các phương pháp định lượng protein

Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


1
Mục lục
LỜI NÓI ĐẦU 3
I. TỔNG QUAN: 4
1. CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN: 4
1.1. Cấu trúc bậc 1: 4
1.2. Cấu trúc bậc 2: 5
1.3. Cấu trúc bậc 3: 6
1.4. Cấu trúc bậc 4: 6
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN 7
1. ĐỊNH LƯNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL 7
1.1. Đònh lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl 7
1.2. Đònh lượng nitơ phi Protein: 12
1.3. Đònh lượng Protein trong nguyên liệu: 13
2. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU 13
2.1. Đònh lượng Protein theo phương pháp Biure. 13
2.2. Đònh lượng Protein bằng phương pháp Lowry (Biure cải tiến): 16
2.3. Đònh lượng Protein theo phương pháp Bradford (Coomassie Brilliant
Blue G - 250): 19
3. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG BICINCHONINIC ACID
(BCA): 22
3.1. Nguyên tắc: 22
3.2. Cách tiến hành: 22
3.3. Tính kết quả: 22
3.4. Độ nhạy và khả năng ứng dụng: 22
4. ĐỊNH LƯNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ 23
4.1. Nguyên tắc: 23
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam

2
4.2. Cách tiến hành: 23
4.3. Tính kết quả: 24
4.4. Độ nhạy và khả năng ứng dụng: 24
5. PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG O-PHTHALALDEHYDE (OPA): 25
5.1. Nguyên tắc: 25
5.2. Độ nhạy và khả năng ứng dụng: 25
6. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG AMONIAC 25
6.1. Nguyên tắc: 25
6.2. Cách tiến hành: 26
6.3. Tính kết quả: 27
6.4. Khả năng ứng dụng: 27
7. PHƯƠNG PHÁP DUMAS: 27
7.1. Nguyên tắc: 28
7.2. Thiết bò: 28
7.3. Cách tiến hành: 29
8. PHƯƠNG PHÁP PRM (PYROGALLOL RED MOLYBDATE): 31
8.1. Nguyên tắc: 31
8.2. Dụng cụ: 32
8.3. Tiến hành: 32
III. SO SÁNH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯNG PROTEIN 33
1. SO SÁNH MẪU BIA CÓ VÀ KHÔNG QUA THẨM TÍCH 33
1. KẾT LUẬN 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


3


L
L
Ơ
Ơ
Ø
Ø
I
I


N
N
O
O
Ù
Ù
I
I


Đ
Đ
A

A
À
À
U
U




Protein là thành phần không thể thiếu của tất cả các cơ thể sinh vật, nó được
cấu tạo từ nhiều nguyên tố: C, H, O, N… Chủ yếu bao gồm các L-axit amin kết hợp
với nhau bằng các liên kết peptid. Tỉ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố này
trong phân tử Protein như sau: : C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%;
S: 0 – 0.24%. Ngoài các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít
các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca… (Sách Hóa sinh công nghiệp- Lê
Ngọc Tú- NXB khoa học và kó thuật HN, trang 94)
Protein có đặc tính đặc thù cao cho từng loài, từng cơ quan mô của cùng một
cá thể. Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sống.
Trong mô và tế bào của các sinh vật cũng như trong thành phần Protein (chất
đạm) tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein
(comoniac hoặc muối amonium). Để xác đònh được chúng hiện nay có nhiều
phương pháp tùy theo đối tượng khảo xác và tùy theo chiều hướng muốn khảo xác,
người ta áp dụng từng phương pháp thích hợp có thể trục tiếp hoặc gián tiếp.
Seminar này sẽ trình bày một số phương pháp dùng để đònh lượng Protein, cùng với
một số lưu ý khi sử dụng từng phương pháp cụ thể.
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


4
I

I
.
.


T
T
o
o
å
å
n
n
g
g


q
q
u
u
a
a
n
n
:
:


1

1
.
.


C
C
a
a
á
á
u
u


t
t
a
a
ï
ï
o
o


p
p
h
h
a

a
â
â
n
n


t
t
ư
ư
û
û


P
P
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
n
:

:


Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, O, N, H, một số còn chứa một
lượng nhỏ S. Tỉ lệ phần trăm khối lương các nguyên tố này trong phân tử protein
như sau: C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 – 0.24%. Ngoài các
nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P,
Fe, Zn, Cu, Mn, Ca…
Protein có thành phần phức tạp và có nhiều bật cấu trúc khác nhau, nổi bật
cấu trúc có cấu trúc và chức năng khác nhau và giữ vai trò rất quan trọng đối với
tất cả các cơ thể sinh vật.
Cấu trúc protein được chia thành 4 bậc: 1, 2, 3, 4
1
1
.
.
1
1
.
.


C
C
a
a
á
á
u
u

t
t
r
r
u
u
ù
ù
c
c


b
b
a
a
ä
ä
c
c


1
1
:
:

Là trình tự sắp xếp các gốc acid amin trong mạch polypeptide. Cấu trúc này
được giữ vững nhờ liên kết peptide (liên kết đồng hoá trò)
O O
+
H
3
N – CH – C +
+
H
3
N – CH – C
R
1
O
-
R
2

O
O O
+
H
3
N – CH – C – NH – CH – C + H
2
O
R
1
R
2

O
–

Liên kết peptide
H H H O H H H O H
– HN – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C – C – N – C –
R
1
O R
2
H R
3
O R
4
H R
5


Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


5
1
1
.
.
2
2
.
.

C
C
a
a
á
á
u
u


t
t
r
r
u
u
ù
ù
c
c


b
b
a
a
ä
ä

c
c


2
2
:
:




Là tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở gần nhau trong mạch
polypeptide. Nói cách khác nó là không gian cục bộ của từng phần trong mạch
polypeptide. Cấu trúc được làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro được tạo thành
giữa các liên kết peptide ở gần nhau cách nhau khoảng xác đònh.

Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


6


1
1
.
.
3
3
.

.


C
C
a
a
á
á
u
u


t
t
r
r
u
u
ù
ù
c
c


b
b
a
a
ä

ä
c
c


3
3
:
:




Tương tác không gian giữa các gốc
acid amin ở xa nhau trong mạch
polypeptide, là dạng cuộn lại trong không
gian của mạch polypeptide (hình dạng
chung của chuỗi polypeptide). Trong nhiều
protein hình cầu có chứa các gốc Cys, sự
tạo thành các liên kết disunfua giữa các
gốc Cys ở xa nhau trong mạch polypeptide,
làm cho mạch bò cuộn lại đáng kể. Các liên kết khác như liên kết Vandecvan,liên
kết tónh điện, liên kết hidro giữa các mạch bên của các gốc acid amin … đều tham
gia làm bền cấu trúc bậc 3. Kết quả nguyên cứu nhiều protein cho thấy chính trình
tự sắp xếp các gốc acid amin trong chuỗi polypeptide chứa những thông tin cần
thiết để hình thành cấu trúc bậc 3.
1
1
.
.

4
4
.
.


C
C
a
a
á
á
u
u


t
t
r
r
u
u
ù
ù
c
c


b
b

a
a
ä
ä
c
c


4
4
:
:




Đối với các phân tử protein bao gồm 2 hay nhiều chuỗi polypeptide hình cầu,
tương tác không gian giữa các chuỗi trong phân tử gọi là cấu trúc bậc 4. Mỗi chuỗi
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


7
polypeptide gọi là”phần dưới đơn vò ” chúng gắn với nhau nhờ liên kết hidro, lực
Vandecvan giữa các nhóm phân bố trên bề mặt của các “phần dưới đơn vò”.
I
I
I
I
.
.

C
C
a
a
ù
ù
c
c


p
p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g


p
p
h
h

a
a
ù
ù
p
p


đ
đ
ò
ò
n
n
h
h


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g

p
p
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
n


1
1
.
.


Đ
Đ
ò
ò
n
n

h
h


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g


n
n
i
i
t
t
ơ
ơ


t
t

o
o
å
å
n
n
g
g


s
s
o
o
á
á


b
b
a
a
è
è
n
n
g
g

p
p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g


p
p
h
h
a
a
ù
ù
p
p


K
K
j
j

e
e
l
l
d
d
a
a
h
h
l
l


Theo nguyên tắc Protein được đònh lượng bằng cách xác đònh lượng nitơ tổng
số và kết quả nhân với 6.25, như thế nghóa là coi Protein luôn chứa 16% là nitơ (vì
trong phân tử Protein thì hàm lượng nitơ tương đối cao và khá ổn đònh khoảng 15 –
17%).
Trong thực tế bên cạnh Protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơ
như: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric….Các chất này gọi là nitơ phi Protein. Vì
vậy trong trường hợp này cần phải xác đònh nitơ tổng số và nitơ phi Protein sau đó
xác đònh nitơ Protein.
Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
 Nitơ protein = Nitơ tổng số – Nitơ phi protein
1
1
.
.
1
1

.
.


Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
h


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g


N
N

i
i
t
t
ơ
ơ


t
t
o
o
å
å
n
n
g
g


s
s
o
o
á
á


t
t

h
h
e
e
o
o


p
p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g


p
p
h
h
a
a
ù
ù

p
p


K
K
j
j
e
e
l
l
d
d
a
a
h
h
l
l


N
N
g
g
u
u
y
y

e
e
â
â
n
n


t
t
a
a
é
é
c
c
:
:




Quá trình gồm 2 giai đoạn:
 Giai đoạn vô cơ hóa: (quá trình tiến hành trong tủ hotte)
nhiệt độ cao và dưới tác dụng của H
2
SO
4
thì các hợp chất có chứa nitơ sẽ bò
phân hủy và bò oxi hóa đến CO

2
và H
2
O , còn nitơ chuyển thành amoniac (NH
3
) rồi
kết hợp với H
2
SO
4
tạo thành muối amoni sulphate
 Giai đoạn cất đạm: (quá trình xảy ra trong máy cất đạm)
Sau khi vô cơ hóa ta đuổi NH
3
ra khỏi dunh dòch bằng NaOH.
(NH
4
)
2
SO
4
+ NaOH  Na
2
SO
4
+ NH
3
+ H
2
O

Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


8
Lượng NH
3
sinh ra được lôi cuốn bằng máy Parmas và được dẫn đến một
erlen có chứa một lượng thừa H
2
SO
4
đã biết chính xác nồng độ. Lúc này NH
3
sẽ tác
dụng với H
2
SO
4
chuyển thành (NH
4
)
2
SO
4
.
NH
3
+ H
2
SO

4
 (NH
4
)
2
SO
4
+ H
2
SO
4
dư
Sau đó đi chuẩn độ lượng H
2
SO
4
còn lại bằng dung dòch NaOH qua đó tính
được lượng nitơ có trong mẫu.
NaOH + H
2
SO
4
 Na
2
SO
4
+ H
2
O
C

C
a
a
ù
ù
c
c
h
h


t
t
i
i
e
e
á
á
n
n


h
h
a
a
ø
ø
n

n
h
h
:
:


Nguyên liệu, hóa chất, thiết bò:
 Nguyên liệu: các mẫu cần xác đònh hàm lượng Protein, nếu nguyên liệu khô
cần được sấy khô tuyệt đối (105
o
C, trong 30 phút).
 Hóa chất: hỗn hợp xúc tác K
2
SO
4
/CuSO
4
(9:1), H
2
SO
4
đặc, H
2
SO
4
0,01N,
H
3
PO

3
2%, NaOH 0,01N, nước cất vô đạm , cồn 96
o
, acid tricloacetic (TCA),
thuốc thử đỏ metyl.
 Thiết bò: bếp đun, máy cất đạm Parmas Warger.
(chen hình vào)
Quá trình được thực hiện qua các bước.
 Bước 1: vô cơ hóa mẫu (được tiến hành trong tử hotte để tránh khí độc SO
2
,
CO
2
).
Nếu mẫu khô thì cân 0,1 -0,3g mẫu rồi dùng một ống giấy (không tro) cuộn
tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào đó vài giọt nước cất vô
đạm để thấm ước bột. Nếu mẫu là chất lỏng thì dùng pipet lấy 2 – 5 ml,nếu nước
quả hộp thì nên lấy 10 – 20ml. tiếp tục cho 0,5g hỗn hợp xúc tácK
2
SO
4
/CuSO
4

(hoặc selen, hay H
2
O
2
30%, hay HCLO
4

70%) và 10ml H
2
SO
4
đặc.
Để bình Kjeldahl trên bếp điện đặt trong tủ hotte và đun cho đến khi dung
dòch trở nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt là được. Lấy ra để nguội.
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


9
Chuyển sang bình đònh mức 100ml, tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nước cất vô
đạm và đònh mức đến vạch đònh mức.
 Bước 2: Cất đạm
Sơ đồ máy cất đạm
Rửa máy: cho vào bình A khoảng 3/2 thể tích bình, đun sôi bình và mở nước
vào ống làm lạnh D, cả 3 khóa điều đóng, sau đó cho lên phiểu C một ít nước cất
(khoảng 10 ml) và cho chảy xuống bình B rồi khóa van 2 lại. Hơi nước của bình A
sẽ từ từ qua erlen E, cứ để như vậy cho đến khi ở E có khoảng 5ml nước. Ngắt điện
ở bình A, hơi nước trong máy sẽ nguội lại,làm giảm áp xuất ở A và B do đó nước
trong bình B sẽ rút qua G. khi nước rút hết, thêm nước vào phiễu C và mở van 2
cho nước chảy vào B, kế đó nước sẽ rút qua G. ta có thể làm như vậy vài lần. Nếu
nước ở bình G đầy thì mở van 3 cho nước rút đi. Khóa van 3 và 2

lại.
Cất đạm: lấy vào erlen E (erlen 250ml) 10 - 20ml dung dòch H
2
SO
4
0,01N

và 3 giọt thuốc thử mêtyl đỏ, dung dòch có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu
mút của ốngsinh hàn D ngập trong dung dòch H
2
SO
4
0,01N của erlen E
Hút 10ml dung dòch đã vô cơ hóa và đã pha loãng cho lên phiễu C. đun sôi
bình A, mở van 2 để dung dòch này chảy từ từ xuống B, đóng van 2 lại. Đổ nước cất
vào và tráng C, cũng mở van 2 thật nhẹ nhàng để nước chảy từ từ xuống B từng
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


10
giọt cho đến khi mực nước trong C xuống gần sát tới van 2 thì khóa van 2 lại. Rửa
C một lần nữa với thao tác tương tự như trên.
Thêm vào phiễu C 10ml NaOH đậm đặc. Mở van 2 từ từ để cho NaOH chảy
xuống C từng giọt một. Nếu nước trong B trào mạnh quá thì khóa van 2 lại, rồi tiếp
tục cho chảy từ từ đến khi NaOH chảy gần hết xuống B.
Tráng phiễu C hai lần với một ít nước cất, chỉ cho nước chảy xuống gần sát tới kẹp
2 mà thôi.
Quá trình kết thúc sau khoảng 25 phút sau đó hạ erlen E xuống sao cho đầu
mút của ống sinh hàn nằm rong không khí, đun tiếp 3 phút nữa. Rửa đầu nhọn của
ống làm lạnh D bằng một tia nước của bình xòt. Lấy erlen E ra rồi rửa lại máy vài
lần như trên rồi chuẩn độ lượng H
2
SO
4
thừa bằng dung dòch chuẩn NaOH 0,01N.
 Bước 3: chuẩn độ
Lượng H

2
SO
4
còn dư trong bình E được chuẩn độ bằng NaOH 0,01N. quá
trình chuẩn độ kết thúc khi dung dòch chuyển từ đỏ sang màu nhạt.
Xác đònh hệ số hiệu chỉnh x: lấy 3 erlen cho vào mỗi erlen 20ml H
2
SO
4
0,01N và
vài giọt đỏ metyl. Sau đó chuẩn độ bởi NaOH 0,01N lấy giá trò trung bình của 3 lần
chuẩn độ
T
T
í
í
n
n
h
h


k
k
e
e
á
á
t
t

q
q
u
u
a
a
û
û
:
:


Hệ số hiện chỉnh x sẽ được tính theo công thức sau:
x là tỉ số giữa thể tích H
2
SO
4
0,01N và thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ.
Hay là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ tinh toán cuả NaOH.
Hàm lượng nitơ trong mẫu đượctinh1 theo công thức:
X=
 
01
* *0,0014*100*100
10*
v v x
m


Trong đó: X: % khối lượng nitơ trong mẫu
V
o
: số ml H
2
SO
4
đem hấp thụ NH
3

V
1
: số ml NaOH 0,01N tiêu tốn khi khi chuẩn độ H
2
SO
4
thừa
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


11
m: khối lượng mẫu đem vô cơ hóa
0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1ml H
2
SO
4
0,1N
Nếu là mẫu lỏng:
N/l=

 
4
1
1000
14* * *10 *
o
m
v v x
v



Trong đó: V
m
là thể tích mẫu
*Ghi chú: Nếu chuẩn độ trực tiếp với hệ chuẩn H
2
SO
4
– H
3
BO
3
Sử dụng hệ chuẩn H
2
SO
4
– H
3
BO

3
để xác đònh hàm lượng nitơ tiện lợi và
tránh được những sai số về sự thay đổi nồng độ đương lượng của kiềm hoặc không
khí.
Cách tiến hành:
 Nguyên liệu và hóa chất:

H
3
BO
3
2%, thuốc thử Tarshiro, H
2
SO
4
0,01N, các hóa chất dùng cho việc vô
cơ hóa mẫu và cất đạm.
Cho vào bình hứng 2ml H
3
BO
3
2%, thêm một ít nước cất sao cho dd H
3
BO
3

ngập đầu mút của ống sinh hàn. Trong bình hứng, dd H
3
BO
3

tự phân li:
H
3
BO
3
 HBO
2
+ H
2
O
Khi cất đạm NH
3
bò kiềm đẩy khỏi (NH4)
2
SO
4
theo hệ thống sinh hàn vào
bình hứng, phản ứng với HBO
2
:
NH
4
OH + HBO
2
 NH
4
+
+ BO
2
-

+ H
2
O
BO
2
-
là một bazơ mạnh làm dd của bình hứng chuyển từ màu tím đỏ sang
màu xanh lá mạ. Lượng BO
2
-
được tạo thành tương đương lượng NH
3
bò đẩy ra
trong quá trình cất đạm. Xác đònh lượng BO
2
-
bằng cách độ ngược với H
2
SO
4

0,01N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dòch chuyển từ màu xanh lá mạ sang
màu tím đỏ.
BO
2
-

+ H
+
 HBO

2

Tính kết quả:
Hàm lượng N%(mg N trong 100g mẫu) sẽ được tính theo công thức sau:
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


12
*0,14 *100
(%)
*
t
m
VV
N
Vm



Trong đó: V
t
– lượng H
2
SO
4
0,01N để chuẩn độ

BO
2
-

(ml)
V – số mol dd mẫu pha loãng (100ml).
V
m
– số ml dd mẫu cất đạm.
m – trọng lượng mẫu đem vô cơ hóa (mg).
0,14 – số mg N tương đương 1ml H
2
SO
4
0,01N.
1
1
.
.
2
2
.
.


Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
h

l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g


n
n
i
i
t
t
ơ
ơ


p
p
h
h
i

i


P
P
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
n
:
:


N
N
g
g
u
u
y
y
e

e
â
â
n
n


t
t
a
a
é
é
c
c
:
:


Dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitơ phi Protein.
Tuy nhiên trong dòch chiết vẫn còn lẫn một vài loại Protein. Vì vậy cần dùng các
chất kết tủa để tách riêng phần Protein hòa tan trong quá trình chiết rút.
Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: Aceton, muối kim loại nặng,
acid, thẩm tích đối nước … Nhưng thông dụng nhất là dùng các chất kết tủa sau:
TCA 10 – 20% (acidtricloacetic), Pb(CH
3
COO)
2
10 – 15%, CuSO
4

10% trong hổn
hộp với NaOH 10% với tỉ lệ 1:1.
Lọc kết tủa Protein, rửa kết tủa nhiều lần ta được dung dòch phi Protein. Vô
cơ hóa dung dòch, cất đạm… tương tự đònh lượng nitơ tổng số.
C
C
a
a
ù
ù
c
c
h
h


t
t
i
i
e
e
á
á
n
n


h
h

a
a
ø
ø
n
n
h
h
:
:


Nguyên liệu: các mẫu cần được xác đònh hàm lượng phi Protein
Hóa chất: cồn 70
o
và các chất cần cho việc đònh lượng Protein theo phương
pháp Kjeldahl.
Cân chính xác 5 – 10g mẫu nguyên liệu đã nghiền nhuyễn, cho vào cối sứ
hay thủy tinh, nghiền lẫn với etanol 70
o
(tỉ lệ thể tích : nguyên liệu là 1:4 nếu mẫu
tươi và 1:8 nếu mẫu khô). Nghiền trong 20 phút, sau đó để ngâm khoảng 40 – 80
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


13
phút và khuấy liên tục. Lọc tách bã hay ly tâm 5000 vòng/phút, sau đó đổ phần bã
vào một becher 250ml còn phần bã lấy ra cối chiết lại bằng cồn 70
o
một lần nữa

theo tỉ lệ 1:4 và nhiều lần bằng nước cất vô đạm cho đến khi nước chiết không còn
phản ứng với thuốc thử ninhydrin. Dồn tất cả các dòch chiết lại và đem kết tủa
Protein, sau đó đem lọc trong đó cặn chứa nitơ Protein, còn dòch lọc chứa nitơ phi
Protein. Đem vô cơ hóa dòch lọc và tiến hành xác đònh hàm lượng ni tơ theo phương
pháp Kjeldahl.
1
1
.
.
3
3
.
.


Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
h


l
l
ư
ư
ơ

ơ
ï
ï
n
n
g
g


P
P
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
n


t
t
r
r
o

o
n
n
g
g


n
n
g
g
u
u
y
y
e
e
â
â
n
n


l
l
i
i
e
e
ä

ä
u
u
:
:


Có thể tiến hành theo 2 cách sau:
cách 1: xác đònh trực tiếp
Xác đònh hàm lượng ni tơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl sau đó lấy kết
quả nhân với 6,25.
Protein = Nitơ
Protein
* 6,25
Cách 2: xác đònh gián tiếp
Nitơ
tổng số
= Nitơ
Protein
+ Nitơ
phi Protein

Ta xác đònh nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl và nitơ phi Protein sau
đó tính nitơ Protein.
Nitơ
Protein
= Nitơ
tổng số
- Nitơ
phi Protein

 Protein = Nitơ
Protein
* 6,25
2
2
.
.


Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
h


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n

g
g


P
P
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
n


b
b
a
a
è
è
n
n
g
g

p
p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g


p
p
h
h
a
a
ù
ù
p
p


s
s

o
o


m
m
a
a
ø
ø
u
u


2
2
.
.
1
1
.
.


Đ
Đ
ò
ò
n
n

h
h


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g


P
P
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i

n
n


t
t
h
h
e
e
o
o


p
p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g


p
p

h
h
a
a
ù
ù
p
p


B
B
i
i
u
u
r
r
e
e
.
.


N
N
g
g
u
u

y
y
e
e
â
â
n
n


t
t
a
a
é
é
c
c
:
:


Dựa vào phản ứng tạo màu giữa Protein và Cu
2+
trong môi trường kiềm tạo
phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


14

Hình : Phản ứng Biure
Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với lượng Cu và số lượng liên kết
peptid trong chuỗi Polypeptid.
C
C
a
a
ù
ù
c
c
h
h


t
t
i
i
e
e
á
á
n
n


h

h
a
a
ø
ø
n
n
h
h
:
:


Chuẩn bò nguyên liệu và hóa chất: dung dòch Albumin tiêu chuẩn 1%
Chuẩn bò thuốc thử Biure:
Cân chính xác 1,5g CuSO
4

6g Tartrat Kilium và Natrium


500ml nước cất
Cho vào bình lắc cho tan hoàn toàn và đònh mức đến 1000ml
Lập đồ thò chuẩn:
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:

Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


15

STT
Protein1%(ml)
H
2
O(ml)
Nồng độ
Protein
(mg/ml)
Thuốc thử
Biure (ml)
OD
1
0,0
1,0
0
5

2
0,2
0,8
2
5

3
0,4
0,6
4
5

4
0,6
0,4
6
5

5
0,8
0,2
8
5

6
1,0
0,0
10
5


Bảng 3: lập đồ thò chuẩn nồng độ Protein
Lắc đều các ống nghiệm và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đem đo
độ hấp thu của các ống ở bước sóng 540nm và ghi nhận mật độ quang.
Chuẩn bò dung dòch nghiên cứu.
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dòch nghiên cứu và 4ml thuốc thử Biure lắc

đều và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem đo mật độ quang ở bước
sóng 540nm. Ghi nhận mật độ quang.
T
T
í
í
n
n
h
h


t
t
o
o
a
a
ù
ù
n
n
:
:


Lập đồ thò chuẩn của các ống nghiệm từ 26. Trò số mật độ quang của các
ống nghiệm từ 26 bằng mật độ mật độ quang của các ống nghiệm từ 26 đã
được đo ở trên trừ cho mật độ quang của ống 1. Sau đó lập đồ thò biểu diễn sự biến
thiên của mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn.

Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trò số mật
độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong
mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghiệm.
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


16
Đ
Đ
o
o
ä
ä


n
n
h
h
a
a
ï
ï
y
y


v
v
a

a
ø
ø


k
k
h
h
a
a
û
û


n
n
a
a
ê
ê
n
n
g
g


ư
ư
ù

ù
n
n
g
g


d
d
u
u
ï
ï
n
n
g
g
:
:


Phương pháp này nhạy hơn phương pháp Lowry nhưng không bằng phương
pháp Bradford vì nó được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lượng Protein
tương đối lớn 20 – 2,000µg/ml.
2
2
.
.
2
2

.
.


Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
h


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g


P
P

r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
n


b
b
a
a
è
è
n
n
g
g


p
p
h
h

ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g


p
p
h
h
a
a
ù
ù
p
p


L
L
o
o
w
w
r
r

y
y


(
(
B
B
i
i
u
u
r
r
e
e


c
c
a
a
û
û
i
i


t
t

i
i
e
e
á
á
n
n
)
)
:
:


N
N
g
g
u
u
y
y
e
e
â
â
n
n

t
t
a
a
é
é
c
c
:
:


Dựa vào phản ứng màu của Protein và thuốc thử Folin. Phương pháp này sử
dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc
tyrosin, tryptophan, hystidin, để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu cực đại
ở bước sóng 750nm và dựa vào đường chuẩn Protein để từ đó dònh lượng hàm
lượng Protein. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein.

Hình : Phản ứng Lowry
T
T
i
i
e
e
á
á
n
n

h
h
a
a
ø
ø
n
n
h
h


Chuẩn bò nguyên liệu, hóa chất, thiết bò
 Dung dòch Protein chuẩn có 10 – 100 µg Protein/1ml
 Dung dòch nghiên cứu có 50 - 300 µg Protein/1ml
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


17
 Dung dòch chuẩn: Albumin 0,1%, thường là huyết thanh bò (BSA –
bovine serum albumin).
Hóa chất : pha
 Dung dòch A : Na
2
CO
3
2% hòa trong NaOH 0,1N
 Dung dòch B : CuSO
4

.5H
2
O 0,5% pha trong dung dòch natri citrat 1%
 Dung dòch C : hỗn hợp dung dòch A và dung dòch B với tỉ lệ 49:1
 Dung dòch Folin
Cách pha dung dòch Folin: Pha trong bình cầu có V= 2l
Cân 100g natri tungstat (natri wonframat (Na
2
WO
4
.2H
2
O) và 25g natri
molypdate ( Na
2
MoO
4
.2H
2
O). Thêm vào đó 700ml nước cất và 50ml acid orto
phosphoric 85% ( H
3
PO
4
) .Khuấy cho tan và thêm vào đó 100ml HCl đậm đặc và
tinh khiết rồi tiếp tục khuấy. Đun sôi hỗn hợp có ống sinh hàn làm lạnh hồi lưu
trong 10h. Sau khi đun hồi lưu thêm vào đó 150g lithium sulfat ( Li
2
SO
4

.H
2
O) tinh
khiết. Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi cho vào đó 5 – 10 ml nước Brom khuấy
đều và đun sôi ở tủ hotte 15 phút để đuổi lượng Brom thừa. Dung dòch phải có màu
vàng, nếu dung dòch có màu xanh thì phải xử lý với Brom lần thứ 2 sau khi làm
nguội dung dòch ở nhiệt độ thường. Để vào bình đònh mức 1l và đònh mức đến vạch.
Có thể lọc nếu dung dòch không trong. Đựng trong chai thủy tinh nút nhám có màu
nâu, cất giữ ở nơi lạnh, sau 2 – 3 tháng, dung dòch chuyển sang màu xanh thì thêm
vài giọt Brom và đun sôi 15 phút dung dòch lại có màu vàng trở lại. Trước khi dùng
phải pha loãng thuốc thử bằng nước cất đến nồng độ 0,5N.
Thiết bò : máy so màu quang điện.
Tiến hành:
Chuẩn bò mẫu thí nghiệm nghiên cứu:
Cho vào ống nghiệm 1ml dung dòch mẫu ,thêm vào ống nghiệm 4ml dung
dòch C, lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm 0,5ml thuốc
thử Folin, lắc đều và để yên trong 30 – 90 phút, lúc này dung dòch sẽ chuyển từ
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


18
màu vàng sang màu xanh. Sau đó đem đo độ hấp thu ở bước sóng 750nm và ghi
nhận mật độ quang học của dung dòch nghiên cứu
Thực hiện tương tự với 1 ống đối chứng bằng cách thay 1ml dung dòch mẫu
bằng 1ml nước cất.
Lập đồ thò chuẩn
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:
ng số
Protein
0,1% (ml)

Nước cất
(ml)
Nồng độ
Protein
(mg/ml)
Dung dòch
C (ml)
Thuốc thử
Folin (ml)
OD
1
0,0
10
0
2
0,5

2
0,5
9,5
50
2
0,5

3
1,0
9,0
100
2
0,5

4
1,5
8,5
150
2
0,5

5
2,0
8,0
200
2
0,5

6
2,5
7,5
250
2
0,5


Bảng 1: lập đồ thò nồng độ Protein
Trình tự và thao tác tương tự như phần dung dòch thí nghiệm. Sau đó đem đo
độ hấp thu của các ống ở bước sóng 750nm. Từ đó xây dựng đồ thò chuẩn.
T
T
í
í

n
n
h
h


t
t
o
o
a
a
ù
ù
n
n
:
:


Từ bảng trên khi lập đồá thò thì ta lấy trò số mật độ quang các ống từ 2 – 6 trừ
đi mật độ quang của ống 1. Đó chính là độ hấp thu thực sự của dung dòch Protein
chuẩn, từ đó ta lập đồ thò biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ
Protein chuẩn. Với trục hoành là nồng độ Protein và trục tung là mật độ quang.
Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trò số mật
độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong
mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghiệm.
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam

19
Đ
Đ
o
o
ä
ä


n
n
h
h
a
a
ï
ï
y
y


v
v
a
a
ø
ø


k

k
h
h
a
a
û
û


n
n
a
a
ê
ê
n
n
g
g


ư
ư
ù
ù
n
n
g
g

d
d
u
u
ï
ï
n
n
g
g
:
:


Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác đònh dung dòch
mẫu chứa vài chục µg Protein thường nhạy cảm trong khoảng từ 5 – 2,000mg
Protein. Tuy nhiên phương pháp này không dùng để đònh lượng các Protein không
chứa acid amin vòng thơm như gelatin, đối với những hợp chất có chứa ion kali thì
tạo kết tủa ảnh hưởng đến kết quả.
2
2
.
.
3
3
.
.

Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
h


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g


P
P
r
r
o
o

t
t
e
e
i
i
n
n


t
t
h
h
e
e
o
o


p
p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n

g
g


p
p
h
h
a
a
ù
ù
p
p


B
B
r
r
a
a
d
d
f
f
o
o
r
r

d
d


(
(
C
C
o
o
o
o
m
m
a
a
s
s
s
s
i
i
e
e


B
B
r
r

i
i
l
l
l
l
i
i
a
a
n
n
t
t


B
B
l
l
u
u
e
e


G
G

-
-


2
2
5
5
0
0
)
)
:
:




N
N
g
g
u
u
y
y
e
e
â
â

n
n


t
t
a
a
é
é
c
c
:
:


Dựa phản ứng màu của Protein với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant
Blue G - 250) và cả khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Trong môi
trường axit Coomassie Brilliant Blue G - 250 liên kết chặt chẽ với Protein, tương
tác với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử Protein
làm dung dòch có màu xanh. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein trong dung
dòch. Dựa vào đường chuẩn của Protein suy ra hàm lượng Protein trong mẫu.

Phản ứng cho màu Coomassie
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


20
T
T

i
i
e
e
á
á
n
n


h
h
a
a
ø
ø
n
n
h
h
:
:


Hóa chất: Chuẩn bò dung dòch mẫu Protein cần xác đònh.
Dung dòch Albumin chuẩn 1mg/ml
Cách pha dung dòch Albumin:
Cân chính xác 10mg Albumin pha trong 1ml nước cất lắc đều cho tan hết và
giữ ở 20
o

C. Khi dùng pha loãng 100 lần để được dung dòch Albumin 0,1mg/ml.
Pha thuốc thử Bradford:
Cân 0,001g Coomassie Brilliant Blue và 4,7g Ethanol 99
o
và 8,5g Acid
Phosphoric 85%, đònh mức tới 100ml bằng nước cất. Đựng trong chai có nút đậy
kín.
Thiết bò: máy đo màu quang điện.
Tiến hành:
Lập đồ thò chuẩn:
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:
ng số
Dung dòch Albumin
0.1mg/ml (ml)
Nước cất
(ml)
Nồng độ Albumin
(µg)
Thuốc thử
Bradford
(ml)
1
0
1
0
5
2
0,1
0,9
10

5
3
0,2
0,8
20
5
4
0,3
0,7
30
5
5
0,4
0,6
40
5
6
0,5
0,5
50
5

Bảng 2: lập đồ thò chuẩn dung dòch Albumin
Lắc điều và để yên một lúc sau đó đem đo độ hấp thu của các ống ở bước
sóng 595nm. Từ đó xây dựng đồ thò chuẩn.
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


21
Chuẩn bò ống thí nghiệm:

Ống thí nghiệm: 0,1ml dd Protein + 5ml dd Bradford
Ống đối chứng: 0,1ml nước cất + 5ml dd Bradford
(Có thể thay nước cất bằng NaCl 0,15M)
Đem đo độ hấp thu ở bước sóng 595nm và ghi nhận mật độ quang (mật độ
quang phải nằm trong khoảng của đường chuẩn).
T
T
í
í
n
n
h
h


t
t
o
o
a
a
ù
ù
n
n
.
.


Từ bảng trên thì ống 1 là ống đối chứng ,vì vậy khi lập đồá thò thì ta lấy trò số

mật độ quang các ống từ 2 – 6 trừ đi mật độ quang của ống 1. Đó chính là độ hấp
thu thực sự của dung dòch Protein chuẩn,từ đó ta lập đồ thò biểu diễn sự biến thiên
của mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn. Với trục hoành là nồng độ Protein
và trục tung là mật độ quang.
Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trò số mật
độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong
mẫu suy ra lượng Protein có trong mẫu thí nghiệm.
Đ
Đ
o
o
ä
ä


n
n
h
h
a
a
ï
ï
y
y


v
v
a

a
ø
ø


k
k
h
h
a
a
û
û


n
n
a
a
ê
ê
n
n
g
g


ư
ư
ù

ù
n
n
g
g


d
d
u
u
ï
ï
n
n
g
g


Phương pháp này dùng cho Protein tan trong nước, phản ứng xảy ra ở nhiệt
độ phòng. Phương pháp này nhạy hơn 2-3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh và
đơn giản hơn nhiều vì nó cho phép xác đònh tới vài µg protein/ml. đồng thời làm
giảm ảnh hưởng của muối, đệm, các chất khử…Tuy nhiên phương pháp này không
dùng với những chất có chứa surfactants vì gây ra kết tủa của các chất phản ứng.
Những chất có tính kiềm mạnh làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết quả. Màu
Coomassie làm bẩn cuvet thạch anh nên chỉ dùng cuvet thủy tinh để đo mật độ
quang.
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam

22
3
3
.
.


Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
h


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g

P
P
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
n


b
b
a
a
è
è
n
n
g
g


p

p
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g


p
p
h
h
a
a
ù
ù
p
p


d
d
u
u
ø

ø
n
n
g
g


B
B
i
i
c
c
i
i
n
n
c
c
h
h
o
o
n
n
i
i
n
n
i

i
c
c


A
A
c
c
i
i
d
d


(
(
B
B
C
C
A
A
)
)
:
:


3

3
.
.
1
1
.
.


N
N
g
g
u
u
y
y
e
e
â
â
n
n


t
t
a
a
é

é
c
c
:
:


Dựa vào phản ứng giữa Protein và thuốc thử BCA trong môi trường kiềm tạo
màu đỏ tía (tím), có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 562nm.

Hình : Phản ứng cho axit bincinchoninic (BCA)
Đầu tiên Protein sẽ khử Cu
2+
thành Cu
+
và tạo thành phức có màu xanh trong
môi trường kiềm. Sau đó hai phân tử BCA sẽ kết hợp với Cu
+
được tạo ra ở trên
cho màu đỏ tía (tím) và có độ hấp thu ở bước sóng 562nm.
3
3
.
.
2
2
.
.

C
C
a
a
ù
ù
c
c
h
h


t
t
i
i
e
e
á
á
n
n


h
h
a
a
ø
ø

n
n
h
h
:
:


Cách tiến hành cũng tương tự phương pháp Biure nhưng chỉ thay thuốc thử
Biure thành thuốc thử BCA.
3
3
.
.
3
3
.
.


T
T
í
í
n
n
h
h

k
k
e
e
á
á
t
t


q
q
u
u
a
a
û
û
:
:


Cách tính kết quả cũng tương tự phương pháp Biure.
3
3
.
.
4
4
.

.


Đ
Đ
o
o
ä
ä


n
n
h
h
a
a
ï
ï
y
y


v
v
a
a
ø
ø

k
k
h
h
a
a
û
û


n
n
a
a
ê
ê
n
n
g
g


ư
ư
ù
ù
n
n
g

g


d
d
u
u
ï
ï
n
n
g
g
:
:


Phương pháp này nhạy gấp 100 lần so với phương pháp Biure. Nó phát hiện
Protein tương đối lớn 20 – 2,000µg. Nhưng đối với những tạp chất có hàm lượng Cu
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


23
dù ít cũng bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả và những hợp chất hữu cơ
trong phân tử có các aminoacid, Cystine, Cystein, Tyrosine, Tryptophan cũng bắt
màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả.
4
4
.
.

Đ
Đ
ò
ò
n
n
h
h


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g


P
P
r
r

o
o
t
t
e
e
i
i
n
n


b
b
a
a
è
è
n
n
g
g


p
p
h
h
ư
ư

ơ
ơ
n
n
g
g


p
p
h
h
a
a
ù
ù
p
p


q
q
u
u
a
a
n
n
g
g

p
p
h
h
o
o
å
å


4
4
.
.
1
1
.
.


N
N
g
g
u
u
y
y

e
e
â
â
n
n


t
t
a
a
é
é
c
c
:
:


Dựa vào sự hấp thụ tia cực tím ở bước sóng 280nm của Protein. Các Protein
hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acidamin Tryptophan,
Tyrosin và một phần là Phenylalanin. Sự hấp thu ở bước sóng 280nm của chúng
cũng thay đổi tùy loại Protein nhưng hệ số tắc đo được cho mỗi Protein cho phép
tính nồng độ của Protein tinh sạch (hệ số tắc là độ hấp thụ của dd Protein 1% với
đường truyền sóng qua 1cm).

Protein
Hệ số tắt
Protein

Hệ số tắt
Protein
Hệ số tắt
IgG
13,6
Chuỗi γ
13,7
Oncanavalin A
120
IgM
11,8
Chuỗi µ
13,9
Lactin Lens
Calinaris
12.5
IgA
13,2
Chuỗi 
12,3
BSA
6.7
IgD
15,3
Chuỗi nhẹ
12,3


Bảng 3: Hệ số tắt của các loại Protein liên quan với hệ miễn dòch ở bước sóng
280nm

4
4
.
.
2
2
.
.


C
C
a
a
ù
ù
c
c
h
h


t
t
i
i
e
e
á
á

n
n


h
h
a
a
ø
ø
n
n
h
h
:
:


Nguyên liệu: Dung dòch Protein để đo, đệm hòa tan Protein
Thiết bò: Máy đo quang phổ UV có Cuvet thạch anh đường truyền sóng là 1cm
Quá trình gồm các bước sau:
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


24
Bước 1: Ly tâm mẫu để loại bỏ các phân tử hoặc phức hợp khác có trong thể
huyền phù. Lấy dòch nổi để xác đònh mật độ quang học.
Bước 2: Chỉnh máy quang phổ ở bước sóng 280nm và điều chỉnh độ hấp thụ
về 0 với cuvet chứa đệm.
Bước 3: Đo mẫu và đọc độ hấp thụ của mẫu. Nếu giá trò thu được > 2,0 thì

pha loãng mẫu (1/5 hoặc 1/10) hoặc đường sáng truyền ngắn hơn (2mm) cho đến
khi số đọc được nằm trong khoảng 0,5 đến 1,5.
Bước 4: Lặp lại bước 2 và 3 ở bước sóng 260nm.
Bước 5: Tính tỉ số hấp thụ 260nm/280nm. Tỉ số này nên nhỏ hơn 0,6. Nếu lớn
hơn 0,6 thì Protein không sạch có lẫn các tạp chất khác đặc biệt với acid nucleic.
4
4
.
.
3
3
.
.


T
T
í
í
n
n
h
h


k
k
e
e
á

á
t
t


q
q
u
u
a
a
û
û
:
:


Nồng độ Protein =
độ hấp thụ ở 280nm
hệ số tắt ở 280nm

Với một hỗn hợp các Protein hoặc với bất kỳ một loại Protein nào mà không
biết hệ số tắc thì tính như sau:
Nồng độ Protein = (1,55 x Độ hấp thụ ở 280nm) – (0,77 x Độ hấp thụ ở 260nm)
Đơn vò: mg/ml
Có thể phỏng đoán lượng acid nucleic dựa vào (độ hấp thu ở 280nm/độ hấp
thu ở 260nm).
4
4
.

.
4
4
.
.


Đ
Đ
o
o
ä
ä


n
n
h
h
a
a
ï
ï
y
y


v
v
a

a
ø
ø


k
k
h
h
a
a
û
û


n
n
a
a
ê
ê
n
n
g
g


ư
ư
ù

ù
n
n
g
g


d
d
u
u
ï
ï
n
n
g
g
:
:


Đây là phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ Protein trong dung dòch.
Phương pháp này không dùng được cho các dung dòch có nồng độ Protein thấp
(dưới 0,05- 0,1 mg/ml) hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng vùng cực
tím (ví dụ: đệm, acid nucleic và một số chất béo) hoặc khi Protein ở trong dung
dòch huyền phù.
Các phương pháp đònh lượng protein. GVHD: TS. Trần Thò Bích Lam


25

So với phương pháp so màu thì phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn,
mẫu dùng lại thường ổn đònh hóa phần lớn Protein.
5
5
.
.


P
P
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g


p
p
h
h
a
a
ù
ù

p
p


h
h
u
u
y
y
ø
ø
n
n
h
h


q
q
u
u
a
a
n
n
g
g

O
O
-
-
P
P
h
h
t
t
h
h
a
a
l
l
a
a
l
l
d
d
e
e
h
h
y
y
d
d

e
e


(
(
O
O
P
P
A
A
)
)
:
:


5
5
.
.
1
1
.
.


N
N

g
g
u
u
y
y
e
e
â
â
n
n


t
t
a
a
é
é
c
c
:
:


Dựa vào phản ứng giữa O-Phthalaldehyde (OPA) với các amin có mặt trong
chuỗi polypeptide (từ đầu đến cuối mạch kể cả chính và phụ). Phản ứng xảy ra
nhanh trong sự có mặt của mercaptoethanol tạo sản phẩm huỳnh quang có màu
xanh và hấp thụ cực đại ở bước sóng 340nm -450nm.

5
5
.
.
2
2
.
.


Đ
Đ
o
o
ä
ä


n
n
h
h
a
a
ï
ï
y
y

v
v
a
a
ø
ø


k
k
h
h
a
a
û
û


n
n
a
a
ê
ê
n
n
g
g

ư
ư
ù
ù
n
n
g
g


d
d
u
u
ï
ï
n
n
g
g
:
:


Độ nhạy rất cao đạt tới 50ng/ml. Có thể phát hiện ra đúng đắn peptide thậm
chí nhỏ. Phương pháp này sử dụng cho những chất không chứa các amin khác với
các amin trong chuỗi polypeptide.
6
6
.

.


P
P
h
h
ư
ư
ơ
ơ
n
n
g
g


p
p
h
h
a
a
ù
ù
p
p


đ

đ
ò
ò
n
n
h
h


l
l
ư
ư
ơ
ơ
ï
ï
n
n
g
g


a
a
m
m
o
o
n

n
i
i
a
a
c
c


6
6
.
.
1
1
.
.




N
N
g
g
u
u
y
y
e

e
â
â
n
n


t
t
a
a
é
é
c
c
:
:


Trong nguyên liệu chứa nitơ thường chứa một loại nitơ nằm dưới dạng vô cơ
(muối ammonium hay những amin dễ bay hơi ). Đây là dạng nitơ tạo thành do sự
phân hủy của protein (bò lên men thối hoặc trong quá trình khử carbonxyl của
amino acid). Những loại nitơ này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng
với MgO thì những loại nitơ nói trên sẽ bò đuổi ra khỏi dung dòch, nên chúng sẽ
được lôi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa axit. Sau đó đem đònh
phân lượng axit dư, cho phép ta xác đònh được loại nitơ này.
2(NH
4
)
+

+ Mg(OH)
2
2NH
3
+ 2H
2
0 + Mg
2+
2NH
3
+ H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4