Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường lỏng đến sự phát triển hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin của nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN
Tên đề tài:
KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG LỎNG
ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN HỆ SỢI VÀ HÀM LƢỢNG CORDYCEPIN
CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2013-2017

Thái Nguyên, năm 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN
Tên đề tài:
KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG LỎNG
ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN HỆ SỢI VÀ HÀM LƢỢNG CORDYCEPIN
CỦA NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Lớp

: 45-CNSH

Khóa học

: 2013-2017

Giảng viên hƣớng dẫn

: 1. TS. Dƣơng Văn Cƣờng
: 2. ThS. Đỗ Tuấn Bách

Thái Nguyên, năm 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trong thời gian thực tập em
đã tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hƣởng thành phần môi
trƣờng lỏng đến sự phát triển hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin của nấm
Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris”.
Kết thúc thời gian thực tập tại Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Khoa học
sự sống – Đại học Thái Nguyên, đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Để đạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa
Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong
Khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo TS. Dƣơng Văn Cƣờng,
ThS. Đỗ Tuấn Bách, ThS. Ma Thị Trang và KS. Vũ Hoài Nam đã tận tình chỉ
bảo, giúp đỡ và hƣớng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những ngƣời
đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian vừa qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Thị Hải Yến


ii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Bậc phân loại nấm ............................................................................. 6
Bảng 2.2: Một số ký chủ của nấm Cordyceps militaris ..................................... 7
Bảng 2.3: Các hoạt chất trong Cordyceps .......................................................... 9
Bảng 2.4: So sánh phƣơng pháp nuôi cấy nấm C. miltaris trên môi
trƣờng lỏng và môi trƣờng rắn ............................................................ 15
Bảng 3.1: Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu. ................... 19
Bảng 3.2: Nghiên cứu ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng lỏng đến sự
tăng sinh hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin ........................................ 212
Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng lỏng
đến sự phát triển hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin trong hệ sợi ......... 28
Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng lỏng
đến hàm lƣợng cordycepin trong dịch lỏng ........................................ 30
Bảng 4.3: Tổng hàm lƣợng cordycepin đạt đƣợc trong một bình nuôi cấy
trên các công thức môi trƣờng khác nhau ........................................... 31
Bảng 4.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng độ pH môi trƣờng lỏng đến sự
sinh trƣởng hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin trong hệ sợi .................. 33
Bảng 4.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng độ pH môi trƣờng lỏng đến sự
hình thành cordycepin trong dịch lỏng ............................................... 36
Bảng 4.6: Tổng hàm lƣợng cordycepin trong một bình nuôi cấy trên các
nồng độ pH khác nhau......................................................................... 37
Bảng 4.7: Các kết quả nghiên cứu nuôi cấy nấm ĐTHT trên môi trƣờng
rắn ........................................................................................................ 37
Bảng 4.8: Các kết quả nghiên cứu nuôi cấy nấm ĐTHT trên môi trƣờng
lỏng ...................................................................................................... 39

iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Nấm Cordyceps militaris ................................................................... 6
Hình 2.2: Các dạng bào tử trong chu trình sống của nấm.................................. 7
Hình 2.3: Công thức hóa học của cordycepin và adenosine ............................ 12
Hình 4.1. Bình giống sau 10 ngày nuôi cấy trên các công thức môi
trƣờng khác nhau .............................................................................. 27
Hình 4.2: Hàm lƣợng cordycepin của hệ sợi trên các công thức môi
trƣờng lỏng........................................................................................ 29
Hình 4.3: Hàm lƣợng cordycepin của dịch lỏng trong một bình trên các
công thức môi trƣờng lỏng ............................................................... 30
Hình 4.4: Bình giống sau 10 ngày nuôi cấy trên các nồng độ pH khác
nhau. .................................................................................................. 32
Hình 4.5: Khối lƣợng hệ sợi trên các nồng độ pH khác nhau.......................... 33
Hình 4.6: Hàm lƣợng cordycepin trong hệ sợi trên các nồng độ pH khác
nhau ................................................................................................... 34
Hình 4.7: Tổng hàm lƣợng cordycepin trong hệ sợi trên các nồng độ pH
khác nhau .......................................................................................... 35
Hình 4.8: Hàm lƣợng cordycepin của dịch lỏng trong một bình trên các
nồng độ pH khác nhau ...................................................................... 36


iv
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
ĐTHT

: Đông trùng hạ thảo

HPLC

: High Performance Liquid Chromatography

Cs

: Cộng sự

EPS

: Expolysaccharides

YE

: Yeast extract

C/N

: Carbon/Nitrogen

HS

: Hệ sợi

C.miltaris

: Cordyceps militaris

SE

: Standard error


v
MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề ......................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................ 2
1.2.1 Mục tiêu tổng quát ............................................................................... 2
1.2.2 Mục tiêu cụ thể ..................................................................................... 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn................................................................ 3
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ................................................................ 3
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài................................................................. 3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
2.1. Giới thiệu................................................................................................ 4
2.1.1. Giới thiệu Đông Trùng Hạ Thảo ......................................................... 4
2.1.2. Nấm Cordyceps militaris .................................................................... 5
2.1.3. Thành phần hóa học của nấm Cordyceps militaris ............................. 8
2.1.4. So sánh hai phƣơng thức nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng và môi
trƣờng rắn của nấm Cordyceps militaris ..................................................... 15
2.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên môi
trƣờng lỏng trong và ngoài nƣớc ................................................................. 15
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .................................................... 15
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc...................................................... 18
PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .. 19
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu ..................................... 19

3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................ 19
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................... 19
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ........................................ 20
3.2.1. Địa điểm ............................................................................................ 20
3.2.2. Thời gian tiến hành ........................................................................... 20


vi
3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 20
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm ..................................... 20
3.4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................... 20
3.4.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm.......................................................... 21
3.4.2.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng thành phần môi trƣờng lỏng
đến sự tăng sinh hệ sợi và sự hình thành tổng hàm lƣợng cordycepin. ...... 21
3.4.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng độ pH môi trƣờng lỏng đến sự
tăng sinh của hệ sợi và sự hình thành tổng hàm lƣợng cordycepin. ........... 23
3.4.3. Các chỉ tiêu theo dõi, phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu........... 26
3.4.3.1. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................. 26
3.4.3.2. Thu thập số liệu .............................................................................. 26
4.1. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng lỏng đến khả năng sinh trƣởng
của hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin ........................................................... 27
4.1.1. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng lỏng đến khả năng sinh
trƣởng của hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin trong hệ sợi. .......................... 27
4.1.2. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng lỏng đến hàm lƣợng
cordycepin trong dịch lỏng.......................................................................... 30
4.2. Ảnh hƣởng của độ pH môi trƣờng lỏng đến khả năng sinh trƣởng của
hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin ................................................................. 32
4.2.1. Ảnh hƣởng của độ pH môi trƣờng lỏng đến khả năng sinh trƣởng của
hệ sợi và hàm lƣợng cordycepin trong hệ sợi ............................................. 32
4.2.2. Ảnh hƣởng của độ pH môi trƣờng lỏng đến khả năng hình thành hàm

lƣợng cordycepin trong dịch lỏng ............................................................... 36
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..................................................... 40
5.1. Kết luận ................................................................................................ 40
5.2. Kiến nghị .............................................................................................. 40


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nấm dƣợc liệu đã đƣợc biết đến từ hàng ngàn năm nay đƣợc sử dụng
hoặc nghiên cứu và điều trị bệnh. Hơn hai phần ba số ca tử vong liên quan
đến ung thƣ có thể đƣợc ngăn ngừa hoặc giảm đi bằng cách bổ sung nấm vào
trong khẩu phần ăn [24]. Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều
dạng môi trƣờng sống khác nhau, kể cả sa mạc. Đa phần các nấm đều không
thể nhìn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất
mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động, thực vật [1].
Những loại nấm nhƣ nấm Hƣơng, nấm Chaga, nấm Linh chi, nấm phục linh,
nấm Đông trùng hạ thảo đã đƣợc tập trung nghiên cứu bởi khả năng chống
ung thƣ, chống virus và tăng cƣờng hệ miễn dịch [1].
Đông trùng hạ thảo (ĐTHT - tên khoa học Cordyceps) là tên gọi chung
chỉ những loài nấm thuộc lớp Ascomycetes kí sinh trên ấu trùng các loài bƣớm
thuộc chi Thitarodes. Vào mùa đông nấm xâm nhiễm vào cơ thể ấu trùng ẩn
dƣới mặt đất, vào mùa hè với nhiệt độ vào độ ẩm thích hợp, hệ sợi nấm phát
triển thành cây nấm nhú lên trên mặt đất. Trong Cordyceps, có rất nhiều thành
phần quan trọng bao gồm các loại acid amin thiết yếu, vitamin: B1, B2, B12
và K, các loại carbohydrate khác nhau nhƣ monosaccharide, oligosaccharides
và các polysaccharide, protein, sterole, nucleoside và các nguyên tố vi lƣợng
khác [24]. Quả thể nấm còn chứa nhiều axit amin khác nhƣ lysine, glutamic
acid, proline và threonine. Hoạt chất chính trong Cordyceps là cordycepin và

adenosine [24]. Cordyceps có rất nhiều tác dụng chẳng hạn nhƣ chống ung
thƣ, chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, bồi bổ sinh khí, tăng cƣờng khả năng
sinh lý của phái mạnh….


2
Hiện nay, trƣớc nhu cầu tiêu thụ đông trùng hạ thảo ngày một lớn, giá trị
kinh tế mang lại từ hoạt động nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo ngày càng
cao, do vậy một số công ty, các viện nghiên cứu, trƣờng Đại học… đang tiến
hành đẩy mạnh nghiên cứu sản xuất loại dƣợc thảo này. ĐTHT trên thị trƣờng
Việt Nam vẫn chƣa đƣợc khai phá hết tiềm năng. Các cơ sở nuôi trồng nấm
đa số thực hiện trên môi trƣờng rắn, sản phẩm chỉ đƣợc thƣơng mại hóa dƣới
dạng sơ chế (quả thể tƣơi, khô dùng để bổ sung vào thực phẩm hoặc làm thức
uống). Nuôi cấy trên môi trƣờng rắn mất thời gian dài để hình thành quả thể.
Trong khi đó nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng có nhiều lợi thế, thời gian nuôi
cấy ngắn hơn với nguy cơ nhiễm thấp, tiết kiệm đƣợc chi phí sản xuất. Việc
nghiên cứu các loại môi trƣờng lỏng thích hợp để tăng hàm lƣợng hoạt chất
có trong ĐTHT sẽ đáp ứng đƣợc nhu cầu về mặt dƣợc liệu, mở ra hƣớng đi
mới trên quy mô công nghiệp.
Xuất phát từ thực tiễn đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh
hƣởng thành phần môi trƣờng lỏng đến sự phát triển hệ sợi và hàm
lƣợng cordycepin của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris”.
1.2. Mục tiêu đề tài
1.2.1 Mục tiêu tổng quát
Tìm ra môi trƣờng lỏng thích hợp để tăng sinh trƣởng hệ sợi và nâng cao
hàm lƣợng cordycepin trên chủng giống C. miltaris.
1.2.2 Mục tiêu cụ thể
- Tìm ra đƣợc công thức môi trƣờng lỏng phù hợp cho sự sinh trƣởng,
phát triển của hệ sợi và đạt đƣợc tổng hàm lƣợng cordycepin cao nhất.
- Tìm ra đƣợc độ pH môi trƣờng lỏng phù hợp cho sự sinh trƣởng, phát

triển của hệ sợi và đạt tổng hàm lƣợng cordycepin cao nhất.


3
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Quá trình nghiên cứu sẽ đƣa ra đƣợc sự ảnh hƣởng của thành phần môi
trƣờng, độ pH của môi trƣờng đến sự phát triển hệ sợi và hàm lƣợng
cordycepin của nấm Cordyceps militaris.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Kết quả nghiên cứu là căn cứ khoa học giúp cho việc hoàn thiện quy
trình nuôi trồng nấm C. miltaris trên môi trƣờng lỏng để sản xuất cordycepin
- Mở ra hƣớng ứng dụng sản xuất cordycepin trên quy mô công nghiệp.
- Tạo ra sản phẩm nấm ĐTHT có chất lƣợng đảm bảo với chi phí hợp lý.
- Thúc đẩy phong trào nghiên cứu khoa học của sinh viên Khoa CNSHCNTP và nhà trƣờng


4
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu
2.1.1. Giới thiệu Đông Trùng Hạ Thảo
Nấm Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) là các loài nấm thuộc ngành phụ nấm
túi Ascomycetes ký sinh trên cơ thể côn trùng, đƣợc xem nhƣ là một dƣợc
liệu nổi tiếng từ cổ xƣa. Chi nấm Cordyceps đã đƣợc thu mẫu và định loại
trên 400 loài khác nhau và theo hệ thống phân loại các loài này đƣợc xếp vào
họ Clavicipitaceae. Dựa trên đặc điểm hình thái cũng nhƣ đặc điểm về cấu
trúc phân tử, các loài nấm trên đƣợc xếp trong 162 đơn vị phân loại, bao
gồm các chi chủ yếu là: Cordyceps, ElaphoCordyceps, MetaCordyceps và
OphioCordyceps thuộc 2 họ Cordycipitaceae và Ophiocordycipitaceae.

Trong chi Cordyceps loài đƣợc biết đến nhiều nhất là Cordyceps sinensis
lần đầu tiên đƣợc biết đến với tên gọi là “yartsa gunbu” tại Tây Tạng trong thế
kỷ 15 [17]. Trong y học Trung Quốc loài nấm này có tên là “Dong Chong Xi
Cao”, còn trong y học Nhật Bản có tên là “Tochukaso/Tochukasu”, “totsu
kasu” [9]. Nấm đƣợc phát hiện ở độ cao 3800m so với mực nƣớc biển trên các
đồng cỏ ở cao nguyên Himalaya miền núi Tây Tạng, Nepal và các tỉnh Trung
Quốc: Tứ Xuyên, Cam Túc, Hồ Bắc, Chiết Giang, Sơn Tây, Thanh Hải, Vân
Nam. Giai đoạn thu hoạch nấm thƣờng vào giữa tháng 4 và tháng 8 [10].
Ở Việt Nam, loài nấm này phân bố ở rừng nhiệt đới lá rộng thƣờng xanh
ở độ cao từ 400-1800m so với mực nƣớc biển. Tần suất xuất hiện rất khác biệt
giữa các địa điểm điều tra, phân bố phổ biến ở vƣờn quốc gia Hoàng Liên và
Vƣờn Quốc gia Ba Vì, Vƣờn Quốc gia Tam Đảo, Khu Bảo tồn Thiên nhiên
Copia [4],[5].
Nấm dƣợc liệu từ lâu đã là thành phần quan trọng trong nền y học thế
giới. Đặc biệt các loài trong chi Cordyceps đƣợc đánh giá cao do chứa nhiều


5
dƣợc chất. Hiện nay Cordyceps có hai loài đƣợc nghiên cứu phổ biến là
Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris bởi nó có nhiều hoạt chất sinh học
tốt cho sức khỏe nhƣ: adenosine, cordycepin, acid béo, polysaccaride, inosine,
thymine, guanidin, thymidine, uracil… [16]. Theo y học truyền thống của
Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng chữa trị nhiều chứng bệnh:
chữa bệnh về thận, bệnh về phổi, bệnh tim, chống suy nhƣợc, phục hồi sức
khỏe, chữa trị ung thƣ, chứng nấc, giảm đau, chống lão hóa, chống viêm,
chống virus, chống nấm, chống lại bệnh viêm màng phổi [9].
Có hơn 1200 loại nấm xâm nhiễm, trong đó Cordyceps là một trong những chi
lớn nhất chứa khoảng 500 loài và các giống. Nhiều loài khác nhau của Cordyceps
đang đƣợc trồng bao gồm C.sinensis, C. miltaris, C.ophioglossoides, C.sobolifera,
C.liangshanesis, và C.cicadicola. Tƣơng tự, nhiều loài Cordyceps khác đã đƣợc ghi

nhận nhƣ C.tuberculata, C.subsessilis, C.minuta, C.myrmecophila, C.Canadensis,
C.agriota, C.gracilis, C.ishikariensis, C.konnoana, C.nigrella, C.nutuc, C.pruinosa,
C.scarabaeicola, C.sphecocephala, C.tricentri… Loài nấm Cordyceps sinensis xuất
hiện nhiều bên ngoài tự nhiên hơn cả, thƣờng phân bố ở độ cao trên 2000m so với
mực nƣớc biển, tập trung chủ yếu ở Tây Tạng – Trung Quốc. Tuy nhiên hiện
nay các nhà khoa học đang gặp khó khăn trong việc tìm ra môi trƣờng phù
hợp để nuôi cấy loài nấm này. Để giải quyết vấn đề này, các nhà nghiên cứu
đã tiến hành nuôi trồng nấm C. miltaris trên môi trƣờng nhân tạo, loài nấm
này có các hoạt chất hóa học tƣơng tự và dễ dàng nuôi trồng trên môi trƣờng
nhân tạo so với loài C.sinensis [24].
2.1.2. Nấm Cordyceps militaris
Cordyceps militaris là loài nấm thuộc họ Clavicipitaceae, giống
Cordyceps. Loài này đƣợc Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi
Clavaria militaris. Ở Trung Quốc, C. miltaris đƣợc đặt tên là “Dong Chong


6
Xia Cao” hoặc “Chong Cao” đƣợc sử dụng nhƣ một loại thuốc y học cổ
truyền và thực phẩm chức năng trong các loại thảo mộc của Trung Quốc [2].

Hình 2.1: Nấm Cordyceps militaris [30]
Bảng 2.1: Bậc phân loại nấm
Giới
Ngành

Fungi
Ascomycota

Lớp

Ascomycetes/ Pyrenonmycetes

Bộ

Hypocreales

Họ

Clavicipataceae

Chi

Cordyceps

Loài

Cordyceps militaris

 Ký chủ
Nấm C. miltaris là loài đƣợc nghiên cứu kỹ nhất trong tất cả các loài của
giống Cordyceps. Ký chủ phổ biến của loài C. miltaris trong tự nhiên bao


7
gồm ấu trùng và nhộng của các loài bƣớm. Ngoài ra, còn có các ký chủ khác
nhƣ các loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh màng
(Hymenoptera) và bộ hai cánh (Diptera). Ví dụ: Lachnosterna quercina
(thuộc bộ cánh cứng), Cimbex similis (thuộc bộ cánh màng) và Tipula
paludosa (thuộc bộ hai cánh) [2].
Bảng 2.2: Một số ký chủ của nấm Cordyceps militaris

Bộ

Họ

Loài

Coleoptera

Scarabaeidae

Lachnosterna quercina

Diptera

Tipulidae

Tipula paludosa

Hymenoptera

Cimbicidae

Cimbex similis

Lepidoptera

Bombycidae

Andraca bipunctata

 Chu trình sống của nấm C. miltaris
Giống nhƣ hầu hết các loài Cordyceps khác, C.miltaris là một loại nấm ký
sinh trên cơ thể côn trùng. Lớp biểu bì của côn trùng đƣợc bao phủ bởi một
lớp biểu bì dày bao gồm chitin, protein và lipid. Trong tất cả các thành phần
này, chitin là một loại heteropolysaccharide đƣợc tạo ra bằng quá trình trùng
hợp N-acetyl glucosamine thông qua liên kết 1-4 β tạo thành cấu trúc quan
trọng trong thành phần của côn trùng, đóng vai trò nhƣ một rào cản bảo vệ
côn trùng với các tác nhân gây bệnh và ngăn ngừa sự mất nƣớc. Chất gây
bệnh phải vƣợt qua lớp vỏ cứng này để có thể xâm nhập vào cơ thể côn
trùng.Vào mùa đông, sâu non, sâu trƣởng thành của một số loài nằm dƣới đất
hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm (bào tử nấm hình
thành các ống có các thể bám, các ống này tiết ra các loại enzyme nhƣ: lipase,
chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ
thể), sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng để sinh trƣởng phát triển, làm
cho côn trùng chết. Giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký


8
sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao nấm chuyển
sang giai đoạn hình thành quả thể và nhú lên khỏi mặt đất nhƣng gốc vẫn dính
liền vào thân sâu [24].

Hình 2.2: Các dạng bào tử trong chu trình sống của nấm. [28]
2.1.3. Thành phần hóa học của nấm Cordyceps militaris
Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối của C. miltaris có 17 acid
amin khác nhau, D-mannitol, lipit và nhiều nguyên tố khoáng (Se, Zn, Cu...).
Quan trọng hơn là trong sinh khối có nhiều chất có hoạt tính sinh học mà các nhà
khoa học phát hiện đƣợc nhờ các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất tự
nhiên. Theo số liệu của Viện sinh thái ứng dụng thuộc Viện Hàn lâm khoa học
Trung Quốc, thành phần hóa học của thể quả nấm C. miltaris nhƣ sau [1]:

+ Protein chiếm 40.69 %.
+ Các loại vitamin: vitamin A (34.7 mg/g), vitamin B1 (13.0 mg/g),
vitamin B6 (62.2 mg/g), vitamin B12 (70.3 mg/g), vitamin B3 (42.9 mg/g).
+ Các nguyên tố khoáng: Se (0.44 ppm), Zn (130.0 ppm), Cu (29.15 ppm).


9
+ Hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1.52 %),
cordycepic axit (11.8 %), polysaccharide (30 %).
Bảng 2.3: Các hoạt chất trong Cordyceps
Hoạt chất sinh học

Tác dụng
 Kháng khuẩn
 Kháng viêm

Cordycepin

 Ức chế kết tập tiểu cầu
 Kháng u
 Giảm mỡ máu
 Điều trị suy tim mãn tính
 Tăng miễn dịch

Adenosine

 Điều tiết máu
 Hỗ trợ chống bệnh trầm cảm
 Chống co giật, mất trí nhớ và giảm đau
 Kháng virus

 Kháng u

Polysaccharide

 Tăng cƣờng hệ miễn dịch
 Chống oxy hóa
 Chống lão hóa

Ergosrerol analog
Mannitol

 Kháng virus
 Chống rối loạn nhịp tim
 Hỗ trợ lợi tiểu, chống co giật
 Kháng u

Peptides

 Tăng cƣờng các hoạt động miễn dịch
 Kháng nấm

Fibrinolytic enzyme

 Hỗ trợ chống đông máu


10
Cordycepin
Đầu năm 1950 cordycepin lần đầu tiên đƣợc phân lập từ C. miltaris, công
thức phân tử là C10H13N5O3, trọng lƣợng phân tử 251.24 g/mol. Phân tử

cordycepin có tính kiềm, dạng bột hoặc tinh thể bông tuyết. Điểm nóng chảy
2280C - 231 0C, với bƣớc sóng hấp thụ cực đại là 259 nm. Cordycepin có thể
hòa tan trong nƣớc muối, rƣợu ấm, methanol [29]. Cấu trúc của cordycepin
bao gồm một phân tử nucleoside purine (adenine) gắn với một ribose đƣờng
(ribofuranose) qua một liên kết β-N9-glycosidic. Sự tổng hợp hóa học của
cordycepin đạt đƣợc chủ yếu thông qua việc thay thế nhóm OH ở vị trí 3'
trong nhóm ribofuranosyl với H, tạo ra một chất tƣơng tự deoxy của
adenosine.
Cordycepin có tác dụng:
+ Tác dụng chống viêm nhiễm: Phản ứng viêm là phản ứng có liên quan
đến quá trình ung thƣ. Các tế bào ung thƣ sinh nhiều cytokine, chemokine và
các receptor của của tế bào ung thƣ, các chất này gây ra phản ứng viêm.
Cordycepin đƣợc cho rằng làm giảm các tác nhân gây ra viêm nhƣ NO,
PGE2, TNF α và IL 1β.
+ Tác dụng làm giảm đƣờng huyết: hoạt chất cordycepin không làm gia
tăng nồng độ insulin trong máu, nhƣng vẫn làm giảm hàm lƣợng glucose máu
thông qua tác dụng làm tăng nồng độ glycogen trong gan. Đồng thời
cordycepin có tác dụng bảo vệ thận và giảm chấn thƣơng lách do tiểu đƣờng
gây ra.
+ Ức chế sinh tổng hợp purine, tổng hợp DNA/RNA: Sau khi vào trong tế
bào, cordycepin đƣợc chuyển thành 5' mono-, di- và tri-phosphate ức chế hoạt
động của các enzyme, chẳng hạn nhƣ ribose-phosphate pyrophosphokinase và
5-phosphoribosyl-1 pyrophosphate amidotransferase, đƣợc sử dụng trong quá
trình tổng hợp của purine. Bởi vì sự giống nhau của nó với adenosine,


11
cordycepin có thể tham gia vào các quá trình phân tử khác nhau trong tế bào,
chẳng hạn nhƣ tổng hợp DNA hoặc RNA. Hơn nữa, nghiên cứu cho thấy rằng
cordycepin có thể đóng con đƣờng tín hiệu mTOR bằng cách kích hoạt AMP

kinase hoạt tính thông qua một cơ chế chƣa rõ, dẫn tới sự ức chế dịch, sự gia tăng
và tăng trƣởng tế bào, từ đó giúp ngăn chặn các tế bào ung thƣ phát triển [23].
+ Kích thích apotosis và chu trình chết tế bào: Apoptosis, là một quá trình
của sự chết tế bào đƣợc lập trình, đƣợc mô tả chủ yếu bởi một loạt các thay
đổi khác biệt về hình thái tế bào, sự thay đổi này bao gồm: mất gắn kết tế bào,
tế bào bị co rút lại, nhân tế bào bị phân chia thành từng mảnh nhỏ, nhiễm sắc
thể bị co lại và DNA trong nhiễm sắc thể bị cắt nhỏ. Các nghiên cứu trƣớc
đây đã chứng minh đƣợc vai trò của cordycepin khi gây ra apoptosis thông
qua việc điều chỉnh sự biểu hiện của các protein khác nhau. Quá trình này liên
quan đến sự chết tế bào đƣợc lập trình, ví dụ: nhóm các protein của Bcl-2 có
cả tác dụng chống apoptotic và pro apoptotic. Cordyceptin cũng đã đƣợc biết
là gây ra apoptosis trong tế bào ung thƣ đại trực tràng của con ngƣời (SW480
và SW620) bằng cách tăng cƣờng các mức độ ép nén protein của các phân tử
JNK, p38 và Bcl-2 pro apoptotic. Tƣơng tự, apoptosis trung gian cordycepin
đã đƣợc quan sát thấy ở dòng tế bào ung thƣ vú MDA-MB-231 bằng cách
tăng chuyển vị ty thể và sự phóng thích của cytochrome C, tiếp theo là sự kích
hoạt của các caspases-9 và -3. Tác dụng apoptotic của cordycepin cũng đã
đƣợc nghiên cứu trong các tế bào ung thƣ, cordycepin phân hủy protein
polyase (ADB-ribose) dẫn đến sự chết tế bào apoptosis ở ngƣời khối u thần
kinh SK-NBE (2) -C (CRL-2268) và u ác tính ở ngƣời. Năm 2012 Lee HJ đã
chứng minh tác dụng chống tăng sinh của cordycepin trong tế bào ung thƣ vú
ở ngƣời thông qua việc gây ra tổn thƣơng DNA, sự phân hủy PARP và sự


12
phosphoryl

hóa

ATM,

ATR

và

histone

γH2AX

[13],[23],[24].

Cordycepin (3′-deoxyadenosine)
Adenosine
Hình 2.3: Công thức hóa học của cordycepin và adenosine
Adenosine
Công thức phân tử là: C10H13N5O4. Trọng lƣợng phân tử: 267.24 g/mol.
Adenosine dạng bột tinh thể có màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 234 – 235 0C.
Adenosine có tác dụng:
+ Tác dụng chống viêm: Adenosine đƣợc chứng minh là một chất có khả
năng kháng viêm tại thụ thể của adenosine A2A. Nồng độ adenosine ngoại
bào ở tế bào bình thƣờng là khoảng 300 nM. Tuy nhiên khi tế bào bị tổn
thƣơng nồng độ này nhanh chóng nâng lên từ 600 đến 1200 nM.
+ Tác dụng trên tim: Hoạt chất Adenosine trực tiếp kiểm soát các chức
năng mô tim, tác dụng giãn mạch vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ
tim, ức chế nút xoang và dẫn truyền nút nhĩ thất. Hoạt chất Adenosine đƣợc
dùng làm thuốc điều trị rối loạn nhịp tim [8].
+ Tác dụng trên phổi và thần kinh trung ƣơng: Adenosine có khả năng điều
chỉnh chức năng các tế bào có liên quan đến bệnh viêm đƣờng hô hấp nhƣ bạch
cầu, tế bào lympho… Ngoài ra adenosine có tác dụng tốt đối với một số bệnh rối
loạn thần kinh nhƣ thiếu máu cục bộ, thoái hóa thần kinh… [8].

Cordycepic acid
Acid cordycepic là một đồng phân của acid quinic đƣợc nghiên cứu 1957,
cấu trúc tinh thể của acid cordycepic đƣợc xác định là D-mannitol. Mannitol


13
là hoạt chất sinh học quan trọng có trong rễ, thân lá của cây và tìm thấy một
lƣợng lớn mannitol trong nấm ăn đƣợc, cà rốt. Công thức hóa học của
mannitol là C6H14O6, trọng lƣợng phân tử: 182 g/mol, nhiệt độ sôi: 290-295
0

C. Trong quả thể nấm Cordyceps có khoảng 29-85 mg/g mannitol. Mannitol

có tác dụng lợi tiểu, chống ho viêm họng… [29].
Acid amin
Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể nấm C. miltaris bao
gồm: lysine (15.06 mg/g), acid glutamic (8.79 mg/g), prolin (6.68 mg/g),
threonine (5.99 mg/g) và alanine (5.18 mg/g).
Acid béo
Quả thể nấm C. miltaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70 % tổng
số acid béo, trong đó lƣợng acid linoleic chiếm 61.3 % trong quả thể. Lƣợng
acid béo no chủ yếu là acid palmitic chiếm 24.5 % trong quả thể.
Polysaccharide
Trong giới nấm, đặc biệt là ở các loài nấm Cordyceps các polysaccharides
đƣợc nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trong y học. Cordyceps chứa một lƣợng
lớn polysaccharide, khoảng 3-8 % tổng trọng lƣợng thƣờng có trong thân quả
thể nấm [26]. Nghiên cứu cho thấy các polysaccharide có hiệu quả trong việc
điều hòa hàm lƣợng đƣờng trong máu, có tác dụng chống và điều trị ung thƣ
đã di căn rất có hiệu lực, có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống ung
thƣ, di căn, điều hòa miễn dịch, hạ lipid máu [20].

Sterols
Một số hợp chất hóa học dạng sterol đã đƣợc tìm thấy trong nấm ĐTHT đó là
ergosterol, Delta-3 ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol,
và campasterol.


14
Ergosterol
Ergosterol là tiền chất quan trọng cho vitamin D. Hàm lƣợng ergosterol ở
Cordyceps militaris nuôi cấy rất cao, chỉ đứng sau Cordyceps sinensis tự
nhiên phân lập ở Tây Tạng. Các ergosterol và các chất đồng dạng của nó có
hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh thận do giảm
immunoglobin A [29].
Tổng hợp một số công dụng chính của nấm Cordyceps militaris
Cordyceps militaris là loài nấm có giá trị dƣợc liệu có tác dụng: Chống
viêm, chống oxy hóa, chống lão hóa, ngăn chặn di căn, điều hòa tăng cƣờng
miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virut, hạ đƣờng huyết, bảo vệ
thần kinh, hỗ trợ bảo vệ gan, hỗ trợ các bệnh về tim.
Cordyceps militaris tăng cƣờng năng lƣợng tế bào ở dạng ATP
(adenosine tri-phosphate). Trong quá trình thuỷ phân phosphate từ ATP, rất
nhiều năng lƣợng đƣợc giải phóng và đƣợc sử dụng bởi tế bào. Các nghiên cứu
trƣớc đây về Cordyceps đã chứng minh rằng nó có chống vi khuẩn, chống nấm,
diệt cỏ, chống viêm, chống bệnh tiểu đƣờng, chống oxy hóa, chống khối u,
apoptotic, miễn dịch, miễn dịch chống virus HIV và nhiều tác dụng khác [24].
Cordyceps militaris từ lâu đã đƣợc sử dụng trong sản xuất thuốc phổi,
thận, điều trị viêm phế quản mạn tính, hen, lao và các bệnh khác của hệ hô
hấp. Cordyceps làm giảm huyết áp cao thông qua các phản ứng trực tiếp hoặc
trung gian với các thụ thể M-cholinergic dẫn đến cải thiện tuần hoàn máu và
mạch máu. Do đó, Cordyceps có thể điều trị hoặc khắc phục tình trạng co thắt
nhịp tim. Chiết xuất Cordyceps giúp điều trị suy tim mãn tính, ngăn ngừa nhồi

máu cơ tim, làm giảm sự tiêu hao oxy cơ tim [24].
Dịch chiết từ thể quả C. miltaris có tác dụng chống ung thƣ, hiệu quả đối
với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch rốn là HT1080 và B16-F10 do có
khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu mới bằng cách giảm sự biểu


15
hiện của bFGF, một trong những nhân tố kích thích quá trình này. Do có vai
trò kìm hãm quá trình tạo thành các mạch máu mà có thể ngăn chặn đƣợc quá
trình di căn và sự phát triển của tế bào ung thƣ.
2.1.4. So sánh hai phƣơng thức nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng và môi
trƣờng rắn của nấm Cordyceps militaris
Bảng 2.4: So sánh phƣơng pháp nuôi cấy nấm C. miltaris trên môi
trƣờng lỏng và môi trƣờng rắn
Nuôi cấy trên môi trƣờng rắn
Thời gian nuôi cấy: 45-60 ngày
[6],[22].

Nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng
Thời gian nuôi cấy: 20 - 35 ngày [12]
Do có hàm lƣợng cordycepin trong

Khả năng nấm mốc xâm nhiễm cao

dịch môi trƣờng cao nên khả năng
nhiễm giảm đáng kể

Trong quá trình nuôi cần trải qua hai
giai đoạn: nuôi tối, nuôi sáng.
- Cần sử dụng nhiều bóng đèn để chiếu

sáng, thiết bị phun ẩm để cung cấp ẩm,
sử dụng điều hòa để ổn định nhiệt độ
nuôi cấy.
- Cần nhân công vận chuyển bình
giống từ phòng nuôi tối sang phòng

Bình giống đƣợc nuôi hoàn toàn trong
tối:
- Sử dụng điều hòa ổn định nhiệt độ
nuôi. Không cần đèn chiếu sáng, không
cần cung cấp độ ẩm [12].
- Không tốn công vận chuyển.

sáng.
Hàm lƣợng cordycepin thấp [22]

Hàm lƣợng cordycepin cao [12]

2.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy nấm Cordyceps militaris trên môi
trƣờng lỏng trong và ngoài nƣớc
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Ngày nay, khi lƣợng ĐTHT ngoài thiên nhiên rất khan hiếm và bị ngăn
cấm thu hoạch thì việc trồng nhân tạo để thu sinh khối đƣợc thực hiện nhƣ là


16
một giải pháp thay thế. Tuy nhiên, các chủng nấm ĐTHT phân lập từ các nơi
khác nhau sẽ phát triển trên các môi trƣờng có thành phần tỉ lệ dƣỡng chất
cũng nhƣ sản sinh các hoạt chất khác nhau. Ví dụ nhƣ thể quả của nấm ĐTHT
có hình dạng, kích thƣớc và màu sắc khá khác nhau khi đƣợc nuôi bởi các

chủng khác nhau. Đã có nhiều nghiên cứu tối ƣu các môi trƣờng cũng nhƣ sử
dụng các chủng đột biến để sản xuất ra các hoạt chất mong muốn.
Năm 2004, X.B. Mao và J.-J. Zhong đã tiến hành nghiên cứu: “Tăng sản
xuất cordycepin bằng cách kiểm soát oxy hòa tan trong giai đoạn nuôi cấy
ngập của nấm C. miltaris”. Hệ số truyền oxi thể tích ban đầu (kLa) trong
khoảng 11.5-113.8 giờ có ảnh hƣởng đáng kể đến sản xuất cordycepin. Nồng
độ cordycepin cao nhất là 167.5 mg/l với giá trị kLa ban đầu là 54.5 giờ [26].
Năm 2005, X.B. Mao và cs đã tiến hành nghiên cứu: “Tối ƣu hóa nguồn
carbon và tỉ lệ carbon/nitrogen trong sản xuất nấm C. miltaris trên môi trƣởng
lỏng để sản xuất cordycepin”. Các nguồn carbon đã đƣợc sử dụng nhƣ lactose,
sucrose, glucose, fructose, galatose, maltose, xylose và trong đó glucose đƣợc
coi là tốt nhất đối với sản xuất cordycepin. Tỉ lệ nguồn C/N tối ƣu là 42 g
glucose/l và 15.8 g peptone/l để sản xuất cordycepin trên quy mô lớn [27].
Năm 2005, Cheng Hong và cs đã tiến hành nghiên cứu: “Tối ƣu hóa các
điều kiện trong nuôi cấy lỏng của nấm C. miltaris”. Kết quả nghiên cứu cho
thấy môi trƣờng lỏng tối ƣu có thành phần: khoai tây 20 %, sucrose 5 %, bột
đậu nành 2 %, KH2PO4 0.1 %, MgSO4.7H2O 0.1 %, VB1 0.01 %, pH 6, nhiệt
độ 24 0C [7].
Năm 2006, M. Masuda, E. Urabe, A. Sakurai và M. Sakakibara đã tiến
hành nghiên cứu: “Sản xuất cordycepin bằng phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt
của nấm C. miltaris”. Nghiên cứu điều tra sản xuất cordycepin (3'deoxyadenosine), một loại tƣơng tự nucleoside, khoảng 98 % cordycepin
đƣợc tổng hợp đã đƣợc bài tiết vào môi trƣờng nuôi cấy và các hợp chất liên


17
quan đến acid nucleic. Nguồn nitơ thích hợp cho sản xuất cordycepin là
peptone và chiết xuất từ cao nấm men, trong đó tỷ lệ của chiết xuất từ nấm là
75% hoặc cao hơn. Tỷ lệ carbon/nitrogen tối ƣu là 2/1 khi glucose đƣợc sử
dụng làm nguồn carbon. Trong điều kiện tối ƣu, nồng độ cordycepin tối đa
trong môi trƣờng nuôi cấy đạt 640 mg/l [18].

Năm 2007, I.-L. Shih, K.-L. Tsai và C. Hsieh đã tiến hành nghiên cứu:
“Ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy lên sự phát triển của nấm và sản sinh
chất chuyển hóa sinh học trong môi trƣờng ngập của C. miltaris”. Kết quả
nghiên cứu cho thấy giá trị pH ban đầu, các nguồn nitơ khác nhau, dầu thực
vật đều ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất expolysaccharides (EPS), adenosine
và đặc biệt là cordycepin. Các điều kiện tối ƣu cho sự phát triển của sợi nấm
sản xuất EPS và cordycepin đƣợc quan sát ở pH tƣơng đối thấp. Trong số các
nguồn hữu cơ, chiết xuất nấm men (YE) thuận lợi cho sản xuất EPS và
cordycepin, trong khi đó bột ngô là thuận lợi cho sản xuất adenosin. Tỷ lệ
C/N thấp hơn thuận lợi cho sản xuất adenosine và cordycepin; tuy nhiên tỷ lệ
C/N quá thấp sẽ làm giảm sản lƣợng. Tất cả các loại dầu thực vật thử nghiệm:
dầu đậu nành, dầu lạc, dầu dừa, dầu oliu đều kích thích sự phát triển của sợi
nấm và sản xuất EPS của C. miltaris, nhƣng chúng không có ảnh hƣởng nhiều
đến sản xuất adenosine và cordycepin. Điều kiện tối ƣu để sản xuất
cordycepin bởi C. miltaris ở pH 6, nồng độ YE 45 g/l [11].
Năm 2010, tại Trung Quốc các nhà khoa học T.C Wen, J.C.Kang,
B.X.Lei, G.R.Li và J.He đã tiến hành nghiên cứu: “Tăng cƣờng sản xuất
cordycepin bằng cách sử dụng chất phụ gia trong nuôi cấy C. miltaris”. Tiến
hành nuôi cấy trên môi trƣờng có thành phần: glucose 26.25 g/l, peptone
26.25 g/l, adenine 7.50 g/l, histidine 4.50 g/l, MgSO4⋅ 7H2O 0.1 g/l, và
KH2PO4 0.1 g/l. Trong điều kiện này, sản lƣợng cordycepin tối đa trong môi
trƣờng nuôi lỏng là 18.92 mg/g trong 39 ngày [21].