TIỂU LUẬN:ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ HEO ppt

1


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
[\



BÀI BÁO CÁO
ĐÊ TÀI 09
: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ
HEO

Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện:
TS.NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN XUÂN KHÁNH
Lớp: DH06SH
MSSV: 06126055




Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 10/2009

2

Phụ lục:
I.Đặt vấn đề 3
I.1. Đặt vấn đề 3

I.2. Mục tiêu 3
II. Tổng quan 4
II.1Giới thiệu về dịch tả heo 4
II.1.1 Hình thái cấu trúc virus dịch tả heo 4
II.1.2.Tính chất kháng nguyên 5
II.1.3. Tính sinh miễn dịch 5
II.2.Nguyên lý sử dụng bộ Kit Elisa: 5
III. Vật liệu và phương pháp tiến hành 6
III.1. Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm 6
III.2.Phương pháp tiến hành: 7
III.2.1.Chuẩn bị 7
III.2.2.Phương pháp: 7
III.2.2.1.Phân phối đối chứ
ng và mẫu 7
III.2.2.2.Thêm kháng huyết thanh 8
III.2.2.3. Thêm conjugate: 8
III.2.2.4. Phát hiện: 9
III.2.2.5. Xử lý số liệu 9
IV. Tài liệu tham khảo: 10






3


I.Đặt vấn đề
I.1. Đặt vấn đề

Nghành chăn nuôi hiện nay đóng vai trò rất quan trọng trong việc
cung cấp thực phẩm cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu.
Bên cạnh những thành công trong chăn nuôi, sự hiện diện của một
số dịch bệnh vẫn thường xuyên gây tổn thất đáng kể trong nghành
chăn nuôi. Một trong những yếu tố nguy cơ phải kể đến là bệnh d
ịch tả
heo. Bệnh xuất hiện trong cả nước, xảy ra tương đối nghiêm trọng ở
nhiều tỉnh thành phía nam. Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, xảy ra ở mọi
lứa tuổi ở heo, trên gia súc non, tỷ lệ chết có thể lên tới 100%. Heo nái
mang trứng tạo cảm nhiễm qua nhau thai, gây chết phôi, sẩy thai… Vì
vậy, tổ chức dịch tể thế giới xếp bệnh này thuộc bảng A, là bảng danh
mục các bệ
nh nguy hiểm nhất.
Xuất phát từ tình hình trên, nên việc nghiên cứu các phương pháp
phát hiện bệnh là yêu cầu cấp thiết để phòng chống bệnh, giảm tổn
thất trong chăn nuôi, giữ cho đàn heo mắc bệnh ở tỷ lệ thấp nhất. Có
nhiều phương pháp phát hiện bệnh đã được nghiên cứu, trong bài này
tôi sẽ trình bày về phương pháp ELISA gián tiếp để phát hiện virus
dịch tả heo.
I.2. Mục tiêu:
Sử d
ụng bộ kit Elisa để phát hiện bệnh dich tả heo sớm.






4


II. Tổng quan
II.1Giới thiệu về dịch tả heo
II.1.1 Hình thái cấu trúc virus dịch tả heo
a. Phân loại

Họ Flavividae
Giống Pestivirus
Virus dịch tả heo rất gần về mặt cấu trúc gen và cấu trúc kháng
nguyên vơi các loài như sau:
Bovine diarrhea virus
Equine arteritis virus
Border diesease virus
b.Hình thái, cấu tạo:

Kích thước nhỏ 40-50 nm
Có dạng hình cầu với cấu trúc nucleocapsid đối xứng 20 mặt
Bộ gen virus là một chuỗi RNA, độ dài khoảng 12.5kb, một khung
đọc mở (ORF)
Có vỏ bọc, trên vỏ có tua gai với bản chất glycoprotein.Virus dịch
tả heo có glycoprotein E1 (55 kDa) và E2 (46 kDa) ở trên bề mặt và
một protein 36 kDa của nucleocapsid.

Protein cấu trúc: P14 tạo nucleocapsid, gp48, gp 25, gp 53.
P125 là protein không cấu trúc, có một đầu amio acid rất ưa nước
và hoạt tính protease. Người ta cho rằng protein này tham gia vào quá
trình nhân đôi DNA.
c. Tính ch
ất lý hóa
Virus dịch tả heo được coi là virus có sức đề kháng yếu.

Ổn định ở PH 5-10, ngoài khoảng PH này thì virus bị phá hủy
nhanh.
Những chất tan lipid như ether, chloroform và deoxycholate làm
bất hoạt virus nhanh.
5



II.1.2.Tính chất kháng nguyên
Kháng thể kháng virus dịch tả heo có thể phát hiện bằng kỹ thuật
huyết thanh học khác nhau như phản ứng trung hòa, kết tủa khuếch
tán trên thạch, kết hợp bổ thể, miễn dịch huỳnh quang, ngưng kết
hồng cầu thụ động.
Chỉ có một typ kháng nguyên dịch tả heo, tuy nhiên, những nghiên
cứu định lượng bằng phản ứng trung hòa huyết thanhcho phép phân
biệt hai nhóm phụ
vì huyết thanh:
Nhóm phụ A: bao gồm những chủng cường độ chủng độc lực thấp,
chủng biến đổi.
Nhóm phụ B: chủng độc lực thấp gây xáo trộn sinh sản.
II.1.3. Tính sinh miễn dịch
Miễn dịch xuất hiện trên heo khỏi bệnh dịch tả heo thì dài và chắc
chắn. Tuy nhiên, những chủng virus dịch tả heo mãn tính hay cận lâm
sàng có tính sinh miễn dịch yếu.
Tính sinh miễn dịch cũng truyền cho heo con (qua s
ữa đầu) của
những heo nái khỏi bệnh, tính miễn dịch này duy trì khoảng 6 tuần lễ.
II.2.Nguyên lý sử dụng bộ Kit Elisa:
Dưa trên nguyên tắc kết hơp đặc hiệu giữa kháng nguyên và
kháng thể.

Kit SERELISA® HCV Ag sử dụng kỹ thuật miễn dịch gián tiếp cho
việc phát hiện kháng nguyên (p125 không cấu trúc protein), mà nó có
tối thiểu một epitope chung cho tất cả các dòng Hog Cholera Virus.
Việc phát hiện được thực hiện trực tiếp trên mẫu máu, huyế
t tương ,
huyết thanh, bạch cầu, hoặc dịch chiết mô, cho phép xác định sớm
những heo bị nhiễm virus.
Gồm 4 bước:
1. Các đối chứng và mẫu được cho vào những giếng có kháng thể đơn
dòng kháng HCV (p125). Protein của virus hiện diện trong mẫu gắn
với những vị trí chuyên biệt.
6

2. Sau đó là một bước rửa để loại bỏ những đoạn không liên kết, thêm
vào kháng huyết thanh thỏ kháng HCV. Nó sẽ gắn kết với kháng
nguyên hiện diện trong mẫu.
3. Tiến hành rửa lần hai, sau đó cho kháng thể dê kháng kháng thể thỏ
có gắn enzyme peroxidase cho phép phát hiện dạng kháng huyết
thanh thỏ kháng HCV theo phức hợp:
(Mab) - (Ag HCV [p125]) - (Rabbit Ig anti-HCV [p125]) - (Goat Ab anti-rabbit
Ig /peroxidase).
4. Sau bước rửa thứ 3, enzyme gắn với lại conjugate được phát hiện
bởi việc thêm vào cơ ch
ất nó làm biến đổi thành sản phẩm có màu.
Cường độ màu được ghi lại và được dùng để xác định có hay không
có sự hiện diện của kháng nguyên, dựa trên giá trị ngưỡng có được
nhờ mẫu đối chứng dương.

III. Vật liệu và phương pháp tiến hành:
III.1. Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm

• Dụng cụ
Các dụng cụ để tiến hành thí nghiệm bao gồm:
ống nghiệm,
eppendorf các loại, pipet, đầu tip, lọ thủy tinh đựng hóa chất,
đầu lọc hóa chất, thùng đựng nước đá, bình tam giác, bộ kit
SERELISA® HCV Ag
• Các thiết bị, máy móc
9 Bồn ổn nhiệt
9 Máy li tâm
9 Tủ lạnh
9 Máy đo OD
9 Tủ sấy dụng cụ
• Thành phần của kit:
9 Conjugate: là phức hợp kháng huyết thanh dê kháng
kháng thể thỏ có gắn enzyme peroxidase, (nồng độ 10X).

9 Kháng huyế
t thanh thỏ kháng HCV [p125] nồng độ 10X
( anti-HCV [p125] rabbit antiserum- AS )
9 Dung dịch cơ chất peroxidase (Buffered peroxidase
substrate (PS) ).
9 Đối chứng âm ( Negative control (N)).
7

9 Đối chứng dương ( Positive control (P)).
9 Mẫu máu pha loãng (Blood sample diluent (SD)).
9 Dung dịch rửa (W) (10X nồng độ).
9 Conjugate và kháng huyết thanh pha loãng (CD)
9 Dung dịch dừng phản ứng (S)
9 Các màng dính

• Vật liệu và yêu cầu chất phản ứng
9 Nước cất hoặc nước khử ion.
9 Điều chỉnh hoặc cài đặt các pipet để ước lượng hoặc
phân phối giữa 0 đế
n 1000 μl. Sai số đo lường có thể
≤ 10% cho thể tích ≤ 10 μl và≤ 5% cho tất cả các thể tích
khác.
9 Xi lanh chia độ (100 ml and 1000 ml).
9 Dụng cụ rửa bằng tay, tự động hoặc bán tự động cho các
bản vi chuẩn độ.
9 Máy đo OD tại 450 và 630 nm, cũng có thể đọc được với
một bước sóng 450 nm.

• Mẫu
9 Kiểm tra được thực hiện trực tiếp trên mẫ
u máu với chất
kháng đông, huyết thanh, huyết tương pha loãng 1:2,
cũng như trên bạch cầu và dịch chiết mô.
9 Mẫu nên được lưu trữ như sau:









III.2.Phương pháp tiến hành:

Sử dụng 2 đối chứng âm và đối chứng dương cho mỗi lần kiểm
tra, cho mỗi đĩa.
8

III.2.1.Chuẩn bị
Cẩn thận cho việc phân phối và xác định đối chứng và mẫu. Tất
cả các thuốc thử phải đạt tới nhiệt độ phòng (18-25
o
C) trước khi
sử dụng.
III.2.2.Phương pháp:
III.2.2.1.Phân phối đối chứng và mẫu
a, Phân phối đối chứng:
Đối chứng được sẵn sàng sử dụng.
Lắc ống đựng đối chứng, cho 100µ đối chứng âm vào giếng
A1, A2, cho 100µl đối chứng dương vào giếng B1, B2.
b,Phân phối mẫu:
 Mẫu huyết thanh, huyết tương, và cả mẫu máu được kiểm
tra sau khi pha loãng vớ
i tỷ lệ 1:2 trực tiếp trong giếng, dùng
100µl/giếng.
 Phân phối 50µl mẫu pha loãng(SD) và thêm 50µl mẫu được
kiểm tra.
 Mẫu bạch cầu và dịch chiết mô: phân phối 100µl
supernatant từ dịch chiết mô không pha loãng hơn nữa.
 Mẫu có thể được kiểm tra một lần hoặc hai lần.
 Giếng phải được phủ phim dính, nó được cắt theo chiều dài
phù hợp với số giếng sử dụng.
 Tr
ộn bằng cách lắc nhẹ đĩa(plate) hoặc máy trộn.

c. Ủ đĩa(plate)
Ủ 2 giờ ± 5 phút ở 37°C ± 3°C hoặc qua đêm (14-18 giờ) ở
20°C ± 5°C.
d.Rửa: dung dịch đệm rửa, pha loãng nồng độ dung dịch rửa 1:10
trong nước cất hoặc nước khử ion. Cẩn thận loại bỏ phim dính và
rửa 4 lần.
III.2.2.2.Thêm kháng huyết thanh
a. Chuẩn bị kháng huyết thanh: pha loãng kháng huyết thanh
1:10 với chất pha loãng.
b. Phân phối kháng huyết thanh: cho 100µl của kháng huyết
thanh pha loãng vào toàn bộ giếng và phủ với một phim dính
mới.
c. Ủ: kháng huyết thanh 1 h ± 5 phút ở 37°C ± 3°C.
d. Rửa: cần chú ý loại bỏ lớp phim dính và rửa 4 lần.

III.2.2.3. Thêm conjugate:
a. Chuẩn bị conjugate: chuẩn bị dung dịch conjugate pha loãng
nồng độ 1:10.
9

b. Phân phối conjugate: thêm 100µl conjugate pha loãng vào tất
cả các giếng và phủ 1 mẫu phim dính mới.
c. Ủ: conjugate 1 h ± 5 phút ở 37°C ± 3°C.
d. Rửa: loại bỏ phim dính, rửa 4 lần.
III.2.2.4. Phát hiện:
a. Thêm cơ chất:
Thêm 100 µl cơ chất peroxidase trên một giếng (không phủ lớp
phim dính ở bước này). Trộn bằng cách lắc nhẹ hoặc sử dụng
máy trộn.
b. Ủ: cơ chất 30 phút ± 5 phút ở nhiệt độ phòng ( 20°C ± 5°C),

tránh ánh sáng.
c. Thêm dung d
ịch dừng phản ứng: thêm 50µl dung dịch dừng
phản ứng trong một giếng.
Trộn bằng cách lắc nhẹ hoặc sử dụng máy trộn. Đảm bảo rằng
không có bọt khí trên giếng.
d. Đo OD: ở 2 bước sóng hấp thu 450 và 630nm hoặc 1bước sóng
hấp thu 450nm bằng máy đọc Elisa
Thu kết quả nếu có giá trị :OD đạt được đối với đối chứng dương
là ≥ 0.300, và OD đạt được
đối với đối chứng âm là < 70% ODP
III.2.2.5. Xử lý số liệu: Hai phương pháp để tính toán và giải thích:
a. Dựa vào chỉ số OD
mẫu
:
Cho mỗi mẫu:

Trong đó:
—
OD
Mẫu
= trung bình các OD mẫu, nếu kiểm tra được thực hiện với
hai mẫu
—


OD
P
= trung bình OD của đối chứng dương.
• Bất kỳ mẫu máu có chỉ số ≥0 xem như dương tính, < -0.15x

coi như âm tính. Bất kỳ mẫu dịch chiết mô, bạch cầu, huyết tương,
hoặc huyết thanh có chỉ số ≥0.1x xem như dương tính, < -0.1 x
coi như âm tính.
—
• Chỉ số OD
Mẫu
đối với mẫu máu

nằm trong khoảng [-0.15,0) là kết quả
nghi ngờ.
—
• Chỉ số OD
Mẫu
đối với mẫu dịch chiết mô, bạch cầu, huyết
tương, hoặc huyết thanh nằm trong khoảng
— —
10

[ 0.1xOD
P
, 0.1xOD
P
) là kết quả nghi ngờ

b. Phân tích OD:

Trong đó: OD CO được tính theo công thức:

IV. Tài liệu tham khảo:
• Công nghệ sinh học trong thú y. Nguyễn Ngọc Hải.
• Phylogenetic of hog cholera virus in Tien Giang province
Trân Thị Dân, Lương Quý Phương, Nguyen Ngọc Tuân,
Thái Quôc Hiêu, Hô Huỳnh Mai
Đại học Nông Lâm TPHCM, CCTY Tiền Giang
• Mignon B., Waxweiler S., Thiry E., Boulanger D., Dubuisson J. and
Pastoret P.P. 1992 J. Virol. Methods, 40 ; 85-94.