ 3 địa đ
iểm trở
lên. Sau khi đã khẳng định chính xác số lượng thể nhiễm sắc của loài thì sang bước 2 tiến
hành xác định tế bào thể hiện hình thái thể nhiễm sắc tốt nhất rồi tiến hành vẽ hay chụp ảnh.
Để vẽ hình thái thể nhiễm sắc người ta dùng dụng cụ vẽ PA - 4 lắp trên ống nối của kính hiển
vi. Bên cạnh ảnh chụp thì việc vẽ hình rất cần thiế
t vì nó phản ảnh đầy đủ rõ nét những dấu


16
hiệu nằm ở độ sâu khác nhau mà ảnh chụp không tài nào thể hiện được. Ngoài việc vẽ và
chụp ảnh người ta còn tiến hành đo kích thước thể nhiễm sắc bằng cách lắp trắc vi vật kích và
trắc vì thị kính vào kính hiển vi nhưng đòi hỏi khi tiến hành thí nghiệm cần phải thống nhất
các bước và thời gian thu mẫu, thời gian xử lý, thời gian cố định cũng như thời gian nhuộm

7.4.2 Hình thái thể nhiễm sắc
Chúng ta có thể quan sát rõ hình thái thể nhiễm sắc ở pha giữa (metaphase) của sự phân
bào vì giai đoạn này hình thái và cấu trúc thể thể nhiễm sắc hiện rõ nhất đó là lúc mà thể
nhiễm sắc đông đặc nhất và dễ bắt màu nhất.
Thể nhiễm sắc có hình que, hình chữ I hay hình chữ V có một chỗ eo gọi là eo cấp I chia
thể nhiễm sắc thành 2 vai. Vị trí đó tương ứng với vị trí của tâm động (centromere). Tuỳ theo
vị trí của tâm động mà người ta phân biệt các thể nhiễm sắc thành các kiểu khác nhau. Theo
Levan et al. (1965, ghi theo Clive A. Stace, 1996) đã đưa ra thang phân chia loại nhiễm sắc
thể theo tỉ lệ của vai dài so với vai ngắn, theo đó:
M (m): 1 - 1,7; Sm: 1,7 - 3; SA: 3 - 7; A: 7 * * và T: *
7.4.2.1 Thể nhiễm sắc tâm cùng (Telocentric) kí hiệu T
Là thể nhiễm sắc có tâm động ở tận cùng, vì thế thể nhiễm sắc bao gồm chỉ một vai. Loại
này ít gặp ở thực vật.
7.4.2.2 Thể nhiễ
m sắc tâm mút (Acrocentric) kí hiệu A
Là thể sắc có tâm động ở gần về một đầu vì thế thể nhiễm sắc gồm 2 vai: vai dài và vai
ngắn và tỷ lệ giữa vai dài và vai ngắn từ 7 - ∞

Hình 7.14.
Hình thái và các kiểu nhiễm sắc thể (Levan et al. theo Stace 1996)

7.4.2.3 Thể nhiễm sắc tâm cận mút (Subacrocentric) kí hiệu Sa
Là thể sắc có tâm động ở gần về một đầu vì thế thể nhiễm sắc gồm 2 vai: vai dài và vai
ngắn và tỷ lệ giữa vai dài và vai ngắn từ 3 - 7.
7.4.2.4 Thể nhiễm sắc tâm cận lệch (submetacentric) kí hiệu Sm
Là thể nhiễm sắc có tâm động nằm lệch xa khỏi điểm trung tâm, tỉ lệ vai dài và vai ngắn
là 1,7 - 3,0.


17

7.4.2.5 Thể nhiễm sắc tâm giữa (Metacentric) kí hiệu M (m)
Là thể nhiễm sắc có tâm động nằm ở khoảng giữa, tỷ lệ của vai dài so với vai ngắn
khoảng 1 - 1,7 (kí hiệu m), trong trường hợp tỉ lệ đó bằng 1 thì được gọi là thể nhiễm sắc tâm
cân (M).
Sơ đồ hóa hình thái thể nhiễm sắc được trình bày trong hình 7.14 trên. Một số thể nhiễm
sắc có thêm eo thứ 2. Eo này thường nằm ở phầ
n cuối của một vai ở một số khác ở tận cùng
thể nhiễm sắc có mang một phần phụ hình cầu hay hình dài gọi là thể kèm. Thể kèm được nối
với phần chính bởi một sợi nhỏ và vì không có axit Thymenucleic (sine acido thymonucleico)
trong đó nên có tên gọi thể nhiễm sắc SAT; thật ra trong đó vẫn có ADN như trong phần
chính của thể nhiễm sắc (Gây, 1931). Đối với tất cả các tế bào của cơ thể thì th
ể nhiễm sắc có
hình dạng không đổi và cũng cố định đối với loài và cả chi nữa. Vị trí tâm động, chiều dài các
vai, eo cấp 2 và thể kèm qui định đặc tính cá biệt của từng thể nhiễm sắc và ngay cả từng loài
nữa.
Bên cạnh các thể nhiễm sắc bình thường như đã trình bày ở trên gọi là thể nhiễm sắc A, ở
một số loài và ngay một số cá thể trong cùng một loài người ta còn th
ấy xuất hiện một số thể
nhiễm sắc có kích thước nhỏ hơn nhiều so với các thể nhiễm sắc bình thường và thường có
dạng cầu nhỏ gọi là thể nhiễm sắc bổ sung hay còn gọi là thể nhiễm sắc B.
7.4.3 Kiểu nhân
ở các cơ thể sinh sản hữu tính trong tế bào sôma đều có bộ thể nhiễm sắc lưỡng bội
(diploide) và được ký hiệu 2n. Bộ thể nhiễm sắc lưỡng bội do sự tập hợp từ hai bộ đơn bội
(haploide) (gặp ở tế bào sinh dục) và được ký hiệu là n. Bộ thể nhiễm sắc khác nhau về chất
lượng và tạo thành một thể thống nhất toàn vẹn được gọi là Jenôm (genom). Do
đó trong giao
tử của loài lưỡng bội có một Jenôm còn trong tế bào sôma có 2 Jenôm.
Số lượng thể thể nhiễm sắc thay đổi từ loài này sang loài khác nhất là trong quá trình tiến
hóa. Thông thường số lượng thể nhiễm sắc tăng lên so với số lượng thể nhiễm sắc khởi thủy.
Số lượng thể nhiễm sắc khởi thủy được gọi là số lượng thể nhiễm sắc cơ bản và đượ

c ký hiệu
là X nó tương ứng với số lượng thể nhiễm sắc trong các giao tử của các loài lưỡng bội. Hiện
tượng tăng số lượng thể nhiễm sắc như vậy gọi là hiện tượng đa bội. Các cơ thể đó gọi là thể
đa bội (polyploide). ở các loài đa bội chứa nhiều Jenôm. Ví dụ đối với giống Lúa mì
(Triticum) có các loài với số lượng thể nhiễ
m sắc tương ứng 14, 28, 42 như vậy số lượng thể
nhiễm sắc đơn bội tương ứng của chúng: 7, 14, 21. Số lượng thể nhiễm sắc cơ bản của chúng
là A = 7 và công thức thể nhiễm sắc được viết như sau:
2n = 2x = 14 (loài chứa 2 Jenôm);
2n = 4x = 28 (loài chứa 4 Jenôm);
2n = 6x = 42 (loài chứa 6 Jenôm).
Trong thiên nhiên một số cơ thể xuất hiện do không có quá trình thụ tinh gọi là đơn tính
sinh (apomixic) nên chúng có số lượng thể nhiễm sắ
c đơn bội. Các cơ thể đơn bội như thế
không có khả năng sinh sản bằng con đường hữu tính ví dụ như cây Bồ công anh (Taraxacum
officinale) thuộc họ Cúc (Asteraceae).
Trong thế giới thực vật mỗi loài đều có một bộ thể nhiễm sắc đặc trưng về số lượng, hình
dạng và kích thước. Vì vậy người ta đã sử dụng chúng làm tiêu chuẩn phân loại. Các thành


18
tựu nghiên cứu thể nhiễm sắc đã góp phần hết sức quan trọng để hoàn thiện và chính xác hóa
các sơ đồ phân loại hiện có. Nhờ vậy đã giải quyết được nhiều vấn đề mà bằng phương pháp
so sánh hình thái không thể giải quyết được.
Hiện nay khi khoa học di truyền học ngày càng thâm nhập vào hệ thống học, ngoài các
chỉ số về số lượng thể nhiễm sắc có khi chẳng có ý ngh
ĩa gì hết vì nhiều loài cùng một họ
thậm chí một chi có số lượng thể nhiễm sắc giống nhau, người ta tiến tới sử dụng chỉ tiêu về
kiểu nhân (caryotype) và xây dựng nên sơ đồ thể nhiễm sắc (idiogramme) hay biểu đồ nhân
(caryogramme) để so sánh và đánh giá.

Kiểu nhân là tập hợp tất cả các đặc tính số lượng, chất lượng của bộ thể nhiễm sắc (Số
lượng, kích th
ước, hình thái và cấu trúc thể nhiễm sắc). Biểu đồ nhân là hình ảnh cụ thể của
chính bộ thể nhiễm sắc được sắp xếp theo một thứ tự nhất định từng đôi tương đồng một từ
thể nhiễm sắc tâm giữa, tâm lệch đến tâm mút và cuối vùng là thể nhiễm sắc SAT. Biểu đồ
nhân có thể dựa vào ảnh chụp hoặc dựa vào bản vẽ và s
ắp xếp theo hai cách: 1/ tất cả các thể
nhiễm sắc được đặt mút dưới của các thể nhiễm sắc nằm trên một đường thẳng và 2/ đặt các
tâm động của các cặp thể nhiễm sắc nằm trên một đường thẳng. Trong hai cách thì cách thứ 2
được sử dụng phổ biến nhất.
Biểu đồ thể nhiễm sắc hay còn gọi là thể nhiễm sắc đồ là dựa vào biểu đồ nhân r
ồi mô
hình hóa lên bằng các đường thẳng có chiều dài, chiều rộng cũng như vị trí tâm động tương
ứng với thể nhiễm sắc thực như trên biểu đồ nhân.
Ví dụ : Kiểu nhân một loài Cúc (Anthemis ruthenica M.B. như sau:2 đôi M (Tâm giữa), 5
đôi Sm (Tâm lệch) và 2 đôi A-SAT (Tâm mút với các thể kèm) (Nguyễn Nghĩa Thìn, 1980): 2
M + 5 Sm + 2A-SAT.
7.5 Phương pháp phân loại izoenzym
7.5.1 Định nghĩa izoenzym
Enzym hay izoenzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học ở
trong cơ thể sống hoặc ở ngoài tế bào khi có đủ điều kiện cho các phản ứng đó xảy ra.
Izoenzym là thuật ngữ để chỉ các biến dạng của enzym, các dạng tồn tại trong quần thể tự
nhiên, là kết quả của các phản ứng gây ra sự thay đổi các axit amin trong cấu trúc bậc một của
chuỗi polypeptide. Cấu trúc này lại do tr
ật tự của các nucleotid trong gen quy định. Chính vì
vậy khi sử dụng phương pháp điện di trên gen agarose, tinh bột thủy phân, polyacrylamid
cùng với việc phối hợp nhuộm hóa tế bào cho phép ta phát hiện các biến dạng khác nhau của
phân tử enzym.
Bởi vậy việc sử dụng các dẫn liệu về đa hình các izoenzym không những hiểu biết gen
của cá thể mà biết mức độ dị hợp của quần thể. Mặt khác mỗi biến d

ạng phân tử enzym là một
“marker” của gen. Vì vậy nó được sử dụng cho loài. Trong nội bộ loài, việc sử dụng các dẫn
liệu đa hình thông qua tần số alen của các locut cũng có thể chỉ ra tính chất đặc trưng cho các
vùng phân bố của loài. Trên cơ sở như vậy người ta dùng izoenzym để phân biệt các cá thể
thuộc các đơn vị phân loại giữa các thứ hoặc giữa các loài, giữa các loài đồng hình, loài chị
em


19
Phương pháp phân tích tính đa hình của izozym là một trong những phương pháp phân
loại ở mức độ phân tử do nó đã tiếp cận với những sản phẩm trực tiếp của quá trình dịch m• di
truyền.
Nhờ tính rõ ràng của kết quả và sự đa hình của các hệ enzym được sử dụng, kết quả phân
tích mang độ chính xác cao và tin cậy.
Nó được sử dụng rộng r•i trong việc nghiên cứu mối quan hệ trong và ngoài loài, góp
phần xây d
ựng mối quan hệ xác thực trong hệ thống học của sinh giới, là công cụ đắc lực hỗ
trợ cho các nhà phân loại trong trường hợp các khóa phân loại hình thái không đủ để giải
quyết vấn đề. Tất nhiên cũng cần nói rõ phương pháp này dù nó có phản ảnh bản chất di
truyền của loài hay bất kỳ một taxôn nào khác nhưng nó không thể thay thế cho phương pháp
phân loại truyền thống. Nó sẽ giúp cho việc hoàn chỉnh và làm chính xác cách phân loại
truy
ền thống trên cơ sở dựa vào các dấu hiệu hình thái bên ngoài. Mỗi sự thay đổi của gen đều
được thể hiện qua tính đa dạng của các izoenzym nhưng chưa chắc các biến đổi đó đã được di
truyền lại cho các thế hệ mai sau. Vì vậy phải tìm, phải sàng lọc và lựa chọn những biến đổi
nào đặc trưng cho loài. Đấy mới là điều quan trọng. Chính vì vậy phương pháp này chỉ ra cho
ta th
ấy mức độ đa dạng của các gen bên trong và qua đó giúp cho ta biết mối quan hệ huyết
thống giữa các taxôn.

7.5.2 Phương pháp phân tích izozym bằng kỹ thuật điện di
Phương pháp này được sử dụng rộng r•i trong nghiên cứu hệ thống học bởi 5 lý do sau:
1. Mẫu cần phân tích rất nhỏ
2. Một lần phân tích được nhiều mẫu
3. Các chất dùng cho chạy điện di không quá đắt tiền
4. Dụng cụ chạy điện di khá phổ biến
5. Kết quả thu được phản ảnh gián tiếp sự có mặt của các alen trong cơ thể đối tượng
nghiên cứu.
Tuy nhiên cũ
ng cần chỉ rõ kết quả trên trước hết có ý nghĩa lớn để đánh giá mối quan hệ
họ hàng giữa các taxôn, còn việc sử dụng phương pháp này cũng như các phương pháp phân
tích ADN dùng trong phân loại không phải đơn giản. Việc nhận dạng và suy luận kết quả của
phép phân tích điện di cần phải tuân theo những nguyên tắc đặc thù và đòi hỏi các nhà nghiên
cứu phải am hiểu các phạm trù trong phân loại học, am hiểu
đối tượng mà mình nghiên cứu
và phải có quá trình nghiên cứu lâu dài trên cơ sở lấy phương pháp phân loại bằng hình thái
làm cơ sở. Về giá trị phân loại của hai phương pháp này có tính hiện thực chỉ khi nào nghiên
cứu một cách đầy đủ và trọn vẹn một taxôn nào đấy. Trên cơ sở đó mới tìm ra các marker đặc
trưng có ý nghĩa trong phân loại. Nếu chỉ phân tích từng phần của một taxôn và không phân
tích có tính hệ thống thì những số liệu
đó chỉ mới nói lên tính đa dạng của taxôn đó hay chỉ
dừng lại xem xét mối quan hệ họ hàng ở mức tương đối mà thôi và nếu tách phương pháp này


20
khỏi phương pháp phân loại hình thái như một số nhà sinh học phân tử đã làm lại là một sai
lầm không thể chấp nhận.
7.5.2.1 Kỹ thuật điện di

Điện di là một kỹ thuật sắc ký được sử dụng rộng r•i để tách một hỗn hợp các hợp chất có
khả năng ion hóa. Điện di trên gel kết hợp dựa vào điện tích và quá trình tách dựa vào kích
thước phân tử c
ủa các đối tượng tham gia điện di. Một quá trình điện di cơ bản gồm các bước
sau:
* Chuẩn bị mẫu cho phép điện di: Do sự xuất hiện và hàm lượng của các izoenzym là
khác nhau ở các bộ phận trong cơ thể, các trạng thái phát triển, điều kiện môi trường. Cần
phải nghiên cứu để tìm ra vật liệu phù hợp cho việc tách mẫu ban đầu. Mẫu phải được bảo
quản trong
điều kiện tránh sự phân huỷ của izoenzym.
* Đổ gel: Tùy theo độ giống nhau của các izoenzym mà chọn nồng độ gel đảm bảo có
độ phân giải cao nhất đối với hệ izoenzym cần nghiên cứu.
* Chuẩn bị dung dịch đệm: Dựa vào tài liệu tham khảo cũng như kinh nghiệm thực tế để
chuẩn bị các dung dịch đệm có nồng độ và giá trị pH phù hợp và chính xác để đảm bảo kết
quả
phân tích sẽ lặp lại.
* Lựa chọn các thông số về dòng điện, thế năng của nguồn điện di và thời gian chạy
mẫu.
* Cắt lát gel: Trong trường hợp chạy gel tinh bột, người ta cắt lát các lớp gel từ tấm gel
dày ban đầu. Các lớp này có thể dùng để nhuộm với các chất nhuộm màu đặc hiệu khác nhau.
* Nhuộm gel hay hiện gel: Sau phép chạy điện di, các izozym chưa thể nhìn thấy mà
phải làm cho chúng phát màu nh
ờ những phản ứng được xúc tác bởi các enzym đó. Kết quả
của bước này phụ thuộc rất nhiều vào tính chất của hỗn hợp phản ứng và điều kiện ủ cho phản
ứng xảy ra như pH, nhiệt độ, cơ chất, tác nhân nhuộm,…
7.5.2.2 Đọc kết quả nghiên cứu
Để phục vụ cho nghiên cứu phân loại, việc xử lý thông tin sau khi chạy điện di cần ph
ải
dựa trên những kiến thức về di truyền học tiến hóa. Đây là phần rất quan trọng vì kết quả điện
di chỉ là một hình ảnh chết nếu người nghiên cứu không hiểu được tương quan hệ nội hàm

giữa các sản phẩm izoenzym và cấu trúc các alen trong hệ gen m• hóa cho các sản phẩm
izoenzym. Đọc kết quả điện di có thể hiểu là quá trình xây dựng bảng tương quan giữa vị trí
c
ủa các băng điện di và số alen quy định các izoenzym.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra cấu trúc khác nhau của phân tử enzym có thể biểu hiện trên
điện di đồ là khác nhau. Xét một số trường hợp cụ thể sau:
a. Trường hợp phân tử enzym có cấu trúc monomer do một alen trên một locut gen gồm
hai alen điều khiển, thì những cá thể đồng hợp tử trội mang kiểu gen AA và đồng hợp tử lặn
mang kiểu gen aa sẽ có mộ
t băng (pattern), còn cá thể dị hợp tử mang kiểu gen Aa sẽ có hai
băng (hình 7.15a).
b. Trong trường hợp phân tử enzym là monomer, locut gen chứa ba alen đồng trội thì
những cá thể đồng hợp tử mang kiểu gen AA, aa, a’a’ có một băng, còn cá thể dị hợp tử Aa,
Aa’ và aa’ có biểu hiện bởi hai băng (hình 7.15b).


21
c. Trong trường hợp phân tử enzym là dimer thì mỗi locut sẽ liên quan tới hai sợi
polypeptide, giả sử có hai alen A và a, mỗi alen m• cho một chuỗi polypeptide, sự phân ly của
kết quả điện di được minh họa trong hình 7.15c.
Trong hình 7.15 ta thấy cá thể dị hợp tử (Aa) mang 3 băng, trong đó có một băng là biểu
hiện của mức di truyền trung gian, là kết quả của sự kết hợp giữa hai chuỗi polypeptide do hai
alen khác nhau của một locut gen kiểm soát.
d. Trường hợp phân t
ử enzym có cấu trúc tetramer, nghĩa là phân tử này do 4 chuỗi
polypeptide tạo thành. Trong trường hợp này các cá thể đồng hợp tử biểu hiện một băng, còn
cá thể dị hợp tử biểu hiện 5 băng trên điện di đồ. Ta đặt giả thiết alen A tổng hợp chuỗi
polypeptide a và gen a tổng hợp chuỗi polypeptide b, cá thể lai biểu hiện 5 băng tương ứng
(hình 7.15d).
Trong một số trường hợp phân tử enzym do một locut gen có hai alen kiểm soát trong

đó
có một alen có hoạt tính và biểu hiện màu còn alen thứ hai không biểu hiện màu gọi là alen
không (null allele) thì trên điện di đồ sẽ có 3 dạng kiểu hình, một dạng biểu hiện một băng
nhuộm màu rõ nét, một dạng không biểu hiện là các cá thể đồng hợp tử, còn dạng có băng
nhạt màu và mảnh là các cá thể dị hợp tử (hình 7.16).


7.5.2.3 Tính tần số alen
Sau khi xác định sự biểu hiện của các alen ta sẽ
phân tích tần số của chúng trong đối
tượng nghiên cứu theo các công thức sau:
Khi số alen là 2 (A, a), tần số xuất hiện



22

Với AA, Aa, aa là số cá thể mang kiểu gen tương
ứng, N là số cá thể mang phân tích * 25 và đảm bảo
thỏa m•n hệ số *2.
Khi số alen là 3 (A, a, a1), tần số xuất hiện cũng
được tính tương tự

Tính hệ số tương đồng di truyền I hay khoảng
cách di truyền D:
Theo tác giả Nei hệ số tương đồng di truyền được
tính như sau:
trong đó:
XA ,YB là các tần số của alen tương ứng.
Ví dụ: Quần th

ể muỗi QTx có:
Tần số A = 0,46 Tần số alen a= 0,54
Quần thể muỗi QTx có:
Tần số alen A= 0,88 Tần số alen =
0,12
Từ đó ta tính được :
Mức độ giống nhau về mặt di truyền là: 0,745.
Từ hệ số tương đồng trên, khoảng cách di truyền
D được tính theo công thức: .
7.5.2.4 Lập cây chủng loại phát sinh dựa trên
hệ số tương đồng I
Là phương pháp tính toán mối quan hệ huyết
thố
ng của các nhóm tham gia quá trình phân loại. Từ
giá trị I thu được của các nhóm khác nhau người ta lập
bảng và xây dựng cây chủng loại phát sinh.
Nếu I > 0,5 thì các nhóm nghiên cứu thuộc về
một loài, sự khác biệt của hệ Izozym chỉ mang ý
nghĩa biến dị trong loài.
Nếu I<0,5 thì có thể sơ bộ kết luận đó là hai loài
riêng biệt.



Ví dụ: Có 5 loài ký hiệu là L1, L2, L3, L4, L5
Có hệ số I giữa 2 loài.
Quy thành nhóm như sau:
AA Aa aa
Tr−êng hîp a

AA Aa’ a’a’ Aa a’a aa
Tr−êng hîp b



AA Aa aa
Tr−êng hîp c



AA aa Aa
Tr−êng hîp d






Hình 7.15. Sơ đồ kết quả điện di
AA Aa aa





Hình 7.16.
Sơ đồ kết quả điện di alen không

23
L2 L3 L4 L5
L1 0,48 0,36 0,35 0,27
L2 0,83 0,12 0,03
L3 0,05 0,01
L4 0,53
Ở đây ta thấy giữa L2 L3 có số lớn nhất (0,83) - có quan hệ gần nhất được quy thành 1
nhóm:
L2/3 L4 L5
L1 0,42 0,35 0,27
L2 0,085 0,02
L4 0,53
Để tìm tiếp mối quan hệ giữa L4/5 và L1/2/3 ta cần nhóm tiếp như sau:
L4/5
L1 0,31
L2/3
0,05 → 0,18
Cây chủng loại phát sinh của 5 loài trên được lập như sau:

7.6 Phương pháp phân loại bằng ADN
Từ thập kỷ tám mươi của thế kỷ XIX việc phát triển các chỉ thị ADN hay còn gọi là dấu
phân tử đã được tiến hành. Đó là các chỉ thị về đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP,
Botstein và cs, 1980); Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (RAPD, Wiliam và cs.1990);
Tiểu vệ tinh (microsatellite, Litt và Luty, 1989) hay còn gọi là sự lặp lại các chuỗi đơn giản
(SSR, Jacob và cs, 1991) và đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (AFLP, Zabeau và Vos,
1993).
7.6.1 Kỹ thuật phản ứng trùng hợp - PCR
Nguyên lý: dùng một đoạn gen hay mẫu rất nhỏ ADN rồi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân
lên gấp bội dùng trong nghiên cứu.

Các nguyên liệu cần thiết:
* ADN đích hay ADN khuôn
* ADN polymerase bền nhiệt (Taq, Vent, Pfu…)
* Một hay nhiều đoạn mồi (primer) nghèo nucleotid
* Bốn loại Didesoxyribonucleotidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
* Đệm phản ứng chứa MgCl2.
Các bước tiến hành: Mỗi một chu kỳ tiến hành theo 3 bước sau:


24
* Biến tính: dùng nhiệt độ 90 - 95oC trong 30 giây đến vài phút để tách ADN khuôn
thành 2 sợi đơn.
* Lai hay bắt cặp mồi: nhiệt độ hạ xuống 50 - 70oC trong 30 giây đến vài phút để cho
các mồi nghèo nucleotid bắt cặp với các sợi đơn tại các trình tự bổ sung.
* Kéo dài chuỗi: tăng nhiệt lên 72oC trong 30 giây đến vài phút để cho ADN
polymerase bền nhiệt tổng hợp sợi mới theo nguyên tắc bổ sung.
Chu kỳ thường được lặp lại 25 - 30 lần và lúc đó số lượng s
ẽ tăng lên 106 lần số lượng
ban đầu.
Từ phương pháp này người ta đã bổ sung, cải tiến tạo ra nhiều phương pháp khác nhau
gọi là các dấu hiệu chỉ thị (marker).
7.6.2 Phân loại dựa trên kỹ thuật cắt giới hạn - RFLP
Đây là kỹ thuật sử dụng các enzym cắt hạn chế, cắt ADN thành các đoạn nhỏ có độ dài
khác nhau. Khi hai hoặc nhiều cá thể được so sánh với một đoạn dò RFLP thì có thể có sự
khác nhau về độ dài các đoạn cắt. Sự khác nhau này gọi là sự đa hình. Các đoạn này có thể di
truyền và được sử dụng như các dấu phân tử. Dựa trên số đoạn ADN tương đồng của các
băng điện di để xác định sự giống nhau hay mối quan hệ họ hàng gần gũi.
Phương pháp tiến hành:
* Tách ADN
* Cắt ADN thành những đoạn nhỏ nhờ các enzym giới hạn

* Phân tích các đoạn ADN bằng điện di trên gel
* Chuyển các đoạn ADN sang một màng lọc
* Hiển thị các đoạn ADN bằng công cụ thăm dò hay đánh dấu phóng xạ
* Phân tích các kết quả.
Thuận lợi củ
a phương pháp này: kết quả có khả năng thực hiện giữ ở các phòng thí
nghiệm; các chỉ thị RFLP thường chỉ ra sự kế thừa tương đồng của các dị hợp tử có thể nhận
ra từ đồng hợp tử; có khả năng phân biệt ở mức độ loài, quần thể hay cá thể và phương pháp
đơn giản.
Tuy nhiên áp dụng phương pháp này có một số hạn chế: tốn nhiề
u thời gian, chi phí cao;
hầu hết công việc phân tích cần đến đánh dấu phóng xạ nên bị phụ thuộc nơi tiến hành công
việc.
7.6.3 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân ngẫu nhiên ADN đa hình - RAPD
Phương pháp này dựa trên phản ứng PCR, sử dụng một hay hai đoạn mồi tự ý ngắn 6-10
bazơ để nhân một đoạn ADN gi•n xoắn nào đó và có thể phân tách và hiển thị bằng điện di
trên gel.
Quá trình được thực hiện trên máy PCR, PTC-100 (MJ Research Inc. Mỹ). Các phản ứng
được thực hiện trong thể tích 25 *l chứa 10 - 25 ng ADN genom, 2,5 *l đệm PCR có nồng độ
gấp 10 lần (đệm PCR x 10), 0,2 mM mồi, 200 mM dNTP, 1,5mM MgCl2 và 0,5 đơn vị Taq
ADN polymerase.


25
Phản ứng được thực hiện theo 3 bước:
* Biến tính ADN ở 94oC trong 1 - 3 phút
* Lai: hạ nhiệt xuống 35oC trong 1 phút
* Kéo dài chuỗi: tăng nhiệt lên 72oC trong 2 - 5 phút.
Các sản phẩm RAPD được phân tích bằng điện di trên gen agaroza 1%. Kết quả cho các
băn khác nhau. Từ đó tiến hành đánh giá mối quan hệ của hai taxôn nào đó.

Kỹ thuật này có ưu điểm là phát hiện nhanh chóng các dấu hiệu; kỹ thuật đơn giản, không
liên quan đến phương pháp lai và chụp ả
nh phóng xạ; chỉ cần một lượng cực nhỏ ADN và chi
phí thấp.
7.6.4 Phân loại dựa trên kỹ thuật nhân đoạn AFLP
Kỹ thuật AFLP là kết hợp giữa kỹ thuật RAPD và nhân đoạn PCR được tiến hành theo
các bước sau:
* Cắt ADN genom bằng enzim cắt giới hạn EcoR1 và Msel: Để làm việc này, lấy 0,3
mg ADN ủ 2 giờ ở 37oC với 3 đơn vị EcoR1 and 3 đơn vị Msel, 6 ml dung dịch điện có nồng
độ gấp 5 lần (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgAc, 250 mM KAc).
* Gắn các đoạn cắt với đoạn tiếp hợp: Sau khi cắt, lấy 10 ml hỗn hợp dùng
để gắn (1ml
đoạn tiếp hợp EcoR1 (5 pmol/ml) và 1 ml đoạn tiếp hợp Msel (50 pmol/ml), 1ml 10 mM
ATP, 1ml T4 ADN ligase và 4 ml nước cất vô trùng) cho vào 20 ml ADN đã được cắt. Phản
ứng gắn được thực hiện ở 20oC trong 3 giờ. Sau khi gắn các tiếp hợp, ADN được làm lo•ng
10 lần và giữ ở -20oC.
* Nhân đoạn bước đầu: Trước khi nhân chọn lọc các đoạn ADN đã gắn các tiếp hợp
được nhân bước đầu với các mồi tiền nhân EcoR1 (5’-GACTGCGTACCAATTC-3’) và Msel
(5’GATGAGTCCTGAGTAA3’). Dung dịch phản ứng nhân bước đầu gồm 5ml ADN đã gắn
tiếp hợp và pha lo•ng 10 lần và 25 ml hỗn hợp tiền nhân (0,5 ml mồi tiền nhân EcoR1 (100
ng/ml), 0,5 ml mồi tiền nhân Msel (100 ng/ml), 1,3ml 5mM dNTP, 3ml 10 x đệm PCR, 1,2
ml 50 mM MgCl2, 0,2 ml 5 đơn vị/ml Taq ADN polymerase, và 18,3 ml nước cất vô trùng).
Phản ứng nhân được thực hiện bằng 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 30 giây ở 94oC, 1 phút ở
56oC, 1 phút ở 72oC.
* Nhân chọn lọc: Việc nhân chọn lọc các đoạn ADN đã được gắn tiếp h
ợp và nhân bước
đầu được tiến hành với việc sử dụng các mồi có 2 hoặc 3 nucleotide chọn lọc.
Các mồi chọn lọc EcoR1 có chuỗi nucleotide chung là 5GACTGCGTACCAATT3’ còn
các mồi chọn lọc Msel có chuỗi nucleotide chung là 5’GATGAGTCCGAGTAA-3’. Các mồi
chọn lọc khác nhau ở chỗ ngoài chuỗi nucleotide chung chúng có từ 1 đến 3 nucleotide chọn

lọc. Chẳng hạn EcoR1-C, EcoR1-CT, EcoR1-CAT hay Msel-A, Msel-AG, Msel-GC.
Nhân chọn lọc được thực hiện trong 12ml dung dịch gồm 6 ml hỗn hợp phản ứng (1,25
ml 10 x đệm PCR, 0,6 ml 50 mM MgCl2, 0,6 ml 5 mM dNTP, 0,5 ml mỗi loại mồ
i chọn lọc,
0,1 ml 5 đơn vị Taq ADN polymerase và 3 ml nước cất vô trùng). Phản ứng nhân chọn lọc
được thực hiện bằng 36 chu kỳ như sau: 1 chu kỳ gồm gi•n xoắn ở 94oC trong 30 giây, gắn
mồi ở 65oC trong 1 phút và kéo dài mồi ở 72oC trong 2 phút; tiếp theo là 12 chu kỳ với nhiệt
độ gắn mồi giảm 0,7oC sau mỗi chu kỳ; cuối cùng là 23 chu kỳ với nhiệt độ gắn mồi là 56oC.