HỖ TRỢ ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GENE LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG CHUYỂN HÓA ADENOSINE VÀ CORDYCEPIN TRÊN LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG METACORDYCEPS TAII

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

NGUYỄN THANH TÙNG

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH SỰ
BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GENE LIÊN QUAN ĐẾN
CON ĐƯỜNG CHUYỂN HĨA ADENOSINE VÀ
CORDYCEPIN TRÊN LỒI NẤM KÝ SINH CƠN
TRÙNG METACORDYCEPS TAII
KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGÀNH HỌC: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021
i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

NGUYỄN THANH TÙNG

HỖ TRỢ ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH SỰ
BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GENE LIÊN QUAN ĐẾN
CON ĐƯỜNG CHUYỂN HĨA ADENOSINE VÀ
CORDYCEPIN TRÊN LỒI NẤM KÝ SINH CÔN

TRÙNG METACORDYCEPS TAII
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC
Mã số chuyên ngành
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGÀNH HỌC: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: TS. LAO ĐỨC THUẬN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

ii


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành, lời chúc sức khỏe đến các thầy cô
khoa Công nghệ sinh học Trường Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh. Nhờ có sự dạy dỗ,
quan tâm, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập
của quý thầy cô trong khoa đến nay em đã có thể hồn thành khóa luận tốt nghiệp với
chuyên đề “Hỗ trợ định danh phân tử và phân tích sự biểu hiện của một số gene liên
quan đến con đường chuyển hóa adenosine và cordycepin trên lồi nấm ký sinh côn
trùng Metacordyceps taii”
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất tới giảng viên –
PGS.TS. Lê Huyền Ái Thúy và TS. Lao Đức Thuận đã quan tâm, giúp đỡ, sự hướng
dẫn tân tình đề em có thể hồn thành đề tài trong q trình thực hiện thực tập tốt
nghiệp. Nếu khơng có những lời hướng dẫn, sự quan tâm của Thầy và Cô, thì chun
đề thực tập này khó mà hồn thiện được.
Bên cạnh đó, em xin gửi những lời cảm ơn tới những anh chị, những người
bạn trong phịng thí nghiệm Sinh học phân tử trường Đại Học Mở Tp. Hồ Chí Minh
đã tạo điều kiện thuận lợi và sẵn sàng giúp đỡ em nhiệt tình trong thời gian thực hiện
chuyên đề tốt nghiệp.
Với điều kiện thời gian, cũng như kinh nghiệm hạn chế, chun đề khơng thể

tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được những sự chỉ bảo, đóng góp ý
kiến của q thầy cơ trong khoa đề chun đề này có hồn thiện hơn nữa, đề em có
thể bổ sung thêm kiến thức của mình, để em có thể làm hành trang mang theo phục
vụ cho quá trình nghiên cứu tiếp theo và công việc sau này.
Em xin chân thành cảm ơn!

iii


MỤC LỤC
PHẦN I: TỔNG QUAN
1. TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM CORDYCEPS ......................................................5
1.1.

Đặc điểm chung và lịch sử nghiên cứu của chi nấm Cordyceps ......................5

1.1.1.

Đặc điểm chung của chi nấm cordycecps .....................................................5

1.1.2.

Lịch sử nghiên cứu chi Cordyceps ................................................................6

1.2.

Thành phần loài và phân loại khoa học chi Cordyceps ....................................7

1.3.

Thành phần dinh dưỡng của Cordyceps ...........................................................7

1.3.1.

Thành phần dinh dưỡng chung của Cordyceps .............................................7

1.3.2.

Thành phần hóa học chính của Cordyceps ...................................................8

1.3.2.1.

Nucleosides.................................................................................................8

1.3.2.2.

Adenosine ...................................................................................................9

1.3.2.3.

Polysaccharid .............................................................................................9

1.3.2.4.

Sterols .........................................................................................................9

1.3.2.5.

Protein, axit amin và các hợp chất khác ..................................................10

1.4.

Tiềm năng ứng dụng của Cordyceps ..............................................................10

1.4.1.

Ứng dụng kiểm soát sâu bệnh......................................................................10

1.4.2.

Ứng dụng trong lĩnh vực y dược ..................................................................11

1.4.2.1.

Điều trị ung thư ........................................................................................11

1.4.2.2.

Hệ thống miễn dịch ..................................................................................11

2. NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ PHÁT SINH LỒI ....................................12
2.1.

Phương pháp định danh hình thái ...................................................................12

2.2.

Phương pháp định danh phân tử .....................................................................13

2.2.1.

Mã vạch DNA ..............................................................................................14

iv


2.2.2.

Internal transcribed spacers (ITS) ..............................................................15

2.2.3.

Gene MT-Atp6 (Mitochondrially encoded ATP synthase 6) .......................16

2.2.4.

Gene Tef1 (translation elongation factor 1α)..............................................16

2.2.5.

Phả hệ phân tử .............................................................................................17

2.2.5.1.

Phả hệ phân tử trong nghiên cứu phát sinh loài ......................................17

2.2.5.2.

Những bước cơ bản trong nghiên cứu phát sinh chủng lồi ...................18

2.2.5.3.

Sắp gióng cột ............................................................................................18

2.2.5.4.

Lựa chọn mơ hình tiến hóa .......................................................................19

2.2.5.5.

Xây dựng cây phát sinh loài .....................................................................20

2.2.5.6.

Đánh giá các cây phả hệ ..........................................................................22

2.3.

Các phương pháp, kỹ thuật sinh học phân tử ..................................................23

2.3.1.

Tách chiết DNA ...........................................................................................23

2.3.2.

Kỹ thuật PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) .................................23

2.3.3.

Phương pháp giải trình tự ...........................................................................24

2.4.

Con đường chuyển hóa cordycepin và adenosine ...........................................25

2.4.1.

Gene 5’-nucleotidase ...................................................................................26

2.4.2.

Gene SAICAR synthetase .............................................................................26

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................29
1.1.

Các phần mềm và trang web được sử dụng ....................................................29

1.2.

Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng .......................................................................30

1.3.

Dụng cụ và thiết bị hóa chất ...........................................................................30

1.3.1.

Dụng cụ........................................................................................................30

1.3.2.

Thiết bị .........................................................................................................30
v


1.3.3.

Hóa chất cần thiết cho q trình tách DNA ................................................30

1.3.4.

Hóa chất cần thiết để thực hiện quá trình PCR và điện di bao gồm: .........30

1.4.

Quy trình nghiên cứu ......................................................................................31

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................32
2.1.

Phương pháp khai thác dữ liệu........................................................................32

2.2.

Phương pháp đánh giá mồi .............................................................................32

2.2.1.

Đánh giá các thông số vật lý của mồi .........................................................32

2.2.2.

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ......................................................................32

2.3.

Tiến hành thực nghiệm ...................................................................................32

2.3.1.

Tách chiết DNA theo phương pháp Phenol/Chloroform bổ sung β-

mercaptoethanol và CTAB: .......................................................................................32
2.3.2.

Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm DNA đã tách chiết ............................33

2.3.3.

Trình tự mồi sử dụng khuếch đại phản ứng PCR ........................................34

2.3.4.

Hiệu chỉnh trình tự ......................................................................................35

2.3.5.

So sánh với cơ sở dữ liệu Genbank .............................................................35

2.3.6.

Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu DNA ..................................................................36

2.3.7.

Đồng bộ hóa bộ dữ liệu ...............................................................................36

2.3.8.

Dị tìm mơ hình tiến hóa ..............................................................................36

2.3.9.

Xây dựng cây phát sinh lồi ........................................................................37

2.3.10.

Phân tích hàm lượng adenosine và cordycepin .......................................37

2.3.11.

Tách chiết RNA theo phương pháp Trizol/Chloroform............................37

2.3.12.

Phản ứng chuyển đổi cDNA ....................................................................38

2.3.13.

Thực hiện khuếch đại trình tự bằng phản ứng Realtime – PCR...............38

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

vi


1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT INSILICO ...................................................................40
1.1.

Kết quả khảo sát insilico các gene định danh phân tử ....................................40
Kết quả kiểm tra mồi bằng BLAST và Annhyb của các cặp mồi .................42

1.1.1.
1.1.1.1.

Kết quả kiểm tra cặp mồi ITS1/ITS4 ........................................................42

1.1.1.2.

Kết quả kiểm tra cặp mồi 982F/2218R ....................................................44

1.1.1.3.

Kết quả kiểm tra cặp mồi Atp6-C1A/Atp6-C2A .......................................45

1.2.

Kết quả khảo sát các gene liên quan đến con đường chuyển hóa adenosine và

cordycepin trên lồi Metacordyceps taii ...................................................................47
1.2.1.

Kết quả kiểm tra cặp mồi SS-F-R trên Annhyb và BLAST ..........................48

1.2.2.

Kết quả kiểm tra cặp mồi 5’-F-R trên Annhyb và BLAST ...........................50

1.2.3.

Kết quả kiểm tra cặp mồi SA-F-R trên annhyb và blast ..............................52

2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM .............................................................................54
2.1.

Kết quả bổ sung dữ liệu phân tử về gene ITS, Tef, Atp6 của Metacordyceps taii
54

2.1.1.

Kết quả tách chiết DNA ...............................................................................54

2.1.2.

Kết quả giải trình tự ....................................................................................55

2.1.3.

Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu phân tử ..............................................................57

2.1.4.

Xây dựng cây phả hệ phân tử ......................................................................63

2.2.

Kết quả nghiên cứu một số gene liên quan đến con đường chuyển hóa

adenosine và cordycepin ...........................................................................................64
2.2.1.

Kết quả phân tích hàm lượng adenosine và cordycepin .............................64

2.2.2.

Kết quả khuếch đại các gene bằng phương pháp Real Time PCR ..............65

2.2.3.

Kết quả giái trình tự các gene chuyển hóa trên lồi Metacordyceps taii ...68

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

vii


1. KẾT LUẬN ........................................................................................................72

2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................74

viii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cordyceps confragosa ngồi tự nhiên
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của cordycepin
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của adenosine
Hình 1.4: Hình biểu diễn cấu trúc vùng gene ITS
Hình 1.5: Hình biểu diễn cấu trúc vùng gene Tef1
Hình 1.6: Q trình chuyển hóa adenosine và adenosine trong các mẫu nấm
Cordyceps
Hình 2.1: Tóm tắt quy trình nghiên cứu
Hình 2.2: Chu trình nhiệt độ chung PCR
Hình 3.1: Kết quả Annhyb cặp mồi ITS1/ITS4 trên trình tự gene ITS
Hình 3.2: Kết quả BLAST cặp mồi ITS1/ITS4 khuếch đại gene ITS
Hình 3.3: Kết quả Annhyb cặp mồi 982F/2218R trên trình tự gene Tef
Hình 3.4: Kết quả BLAST cặp mồi 982F/2218R khuếch đại gene Tef
Hình 3.5: Kết quả Annhyb cặp mồi Atp6-C1A/Atp6-C2A trên trình tự gene Atp6
Hình 3.6: Kết quả BLAST cặp mồi Atp6-C1A/Atp6-C2A khuếch đại gene Atp6
Hình 3.7: Kết quả Annhyb của cặp mồi SS-F-R
Hình 3.8: Kết quả BLAST trình tự cặp mồi SS-F-R
Hình 3.9: Kết quả Annhyb của cặp mồi 5’-F-R
Hình 3.10: Kết quả BLAST trình tự cặp mồi 5’-F-R
Hình: 3.11: Kết quả annhyb của cặp mồi SA-F-R
Hình 3.12: kết quả BLAST trình tự cặp mồi SA-F-R
Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm PCR gene ITS, Tef, Atp6
Hình 3.14: Kết quả giài trình tự vùng gene ITS

ix


Hình 3.15: Kết quả BLAST vùng trình tự gene ITS
Hình 3.16: Kết quả BLAST vùng trình tự gene Tef
Hình 3.17: Kết quả BLAST vùng trình tự gene Atp6
Hình 3.18: Cây phả hệ phân tử Maximum Likelihood đa gene ITS-Tef-Atp6 (Các con
số hiển thị trên cây là giá trị Bootstrap của 1000 lần lặp lại tương ứng với các cây
NJ/MP/ML)
Hình 3.19: Kết quả khuếch đại các gene chuyển hóa bằng phương pháp Real Time
PCR
Hình 3.20: Biểu đồ phân tích đường cong nóng chảy của các gene chuyển hóa
Hình 3.21: Kết quả điện di sản phẩm Real-Time PCR
Hình 3.22: Kết quả BLAST trình tự gene Adenylosuccinate synthetase
Hình 3.23: Kết quả BLAST trình tự gene 5’-nucleotidase
Hình 3.24: Kết quả BLAST trình tự gene SAICAR synthetase

x


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1: Bảng các mồi sử dụng trong thực nghiệm
Bảng 3.1: Bảng thơng số vật lí của các cặp mồi định danh phân tử
Bảng 3.2: Thông số vật lý của các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại các gene
chuyển hóa trên lồi Metacordyceps taii
Bảng 3.3: Thơng tin các trình tự được thu nhận để xây dựng bộ cơ sở dữ liệu

xi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AIC
BIC

Akaike Information Content
Bayesian Information Content

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

BP

Base-Pair

CTAB

Cetyltrimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic Acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

GTR

General time reverible model

ITS

Internal Transcribed Spacer

ML

Maximum Likelihood

MP

Maximum parsimony

MT-ATP6

Mitochondrially encoded ATP synthase 6

NCBI

National Center for Biotechnology Information

NJ

Neighber-Joining

Nu

Nucleotide

PCR

Polymerase Chain Reaction

rDNA

Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

RNA

Ribonucleic Acid

rRNA

Ribosomal Ribonucleic Acid

SDS
TEF-1α

Sodium dodecyl sulfat
The Elongation Factor 1 alpha

UPGMA

Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean

xii


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cordyceps là nhóm nấm ký sinh trên cơn trùng (Kobayashi, 1982; Spatafora

& Blackwell, 1993) thuộc họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Pyrenomycetes
thuộc ngành nấm túi (Ascomycota). Chi Cordyceps nổi tiếng trong y học cổ truyền
Trung Quốc và có nhiều tác dụng đối với sức khỏe lâm sàng bao gồm các hoạt động
điều hòa miễn dịch, chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm và chống vi khuẩn
(Tuli et al., 2014, Yue et al., 2013). Nổi bật nhất trong số này là các lồi
Ophiocordyceps sinensis (Đơng Trùng Hạ Thảo), Cordyceps militaris (Nhộng Trùng
Thảo), Cordyceps subsessilus, Cordyceps takaomontana nhờ vào khả năng tạo ra các
hoạt chất sinh học quý sử dụng khá rộng rãi trong y dược. Nhóm nấm này mang nhiều
đặc tính sinh học đáng chú ý nhờ khả năng ký sinh gây bệnh cho cơn trùng và hình
thành nên các dạng quả thể độc đáo.
Ophiocordyceps sinensis (Đông trùng hạ thảo), là lồi nấm có chứa nhiều hoạt
chất quan trọng được dùng nhiều nhất trong y dược nhất. Các nghiên cứu cho thấy
sinh khối của lồi nấm này có đến hơn 20 tác dụng chữa bệnh khác nhau đối với con
người: (1) điều chỉnh đáp ứng miễn dịch (Kuo et al., 1996), (2) ức chế sự phát triển
của tế bào khối u (Bok et al., 1999), (3) gia tăng chức năng gan (Manabe et al., 1996),
(4) thúc đẩy việc tiết ra các hormone tuyến thượng thận (Wang et al., 1998), (5) giảm
huyết áp và sự căng cơ (Chiou et al., 2000), (6) điều hòa đường máu (Guo & Zhang
1995), v.v... Các nghiên cứu về nhóm nấm Cordyceps cho thấy có nhiều lồi
Cordyceps sp. được phát hiện cũng có khả năng ứng dụng trong y dược. Tiêu biểu
như Cordycepin có trong Cordyceps militaris có khả năng ức chế q trình tổng hợp
RNA, DNA và ngăn chặn sự tái bản của virus (Kuo et al., 1994). Hợp chất
Galactomannan được tách chiết từ Cordyceps cicadae cho thấy chất này có khả năng
chống lại sự phát triển của dòng tế bào ung thư xương ở chuột (Ukai et al., 1983).
Một số polysaccharides tinh chế từ Cordyceps ophioglossoides đã được chứng minh
là tác nhân chống khối u (Yanada et al., 1984; Ohmiru et al., 1986). Khả năng chống
ung thư của Paecilomyces tenuipes đối với cơ thể sống đã được Ban et al., phát hiện
năm 1998. Cũng ở loài nấm này, tác giả Shim et al., (2001) đã tìm thấy khả năng gây

1

độc tế bào chống lại các dòng tế bào ung thư. Dẫn xuất nucleoside N6-(2hydroxyethyl) adenosine (HEA) tách chiết từ Cordyceps pruinosa cho thấy tác dụng
kháng Ca và chống co thắt cơ tim (Furuya et al., 1983). Cordyceps pruinosa có khả
2+

năng kháng viêm thông qua việc ức chế sự biểu hiện của gene phụ thuộc NF-kappaB
(Kim et al., 2003). Cyclosporin chiết ra từ Tolypocladium inflatum (thể hữu tính là
Cordyceps subsessilus) là chất duy nhất làm cho sự cấy ghép các cơ quan trong cơ
thể người có thể thực hiện được.
Nucleosides là một trong những thành phần chính của Cordyceps. Vào năm
1964, 3’-deoxyadenosine hay cordycepin được phân lập từ Cordyceps militaris. Kể
từ đó, nucleosides trong Cordyceps đã trở thành tiêu điểm vì cordycepin (3’deoxyadenosine) đã cho thấy hoạt tính chống khối u. Hay N6-(2-hydroxylethyl)adenosine đóng vai trị như là đối vận Ca và thành phần ion được phân tích từ nấm
2+

ni cấy Cordyceps. Các nucleoside ở Cordyceps cũng đã được chứng minh cho thấy
chúng có liên quan đến việc điều hồ và điều chỉnh các tiến trình sinh lý khác nhau
trong hệ thần kinh trung ương. Adenosine được biết đến là nhằm làm suy giảm tính
kích thích của các neuron hệ thần kinh trung ương và ức chế phóng thích các chất dẫn
truyền thần kinh tiền synap. Ngoài ra, inosine, chất chuyển hố sinh hố chính của
adenosine từ phản ứng oxi hố khử amin, có thể kích thích sự phát triển sợi trục trong
ống nghiệm và trong hệ thống thần kinh người trưởng thành.
Từ các tóm lược như trên, có thể thấy rằng giá trị của nấm ký sinh côn trùng
chi Cordyceps đã được khẳng định không chỉ dựa trên kinh nghiệm dân gian mà rất
nhiều bằng chứng khoa học. Bên cạnh đó đối mặt với tình hình dịch bệnh của covid19 cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kì (FDA) đã cho phép dùng
cordycepin trong Nhộng trùng thảo nuôi cấy để chữa Sars – Cov - 2 vì cordycepin có
thể ức chế q trình tổng hợp RNA, DNA và ngăn chặn quá trình tái bản của virus.
Trong nhiều giá trị của chúng trong y dược, chúng tôi đặc biệt chú trọng đến khả năng
sinh tổng hợp nucleoside (Cordycepin) của các chủng nấm – như một chỉ dấu sinh
học quan trọng nhằm chọn lọc được chủng giống tốt. Việc phân tích mối tương quan
của các gene liên quan đến q trình sinh tổng hợp cordycepin, adenosine chính là cơ

2


sở khoa học quan trọng để hiểu được sự chuyển hóa tạo adenosine và cordycepin và
là một dữ liệu thú vị để sàng lọc chọn lựa các chủng giống tiềm năng có thể tạo nên
adenosine và cordycepin.
Cho đến nay, số lượng cơng trình nghiên cứu một số gene liên quan đến con
đường sinh tổng hợp adenosine và cordycepin trên các mẫu nấm ký sinh cơn trùng
nói chung và lồi Metacordyceps taii là khơng nhiều. Vì vậy em quyết định thực hiện
khóa luận tốt nghiệp với chuyên đề “HỖ TRỢ ĐỊNH DANH PHÂN TỬ VÀ PHÂN
TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GENE LIÊN QUAN ĐẾN CON ĐƯỜNG
CHUYỂN

HĨA

ADENOSINE

VÀ

CORDYCEPIN

TRÊN

LỒI

METACORDYCEPS TAII” với mục tiêu là khảo sát sự hiện diện, biểu hiện một số
gene liên quan đến con đường sinh tổng hợp cordycepin và adenosine trên lồi
Metacordyceps taii từ đó giúp xác định các phân tử các gene có thể ảnh hưởng đến
hàm lượng adenosine và cordycepin trên lồi Metacordyceps taii, từ đó làm cơ sở dữ

liệu hỗ trợ cho sàng lọc chọn lọc các lồi chủng giống nấm ký sinh cơn trùng có tiềm
năng cao trong sản xuất adenosine và cordycepin phục vụ cho y học Việt Nam.

3


PHẦN I:
TỔNG QUAN

4


1.

TỔNG QUAN VỀ CHI NẤM CORDYCEPS

1.1.

Đặc điểm chung và lịch sử nghiên cứu của chi nấm Cordyceps

1.1.1. Đặc điểm chung của chi nấm Cordycecps
Cordyceps là danh pháp khoa học của một chi nấm lớn nhất và đa dạng nhất
nhóm ký sinh trên côn trùng (Kobayashi, 1982; Spatafora & Blackwell, 1993) thuộc
họ Clavicipitaceae, bộ Hypocreales, lớp Pyrenomycetes thuộc ngành nấm túi
(Ascomycota), với hơn 750 loài đã được xác định. Chi Cordyceps là những lồi nấm
ký sinh trên cơn trùng hoặc ấu trùng côn trùng phân bố tập trung chủ yếu tại Trung
Quốc và các quốc gia thuộc khu vực Đông Nam Á. Nhìn chung, các lồi thuộc chi
Cordyceps cho thấy sự ký sinh nghiêm ngặt với vật chủ, mặc dù mức độ ký sinh khác
nhau từ loài này sang loài khác. Một số loài trong chi chỉ ký sinh duy nhất trên một
vật chủ (ví dụ, Cordyceps sobolifera ký sinh trên nymph của loài Platypleura

kaempferi ở Nhật Bản), trong khi những lồi khác có khả năng ký sinh và lây nhiễm
một loạt các vật chủ khác thuộc cùng một nhóm (các loài trong một số họ hoặc bộ
động vật chân đốt), (ví dụ, Cordyceps militaris ký sinh trên nhộng của lồi bướm
đêm). Khoảng 20 loài thuộc chi Cordyceps sẽ ký sinh trên các loài thuộc chi
Elaphomyces, trong khi phần lớn các lồi cịn lại thuộc chi Cordyceps sử dụng ký chủ
cơn trùng từ các bộ phận khác nhau như Homoptera, Lepidoptera, Coleoptera,
Hymenoptera và Diptera, cho thấy rằng vật chủ chính thay đổi giữa các lồi cơn trùng
đã xảy ra trong chi (Kobayashi, 1941; Mains, 1958). Cordyceps phát triển các cơ chế
đặc biệt và phức tạp để né tránh hệ thống miễn dịch của vật chủ và hài hịa với thơng
số vịng đời của chúng với thơng số vịng đời của vật chủ nhằm mục đích tồn tại và
nhân lên. Cơ chế tồn tại này đã dẫn đến việc sản sinh ra một số chất chuyển hóa thứ
cấp duy nhất để phản ứng lại sự bảo vệ của vật chủ và là những nguồn đầy hứa hẹn
cho việc khám phá ra loại thuốc mới. Cordyceps là một trong những loại nấm y học
cổ truyền Trung Quốc có giá trị nổi bật nhất , nó được gọi là “Đơng trùng hạ thảo”
trong văn học Trung Quốc và được tìm thấy trên Cao nguyên Tây Tạng với độ cao từ
3500 đến 5500m. Các nghiên cứu trước đây đã tiết lộ rằng Cordyceps có nhiều hợp
chất sinh học quý chẳng hạn như cordycepin, axit cordycepic, ergosterol,

5


polysaccharides, với tác dụng dược lý rộng rãi bao gồm hoạt động điều hòa miễn
dịch, chống ung thư, chống oxy hóa, chống viêm và chống vi khuẩn (Tuli et al., 2014,
Yue et al., 2013) sửa chữa tổn thương gan. Quá trình ký sinh của Cordyceps trên cơn
trùng chủ yếu trải qua 3 giai đoạn: (1) Ký sinh trên côn trùng; (2) Cuối mùa thu, các
chất trên da sâu bươm tương tác với các bào tử nấm và giải phóng các bào tử, sau đó
sẽ xâm nhiễm trên sâu bướm; (3) đến mùa hè năm sau nấm ký sinh hoàn toàn và giết
chết sâu bướm, sau đó hình thành quả thể và tiếp tục phát triển.

Hình 1.1: Cordyceps confragosa ngồi tự nhiên (Kepler et al., 2017)

1.1.2. Lịch sử nghiên cứu chi Cordyceps
Cordyceps có lịch sử lâu đời như một loại thần dược q hiếm có tác dụng
điều trị nhiều lồi bệnh của Trung Quốc. Năm 1964, Cordyceps sinensis chính thức
6


được ghi nhận là một loại thuốc thảo dược trong dược điển của Trung Quốc trong tác
phẩm “Trích yếu về y dược” của tác giả Wang Ang với tên gọi là Dongchaoxiacao
(Đông trùng hạ thảo). Năm 1843, Miles Joseph Berkeley đã tìm ra lồi nấm có “rễ”
mọc ở trên sâu. Ơng đã phân loại và đặt tên lồi nấm đó là Sphaeria sinensis. Năm
1878, Saccardo nhà phân loại học người Ý đã đặt tên chính thức cho Đơng trùng hạ
thảo được phát hiện ở Trung Quốc là Cordyceps sinensis.

1.2.

Thành phần loài và phân loại khoa học chi Cordyceps
Hiện nay, chi nấm Cordyceps đã được nghiên cứu và tiến hành định danh được

trên 400 loài khác nhau (khoảng 120 loài đã được tìm thấy ở Trung Quốc) chủ yếu
được phân loại dựa theo các nghiên cứu phân loại truyền thống bằng phương pháp
phân tích giải phẫu hình thái của Kobayashi (1982) và Main (1958), các loài này được
xếp vào họ Clavicipitaceae.
Hệ thống phân loại khoa học của chi nấm Cordyceps: (Kepler et al., 2017)
Giới (Regnum): Fungi
Phân giới (subregnum): Dikarya
Ngành (phylum): Ascomycota
Phân ngành (subphylum): Pezizomycotina
Lớp (class): Sordariomycetes
Phân lớp (subclass): Hypocreomycetidae
Bộ (ordo): Hypocreales

Họ (familia): Clavicipitaceae
Chi (genus): Cordyceps

1.3.

Thành phần dinh dưỡng của Cordyceps

1.3.1. Thành phần dinh dưỡng chung của Cordyceps
Hiện nay, các nghiên cứu phân tích thành phần hóa học từ chiết xuất của
Cordyceps sinenis cho thấy có nhiều thành phần dinh dưỡng bao gồm: Axit amin,
Vitamin E, K và các vitamin tan trong nước như B1, B2, B12. Ngồi ra, chúng cịn
chứa nhiều các phức hợp polysaccharides, proteins, sterols, nucleosides, các nguyên

7


tố vi lượng và đa lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr,
Ga, V, và Zr) và các dẫn xuất đường như mono, di, oligosaccharides.
1.3.2. Thành phần hóa học chính của Cordyceps
1.3.2.1.

Nucleosides

Nucleosides là một trong 2 nhóm hợp chất chính xuất hiện trong chi
Cordyceps. Vào năm 1964, 3’-deoxyadenosine hay cordycepin được phân lập từ
Cordyceps militaris. Kể từ đó, nucleosides trong Cordyceps đã trở thành tiêu điểm vì
cordycepin (3’-deoxyadenosine) đã cho thấy hoạt tính chống khối u. Hay N6-(2hydroxylethyl)-adenosine đóng vai trị như là đối vận Ca2+ và thành phần ion được
phân tích từ nấm ni cấy Cordyceps. Các nucleoside ở Cordyceps cũng đã được
chứng minh cho thấy chúng có liên quan đến việc điều hồ và điều chỉnh các tiến
trình sinh lý khác nhau trong hệ thần kinh trung ương. Adenosine được biết đến là

nhằm làm suy giảm tính kích thích của các neuron hệ thần kinh trung ương và ức chế
phóng thích các chất dẫn truyền thần kinh tiền synap. Ngồi ra, inosine, chất chuyển
hố sinh hố chính của adenosine từ phản ứng oxi hố khử amin, có thể kích thích sự
phát triển sợi trục trong ống nghiệm và trong hệ thống thần kinh người trưởng thành.

Hình 1.2: cấu trúc hóa học của cordycepin

8


1.3.2.2.

Adenosine

Adenosine là một nucleoside nội sinh có trong tất cả tế bào của cơ thể, có cấu
trúc khoa học là 6-amino-9-beta-D-ribofuranosyl-9-H-purine. Adenosine tham gia
cấu thành lên DNA, ATP (chất mà các tế bào của chúng ta sử dụng cho năng lượng
và sinh tổng hợp ở gan) và tạo ra các hoạt chất khác như Cordycepin, D-manitol dược liệu quý trong y học. Các nghiên cứu chỉ ra rằng Adenosine là hoạt chất có tác
dụng tuyệt vời đối với hệ tim mạch. Nó tham gia vào q trình dẫn truyền thần kinh,
quá trình trao đổi chất và hoạt động năng lượng hàng ngày.

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của adenosine
1.3.2.3.

Polysaccharid

Cordyceps chứa một hàm lượng cao polysaccharid (3% - 8% tổng khối lượng
khơ). Polysaccharid là một trong những hợp chất chính trong Cordyceps, và các dẫn
xuất đường khác chẳng hạn như axit cordycepic [d-mannitol] đã được báo cáo là có
hoạt tính chống oxi hóa, tiềm năng miễn dịch, chống khối u và khả năng giảm lượng

đường, điều hòa lượng đường trong máu (Li et al., 2001; Li et al., 2002).
1.3.2.4.

Sterols

Các loài thuộc chi Cordyceps chiếm một lượng lớn các hợp chất từ sterols.
Hầu hết các sterol được phân lập từ loài Cordyceps đã được báo cáo là có khả năng
kháng các khối u một cách mạnh mẽ. Ergosterol và ergosterol peroxide là hai sterol
chiếm ưu thế chính được tìm thấy trong các loài Cordyceps. Tuy nhiên một số các
sterol khác như 3-sitosterol, campeasterol, daucosterol và 5α, 8αepidioxy-24 (R) -

9


methyl-cholesta-6,22-dien-3β-D-glucopyranoside có đã được báo cáo phân lập từ các
lồi trong chi Cordyceps (Bok et al., 1999; Zhu et al., 1998b). Những sterol này đã
thể hiện nhiều đặc tính dược lý như gây độc tế bào, kháng vi-rút, chống loạn nhịp tim,
ức chế trung bì người được kích hoạt tế bào và giảm bớt immunoglobulin A bệnh
thận (Li et al., 2006; Yang et al., 2003).
1.3.2.5.

Protein, axit amin và các hợp chất khác

Hàm lượng protein trong Cordyceps vào khoảng 29,1 – 33% bao gồm 18 acid
amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin, methionin,
isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin, histidin, cystin, cystein và tryptophan.
Các acid amin có hàm lượng cao nhất là glutamat, arginin và acid aspartic và có dược
tính cao nhất là arginin, glutamat, tryptophan và tyrosin. Họ protein của loài
Cordyceps militaris đã được nghiên cứu (Zheng et al., 2011), kết quả cho thấy bộ
gene Cordyceps militaris chứa 61 họ protease nhưng hầu hết là serin protease và

metallopeptidase, 12 gene mã hóa trypsin, 167 gene mã hóa protein kinase, 105 gene
mã hóa glycosid hydrolase. Hơn nữa, Cordyceps militaris sở hữu hầu hết các gene
cần thiết cho hoạt động biến dưỡng adenin và adenosin, ngoại trừ việc thiếu
ribonucleotid triphosphat reductase và deoxyadenosin kinase. Ngồi ra, Cordyceps
cịn chứa nhiều hợp chất có tính phân cực là hydrocarbon, alcohol, aldehyde...). Các
protein, peptide, polyamine, các amino acid và một số các dipeptide vòng của
Cordyceps cũng có hoạt tính chống ung thư và hỗ trợ miễn dịch. Nấm Hypcrealean
AP và vài loài trong chi Cordyceps có khả năng sản xuất ra các chất chuyển hóa thứ
cấp có hoạt tính sinh học làm nguồn cung cấp tiềm năng để sản xuất dược phẩm và
thuốc điều trị.

1.4.

Tiềm năng ứng dụng của Cordyceps

1.4.1. Ứng dụng kiểm soát sâu bệnh
Nhiều lồi nấm ký sinh cơn trùng đã được ứng dụng rộng rãi trong đối kháng
sinh học kiểm soát dịch hại, trong đó phổ biến là các lồi Beauveria bassiana,
Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi (Nguyễn Dương Khuê, 2005).
Metarhizium anisopliae lần đầu tiên được ứng dụng trong đối kháng sinh học vào
10


năm 1992. Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã thành cơng trong việc sử dụng nấm ký
sinh cơn trùng phịng trị các loại côn trùng và sâu hại cây trồng, điển hình như nấm
Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana đã được ứng dụng trong phòng trừ
mối nhà (Nguyễn Dương Khuê, 2005), sâu khoang hại cải xanh (Võ Thị Thu Oanh et
al., 2005), sâu hại đậu tương và đậu xanh (Phạm Thị Thùy et al., 2005), rầy mềm và
các loài sâu hại lúa (Trần Văn Hai et al., 2006; Nguyễn Thị Lộc et al., 2002). Ngồi
ra nghiên cứu của nhóm tác giả Sung et.al. (2007) đã phân loại nấm có khả năng tác

động đến hành vi của côn trùng vào chi nấm Cordyceps. Ví dụ điển hình như
Cordyceps unilateralis đã tác động đến hệ thần kinh của kiến khiến nó phải leo lên
cây và bám trên cây trước khi chết, giúp các bào tử nấm được phát triển và phân phối
trên diện tích rộng.
1.4.2. Ứng dụng trong lĩnh vực y dược
1.4.2.1.

Điều trị ung thư

Nhiều lồi nấm trong chi Cordyceps có vai trị kiềm chế phát triển của khối u,
tăng cường miễn dịch và tăng thể lực góp phần hỗ trợ tốt cho bệnh nhân ung thư. Một
số nghiên cứu đã được công bố chứng minh khả năng của Cordyceps như: ức chế sự
phát triển của tế bào khối u (Bok et.al., 1999; Nakamura, 1999), khả năng kháng ung
thư của alkali-soluble polysaccharide thu từ Cordyceps ophioglossoides (Yanada,
1984), khả năng gây độc tế bào để chống tế bào ung thư của Paecilomyces tenuipes
(Shim et.al., 2001).
1.4.2.2.

Hệ thống miễn dịch

Hợp chất chứa trong chi nấm Cordyceps có tác dụng điều hịa miễn dịch của
cơ thể và ngăn ngừa bệnh. Cordyceps có hai chức năng là điều chỉnh tăng hoặc giảm
miễn dịch. Cordyceps có khả năng ức chế miễn dịch thơng qua kiểm sốt các rối loạn
tự miễn dịch và viêm khi xảy ra tổn thương mô, ngăn chặn quá trình thải ghép sau
khi cấy ghép nội tạng (Taylor et al., 2005), điều khiển miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng
miễn dịch (Li & Tsim, 2004; Ng.T.B & Wang, 2005).

11

2.

NGHIÊN CỨU ĐỊNH DANH VÀ PHÁT SINH LOÀI

2.1.

Phương pháp định danh hình thái
Phương pháp định danh hình thái được xem là tiêu chuẩn vàng trong việc định

danh các loài nấm, vi khuẩn nói chung và các lồi thuộc chi Cordyceps nói riêng bằng
cách giải phẫu và dựa trên các phân tích giải phẫu hình thái. Hình thái của khuẩn lạc
nấm ở dạng sợi nấm là kết quả của việc phát triển dưới dạng sợi (hypha), đó là cấu
trúc hình trụ, dạng sợi, đường kính 2–10 μm, dài đến vài cm, với các hình thái khác
nhau như màu sắc, kích thước, hình dạng có thể nhìn thấy bởi mắt thường được sử
dụng để định danh nấm (Lima & Borba, 2001). Hình thái của nấm được quan sát dưới
kính hiển vi để kiểm tra hình dạng, hình thành từ sự sắp xếp của các bào tử (Gaddeyya
et al., 2012). Năm 1982, Kobayashi đã xây dựng khóa phân loại cho các lồi thuộc
nhóm Cordyceps và Torrubiella dựa trên việc phân tích 282 lồi Cordyceps , 59 loài
Torrubiella và 75 loài khác thuộc các chi lân cận. Đến nay khóa phân loại này vẫn
cịn được sử dụng đễ hỗ trợ trong việc định danh các loài thuộc chi Cordyceps và
Torrubiella dựa trên việc phân tích các đặc điểm hình thái bằng phương pháp định
danh truyền thống. Tuy nhiên, phương pháp định danh truyền thống vẫn cịn nhiều
hạn chế bởi vì hình thái, sinh hóa nhận dạng của các loại nấm đôi khi gặp nhiều vấn
đề chẳng hạn như: tác động của môi trường, nhu cầu về thời gian lớn, đòi hỏi kỹ năng
cao, và tạo ra các hình thái, đặc điểm khác nhau trong một loài. Việc sử dụng định
danh phân tử đủ nhanh, tạo ra các sản phẩm có độ đặc hiệu cao cho việc phân biệt
giữa các loài và phân loài của nấm, khơng giống như các xét nghiệm hình thái và sinh
hóa được sử dụng trong định danh nấm trong phịng thí nghiệm (Liu et al., 2000;
Sugita & Nishikawa, 2003).
Năm 2007, nhóm tác giả Sung et al. đã xắp xếp lại hệ thống chi nấm Cordyceps

và họ Clavicipitaceae. Theo tổng kết của nhóm tác giả, trong họ Clavicipitaceae có
các thể hữu tính thuộc các chi Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và
Torrubiella chính là thể vơ tính thuộc các chi Aschersonia, Metarhizium, Nomuraea,
Paecilomyces, Pochonia, Rotiferophthora, Verticillium. Trong họ Cordycipitaceae,
có thể hữu tính thuộc chi Cordyceps chính là thể vơ tính của Beauveria,

12


Engyodontium, Isaria, Lecanicillium, Mariannaeae, Microhilum, Simplicillium.
Ophiocordyceps, Elaphocordyceps là các thể hữu tính trong họ Ophiocordycipitaceae
và các thể vơ tính bao gồm: Hirsutella, Haptocillium, Harposporium, Hymenostilbe,
Paecilomyces, Paraisaria, Sorosporella, Syngliocladium, Tolypocladium và
Verticillium.

2.2.

Phương pháp định danh phân tử
Việc xác định và phân định các lồi nấm thường gặp khó khăn khi sử dụng

bằng phương pháp phân tích hình thái vì thiếu các đặc điểm, cấu trúc và hình thái
riêng biệt cho từng lồi nấm. Các chu kỳ sống phức tạp, chẳng hạn như quá trình
chuyển đổi nấm men - sợi nấm, một số lồi có khả năng tồn tại và mang các đặc điểm
giải phẩu, sinh hóa riêng biệt khác nhau nhưng là từ cùng một lồi đã làm ảnh hưởng
q trình định danh hình thái đẫn đến kết quả khơng chính xác (Seifert & Samuels,
2000). Các phương pháp nhận dạng nấm cổ điển thường sử dụng phương pháp ni
cấy và phân tích bằng kính hiển vi thường khơng chính xác, chậm (7–14 ngày) và
phụ thuộc nhiều vào mức độ chuyên môn về lĩnh vực nấm học (Alexander & Pfaller,
2006; Balajee et al., 2007). Các đặc điểm hình thái hóa học và sinh học thường mang
tính chủ quan, dễ bị sai sót và dẫn đến việc định danh các lồi thiếu chính xác (Sangoi

et al. 2009). Ngoài ra, thực tế là nhiều loài nấm khơng thể phát triển trong điều kiện
phịng thí nghiệm đã không được tiếp tục định danh (Begerow et al., 2010; Nilsson
et al.,, 2009). Các tính trạng kiểu hình khơng phản ánh được mức độ phân loài giữa
các loài hoặc nhiều loại có các đặc điểm hình thái gần giống nhau, nhưng các đặc
điểm di truyền có thể phân biệt được, chẳng hạn như là các loài thuộc các chi
Fusarium, Aspergillus, và Scedosporium (Balajee et al., 2005; Gilgado et al., 2005;
O’Donnell, 2000). Tuy nhiên, chỉ 20-30 năm sau đó phương pháp định danh phân tử
được ứng dụng để nghiên cứu sự phát sinh loài đều gia tăng (Hillis, 1987; Patterson,
1987; Doolittle, 1990; Hillisand Moritz, 1990). Do đó, hiện nay các nghiên cứu ngoài
việc sử dụng kỹ thuật định danh truyền thống, phần lớn đều ứng dụng kỹ thuật sinh
học phân tử vào công tác định danh. Sinh học phân tử đã góp phần tích cực trong việc

13