Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh pdf

Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 1

MỤC LỤC
LỜI MỞ
ĐẦU
3
PHẦN I. TỔNG

QUAN

VỀ

PHÂN

BÓN

VI

SINH

KÍCH

THÍCH

SINH

TRƯỞNG

CÂY

TRỒNG
4
Khái

niệm
4
I.

Các

chất

điều

hòa

sinh

trưởng

cây

trồng

chính
4
1.1.

Auxin

4
1.1.1.

Phân

loại
4
1.1.2

Quá

trình

trao

đổi

chất

của

auxin
4
1.1.3. Những ảnh hưởng của auxin đối với cây trồng 5
II.

Gibberellin

(GA)
7

2.1.

Sinh

tổng

hợp

gibberellin
7
2.2.

Những

ảnh

hưởng

sinh

lý

của

gibberellin
8
2.3.

Ứng

dụng

của

GA
9
III.

Cytokinin.
9
3.1.

Nguồn

gốc
9
3.2.

Sinh

tổng

hợp

cytokinin
10
3.3.

Những

ảnh

hưởng

sinh

lý

của

cytokinin
11
II.

GIỚI

THIỆU

VI

KHUẨN

AZOTOBACTER

VÀ

ỨNG

DỤNG TRONG

CÔNG NGHIỆP

SẢN
XUẤT PHÂN

BÓN

VI

SINH.
12
2.1.

Đặc

tính

của

vi

khuẩn

Azotobacter
12
2.1.1.

Hình

thái

học
14
2.1.2.

Nang

vi

khuẩn
14
2.1.3.

Đặc

tính

vật

lý:
14
2.2.

Khả

năng

sản

xuất

các

chất

kích

thích

sinh

trưởng

và

những tác

động

của

chúng tới

cây

trồng
15
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG 16
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 2

III. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG
AZOTOBACTER
CÓ
KHẢ
NĂNG
TỔNG HỢP CÁC
P
HYTOHORM
ONE.
17
3.1. Phân
lập
17
3.2. Tuyển chọn các chủng VK Azo
tobacte
r
sinh tổng hợp
IAA
18
3.3. Tuyển chọn chủng sinh
Gib
bere
li
n
18
3.4. Kiểm tra hoạt lực tổng hợp IAA của chủng vừa tuyển
trọn
trong thực

t
ế 19
3.5 Lên men thu sinh
k
hố
i. 20
3.6 Kiểm tra sinh
k
hố
i 21
IV. CHUẨN BỊ CHẤT
M
ANG 22
4.1 Giới thiệu chung về chất
mang.
22
4.2 Lựa chọn chất mang cho Azotobacter 22
4.3. Xử lí chất
ma
ng
23
4.4 Cấy
chủng
24
4.5 Bảo
quản
24
4.6 Sử
dụn
g

24
PHẦN II. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG TỔNG HỢP RA CHẤT KÍCH
THÍCH SINH TRƯỞNG 25
I. Phân lập, tuyển chọn chủng Pseudomonas tổng hợp ra chất kích thích sinh trưởng Auxin
25
1.1. Đặc điểm của chủng Pseudomonas sp 25
1.2. Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas từ các mẫu khác nhau. 25
II. Phân lập và tuyển chọn chủng Azospirillum tổng hợp Auxin và Giberelin 30
2.1. Đặc điểm của Azospirillum 30
2.2. Phân lập và tuyển chọn Azospirillum từ cây mía ở tỉnh Cần Thơ(ĐH Cần Thơ nghiên
cứu ) 31
2.3. Phân lập và tuyển chọn Azospirillum từ mẫu đất rừng của quận Thanjavur, Tamil Nadu,
Ấn Độ[6] 32
PHẦN III. GIỚI THIỆU VỀ AZOTOBACTER 35
1. Phân lập chủng Azotobacter spp từ đất 35

Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 3

LỜI MỞ
ĐẦU


Cùng với việc gia tăng dân số mạnh mẽ là vấn đề về an ninh lương thực cho mỗi quốc
gia và trên toàn thế giới, từ đó nảy sinh những yêu cầu cao hơn đối với nên nông nghiệp,
nhằm nâng cao sản lượng, chất lượng của các sản phẩm nông sản phục vụ cuộc sống con
người. Từ lâu, người nông dân đã sử dụng các loại phân bón hóa học như một công cụ hữu
ích giúp nâng cao năng suất vụ mùa. Thực tế cho thấy, phân bón hóa học đã giúp cải thiện
một cách đáng kể sản lượng lương thực thu được. Song mặt khác, việc sử dụng gia tăng

phân bón hóa học trong sự mất cân đối nghiêm trọng giữa các yếu tố dinh dưỡng đã gây
ra nhiều ảnh hưởng xấu đến hiệu quả sản xuất và môi trường sinh thái. Để phát triển nông
nghiệp bền vững, cần phải có chiến lược an toàn dinh dưỡng cho đất và cây trồng: đó là
bảo đảm cung cấp đủ liều lượng cần thiết các chất dinh dưỡng thiết yếu đúng lúc cây
cần, theo tỷ lệ cân đối giữa các chất trong phân bón, phù hợp với yêu cầu từng loại cây trên
các vùng đất trồng dưới các điều kiện thời tiết, khí hậu khác nhau: an toàn dinh dưỡng cho
cây và đất trồng cũng có nghĩa bảo đảm và phát triển hệ sinh thái đất. Đất trồng không chỉ
là tập hợp các nguyên tố hóa học, mà còn là một thế giới sống – nơi trú ngụ và sinh
sống của hàng triệu triệu sinh vật, nơi từng giờ, từng phút diễn ra hàng loạt các phản ứng
lý, hóa và sinh học. Thông qua các phản ứng lý, hóa, sinh học và các hoạt động của
sinh vật sống, đất trồng mới có điều kiện để hồi phục và cân bằng thông qua các quy luật
của tự nhiên. Nếu phá vỡ các quy luật này, đất sẽ bị hủy hoại và không phát huy được vai
trò của nó. Bảo đảm an toàn dinh dưỡng cho cây và đất trồng không chỉ nâng cao năng
suất, chất lượng nông sản, giảm chi phí sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế mà còn góp
phần bảo vệ môi sinh, môi trường thông qua việc tạo thế cân bằng trong tự nhiên, giảm
bớt hóa chất độc sử dụng trong phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng. Chiến lược an toàn dinh
dưỡng cho cây và đất trồng là sử dựng cân đối phân bón hóa học và phân bón sinh học
cho cây trồng phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng và điều kiện đất đai, khí hậu trong đó phân
bón sinh học có vai trò vô cùng quan trọng. Phân bón sinh học không chỉ cung cấp cho
cây trồng các chất dinh dưỡng cần thiết mà còn góp phần duy trì độ phì nhiêu của đất
trong quá trình canh tác, do vậy có vai trò rất quan trọng trong thâm canh. Phân bón sinh
học là nhóm phân bón có nguồn gốc từ các chất liệu sinh học bao gồm các loại phân vi
sinh vật, phân hữu cơ được chế biến thông qua quá trình lên men vi sinh vật.





Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 4

PHẦN I. TỔNG

QUAN

VỀ

PHÂN

BÓN

VI

SINH

KÍCH

THÍCH

SINH

TRƯỞNG

CÂY

TRỒNG

Khái

niệm

Phân vi sinh kích thích sinh trưởng là sản phẩm chứa các vi sinh vật sống , có khả năng
tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng như: auxin (IAA), Cytokinin, GA, ethylene kích
thích sự phát triển của cây trồng nâng cao năng suất nông sản.
I.

Các

chất

điều

hòa

sinh

trưởng

cây

trồng

chính
1.1.

Auxin

1.1.1.

Phân

loại

Auxin có thể được chia thành 6 nhóm sau :
- Những dẫn xuất indole: Indole-3-acetic (IAA) và Indole-3-butyric acid (IBA).
- Những benzoic acid: 2,3,6-trichlorobenzoic acid và 2-methoxy-3-6- dichlorobenzoic
acid (Dicamba).
- Những chlorophenoxyacetic acid: 2,4,5 - trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) và 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D).
- Picolinic acid: 4-amino-3,5,6-trichloropiconic acid (Tordon hay Pichloram).
- Những naphthalene acid: α và β-naphthaleneacetic acid (α và β - NAA).
- Những naphthoxyacetic acid: α và β-naphthoxyacetic acid (α và β- NOA).
1.1.2

Quá

trình

trao

đổi

chất

của

auxin

- Sự tổng hợp IAA: Auxin được tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm và cả

ở vi khuẩn. Ở thực vật bậc cao IAA được tổng hợp chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn và từ đó được
vận chuyển xuống dưới với vận tốc 0,5- 1,5cm/h. Sự vận chuyển của auxin trong cây
có tính chất phân cực rất nghiêm ngặt, tức là chỉ vận chuyển theo hướng gốc. Chính vì
vậy mà càng xa đỉnh ngọn, hàm lượng auxin càng giảm dần tạo nên một gradien nồng độ
giảm dần của auxin từ đỉnh ngọn xuống gốc của cây. Ngoài đỉnh ngọn ra auxin còn được
tổng hợp ở các cơ quan còn non khác như lá non, quả non, phôi hạt đang sinh trưởng, mô
phân sinh tầng phát sinh. Quá trình tổng hợp auxin xảy ra thường xuyên và mạnh mẽ
ở trong cây dưới xúc tác của các enzyme đặc hiệu. Axit β-Indol Axetic là loại auxin phổ
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 5

biến trong cây, được tổng hợp từ tryptophan bằng con đường khử amin, cacboxyl và oxy
hóa.
Công thức tổng quát của Axit β - Indol Axetic là C10H9O2N.
- Sự phân hủy auxin: Sự phân hủy auxin cũng là một quá trình quan trọng điều chỉnh
hàm lượng auxin trong cây. Auxin sau khi tác dụng có thể bị phân hủy làm mất hoạt tính
hoặc trong trường hợp hàm lượng cao và dư thừa auxin có thể bị phân hủy để giảm hàm
lượng. Sự phân hủy auxin trong cây chủ yếu xảy ra bằng con đường enzyme IAA-oxidase.
IAA-oxidase hoạt động rất mạnh trong cây, đặc biệt trong hệ thống rễ. Dưới tác dụng xúc
tác của IAAoxidase, IAA bị ôxy hóa và chuyển thành dạng mất hoạt tính là metilen oxindol.
- Sự biến đổi thuận nghịch dạng tự do và dạng liên kết: IAA ở trong cây có thể tồn tại
dưới hai dạng là dạng tự do và dạng liên kết. IAA tự do là dạng gây ra hoạt tính sinh lý ở
trong cây. Tuy nhiên, trong tế bào IAA tự do chiếm một hàm lượng rất thấp so với dạng
IAA liên kết. IAA liên kết ở trong cây là dạng chủ yếu, nhưng chúng không có hoạt tính
sinh lý hoặc có hoạt tính sinh lý thấp. AIA liên kết chủ yếu với gluxit và với axit amin.
Dạng liên kết của IAA có ý nghĩa rất lớn trong việc dự trữ IAA, làm giảm hàm lượng IAA
tự do, tránh tác dụng của IAA-oxidase và cũng là dạng vận chuyển auxin trong cây.
Nhờ ba quá trình trao đổi chất tiến hành đồng thời của auxin ở trong cây mà hàm lượng
auxin trong cây tương đối ổn định bảo đảm sự sinh trưởng, phát triển của các cơ quan và cơ

thể cây hài hòa, không bị rối loạn.
Bằng con đường tổng hợp hóa học, hàng loạt hợp chất có bản chất tương tự auxin lần
lượt ra đời và có ý nghĩa quan trọng trong việc điều chỉnh sinh trưởng của cây. Có nhiều
chất quan trọng như: α-NAA; IAA; IBA; 2,4D; 2,4,5T
1.1.3. Những ảnh hưởng của auxin đối với cây trồng
Auxin liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Vài ảnh hưởng quan trọng của
auxin điều hòa các quá trình sinh lý của thực vật có thể kể đến như sau:
 Vươn dài tế bào: Các bước ảnh hưởng lên sự vươn dài do auxin tác động có thể tóm
tắt như sau:
- Giảm tính chống chịu của vách tế bào đối với sức căng. Điều này gây ra do sự bẻ gãy
những liên kết không cộng hóa trị giữa xyloglucans và cellulose trong vách tế bào.
- Có một sự thay đổi về những chế độ nước với tế bào. Ngay cả khi áp suất thẩm thấu
trong tế bào không thay đổi, thế năng nước trong tế bào được xử lý với auxin trở nên yếu
hơn do sự giảm thế năng áp suất.
- Sự giảm thế năng nước cho phép nước di chuyển vào bên trong tế bào và tạo ra một áp
suất về phía vách tế bào có tính dẻo tạo ra sự vươn dài.
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 6

- Khi sự vươn dài hoàn tất, những liên kết không cộng hóa trị giữa cellulose và những
polysaccharide tái lập trở lại. Quá trình này không thuận nghịch.
 Quang hướng động: Quang hướng động là sự phát triển của một mô thực vật
hướng về phía sáng do sự đáp ứng với thông lượng trực tiếp hoặc gradient. Theo giả thuyết
Cholodny - Went thì ánh sáng chiếu từ một phía sẽ gây ra sự di chuyển của auxin
về phía tối, do đó nồng độ auxin về phía tối cao hơn phía được chiếu sáng. Sự phân phối
auxin không đều được xem là nguyên nhân gây ra sự nghiêng.
 Địa hướng động: Là sự hướng động của một cơ quan thực vật đáp ứng với trọng
lực. Nếu một câyđược đặt nằm ngang, chồi của nó sẽ nghiêng lên phía trên ngược chiều
với trọng lực (địa hướng động âm), trái lại rễ sẽ nghiêng xuống theo chiều của trọng lực

(địa hướng động dương). Theo thuyết Cholodny-Went về địa hướng động thì thân và rễ
đáp ứng với trọng lực tích lũy IAA về phía thấp hơn. Trong thân IAA kích thích sự sinh
trưởng trên mặt đáy của thân và làm cho thân nghiêng về phía trên. Khi cắt chóp rễ đi thì
khả năng đáp ứng của rễ đối với trọng lực bị mất đi và khi đặt chóp rễ trở lại thì tính địa
hướng động được phục hồi.
 Ưu thế chồi ngọn: Chồi ngọn được biết là nguyên nhân khống chế sự phát triển của
chồi bên. Khi cắt chồi ngọn, chồi bên sẽ phát triển. Tuy nhiên theo thời gian, chồi bên phát
triển trội lên và ức chế sự phát triển của những chồi bên mọc sau. Sau khi auxin được phát
hiện, hàm lượng cao của nó trong đỉnh chồi cũng đã được ghi nhận. Ưu thế chồi ngọn đã
được ghi nhận ở nhiều loài thực vật và được điều khiển bởi chất điều hòa sinh trưởng.
 Sự tượng rễ: Julius Von Sachs (1880) cho rằng trong lá non và những chồi hoạt
động có chứa một chất điều hòa sinh trưởng có khả năng dẫn truyền và kích thích sự tượng
rễ. IAA cũng đã được biết là chất có khả năng kích thích sự tượng rễ của cành giâm và
cũng đã cho thấy khả năng ứng dụng trong thực tiễn. Những auxin tổng hợp thường
được dùng thay vì IAA tự nhiên vì chúng không bị phân hủy bởi enzyme IAA oxidase hay
những enzyme khác và sẽ tồn tại trong mô trong một thời gian dài. Áp dụng auxin ngoại
sinh có thể kích thích sự tượng rễ và sự phát triển sớm của rễ, trái lại sự vươn dài của rễ nói
chung bị ức chế trừ khi áp dụng với nồng độ đủ nhỏ. Sự ức chế sinh trưởng của auxin
thường có liên quan đến sự kích thích sinh tổng hợp ethylene.
 Sự sản sinh ethylene: Sự kích thích sản sinh ethylene gây ra do auxin được ghi
nhận đầu tiên trên cà chua bởi Zimmerman và Wilcoxon (1935). Ngày nay, auxin đã
được biết là chất điều hòa sinh trưởng kích thích sự sinh tổng hợp ethylene trên nhiều
loài thực vật như đậu xanh, lúa, cỏ lồng vực…
 Sự phát triển trái: Sự gia tăng kích thước trái chủ yếu do sự nở rộng của tế bào gây
ra. Auxin có liên quan đến sự nở rộng của tế bào và đóng vai trò cơ bản trong việc quyết
định sự phát triển của trái. Vai trò mạnh mẽ của auxin trong sự phát triển của trái gồm hai
yếu tố. Thứ nhất là mối quan hệ giữa sự phát triển hột với kích thước cuối cùng và hình dạng
trái. Thứ hai là việc áp dụng auxin lên trái nào đó ở những giai đoạn đặc thù của sự phát
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 7

triển sẽ gây ra sự đáp ứng. Ví dụ ở dâu tây, nội phôi nhủ và phôi trong bế quả sản xuất
auxin, nó di chuyển ra ngoài và kích thích sự sinh trưởng. Vị trí của bế quả trên trái có một
ảnh hưởng lớn đến hình dạng trái. Bế quả dâu tây nằm bên ngoài đế hoa thịt quả và dễ dàng
tác động. Khi tách tất cả bế quả thì trái không phát triển. Tuy nhiên, nếu tách tất cả bế
quả và áp dụng auxin lên đế hoa thì trái phát triển bình thường.
 Sự rụng: Nếu cắt bỏ phiến lá non thì lá sẽ dễ rụng. Tuy nhiên cuống lá sẽ không
rụng nếu được xử lý auxin như IAA. Sự rụng lá là do sự thành lập tầng rời và hiện
tượng này bị chi phối bởi auxin. Sự rụng sẽ gia tăng khi lượng auxin nội biên bằng hoặc
lớn hơn auxin ngoại biên. Xử lý auxin về phía lá của tầng rụng làm giảm sự lão hóa,
về phía thân của tầng rụng kích thích sự lão hóa và gây ra sự rụng. Sự giảm auxin nội sinh
trong lá hoặc các cơ quan khác của cây sẽ gây ra sự rụng. Việc xử lý NAA hay 2,4 D cũng
làm giảm sự rụng trái.
 Sự thể hiện giới tính: Việc xử lý auxin có thể làm thay đổi giới tính của hoa trên
một số loài cây và sự thay đổi giới tính này được ghi nhận có liên quan đến sự kích thích
sinh tổng hợp ethylene. Khi xử lý auxin ngoại sinh đã làm tăng số lượng hoa cái trên họ
bầu bí.
II.

Gibberellin

(GA)

2.1.

Sinh

tổng

hợp

gibberellin

Nói chung người ta chấp nhận rằng gibberellin được tổng hợp từ mevalonic acid
trong những chồi non đang sinh trưởng tích cực và hột đang phát triển. Chu trình mevalonic
acid không chỉ có liên quan đến sinh tổng hợp gibberellin mà còn liên quan đến sinh tổng
hợp cytokinin, abscisic acid và brassinosteroid (hình 3.6). Sau khi mevalonic acid biến đổi
thành mevalonicacid pyrophosphate rồi thành isopentenyl pyrophosphate sẽ tách ra theo
hướng tổng hợp cytokinin, abscisic acid và con đường khác theo các bước tiếp theo để tạo
thành ent-kaurene sẽ dẫn đến sự thành lập các phân tử gibberellin. Quá trình tổng hợp
gibberellin có thể bị ức chế bởi các chất làm chậm sinh trưởng trong bước chuyển hóa từ
geranylgeranyl pyrophosphate thành copyl pyrophosphate. Các chất làm chậmsinh trưởng
gốc pyrimidine, triazole, tetcyclacis và inabenfide cũng ức chế sự biến đổi từ ent-
kaurene thành ent-kaurenol, từ ent-kaurenol thành ent-kaurenal, từ ent-kaurenal thành ent-
kaurenoic acid.
Quá trình sinh tổng hợp gibberellin của nấm G.fujikuroi và thực vật bậc cao có thể chia
thành 3 giai đoạn chính:
- Chuyển hóa mevalonic acid thành ent-kaurene.
- Chuyển hóa ent-kaurene thành gibberellin prototype, GA12-aldehyde.
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 8

- Chuyển hóa GA12 - aldehyde thành C20-, rồi thành C19 - GA với con đường
không 13-hydroxyl hóa và con đường 13-hydroxyl hóa sớm ở các vị trí khác nhau và sau
cùng thành các dạng GA khác nhau.
2.2.

Những

ảnh

hưởng

sinh

lý

của

gibberellin

Gibberellin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Tuy nhiên ở những chi,
loài với những yếu tố khác nhau sẽ quyết định gibberellin đặc hiệu hiệu quả nhất.
Gibberellin ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như
sự phát triển thân, sự nảy mầm của hột, miên trạng, trổ hoa, phân hóa giới tính, trinh quả
sinh, đậu trái và lão hóa.
- Ảnh hưởng trên sự phát triển của thực vật sống: Các gibberellin đã biết
đều có khả năng kích thích sự vươn dài của thân hay sự phân chia tế bào. Sự kích thích
vươn dài của GA thể hiện rất rõ trên những cây non hoặc bộ phận non, ở cây đã trưởng
thành hay cơ quan đã già thì ảnh hưởng sẽ kém đi. Nhìn chung, GA kích thích sự
sinh trưởng của nhiều loài cây đặc biệt là những cây lùn. Khác với auxin, ảnh hưởng vươn
dài của GA lên thực vật sống thì rõ hơn trên các đoạn mẫu được cắt. Thực vật đáp ứng với
các loại gibberellin khác nhau cũng khác nhau. Đối với trục hạ diệp rau diếp, ảnh hưởng
kích thích sự vươn dài của GA8 không rõ nét, ảnh hưởng kích thích sự vươn dài của GA4,
GA1 và GA3 mạnh dần và GA9 lại có ảnh hưởng mạnh hơn cả. Trong một vài trường hợp
thì ảnh hưởng kích thích sự vươn dài trục hạ diệp dưa leo của gibberellin cũng kém hiệu quả.
- Ảnh hưởng lên tính trạng lùn: Có nhiều biến dị thiếu sinh tổng hợp GA đã được
phát hiện. Đây là tính trạng đơn gene, kích thước của cây biến dị có thể chỉ bằng một phần

năm cây bình thường và sự lùn chủ yếu là do lóng bị ngắn lại. Các dạng đột biến lùn như đột
biến bắp lùn (Zea mays L.) d1 và d5 và lúa lùn (Oryza sativa L.) Tan-ginbozu và Waito-
C. GA nội sinh kiểm soát hoạt động của bắp và lúa là GA1. Việc xử lý GA ngoại sinh làm
cho các cây này cao trở lại bình thường. Cũng có những dạng đột biến lùn không đáp
ứng với việc áp dụng gibberellin ngoại sinh và cây vẫn lùn sau khi xử lý.
- Ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hột và miên trạng: Hiện nay GA được biết là
những chất có khả năng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng trên nhiều loại cây trồng.
GA có thể kích thích hoạt động của các enzyme thủy phân hydrolase trong hột ngũ cốc.
GA ngoại sinh tác động lên lớp aleurone của hột ngũ cốc và kích thích sự sản
sinh enzyme α-amylase để tác động lên sự phân hủy tinh bột thành đường đơn.
Tác động này có tác dụng kích thích nảy mầm và phá vỡ miên trạng. Khoai tây có thể nảy
mầm sớm khi xử lý với GA3. GA cũng có thể kích thích sự nảy mầm của hột rau diếp mà
không cần xử lý ánh sáng đỏ. GA cũng có thể thay thế điều kiện nhiệt độ thấp hoặc ngày
dài để phá vỡ miên trạng.
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 9

- Ảnh hưởng lên sự trổ hoa: Gibberellin có khả năng thúc đẩy quá trình trổ hoa trong
nhiều loài thực vật. Đối với những cây cần yêu cầu ngày dài hay trải qua điều kiện lạnh
trước trổ hoa thì khi xử lý GA trong những điều kiện không cảm ứng chúng sẽ tượng hoa
và trổ hoa. Ảnh hưởng này có liên quan đến sự kích thích quá trình phân chia tế bào
và vươn dài tế bào.

- Ảnh hưởng lên sự phân hóa giới tính, đậu trái và lão hóa: GA có thể làm thay đổi
giới tính của hoa tương tự như auxin, cytokinin và ethylene. Tuy nhiên, GA có hiệu
quả ngược với auxin và ethylene. GA làm tăng số hoa đực trên dưa leo. GA cũng gây nên
hiện tượng trình quả sinh và tạo nên trái không hột. GA cũng giúp cho trái to và trì hoãn sự
lão hóa. Các loại trái nho không hột ở Nhật, Úc, Mỹ và châu Âu thường có xử lý GA3. Bằng
cách giảm lão hóa, GA giữ cho vỏ trái cam quít tươi lâu hơn, chậm mềm khi chín và

kéo dài thời gian bảo quản hơn. GA cũng làm cho vỏ táo đẹp hơn, cây kiểng trổ hoa sớm và
tập trung. GA3 cũng có thể giúp quá trình sản xuất malt trong công nghiệp sản xuất bia hiệu
quả hơn và ngắn hơn 2-3 ngày.
2.3.

Ứng

dụng

của

GA

- Kích thích tăng chiều cao, tăng sinh khối.
- Tăng năng suất và tạo quả không hạt.
- Phá bỏ sự ngủ nghỉ của hạt, củ.
- Điều chỉnh giới tính
III.

Cytokinin.

3.1.

Nguồn

gốc

Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, nó kích thích sự phân chia tế bào và
những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như kinetin(6-furfurylaminopurine).
Cytokinin đầu tiên được phân lập từ DNA tinh trùng cá trích được thanh trùng và

được gọi là kinetin bởi vì nó có khả năng kích thích sự phân chia tế bào hay sự phân bào
(cytokinensis) trong mô lõi thuốc lá.
Cytokinin có nguồn gốc tự nhiên được phân lập đầu tiên từ hột bắp non và được gọi
làzeatin(6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenyl-amino)purine). Ngày nay, hầu hết
cytokinin được tìm thấy trong cây là zeatin (hình 3).

Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 10







Hình 3. Cấu trúc của Zeatin
Hiện nay, có nhiều cytokinin tổng hợp được biết. Có 3 chất thông dụng là kinetin (6-
furfurylaminopurine), BA (6-benzylaminopurine), và BPA (6-benzylamino)-9-(2-
tetrahydropyranyl)-9H-purine) (hình 4).
Cytokinin đã được tìm thấy ở hầu hết thực vật bậc cao, rêu, nấm ký sinh và không ký
sinh, vi khuẩn, và cũng có trong phần lớn tRNA của vi sinh vật và tế bào động vật. Hiện tại
có hơn 200 cytokinin tự nhiên và tổng hợp đã được phát hiện.

Hình 4. Cấu trúc của 6-(furfurylamino)purine (Kinetin), benzylaminopurine và BPA (6-
benzylamino)-9-(2-tetrahydropyranyl)-9H-purine)
3.2.

Sinh

tổng

hợp

cytokinin

Cytokinin có nhiều nhất trong miền phân sinh và vùng phát triển có hiệu quả
liên tục bao gồm rễ, lá non,trái đang phát triển và hột. Chúng được xem là được tổng hợp ở
rễ và vận chuyển đến chồi bởi vì có nhiều báo cáo cho thấy rằng cytokinin được tìm thấy
ở nhựa gỗ. Tuy nhiên, cytokinin đã được tìm thấy nhiều trong mô của trái và hột cho
thấy rằng chúng có thể được tổng hợp ở đó. Sự sinh tổng hợp cytokinin liên quan đến các
bước khởi đầu của chu trình mevalonic acid đến isopentenyl phosphate (hình 3.6).
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 11

Bước tiếp theo, isopentenyl sẽ kết hợp với AMP để tạo thành isopentenyl AMP.
Chất này sau đó được biến đổi thành isopentenyl adenosine theo sau bởi một loạt phản ứng
khác để tạo thành cytokinin.
3.3.

Những

ảnh

hưởng

sinh

lý

của

cytokinin

- Phân chia tế bào và tạo thành cơ quan: Vai trò chính của cytokinin trong
cây là kích thích sự phân chia tế bào. Callus có thể được tạo thành ban đầu chỉ cần auxin
hoặc cytokinin riêng lẽ. Tuy nhiên để duy trì sự phát triển của callus, sự kết hợp của auxin
và cytokinin tỏ ra cần thiết. Tỉ lệ auxin/cytokinin sẽ ảnh hưởng lên sự tạo callus, rễ
hay chồi . Khả năng tái sinhcây từ callus là một công cụ kỹ thuật sinh học thông thường
dùng để chọn lọc những cây kháng với điều kiện khô hạn, stress do mặn, bệnh, thuốc cỏ hay
những yếu tố khác.
- Sự nảy mầm, sự mở rộng của tế bào và cơ quan: Kinetin có thể giúp hột rau diếp
nảy mầm vượt qua ảnh hưởng ức chế của ánh sáng đỏ xa. Cytokinin được biết là chất kích
thích sự phân chia tế bào, tuy nhiên vẫn có những trường hợp thấy được ảnh hưởng của
cytokinin lên sự mở rộng của tế bào. Cytokinin kích thích sự mở rộng tế bào trục hạ diệp
được cắt từ cây củ cải, bí rợ, cây lanh và nhiều cây song tử diệp khác. Sự mở rộng của tế bào
là do sự hấp thu nước gây ra do sự giảm thế năng thẩm thấu của tế bào được kích thích bởi
sự biến đổi trở lại của lipid dự trữ trong trục hạ diệp thành đường khử (glucose và fructose).
- Sự tượng rễ và sự phát triển rễ: Cytokinin có thể kích thích hoặc ức chế sự
khởi đầu và phát triển của rễ tùy theo nồng độ và thời gian xử lý. Kinetin có thể kích thích
sự gia tăng trọng lượng khô và sự vươn dài của rễ cây đậu lupin con, trái lại hai yếu tố

trên bị ức chế ở nồng độ kinetin cao. Khi kinetin được xử lý lên rễ ở nồng độ thấp, nó kích
thích quang hợp và sinh trưởng. Tuy nhiên nếu rễ tiếp xúc với 0,47 µM kinetin hơn
hai ngày thì sinh trưởng của rễ và toàn cây sẽ bị giảm rõ rệt.
- Sự phát triển nụ và chồi: Cytokinin có khả năng kích thích chồi bên và đặc biệt là
vượt qua ảnh hưởng ưu thế chồi ngọn. Bằng công nghệ di truyền người ta đã làm gia
tăng được sự sinh tổng hợp cytokinin trong cây thuốc lá và Arabidopsis. Một gene của vi
khuẩn giải mã enzyme isopentenyl AMP synthase, một enzyme đáp ứng với quá trình
sản sinh cytokinin, cùng với kích thích gây sốc nóng đã đưa được gene này vào cây thuốc lá
và Arabidopsis. Gene mới này được hoạt hóa bằng cách cho cây chuyển gene vào
điều kiện nhiệt độ 40-450C trong một thời gian ngắn và kết quả là làm gia tăng hàm
lượng zeatin riboside monophosphate, zeatin riboside và zeatin lần lượt là 23, 46 và 80 lần.
Một ví dụ khác là việc đưa một gene giải mã enzyme biến đổi IAA tự do thành một amino
acid liên hợp bất hoạt. Dưới ảnh hưởng của gene này, IAA tự do bị giảm, do đó kích thích
chồi bên phát triển. Ưu thế chồi ngọn được điều khiển bởi sự cân bằng giữa mức độ
cytokinin và auxin nội sinh. Có hai giả thiết về mối quan hệ của cytokinin lên
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 12

ưu thế chồi ngọn. Giả thiết thứ nhất cho rằng cytokinin có thể ức chế enzyme IAA oxidase
trong chồi bên và do đó cho phép tích lũy auxin và gây ra sự vươn dài của chồi bên. Giả
thiết thứ hai là cytokinin có thể khởi đầu cơ chế liên quan đến sức chứa ở chồi bên bằng
cách kích thích sự vận chuyển dinh dưỡng, vitamin, khoáng và những chất sinh trưởng
khác để tác động lên sự sinh trưởng.
- Trì hoãn sự lão hóa và kích thích sự vận chuyển chất dinh dưỡng và
những hợp chất hữu cơ: Cytokinin có thể giúp làm giảm quá trình lão hóa khi tách lá ra
khỏi thân cây và hoạt động như là chất thay thế cho sự cần thiết của rễ để giảm lão hóa.
Cytokinin cũng có khả năng thay thế ảnh hưởng của ánh sáng và làm giảm sự lão hóa bằng
cách duy trì nguyên vẹn màng tonoplast (màng bán thấm bao quanh không bào). Khi
cytokinin được xử lý lên lá cây úa vàng hoặc tử diệp vài giờ trước khi đưa ra ánh sáng, tiền

lạp thể sẽ được chuyển hóa thành lục lạp và kết quả là có sự gia tăng sự sản sinh diệp lục tố.
Cytokinin cũng làm giảm sự lão hóa của hoa cắt cành và rau tươi. Kinetin có khả năng
kích thích sự vận chuyển của những hợp chất hữu cơ trong lá đã cắt và giữ trong tối. Khả
năng của cytokinin kích thích sự vận chuyển dinh dưỡng và tạo ra sức chứa đã được biết
trên nhiều loài.

II.

GIỚI

THIỆU

VI

KHUẨN

AZOTOBACTER

VÀ

ỨNG

DỤNG TRONG

CÔNG
NGHIỆP

SẢN XUẤT PHÂN

BÓN

VI

SINH.
2.1.

Đặc

tính

của

vi

khuẩn

Azotobacter

Azotobacter thuộc nhóm vi khuẩn di động (motile), có dạng hình cầu hoặc ovan,
thường hình thành các nang có vỏ rất dầy và tiết ra một lượng lớn chất nhờn bao quanh.
Chúng là vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất, có đóng góp quan trọng vào chu trình N2
trong tự nhiên bằng cách cố định N2 không khí_ dạng mà cây không hấp thụ được, rồi
chuyển hóa thành muối amoni trong đất. Con người đã lợi dụng các đặc điểm có lợi của
Azotobacter để sản xuất phân bón vi sinh, các chất phụ gia thực phẩm và một vài loại
polymer sinh học. Đại diện đầu tiên của loài VK này là chủng Azotobacter
chroococum, được phát hiện và miêu tả lần đầu vào năm 1901 bời nhà vi sinh vật học
người Hà Lan Martinus Beijerinck. Azotobacter là vi khuẩn Gram âm, ta có thể dễ dàng
phân lập chúng từ các nguồn đất trung tính hoặc kiềm, nước và một số loài thực vật.

Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 13













Tên chủng:
Azotobacter agilis
Azotobacter armeniacus
Azotobacter sp. AR
Azotobacter beijerinckii
Azotobacter chroococcum *
Azotobacter sp. DCU26
Azotobacter sp. FA8
Azotobacter nigricans
Azotobacter paspali
Azotobacter salinestris
Azotobacter tropicalis
Azotobacter vinelandii *

* : Chủng có khả năng sinh tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (auxin,
cytokinin, giberellin ) được công bố trong các tài liệu kèm theo.
Domain:

Bacteria
Kingdom:
Bacteria

Phylum:
Proteobacteria

Class:
Gammaproteobacteria

Order:
Pseudomonadales

Family:
Pseudomonadaceae/Azotobacterace-ae

Genus:
Azotobacter

Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 14

2.1.1.

Hình

thái

học

Tế bào Azotobacter tương đối lớn hơn so với vi khuẩn nói chung (đường kính
khoảng 1-2 micromet). Thường thì chúng có dạng hình oval, nhưng cũng có thể có nhiều
hình dạng khác, từ hình que đến hình cầu. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi, ta có thể thấy
chúng phân tán hay co cụm thành đám, đôi khi lại hình thành các chuỗi dài ngắn khác nhau.
Trong canh trường non, các tế bào trở nên di động nhờ vào đuôi flagella.
Khi tế bào già đi, chúng mất dần khả năng di động, trở nên dạng hình cầu và sản sinh ra
lớp dịch nhầy, sau tạo thành vỏ tế bào. Hình dạng của tế bào được quyết định bởi a.a
Glycine có mặt trong canh trường peptone. Ngoài ra, khi quan sát canh trường còn nhìn thấy
nhiều thể vùi, một số có màu sắc. Vào khoảng những năm 1900, những thể vùi có màu được
cho là các hạt tái sinh “ reproductive grains”. Tuy nhiên, sau này người ta nhận
ra rằng những hạt đó không tham gia vào quá trình phân chia tế bào , mà đó là volutin,
còn những thể vùi không màu là giọt chất béo, giúp vi khuẩn dự trữ năng lượng.
2.1.2.

Nang

vi

khuẩn

Các nang của vi khuẩn Azotobacter giúp chống chịu một số yếu tố môi trường có
hại, độ khô, sóng siêu âm và đặc biệt là tia UV, nhưng lại không chịu được nhiệt độ cao.
Sự tạo nang xảy ra khi có sự thay đổi nồng độ một số chất dinh dưỡng trong môi trường
và việc thêm vào các chất hữu cơ như etanol, n-butanol hay beta-hydroxybutyrate. Dạng
nang hiếm khi hình thành trong môi trường lỏng, khi tạo nang thì kèm theo nhiều thay đổi

trong đường hướng trao đổi chất, hô hấp…
Bản chất của nang chính là dạng tế bảo sinh dưỡng ở trạng thái ngủ;
tuy nhiên, trong khi những tế bào sinh dưỡng bình thường nhân lên thì nang Azotobacter
không có khả năng này, tựa như việc hình thành bào tử của nhiều loài VSV khác
nhằm chống chọi khi điều kiện môi trường không thuận lợi (pH, nhiệt độ, nguồn
dinh dưỡng…). Khi nang nẩy chồi, những tế bào sinh dưỡng mới này tăng sinh bằng
hình thức phân chia giản đơn. Quá trình này diễn ra khá chậm, mất khoảng 4-6 giờ, sau đó
tốc độ tăng dần, các tế bào bắt đầu hấp thu O2 và thải CO2.

2.1.3.

Đặc

tính

vật

lý:

Azotobacter là vi khuẩn hiếu khí, pH tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của
chúng khoảng 7.0 – 7.5, tuy nhiên chúng vẫn tồn tại ở dải pH từ 4.8 tới 8.5. Nhiệt độ phù
hợp khoảng 20 – 30
o
C.
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 15

Trạng thái khuẩn lạc: dẹt, nhầy, đường kính khoảng 5-10 mm, có thể tạo thành màng
trong canh trường lỏng. Màu sắc khuẩn lạc có thể là nâu đen, xanh lá cây hoặc đôi khi

không có màu, tùy thuộc vào từng chủng cụ thể.
2.2.

Khả

năng

sản

xuất

các

chất

kích

thích

sinh

trưởng

và

những tác

động

của

chúng tới

cây

trồng

Chất kích thích sinh trưởng, hay hormone thực vật là những hợp chất tự nhiên được tạo
ra bởi các vi sinh vật và cây cối, có tác dụng kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh hóa
trong cây và bản thân VSV.
Brakel và Higer (1965) đã chỉ ra rằng loài vi khuẩn Azotobacter có thể sản sinh ra
indo -3-acetic acid (IAA) khi thêm trytophan vào canh trường nuôi cấy. Vancura và
Macura (1960), Burlingham (1964) và Hennequin (1966) mặt khác chỉ tìm thấy một
lượng nhỏ IAA trong canh trường khi không có mặt tryptophan. Ba hợp chất giống với
Gibberelin cũng đã được kiểm tra bởi 2 nhà khoa học Brown và Burlingham (1968)
trên chủng Azotobacter Chroococum. Sau 14 ngày, lượng chất tăng tương ứng từ 0.01 đến
0.1 g GA3/ml.
Các chủng vi khuẩn Azotobacter tự tổng hợp auxin, cytokinin và những chất
tương tự GA, có vai trò điều khiển sự phát triển của cây cà chua (Jackson et al.,1964;
Barea và Brown, 1974; Azcorn và Barea , 1975). Những hormone này có khả năng kích
thích sự sinh trưởng của rễ cây, chúng được hình thành không chỉ trong cây mà còn từ
vùng đẩt rễ _ nơi có vi khuẩn Azotobacter sinh sống. Rất nhiều đề tài đã chứng minh sự
hiện diện của các phytohormone này trong canh trường nuôi cấy và các nhà khoa học đã
đo đạc được sự ảnh hưởng của nó lên cây trồng: Reliv et al. (1987), Martinez
Toledo et al. (1989), Salmeron et al. (1990) và Gonzales Lopez et al. (1991). Một nghiên
cứu được thực hiện bởi Govedarica và cộng sự (1993) trên 9 chủng Azotobacter
Chrocoocum phân lập từ đất bùn đen đã cho thấy khả năng sinh tổng hợp auxin, gibberelin
và phenol, làm tăng chiều cao cây cà chua, khối lượng và hàm lượng N trong cây. Các
chủng được phân lập từ vùng rễ củ cải đường lại cho một lượng Gibberelin vào khoảng
0.003- 0.1 g/cm

3
canh trường (Miliv và Markova-ki, 1995). Nhưng tiến bộ trong sinh
học phân tử gần đây giúp cải tiến nhiều kỹ thuật phân tích, gia tăng độ nhạy, cho phép đo
đạc chính xác hơn sự có mặt và lượng phytohormone mà VSV tạo ra. Thêm vào đó, rất
nhiều quá trình sinh trưởng của thực vật không chỉ bị điều hòa bởi 1 hormone mà do tác
động của nhiều chất điều hòa khác. (Barendse và Peter, 1995; Voasenek và Blom, 1996).



Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 16

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG








Chất mang
Xử lý
Nghiền mịn
Đóng bao
Thanh trùng
Phân lập, tuyển chọn VSV
Lên men sinh khối
Thu sinh khối hỗn hợp, kiểm tra

sinh khối và mật độ tế bào
Tiêm dịch
Hỗn hợp
Ủ sinh trưởng
Bảo quản, sử dụng
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 17

III. PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG
AZOTOBACTER
CÓ
KHẢ
NĂNG TỔNG HỢP CÁC
P
HYTOH
OR
M
ONE.

3.1. Phân
lập

Từ nhiều mẫu đất khác nhau (trồng lúa, trồng màu, đất bỏ hoang). Hong khô,nghiền
mịn ta tiến hành pha loãng với các hệ số pha loãng khác nhau.Trang trên hộp peptri chứa
môi trường Burk đặc pH=7.2-8.2, 28-30
o
C để 2-3 ngày đem quan sát khuẩn lạc.
Các môi trường phân
lậ

p:

(1) Môi trường Burk (2)
Fe - Mo mixture


K
2
HPO
4
0.08 g


(3) Môi trường Thompson
– Sherman

K
2
HPO
4
1 g
MgSO
4

0,2 g
CaCl
0,1 g
Na
2
MoO

4
0,001 g
Glucose
10 g
Nước máy
1000 ml

FeCl
3
.6H
2
O
1,45 g
Na
2
MoO
4
.2H
2
O

0,253 g
Nước cất
100 ml

KH
2
PO
4

0.02 g
MgSO
4
.7H
2
O
0.02 g
NaCl
0.02 g
CaSO
4
0.01 g
Fe – Mo mixture
0.1 ml
Sucrose
2.0 g
H
3
BO
3

10.0 µg
ZnSO
4
.7H
2
O
10.0 µg
MnSO
4

.4H
2
O
1.0 µg
CuSO
4
.5H
2O
0.30 µg
KI
0.10 µg
Nước cất
100 ml
Agar
2.0 g

Kết quả phân lập được một số chủng VK, cấy chuyển các chủng VK vào ống thạch
nghiêng môi trường Burk
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 18

Kiểm tra các chủng VK phân lập thuộc chi Azotobacter bằng cách quan sát hình thái
hoặc dùng sinh học phân tử. Qua một nghiên cứu cụ thể của ĐH Đà Nẵng người ta nhận
thấy có 4 loài: A.chroococcum;
A.beijerinckii;
A.vinelandii;
A.
agilis .
Khi nuôi trong môi trường thạch,vi khuẩn Azotobacter có khuẩn lạc nhầy, lồi hoặc

tan,lúc đầu không màu, sau biền thành màu nâu tối, thậm chí đến màu đen nhưng không
làm nhuộm màu môi trường khuẩn lạc.Ngoài ra một số loài Azotobacter có dạng nhãn
nheo,khuẩn lạc có màu vàng lục,màu hồng.
3.2. Tuyển chọn các chủng VK Azo
tobacte
r
sinh tổng hợp
IAA

Từ các chủng VK phân lập được, chúng tôi tiếp tục tuyển chọn các chủng có
khả năng sinh tổng hợp IAA, dựa vào phản ứng màu với thuốc thử Salkowski (2 ml of 0.5
M FeCl3+ 98 ml 35% HClO4). Cường độ máu tỉ lệ thuận với nồng độ IAA.
Tiến
hành:
Phản ứng màu giữa thuốc thử Salkowski và IAA













.3. Tuyển chọn chủng sinh
Gib

bere
li
n

Qua quá trình thử trên ta lựa chọn được chủng A.chroococcum sinh tổng hợp IAA
mạnh nhất. Ngoài kiểm tra khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng ta con kiểm tra khả
năng tổng hợp Gibberellins vi một số chủng Azotobacter có khả năng tổng hợp
Gibberellins. Phương pháp tiến hành như sau:
Lấy 2ml dịch vi sinh vật đã li tâm loại bỏ
tế bào

8ml thuốc thử Salkowski cải tiến, lắc đều

Hàm lượng IAA thô được xác
định theo phương pháp so màu
ở 530nm với đồ thị chuẩn IAA

Quan sát màu của các
ống
nghiệm phản
ứng

Nuôi cấy Azotobacter trên môi trường
lỏng, bổ sung 0,1% tryptophan nuôi lắc
220v/p, 5 ngày, t
o
= 28- 30
o
C

Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 19



.











Qua kiểm tra thấy chủng
A.chroococcum
tổng hợp IAA mạnh nhất lại có khả năng
tổng hợp cả Gibberellins. Như vậy ta sẽ chọn A.chroococcum làm đối tượng để sản xuất.
3.4 Kiểm tra hoạt lực tổng hợp IAA của chủng vừa tuyển
trọn
trong
thực
t
ế
Sau 24h, hạt đậu đen được xử lý bằng dịch nuôi cấy của chủng A.chroococcum ở nồng
độ pha loãng 10

-2
và 10
-3
. Sau 72h, tỷ lệ nảy mầm ở nồng độ pha loãng 10
-2
vượt 23%
so với đối chứng. Như vậy dịch nuôi cấy của chủng A.chroococcum đã kích thích và rút
ngắn thời gian nảy mầm của hạt giống. Vì vậy, có thể ứng dụng chủng này để xử lý hạt
giống trước khi gieo.

Dịch nuôi cấy ở 28
0
C trong 3
ngày
Lấy 1 ml dịch nuôi cấy vào
flask 250 ml
Cho 15 ml axit
phosphomolybdic
Đun sôi 1 h và làm nguội về
nhiệt độ phòng
Tính nồng độ Gibberelins (tỷ
lệ với cường độ màu)
Đo cường độ màu ở 780 nm
Bổ sung nước cất đến 25 ml
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 20

3.5 Lên men thu sinh
k
hố
i.
- Từ chủng VSV tuyển chọn ta tiến hành nhân sinh khối VSV theo phương pháp lên
men chìm trong môi trường Burk lỏng có sục khí và bổ sung N (cao nấm men, pepton hay
axit amin).
- Chuẩn bị môi trường.
Pha môi trường, điều chỉnh pH thích hợp với chủng rồi thanh trung môi trường.
Sinh khối VSV được nhân qua cấp 1,2 trong các điều kiện phù hợp với từng chủng
VSV và mục đích sản xuất.




Nhiệt độ
20 – 30
o
C
pH
7.0 – 8.0
Sục khí, khuấy
Khuấy
Áp suất
Áp suất thường
Đối chứng
Xử lý bằng dịch ở nồng độ 10
-2

Giống tr

ong
ống
thạ
ch


Hoạt hóa giống

Lên men thu
nhận giống

Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 21

Dinh dưỡng
Bổ sung N trong môi trường
- Trong quá trình sản xuất việc kiểm tra và điều chỉnh các yếu tố môi trường (pH, liều
lượng ,tốc độ khí ,áp suất, nhiệt độ…) là hết sức cần thiết. Các hệ thống lên men hiện nay
đã được trang bị hiện đại có công suất từ hàng chục đến hàng trăm ngàn lít.
- Trên cơ sở nghiên cứu, khảo sát tình hình thực tế ở một số quốc gia gần đây, ở
Hoa Kỳ, Úc đã nghiên cứu và chế tạo thành công nồi lên men đơn giản để tạo ra sinh khối
vi khuẩn có thể sử dụng trong điều kiện bán công nghiệp ở các nước phát triển. Nồi lên
men đơn giản kiểu này đang được sử dụng tại Thái Lan, Ấn Độ và một số quốc gia khác
trong đó có Việt Nam. Thời gian nuôi 5-7 ngày
3.6 Kiểm tra sinh
k
hố
i
Sau khi lên men thu sinh khối phải tiến hành kiểm tra xem mật độ tế bào trong dịch

lên men là bao nhiêu để chúng ta kiểm soát qua trình tiêm dịch vào chat mang cho đúng tỉ
lệ. Ta lam tương tự như phần phân lập với quy trình như sau:









1m
l
dịch
l
ên
m
en


Pha
l
oã
ng

với
nhiều
tỉ
l
ệ

Lấy
0.0
5m
l
từ các
m
ẫu
pha
l
oãn
g
trang
đều
lên
các hộp peptri
MT Burk

Tính mật độ tế
bào
trong dịch
lên
m
en


Quan sát
và
đếm khuẩn

l
ạc


Để 2-3
ngày


Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 22

IV. CHUẨN BỊ CHẤT
M
ANG
4.1 Giới thiệu chung về chất
mang.
Chất mang là chất để vi sinh vật mong muốn tồn tại và phát triển, tạo điều kiện thuận
lợi cho quá trình vận chuyển, bảo quản và sử dụng phân vi sinh. Chất mang không được
chứa chất có hại cho người , động thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
- Khi lựa chọn một chất mang để sử dụng cho phân bón vi sinh cần căn cứ vào các yếu
tố sau:
+ Bảo đảm cho vi sinh vật mong muốn sinh trưởng và phát triển tốt.
+ Dễ tìm, giá thành rẻ.
+ Không ảnh hưởng đến khả năng hấp thu dinh dưỡng của cây trồng.
+ Khả năng đệm pH tốt.
+ Không chứa chất độc hại cho người, động vật, môi trường sinh thái
+ Dễ sử dụng trong nông nghiệp
- Nguồn gốc chất mang
+ Nguyên liệu hóa thạch: than bùn, than đá, than non Chất thải từ thực vật: phân, bột

đậu, cám mì
+ Chất trơ: đất sét, đá trân châu, CaSO4
4.2 Lựa chọn chất mang cho Azotobacter
Loại chất mang thường được sử dụng để nuôi Azotobacter trong sản xuất phân vi sinh
là Than bùn
- Than bùn hoàn toàn thỏa mãn các yêu cầu lựa chọn chất mang. Than bùn và than non
không độc, giá thành rẻ, than chứa các thành phần dinh dưỡng giúp Azotobacter có thể sống
được, và không ảnh hưởng đến cây trồng…
- Than bùn được tạo thành từ xác các loài thực vật khác nhau. Xác thực vật được tích tụ
lại, được đất vùi lấp và chịu tác động của điều kiện ngập nước trong nhiều năm. Với điều
kiện phân huỷ yếm khí các xác thực vật được chuyển thành than bùn.
Trong than bùn có hàm lượng chất vô cơ là 18 – 24%, phần còn lại là các chất hữu
cơ. Theo số liệu điều tra của các nhà khoa học, trên thế giới trữ
lượng than bùn có khoảng 300 tỷ tấn, chiếm 1.5% diện tích bề mặt quả đất. Than bùn
được sử dụng trong nhiều ngành kinh tế khác nhau. Trong nông nghiệp than bùn được sử
dụng để làm phân bón và tăng chất hữu cơ cho đất. Than bùn cho phản ứng chua. Hàm
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 23

lượng các chất dinh dưỡng trong than bùn thay đổi tuỳ thuộc vào thành phần các loài thực
vật và quá trình phân huỷ các chất hữu cơ.

Hàm lượng hữu cơ
40%
Hàm lượng N
2.0% - 2.2%
Acid humic
16% - 18%
Mùn hữu cơ

30% - 40%
Đạm tổng số
1.4% - 1.7%
Lân tổng số
0.1% - 1.0%
Độ giữ nước
1.77
Chất khoáng
K, P

Tuy nhiên, than bùn có hợp chất bitumic rất khó phân giải. Nếu bón trực tiếp cho cây
không những không có tác dụng tốt mà còn làm giảm năng suất cây trồng. Vì vậy, than bùn
muốn dùng làm phân bón phải khử hết bitumic.
Trong than bùn có axit humic, có tác dụng kích thích tăng trưởng của cây. Hàm lượng
đạm tổng số trong than bùn cao hơn trong phân chuồng gấp 2 – 7 lần, nhưng chủ yếu ở dưới
dạng hữu cơ. Để có thể dùng than bùn làm chất mang, cần phải khử hết bitumic và đưa pH
về pH tối thích cho cả vi sinh vật mong muốn và đất cần bón.
4.3. Xử lí chất
ma
ng

- Dùng tác động của nhiệt để khử bitumic trong than bùn. Có thể phơi nắng một thời
gian để ôxy hoá bitumic. Có thể hun nóng than bùn ở nhiệt độ 70
o
C.
- Sấy đến độ ẩm 25 %-30%, rây để loại bỏ đất đá, rễ cây.
- Xay bằng kỹ thuật nghiền búa. Và được qua rây: 1mm, 355μm, 150 μm và 75 μm.
hoặc là nhỏ hơn.
- Điều chỉnh pH = 7.0 – 8.0 bằng CaO.
- Trộn nước thịt : than bùn với tỉ lệ 1 : 2.

- Có thể thay nước thịt bằng nước đậu (cung cấp dinh dưỡng).
- Trộn đều, rồi cho vào bao plastic (250g - 500g).
- Tiến hành thanh trùng trong nồi hấp với áp suất là 1.2 – 1.5 at, trong 30 phút.
- Bao plastic phải được giữ kín. Bao đủ dầy để không bị rách,đủ mỏng để VSV có thể
hô hấp.
Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 24

- Trên bao phải ghi đầy đủ những thông tin: tên loại phân VS, hạn sử dụng…
4.4 Cấy
chủng
-
C
huẩn bị các túi đựng than bùn đã khử trùng (hoặc là nguồn chất mang khác).
- Từ đường cong tiềm năng ẩm độ của chất mang, xác định số lượng sinh khối sẽ trộn
vào than bùn để đạt được ẩm độ thích hợp cho sự tồn tại của azobacter trong chất mang đó.
- Làm sạch bề mặt của túi ở ngay vùng sẽ tiêm bằng cồn.
- Sử dụng xy lanh và kim tiêm khử trùng, cẩn thận lấy lượng dịch sinh khối đã xác định
cho vào trong túi chất mang, tránh dịch này tràn ra ngoài theo đường tiêm. Khử trùng vùng
tiêm này bằng cồn và sau đó thì dán với nhãn dính với tên chủng và ngày tiêm.
- Xoa bóp nhẹ nhàng túi chế phẩm cho đến khi dịch sinh khối phân phối đều trong chất
mang, kiểm tra xem dịch sinh khối có phân bố đều ở 4 góc túi không.
- Ủ các túi chế phẩm ở nhiệt độ phòng từ 1– 4 tuần.
4.5 Bảo
qu
ả
n
-
Trong 1g phân bón vi sinh là 10

9
tế bào.
-
Sau khi sản xuất mà không sử dụng ngay thì ta phải bảo quản
15

–

20
0
C thì hiệu
quả kéo dài trong 6 tháng; 4
0
C thì bảo quản trong 2
năm.
- Thời gian bảo hành được quyết định sau khi đã kiểm tra chặt chẽ các thông số: thành
phần, độ ẩm, nhiệt độ.
4.6 Sử
dụn
g

Muốn nâng cao sản lượng cây trồng, một trong những biện pháp cần thiết là đáp ứng
nhu cầu dinh dưỡng của cây. Bón phân hợp lý nghĩa là phải xác định lượng phân bón hợp lý
cho cây trồng, tỷ lệ các loại phân bón thích hợp, xác định thời kỳ và phương pháp bón phân,
biết độ phì của đất (khả năng cung cấp của đất) và mức độ sử dụng phân bón của cây.



Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh kích thích sinh trưởng thực vật có thể sử dụng 1
chủng Azotobacter hoặc kết hợp với nhiều chủng vi khuẩn khác, nhằm tạo chế phẩm có khả

năng cung cấp nhiều loại phytohormone khác nhau cho cây trồng.

Tiểu luận Công nghệ sản xuất phân bón vi sinh

SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà, Đặng Thị Thuý, Nguyễn Văn Hùng 25

PHẦN II. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG TỔNG HỢP RA CHẤT KÍCH
THÍCH SINH TRƯỞNG
I. Phân lập, tuyển chọn chủng Pseudomonas tổng hợp ra chất kích thích sinh trưởng
Auxin
1.1. Đặc điểm của chủng Pseudomonas sp
Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào
tử.Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh họat về dinh dưỡng, không quang
hợp hoặc cố định nitrogen. Vi khuẩn này có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và
pháttriển thực vật: Tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật; kích thích bộ rễcủa cây chủ;
gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất




1.2. Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas từ các mẫu khác nhau.
a. Pseudomonas từ đồng bằng Sông Cửu Long. (Do viện sinh học công nghệ-Đại Học
Cần Thơ nghiên cứu)
pseudomonas