Báo cáo " TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TRỨNG " ppt

Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT
337
TẠO PHÔI BÒ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI TIÊM TINH
TRÙNG VÀO BÀO TƯƠNG TR ỨNG
Trần Thị Thanh Khương, Đặng Hoàng Lâm, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc
ĐH Khoa học Tự nhiên TPHCM
MỞ ĐẦU
Để nâng cao hiệu quả thụ tinh nhằm nhân nhanh đ àn bò sữa, việc áp dụng vi
tiêm (microinjection) tinh trùng vào bào tương tr ứng là cần thiết. Trứng bò thu
nhận từ nhiều nguồn được nuôi trưởng thành trong TCM 199 với 20% FBS (Fetal
Bovine Serum). Tinh trùng bò sữa đông lạnh được hoạt hoá bằng phương pháp
swim-up trong môi trường BO. Sau khi vi tiêm, trứng được hoạt hoá. Sau 9 lần
thực hiện với 44 trứng tạo, đ ược 20 phôi, với tỷ lệ thành công là 47,17% và phôi
đạt giai đoạn morula là 10%.
ICSI - Intracytoplasmic sperm injection là phương pháp vi tiêm m ột tinh trùng
được lựa chọn từ trước đó vào bào tương trứng, với sự hỗ trợ của hệ thống vi thao tác
cùng với kính hiển vi đảo ngược. Kỹ thuật này ra đời vào năm 1992 do Palemo và cs đã
ứng dụng thành công trên người. ICSI như là một cuộc cách mạng trong hỗ trợ sinh sản
đặc biệt trong chữa trị vô sinh nam.
Đối với gia súc, sau khi thực hiện ICSI, tế b ào trứng có chứa tinh trùng phải trải
qua quá trình hoạt hoá với các tác nhân như xung điện, ethanol 7%, Calcium Ionophore
(A23187)…
Tạo phôi bò bằng phương pháp vi tiêm đã mở ra hướng mới trong nhân giống
bò đem lại hiệu quả cao, đặc biệt l à bò sữa trong trường hợp nguồn giao tử có chất
lượng kém hoặc nguồn trứng đông lạnh. Bên cạnh đó, việc tiếp cận kỹ thuật hiện
đại còn giúp hoàn thiện các quy trình công nghệ khác trong các nghiên cứu xa như
tạo dòng, sinh thiết, tạo động vật chuyển gen, bảo tồn động vật quý hiếm…
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chuẩn bị trứng: Trứng bò tươi thu nhận tại lò mổ hay trứng đông lạnh được
lựa chọn, phân loại A, B. Các trứng n ày được nuôi trưởng thành trong môi trường
TCM 199 (Sigma) với 20% FBS (In vitrogen). Sau 24 giờ nuôi, tiến h ành phá lớp

tế bào cumulus bao quanh trứng bằng enzyme hyaluronidase (1mg/ml, Sigma).
Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
338
Hình 1. Trứng bò chín.
(a) Trước khi phá lớp cumulus, (b) Sau khi phá lớp cumulus
Chuẩn bị tinh trùng: Tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ được giải đông ở 37
o
C trong
60 giây. Thực hiện swim-up 15 phút trong môi trường BO, thu nhận dịch nổi, chọn tinh
trùng cho vi tiêm.
Vi tiêm: Hút tinh trùng bằng kim tiêm (injection pipette) trong giọt PVP (In
vitrogen) chuyển qua giọt TCM 199 chứa trứng. Kim giữ (holding pipette) trứng đ ược
điều chỉnh thể cực ở vị trí 6 giờ hay 12 giờ, tiến hành tiêm tinh trùng vào bào tương
trứng một cách nhẹ nhàng, nhanh chóng với thể tích đưa vào bào tương trứng ít nhất.
Hình 2. Vi tiêm tinh trùng vào bào t ương trứng
(a)
(b)
Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT
339
Chuyển trứng sau khi vi tiêm vào môi trường nuôi phôi CR1aa. Sau 4 giờ nuôi, tiến
hành hoạt hoá trứng sau khi vi tiêm với TCM 199 với 7% ethanol trong 4 phút. Tiếp tục
nuôi phôi trong môi trường CR1aa và theo dõi các giai đoạn phát triển của phôi.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sau 9 lần vi tiêm, được 44 trứng, số phôi thu được là 20 phôi, chiếm tỷ lệ tạo phôi
là 47,17%. Trong 20 phôi có 2 phôi ở giai đoạn 2 tế bào (10%), 5 phôi giai đoạn 4 tế
bào (25%), 10 phôi giai đoạn 8 tế bào (50%), 1 phôi giai đoạn 16 tế bào (5 %) và 2 phôi
giai đoạn morula (10%).
Hình 3. Kết quả tạo phôi bò bằng ICSI.
(a) Phôi 2 tế bào, (b) Phôi 4 tế bào, (c) Phôi 8 tế bào, (d) Phôi morula
Năm 1989, Younis và cs đã tạo được phôi bò bằng kỹ thuật ICSI truyền thống và

trứng không hoạt hóa với tỷ lệ 2%. Li v à cs (1999) tạo phôi bằng piezo-ICSI có hoạt
hóa bằng ethanol 7% phôi tạo ra với tỷ lệ 26,4%. Cùng năm đó Hamano đã thành công
với tỷ lệ tương đối cao là 56,6 %. Năm 2004, Kato, H., Matsumoto và cs đ ã so sánh
giữa hoạt hóa bằng ethanol 7% và không hoạt hóa, đạt tỷ lệ phôi là 51% so với không
hoạt hóa là 13%. Takenaka và cs (2005) cùng dùng phương pháp hoạt hóa bằng ethanol
7% với tỷ lệ tạo phôi là 75,6%.
(a)
(b)
(c)
(d)
Hội nghị KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 2007
340
Như vậy với tỷ lệ tạo phôi là 47,17 % là tương đối cao, cao hơn hẳn với lần thực
hiện đầu tiền vào năm 1989. So với các nghiên cứu gần đây thì tỷ lệ tạo phôi là tương
đối thấp, tuy nhiên các nhà khoa học trên thế giới thực hiện ICSI có hỗ trợ Piezo trong
khi chúng tôi thực hiện với phương pháp cổ điển, dùng lực cơ học của kim tiêm vào
màng trứng. Kỹ thuật Piezo-ICSI, màng pellucida và màng noãn sẽ chịu ít sự tác động
của đầu pipette mà thay vào đó là có sự hỗ trợ của tia piezo. Một trong những thuận lợi
của kỹ thuật piezo là giảm đáng kể sự phá hủy trứng trong suốt quá tr ình thụ tinh. Trong
khi với kỹ thuật cổ điển, lực của đầu kim gồm lực tiếp tuyến v à lực xoay đã phần nào
tác động đến tế bào chất trứng.
Như vậy, với kỹ thuật ICSI cổ điển chúng tôi đ ã tạo ra phôi với tỷ lệ 47,17% cùng
với sự hoạt hóa của ethanol 7%. Tuy ethano l7% không phải là tác nhân hoạt hóa nhân
tạo tối ưu nhưng tỷ lệ tạo phôi cũng tương đối cao. Hơn thế nữa, ethanol 7% là hóa chất
dễ có và tiện lợi trong điều kiện chúng tôi
Có thể khẳng định rằng với nguồn mẫu ổn định, trứng chất l ượng tốt, hệ thống vi
thao tác tốt, ổn định cùng với tay nghề của kỹ thuật viên thao tác cao thì tỷ lệ phôi bò
bằng phương pháp ICSI không chỉ dừng ở tỷ lệ 47,17% mà còn cao hơn nữa.
Đối với trứng người, tỷ lệ ICSI cao hơn so với IVF, nhưng ở bò: theo Kim tea
Chung và cs (1999) tỷ lệ phôi IVF là 75%, của Phan Kim Ngọc và cs (2006) là 72,19%

tỷ lệ tạo phôi bằng ICSI thấp hơn do bản chất của trứng bò khó hoạt hóa hơn so với
trứng người và để tạo thành hợp tử, chúng phải nhận những kích thích nhân tạo. Tuy
nhiên, Gyu-Jin Rho và cs (1998) đã tiến hành xác định giới tính tinh trùng bằng phương
pháp Flow Cytometry với tỷ lệ 80% và tiến hành vi tiêm tinh trùng đã xác định giới
tính. Tỷ lệ phôi đạt được với phương pháp này là 46,6% và phôi ở giai đoạn blastocyst
là 6,9%. So với kết quả tạo phôi của chúng tôi là 47,17 % cao hơn.
KẾT LUẬN
Trong phương pháp chuẩn bị giao tử, swim-up dùng cho hoạt hoá tinh trùng phù
hợp với ICSI. Tác nhân ethanol 7% có vai tr ò hoạt hoá trứng sau khi vi tiêm, cho kết
quả tạo phôi tương đối cao và phù hợp với điều kiện thực hiện. Bằng kỹ thuật ICSI cổ
điển, với tác nhân hoạt hoá là ethanol 7% tỷ lệ tạo phôi 47,17% với phôi đạt giai đoạn
morula là 10%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Carlos A. Guerrero. (2006) Cryopreservation And Intracytoplasmic Sperm
Injection With Bovine Epididymal Spermatozoa . .S. Louisiana State University.
2. Henry E. Malter & Jacques Cohen.(2002) Intracytoplasmic sperm injection:
technical aspects. Gamete source, manipulation and disposition.
3. Heuwieser W, Yang X, Jiang S, Foote RH: Fertilization of 21. Yanagida K,
Katayose H, Yazawa H, et al(1992): Successful fertilizabovine oocytes after
microsurgical injection of spermatozoa Theriogenology
Phần IV: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT
341
4. Jin-Tae Chung (1999). Activation of bovine oocytes following intracytoplasmic
sperm injection (ICSI). Department of Animal Science Macdonald Campus McGill
University, Montreal, Quebec, Canada.
5. Keith J. Betteridge (2004). New reproductive Technologies in Cattle: A Veterinary
Perspective. Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College,
University of Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Canada.
6. Kimura, Y & R. Yanagimachi (1995). Intracytoplasmic sperm injection in the
mouse. Biol. Reproduction. 52: 709-720.

7. Mapletoft RJ & J. F. Hasler (2005). Assisted reproductive technologies in cattle: a
review. (1) Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan,
Saskatoon, SK S7N 5B4, Canada (2) AB Technology, Bionich e Animal Health
USA, Inc., Pullman, WA 99163, United States of America.
8. Ragaa Mansour (1998). Intracytoplasmic sperm injection: a state of the art
technique Human Reproduction Update, Vol. 4, No. 1 pp. 43-56.
9. Toshitaka Horiuchi (2002) Application of Intracytoplasmic Sperm Injection to
Animal Production. Faculty of Life and Environmental Sciences Department of
Life Sciences.
SUMMARY
Bovine embryo production by intracytoplasmic sperm
injection
Tran Thi Thanh Khuong, Dang Hoang Lam, Pham Van Phuc, Phan Ki m Ngoc
University of Sciences HCMCity
Due to bovine oocyte source is rare. To increase fertilization effect, application of
intracytoplasmic sperm injection method is nessesary. In our research, bovine oocytes
are collected at slaughter-house and cultured with TCM 199 plus 20% FBS (fetal bovine
serum) until maturation. Cryopreserved bovine semen is thawed and activated with BO
medium. After injection, oocytes are treated with 7% ethanol in TCM 199 for 4 min for
activation. In 9 repeats, 44 oocytes were in jected, with 20 embryo that are formed, with
47,17% cleavage rate, 10% morula embryo.