Mức độ tồn lưu của malachite green và leucomalachite trong nguyên liệu cá tra

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

BÙI THỊ THU CÚC

MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN
VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN
LIỆU CÁ TRA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN

2009

i

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

BÙI THỊ THU CÚC

MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA MALACHITE GREEN
VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN
LIỆU CÁ TRA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Th.S VƯƠNG THANH TÙNG

2009

ii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Luận văn đính kèm theo đây, với tựa đề tài: “MỨC ĐỘ TỒN LƯU CỦA
MALACHITE GREEN VÀ LEUCOMALACHITE TRONG NGUYÊN LIỆU
CÁ TRA” do sinh viên Bùi Thị Thu Cúc thực hiện và báo cáo ngày 16 tháng 07
năm 2009, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Luận văn đã chỉnh sửa
theo ý kiến của hội đồng và được giáo viên hướng dẫn xét duyệt.

Cần Thơ, ngày 19 tháng 07 năm 2009
Cán bộ hướng dẫn

Th.S Vương Thanh Tùng

iii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


LỜI CẢM TẠ
Luận văn là bước đánh giá cuối cùng của quá trình học tập, rèn luyện một
sinh viên trong môi trường đại học. Thực hiện tốt luận văn không chỉ nhờ sự cố
gắng bản thân mà còn nhờ nhiều vào sự giúp đỡ từ thầy cơ cán bộ.

Để hồn thành được đề tài luận văn này, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
thầy Vương Thanh Tùng đã tận tình hướng dẫn tơi trong suốt thời gian thực hiện.
Ghi lịng biết ơn đến cơ cố vấn học tập Lê Thị Minh Thủy vì đã hết lịng giúp đỡ
khơng chỉ trong đợt luận văn mà cịn trong suốt khóa học.
Chân thành cảm ơn đến thầy cô giảng dạy bộ môn Dinh Dưỡng và Chế
Biến đã truyền đạt những kiến thức quý báu và bổ ích. Cảm ơn đến chị Lương
Diễm Trang học viên cao học K13 và anh Nguyễn Thanh Phong cán bộ phịng
thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ thực hiện các thao tác thực nghiệm cho tơi hồn
thành đề tài.
Cám ơn cha mẹ và gia đình đã quan tâm, chăm sóc và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tơi trong q trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài
này.
Gởi lời cảm ơn và chúc thành công đến tất cả các bạn lớp Chế Biến Thủy
Sản K31, những người luôn giúp đỡ tôi trong khi thực hiện đề tài.
Cần Thơ, tháng 05 năm 2009
Sinh viên thực hiện

Bùi Thị Thu Cúc

i

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


TĨM TẮT
Trong tình hình hiện nay, xuất khẩu thủy sản của nước ta phải đối mặt với
một vấn đề khó khăn rất lớn, đó là vấn đề dịch bệnh và dư lượng hóa chất, kháng
sinh trong thủy sản. Dư lượng các hóa chất, kháng sinh cịn tồn đọng trong thủy
sản rất có hại đối với sức khỏe con người và nền kinh tế nước nhà. Vì vậy, việc
xác định “mức độ tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite trong nguyên

liệu cá tra” được thực hiện nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu của
Malachite green và Leucomalachite trong cá tra. Đề tài bao gồm hai thí nghiệm:
Thí nghiệm (1) Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh
MG trong cá tươi bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ. Từ đó, có thể chọn ra
một phương pháp cho hiệu suất tốt nhất để tiến hành thí nghiệm (2) xác định mức
độ tồn lưu của Malachite green và Leucomalachite green trong cá tra.
Thí nghiệm (2) cá được gây nhiễm hai lần gồm ba nồng độ MG gây
nhiễm: 0,1 ppm, 0,15 ppm và 0,2 ppm với 9 mức thời gian thu mẫu: trước khi gây
nhiễm T0, sau gây nhiễm lần 1: 6 giờ (T1), 72 giờ (T2). Sau gây nhiễm lần 2: 6 giờ
(T3), 72 giờ (T4), 7ngày (T5), 14 ngày (T6), 28 ngày (T7), 56 ngày (T8). Chất phân
tích sau khi chiết tách được xác định bằng LC-MS.
Kết quả cho thấy phương pháp 2 là phương pháp tốt nhất với hiệu suất đạt
và chọn làm thí nghiệm (2). Ở thí nghiệm (2) nồng độ MG tìm thấy trong cơ và
da cá khi gây nhiễm ở tất cả các nghiệm thức đều giảm xuống sau 72 giờ gây
nhiễm lần. Hàm lượng MG phát hiện trong cá ở nghiệm thức 0,1 ppm và 0,15
ppm cho thấy sau 28 ngày gây nhiễm nồng độ MG thấp hơn mức ấn định dư
lượng tối đa của MG và LMG (không được vượt quá hai phần tỉ (ppb)) trong sản
phẩm thủy sản của các quốc gia trong khối Liên hiệp Âu Châu và Úc Châu
(Quyết định số 2002/657/EC ngày 22/12/2003). Sau 56 ngày sau gây nhiễm thì
nồng độ MG vẫn cịn tồn lưu trên cá tra với nồng độ thấp (0,31-2,42 ppb).

ii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


CÁC TỪ VIẾT TẮT
MG

Malachite green

LMG

Leucomalachite green

MW

Molecular Weight

MF

Chemical Formula

ppb

Parts per billion

ppm
ng
µm

Parts per million
Nanogram
Micrometer

HPLC

High pressure Liquid chromatography

MS

Mass spectrometry

LC-MS

Liquid chromatography- Mass spectrometry

EU

Thị trường Châu Âu

BTS
GDP

Bộ Thủy Sản
Gross Domestic Product

ACN

Acetonitrile

HA

Hydroxylamine.HCl

DEG

Diethylene glycol

TSA

p-toluen sulfonic acid monohydrate

TMPD

N,N,N,N-tetramethyl- 1,4- phenilenediamine dihydrochloride

iii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


DANH SÁCH HÌNH
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ....................................................................15
Hình 3.2: Hệ thống cơ quay chân khơng.............................................................18
Hình 3.3: Qui trình li trích MG ở phương pháp 1 ...............................................19
Hình 3.4: Thiết bị li tâm lạnh..............................................................................22
Hình 3.5: Bình chiết ...........................................................................................23
Hình 3.6: Qui trình li trích MG ở phương pháp 2 ...............................................24
Hình 3.7: Qui trình li trích MG ở phương pháp 33.2.3 Thí nghiệm xác định thời
gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra..........................................................27
Hình 3.8: Bể ni ...............................................................................................29
Hình 3.9: Sơ đồ bố trí nghiệm xác định mức độ tồn lưu của MG và LMG trong
nguyên liệu cá tra ...............................................................................................30
Hình 4.10: Đồ thị đường chuẩn ..........................................................................33
Hình 4.11: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm .....................37
Hình 4.12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm..........................................40

iv

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1: Tín hiệu trên máy LC-MS đọc được ứng với nồng độ chuẩn ................... 33
Bảng 4.2: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn MG, LMG 39 ppb .............. 34
Bảng 4.3: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG và LMG .......... 35
Bảng 4.4: Kết quả phân tích các mẫu khi thêm chuẩn 39 ppb MG, LMG ............... 36
Bảng 4.5: Sự tồn lưu của MG và LMG theo thời gian thí nghiệm .............................. 37
Bảng 4.6: Sự tồn lưu của MG theo thời gian thí nghiệm ................................................. 39
Bảng 4.7: Sự tồn lưu của LMG theo thời gian thí nghiệm .............................................. 40

v

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ...................................................................................................... I
TÓM TẮT..........................................................................................................II
CÁC TỪ VIẾT TẮT ..........................................................................................III
DANH SÁCH HÌNH......................................................................................... IV
DANH SÁCH BẢNG .........................................................................................V
DANH SÁCH BẢNG .........................................................................................V
MỤC LỤC ........................................................................................................ VI
CHƯƠNG 1 ........................................................................................................ 1
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................... 1
1.1 Giới thiệu .................................................................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................................ 1
1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................................... 2

1.4 Thời gian thực hiện .............................................................................................................. 2
CHƯƠNG 2 ........................................................................................................ 3
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.................................................................................... 3
2.1 Tìm hiểu về malachite green............................................................................................ 3
2.1.1 Sơ lược về malachite green ....................................................................................... 3
2.1.2 Tình hình sử dụng MG................................................................................................ 4
2.1.3 Các ứng dụng của Malachite green ....................................................................... 5
2.1.4 Tác hại của Malachite green ..................................................................................... 6
2.1.5 Công dụng của Malachite green sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ...... 7
2.1.6 Chất thay thế malachite green............................................................. 7
2.2 Nguyên liệu cá tra................................................................................................................. 7
2.2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra.................................................................................... 7
2.2.2 Tình hình phát triển ngành nuôi cá tra ................................................................. 8
2.3 Các phương pháp xác định dư lượng Malachite green......................................... 8
2.3.1 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong các sản phẩm cá
bằng sắc kì lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) ......................................................... 10
2.3.2 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG bằng sắc kí lỏng (LC)
với sự oxi hóa LMG ......................................................................................................................... 11
2.3.3 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ
bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng.............................................. 11
2.4 Mức độ tồn lưu của chất kháng sinh .......................................................................... 11
2.5 Một số qui định của các quốc gia về việc cấm sử dụng một số loại thuốc
và hoá chất ............................................................................................................................................ 12
CHƯƠNG 3 .......................................................................................................14
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................................14
3.1 Phương tiện nghiên cứu ................................................................................................... 14
3.1.1 Địa điểm .......................................................................................................................... 14
3.1.2 Nguyên vật liệu ............................................................................................................ 14
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................................... 14
vi

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


3.2 Phương pháp thí nghiệm.................................................................................................. 14
3.2.1 Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá
tra bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ.............................................................................. 14
3.2.2 Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra . 28
3.3 Xử lý số liệu .......................................................................................................................... 32
CHƯƠNG 4 .......................................................................................................33
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................33
4.1 Xây dựng đường chuẩn MG, LMG ............................................................................ 33
4.2 Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tra
bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ .................................................................................... 33
4.2.1 Phương pháp 1: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá
tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) ..................... 34
4.2.2 Phương pháp 2: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá
tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) ..................... 35
4.2.3 Phương pháp 3: Xác định dư lượng MG và LMG trong nguyên liệu cá
tra bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS) ..................... 36
4.3 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống .............................................................. 37
4.3.1 Sự tồn lưu của MG + LMG................................................................37
4.3.2 Sự tồn lưu của MG ............................................................................39
4.3.3 Sự tồn lưu của LMG..........................................................................40
CHƯƠNG 5 .......................................................................................................42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...............................................................................42
5.1 Kết luận ..................................................................................................42
5.2 Đề xuất ..................................................................................................43
PHỤ LỤC 1 .......................................................................................................44
PHỤ LỤC 2 .......................................................................................................47

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................50

vii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Chương 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Xuất nhập khẩu chiếm một vị thế quan trọng trong việc tăng tỉ trọng, tăng
GDP của cả nước. Trong các mặt hàng xuất khẩu thì cá da trơn, đặc biệt là cá tra
là một mặt hàng chiếm ưu thế khá lớn. Để đáp ứng nhu cầu ở các thị trường khó
tính địi hỏi mặt hàng cá tra không chỉ đảm bảo về chất lượng vệ sinh an tồn thực
phẩm, mà cịn phải đảm bảo nhu cầu sức khoẻ con người. Nhưng đứng trước tình
hình khá phổ biến hiện nay đó là thực trạng tồn lưu của Malachite green (MG) và
Leucomalachite green (LMG) trong nguyên liệu cá tra- một loại hóa chất có tác
hại rất lớn đối với sức khoẻ con người và nền kinh tế thị trường nước nhà.
Như chúng ta đã biết biểu hiện gây ung thư của LMG trên chuột nhắt cái
và là chất gây đột biến trong cơ thể của các loài động vật, ngồi ra MG cịn là 1
hố chất có thể gây bệnh ung thư cho con người nên đã bị cấm sử dụng và được
kiểm tra nghiêm ngặt về dư lượng có trong thực phẩm ở nhiều nước trên thế giới
(www.thanhnien.easyvn.com). Sự kiện một số container sản phẩm thuỷ sản xuất
khẩu từ Việt Nam bị từ chối ở thị trường Châu Âu, Mỹ và Canada trong thời gian
qua do phát hiện có dư lượng MG. Những tháng cuối năm 2004, trên 10 container
cá da trơn, cá rô phi và cá trê xuất khẩu sang thị trường Châu Âu của các doanh
nghiệp ở An Giang, Đồng Tháp…bị trả về do phát hiện chất MG. Chỉ riêng năm
2005, EU đã phát hiện 12 lô hàng về dư lượng MG. Tất cả lô hàng bị phát hiện
đều bị trả lại Việt Nam. Điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành xuất khẩu
thủy sản trong nước và đời sống của người dân lao động nước ta.

Việc xác định được dư lượng các chất kháng sinh cịn tồn lưu trong các
lồi động vật thủy sản cũng đã được nghiên cứu nhiều trong và ngoài nước,
nhưng sự tồn lưu MG trong cá tra, ứng với điều kiện ni ở Đồng Bằng Sơng
Cửu Long thì ít được nghiên cứu. Nên những thông số về “mức độ tồn lưu
Malachite green và Leucomalachite green trong nguyên liệu cá tra” rất cần thiết
cho người nuôi cũng như nhà chế biến.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Thơng qua việc phân tích dư luợng MG trong nguyên liệu cá tra sau các
giai đoạn lây nhiễm, đề tài nhằm xác định thời gian tồn lưu của hoá chất MG
1

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


trong ngun liệu cá tra. Từ đó có thêm thơng tin cho các nhà nuôi trồng và chế
biến trong việc hướng tới việc sử dụng hoá chất, kháng sinh hiệu quả và an toàn
để nâng cao chất lượng và độ an toàn nguyên liệu cá tra trước khi đưa vào chế
biến.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng sinh MG trong cá tươi
bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ.
Thí nghiệm xác định thời gian tồn lưu của MG và LMG trong cá tra.
1.4 Thời gian thực hiện
Từ tháng 01/2009 đến tháng 05/2009.

2

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

Chương 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tìm hiểu về malachite green
2.1.1 Sơ lược về malachite green
Các quốc gia trong khối liên hiệp Âu Châu và Úc Châu ấn định ngạch số
tối đa của MG và LMG trong thủy sản là phải ở mức 2 ppb, tức là không vượt quá
0,002 mg/kg. Hoa Kỳ, Canada, cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới
trong đó có Trung Quốc và Việt Nam thì khơng chấp nhận sự hiện diện của bất kì
1 dư lượng nào dù thật thấp của MG và LMG.
2.1.1.1 Malachite green là gì?
Malachite green (cịn gọi là xanh malachite) có tên khoa học là
Triphenylmethane. MG là một hố chất thường ở dạng bột mịn, có màu xanh, hay
dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như da, sợi và giấy trong ngành sản xuất cơng
nghiệp. Ngồi ra MG cũng được dùng trong phịng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn
và bào tử của nó. Từ lâu, MG đươc xem là chất diệt nấm (loại saprolegnia ssp) và
diệt kí sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa).
Leuco malachite green được sinh ra từ sự khử malachite green bới các
enzyme trong cá, một hợp chất chuyển hoá rất bền của MG. LMG được tích luỹ
bên trong, vỗ béo cơ thịt, tồn trữ lâu dài trong cơ thịt của cá.
2.1.1.2. Công thức cấu tạo của Malachite green và Leucomalachite green.

Reduction
- HCl
-

Cl
H3C N

Oxidation

N CH3

CH3

H3C N

CH3

N CH3

CH3

CH3

Leucomalachite green (LMG)

Malachite green (MG)

Malachite green, Green malaquite, Grenoble green ...
Tên quốc tế (IUPAC): [4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methylidene]1-cyclohexa-2,5-dienylidene]-dimethyl-ammonium chloride
3

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Khối lượng phân tử (MW): 364,911
Công thức phân tử (MF): C23H25N2Cl
Malachite green leuco, Leucomalachite green ...
IUPAC:

4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl-methyl]-N,N-dimethyl-

aniline
MW: 330,466
MF: C23H26N2
2.1.2 Tình hình sử dụng MG
2.1.2.1 Tình hình sử dụng MG trên thế giới
Trong các thập niên qua ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới có những
bước tiến vượt bậc. Do việc áp dụng kĩ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ
cao để gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm
cho thủy sản chết hàng loạt, vì thế người ni ln tìm biện pháp khắc phục và
việc sử dụng thuốc, hóa chất trong cơng việc phòng và trị bệnh là rất hữu hiệu.
Tháng 6/2005, các cơ quan chức năng Trung Quốc đã phát hiện thấy một
vài tỉnh vẫn cịn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay
MG vẫn được sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi như 1 chất diệt nấm. Nguyên
nhân là do loại chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dể mua.
(www.vietnam.net).
Theo bộ nghề cá và hàng hải Hàn Quốc (MMAF), MG đã được tìm thấy
trong các trại ni cá Hồi và cá Chép ở tám vùng của Hàn Quốc. Trong các ngày
từ 15/9 đến 3/10/2005, cục thanh tra chất lượng thủy sản quốc gia Hàn Quốc
(NEPQIS) đã tiến hành kiểm tra khắp các trại nuôi cá nước ngọt và nước lợ trên
cả nước và đây là lần đầu tiên Hàn Quốc phát hiện thấy MG trong các trại nuôi cá
ở nước này. Lượng hóa chất dao động từ 0,1-3 ppm (www.Intrafish.com)
2.1.2.2 Tình hình sử dụng MG ở Việt Nam
Sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu
phát hiện nhiễm kháng sinh cấm đã gây thiệt hại lớn về tài chính cũng như uy tín
hàng thủy sản Việt Nam. Nhà nước và cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt
Nam đã đưa ra các qui định tương đối chặt chẽ về việc sử dụng kháng sinh trong
nuôi trồng cũng như chế biến thủy sản, nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm
4

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


cho người tiêu dùng, ổn định và phát triển xuất khẩu. Tuy nhiên, việc chấp hành
các qui định của nhà nước là chưa triệt để vì thỉnh thoảng vẫn cịn một số lô hàng
thủy sản Việt Nam xuất khẩu phát hiện nhiễm kháng sinh cấm hoặc vượt quá giới
hạn đối với những kháng sinh cho phép sử dụng có giới hạn, trong chương trình
kiểm sốt dư lượng các chất độc hại trong thủy sản nuôi do Nafiqaved thực hiện
năm 2003 và 2004 thỉnh thoảng vẫn phát hiện mẫu thủy sản nhiễm thuốc hoặc
hoá chất bị cấm sử dụng, MG là một điển hình.
Về tình hình sử dụng thuốc, hố chất trong nuôi cá tra công nghiệp ở Đồng
Tháp (Phạm Thanh Tuấn, 2004) ghi nhận được có 90 loại thuốc, hố chất được sử
dụng trong nuôi trồng. Riêng kháng sinh trị bệnh cho cá có 58 loại thì hầu hết
nằm trong danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại ở dạng nguyên liệu và nguồn
gốc không rõ ràng, riếng chất MG là nằm trong danh mục cấm nhưng vẫn được
người nuôi sử dụng dụng ở đây.
Theo một số hộ nuôi cá tra ở khu vực Thốt Nốt, Cần Thơ, An Giang thì
cho biết khơng sử dụng MG trong q trình ni nhưng qua phân tích thì hiện
diện đến 10/64 mẫu trong cá thương phẩm, và nồng độ tồn lưu 2-4,9 ppb. Đối với
cá đang ni thì hiện diện 9/30 mẫu được kiểm tra, nồng độ tồn lưu là 2,4- 4,18
ppb. (Nguyễn Chính, 2005).
2.1.3 Các ứng dụng của Malachite green
2.1.3.1 Trong cơng nghiệp
Trong ngành công nghiệp MG hay dùng để nhuộm các nguyên vật liệu như
da, tơ, sợi và giấy. Ngoài ra MG cũng được dùng trong phịng thí nghiệm để làm
dung dịch nhuộm vi khuẩn, và bào tử của nó, làm chỉ thị màu pH, vàng (axit),
xanh lục (kiềm).
2.1.3.2 Trong thủy sản
Chất MG đã được giới nuôi trồng thủy sản trên thế giới sử dụng 1 cách

rộng rãi từ lâu và được dùng rất phổ biến trên thế giới để xử lý nước và để sát
nấm cũng như để sát kí sinh trùng nhóm nguyên sinh vật (protozoa) và các bệnh
nấm kí sinh trùng trên trứng cá, cá và các loại sị hến (lồi nhuyễn thể) như phịng
trị các bệnh nấm mi, bệnh trùng quả dưa….Đó là một loại thuốc trừ nấm rất công
hiệu và thường được dùng để tẩy trùng trong các hồ gây cá giống và trong các mơ
hình nuôi trồng thủy sản.

5

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


2.1.4 Tác hại của Malachite green
Khi vào cơ thể cá, MG sẽ bị phân hủy thành chất chuyển hóa (metabolite)
là Leucomalachite Green. Thời gian đào thải của MG nhanh, ngược lại chất LMG
có thể tồn tại trong thời gian rất lâu trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị
nhiễm MG.
Độc tính của MG có liên hệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá có thể
chịu đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng
sẽ dẫn đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng
MG vào lúc sáng sớm khi nhiệt độ nước chưa tăng cao là tốt nhất. Đặc biệt trong
các tháng mùa hè nóng bức, thời gian tiếp xúc khi xử lý MG nên giảm xuống. (Lê
Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004).
2.1.4.1 Tác hại đối với con người
Thí nghiệm cho thấy MG và LMG làm hại gan, làm biến đổi tuyến giáp
trạng, gây ra tình trạng mất máu, làm đột biến thay đổi gen (mutagenic) và gây
cancer (carcinogenic) trên lồi chuột thí nghiệm. Qua việc thẩm định các kết quả
trên, giới khoa học đưa ra kết luận rằng MG và LMG là 2 chất nguy hại có tiềm
năng gây cancer cho người.
Một nghiên cứu khác về độc tính của MG và LMG được tiến hành trong

thời gian 2 năm của trung tâm nghiên cứu độc tố quốc gia Hoa Kỳ cho thấy có
biểu hiện gây ung thư của LMG trên chuột nhắt cái. Ngồi ra, LMG cịn là chất
gây đột biến trong cơ thể của các loài động vật.
Theo thạc sĩ Từ Thanh Dung- Khoa Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ,
thì MG là một hố chất có thể gây bệnh ung thư, ảnh hưởng đến sức khỏe con
người nên đã bị cấm sử dụng và được kiểm tra nghiêm ngặt về dư lượng có trong
thực phẩm ở nhiều nước trên thế giới.
Trước những tác hại có thể gây ra đối với sức khỏe con người và nhằm
đảm bảo an toàn thực phẩm, đáp ứng yêu cầu khắc khe của thị trường xuất khẩu
thủy sản, theo chỉ thị của bộ thủy sản 7/3/2005 về việc ngừng sản xuất, tiêu thụ và
sử dụng MG trong nuôi trồng thủy sản và đề nghị tất cả các hộ nuôi thủy sản
khơng được sử dụng MG để phịng và trị bệnh cho thủy sản.
2.1.4.2 Thiệt hại về kinh tế

6

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Nếu sản phẩm thủy sản xuất khẩu có chứa các lượng tồn dư chất độc hại
và bị cấm sử dụng như MG thì tồn bộ lơ hàng sẽ bị trả về và có thể bị nước sở tại
kiện, dẫn đến những thiệt hại về kinh tế là không nhỏ.
2.1.5 Công dụng của Malachite green sử dụng trong nuôi trồng thủy sản
MG được sử dụng như một loại thuốc kháng sinh có hiệu quả trong nghề
ni trồng thuỷ sản từ năm 1936 (Foster and Woodurg, 1936). Nó được sử dụng
để trị bệnh ký sinh trùng ngoài da, nấm, những bệnh do các động vật nguyên sinh
gây ra ( bệnh protozoa) trong cá và trứng cá. Cho đến ngày nay, nó vẫn cịn là
một trong những hố chất có hiệu quả nhất cho mục đích này và được sử dụng
phổ biến trên toàn thế giới.
2.1.6 Chất thay thế malachite green

Để giải quyết tạm thời vấn đề cần phải có những chất khác thay thế MG
trong cơng tác phịng trị bệnh trên các lồi thủy sản. BRONOPOL là chất có tác
dụng diệt kí sinh trùng trên cá thay thế MG. Đây là chất được EU cho phép sử
dụng trị bệnh cho cá từ năm 2001 và không qui định giới hạn về dư lượng. Theo
đánh giá của cơ quan bảo vệ Môi Trường Hoa Kì (EFA) thì Bronopol khơng là
chất gây ung thư, có thể làm chất tẩy trùng, diệt khuẩn.
Chất bronopol có cơng thức hóa học: C3H6BrNO4. Tên hóa học của chất
này là 2-Bromo-2-Nitropropane-1,3-Diol. Bronopol được cung cấp ra thị trường
với các tên thương mại như: Pyceze, Onyxide 500…. Nhằm mục tiêu phát triển
xuất khẩu thủy sản ổn định trong thời gian tới, thiết nghĩ các hộ nuôi thủy sản cần
tuân thủ nghiêm các qui định của nhà nước và các cơ quan chun mơn trong việc
sử dụng hóa chất và kháng sinh trong thủy sản để đảm bảo uy tín, chất lượng và
giữ vững thương hiệu, đồng thời tránh ra các thiệt hại lớn về kinh tế do bị phát
hiện có dư lượng cá hóa chất và kháng sinh có hại trong các lô hàng thủy sản xuất
khẩu. (Sở Nông Nghiệp An Giang, 2/2/2005).
2.2 Nguyên liệu cá tra
2.2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra
Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) là một trong những đối tượng nuôi
trồng thủy sản đang được phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh Đồng bằng sông
Cửu Long (tập trung chủ yếu ở hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp) là một trong

7

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


những lồi cá có giá trị xuất khẩu cao. Có thân dẹp, da trơn, có râu ngắn, màu sắc
đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng.
Cá sống chủ yếu ở vùng nước ngọt, có thể sống ở vùng nước lợ (10-14 %
độ muối), chịu được nước phèn với pH >5. Chịu được nhiệt độ nóng đến 39 0C,

nhưng dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 15 0C.
Cá trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm. Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18
kg hoặc có mẫu cá dài tới 1,8 m. Cá nuôi sau một năm đạt 1-1,5 kg (năm đầu),
những năm sau cá tăng trọng nhanh hơn có khi đạt 5-6 kg/năm.
Tài liệu phân loại gần đấy nhất của tác giả W.Rainboth xếp cá tra nằm
trong giống cá tra dầu và được phân loại như sau:
Bộ cá nheo Siluriformes.
Họ cá tra dầu Pangasiidae.
Giống cá tra dầu Pangasianodon.
Loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus.
Mùa sinh sản: từ tháng 2 – 10
Mùa thu hoạch: quanh năm.
Kích thước thu hoạch: 30 – 40 cm, lớn nhất 90 cm.
Sản phẩm xuất khẩu: dưới dạng nguyên con, philê đông lạnh, các mặt hàng
chế biến và hàng giá trị gia tăng.
2.2.2 Tình hình phát triển ngành ni cá tra
Trong họ cá tra có một số lồi được ni trong hồ từ lâu đời, đặc biệt là cá
tra (cá tra nuôi). Ngày nay ngành cá nuôi trở thành một công nghiệp nuôi và chế
biến mà họ cá tra là trọng điểm. Trên đà nghiên cứu cho ngành cá ni có rất
nhiều báo cáo về mơi trường sống, thức ăn... của họ cá tra trong điều kiện thiên
nhiên và trong điều kiện "gia ngư hóa".
Hình thức ni: Ni thâm canh, bán thâm canh với các mơ hình ni bè,
ni trong ao hầm.
Hình thức khai thác: Lưới, rùng, đăng, vó.
2.3 Các phương pháp xác định dư lượng Malachite green
MG là một thuốc sát trùng không đắt, được sử dụng có hiệu quả trong
ngành ni cá từ những năm 30, chủ yếu trong những nước Châu Á. Việc sử dụng

8

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


MG được xem là bất hợp pháp, bởi vì có liên quan đến những tác hại lâu dài đối
với con người.
Do đó, đã có rất nhiều phương pháp kiểm tra dư lượng MG và hợp chất
chuyển hóa của nó là LMG trong các sản phẩm cá. Nhưng theo sự quyết định của
Hội đồng Châu Âu EC / 657 / 2002, một phương pháp kiểm nghiệm có thể được
tiến hành, phải có độ phát hiện tổng hàm lượng MG và LMG trong thịt cá là 2
µg/kg. Theo Julie Kowalski, một nhà hóa học nhiều sáng kiến, đã đưa ra một
phương pháp đo sắc ký chung để xác định dư lượng MG và LMG. Đó là phương
pháp phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp, với hệ hấp phụ pha ngược HPLC.
Để phân tích MG và LMG bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, với hệ
hấp phụ pha ngược HPLC, cột chứa octadecylsilane đặc trưng làm cột bảo vệ,
đồng thời cũng đóng vai trị là pha tĩnh. Thành phần pha động là hỗn hợp dung
dịch đệm và chất hữu cơ, với một tỷ lệ 50 : 50, acetonitrile là hợp chất hữu cơ sử
dụng phổ biến nhất. Dung dịch đệm có pH thích hợp từ 4,0 đến 4,5.
Chiều dài cột là 100 mm hoặc dài hơn.
Ngày nay, có 3 loại detector được dùng cho kỹ thuật HPLC để xác định
MG và LMG là detector đo phổ hấp thụ phân tử UV-Vis, phổ huỳnh quang phân
tử và phổ khối lượng MS.
MG có cực đại hấp phụ ở 620 nm và LMG ở 265 nm, làm chúng ta khó
quan sát cả hai trong một phép đo phổ hấp thu. Điều này có thể được khắc phục
bằng cách nối thêm vào sau cột phân tích HPLC một cột chứa chất oxi hóa (như
chì oxit) để chuyển LMG về MG.

Reduction
- HCl
-

Cl
H3C N

Oxidation

N CH3

CH3

H3C N

CH3

N CH3

CH3

CH3

Leucomalachite green (LMG)

Malachite green (MG)

LMG sau khi chuyển về dạng MG cũng được xác định trên sắc đồ, MG
này có thể được phân biệt với MG trước bởi thời gian lưu khác nhau.

9

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

Detector phát phổ huỳnh quang được gắn vào đường dẫn dung môi rửa
giải, để phát hiện ra LMG bởi sự kích thích phát xạ ở 265 nm và sự phát xạ ở 360
nm.
Với phép ghi phổ khối lượng cho phép phát hiện cả hai hợp chất mà khơng
sự oxi hóa hoặc sử dụng hai detector.
Sau đây, một vài phương pháp xác định dư lượng MG và chất chuyển hóa
của nó trong cá của nhiều nhóm tác giả:
∗ Phương pháp xác định dư lượng malachite green và leucomalachite
green trong nguyên liệu cá tra bằng sắc kí lỏng ghép với phổ khối lượng (LCMS/MS). Nhóm tác giả Van de Riet JM, Murphy CJ, Pearce JN, Potter RA,
Burns BG.
∗ Phương pháp xác định dư lượng Malachite green và Leucomalachite
green bằng sắc ký lỏng (LC) với sự oxi hóa Leucomalachite green. Nhóm tác giả
Andersen WC, Roybal JE, Turnipseed SB.
∗ Phương pháp xác định dư lượng Malachite green và Leucomalachite
green trong cá hồi Bắc Mỹ bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối
lượng. Nhóm tác giả Halme K, Lindfors E, Peltonen K.
2.3.1 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong các sản phẩm cá
bằng sắc kì lỏng ghép với phổ khối lượng (LC-MS)
Một phương pháp phân tích bằng LC-MS khác đã được phát triển trong
việc xác định dư lượng MG và LMG trong nhiều cá nước ngọt bởi nhóm tác giả:
Van de Riet JM, Murphy CJ, Pearce JN, Potter RA, Burns BG. MG và hợp chất
chuyển hóa của nó được chiết từ những mẫu thịt cá đã được nghiền đồng nhất
bằng dung dịch acetonitrile – perchloric acid. Sau khi ly tâm, dịch trong được lấy
và đem cô đặc rồi chuyển vào cột chiết chứa pha rắn octadecyl C18. Tiếp theo, ta
tiến hành rửa giải bằng cách cho dung dịch acetonitrile qua cột, thu dịch rửa giải
đem cô quay đến khơ cạn. Phần cặn đã khơ cạn được hịa tan với acetonitrile và
pha loãng với nước cất để chuẩn bị phân tích LC-MS. MG và hợp chất chuyển
hóa của nó sẽ được phân tích bằng LC pha đảo sử dụng cột Luna C18 với dung
dịch đệm ammonium hydroxide-formic acid trong gradient acetonitrile. Phép ghi

phổ khối lượng phát hiện định phân ở nhiều giai đoạn phản ứng. Các mẫu thêm
chuẩn ở nồng độ 1 ng/g có hiệu suất thu hồi là 81 % đối với LMG và 98 % cho
MG. Phương pháp này có giới hạn phát hiện cho cả hai hợp chất trên là 0,1 ng/g.
10

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


2.3.2 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG bằng sắc kí lỏng (LC)
với sự oxi hóa LMG
Một phương pháp sắc ký lỏng (LC) khác đã được tìm ra để xác định dư
lượng MG trong cá bởi nhóm tác giả: Andersen WC, Roybal JE, Turnipseed SB.
Dư lượng MG và LMG được trích từ thịt cá hồi bằng dung dịch đệm acetate và
acetonitrile. Tiếp theo, dịch trích được chiết tách lại bằng dichloromethane. LMG
sẽ bị oxi hóa trở về dạng MG bằng phản ứng với 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4benzoquinone. Mẫu phân tích được làm sạch hơn bằng sự chiết với pha rắn gồm
alumina và propylsulfonic acid. Cuối cùng, dịch chiết được phân tích bằng LC
với bước sóng phát hiện ở 618 nm sử dụng cột rửa giải phân tách C18. Phương
pháp đã phân tích được 35 mẫu cá hồi ni với sự thêm chuẩn ở 1, 2, 4, và 10
ng/g (ppb) thì có được hiệu suất thu hồi trung bình là 95,4 %, độ sai số ± 11,1 %.
Với 5 mẫu cá hồi trong hộp với sự thêm chuẩn ở 10 ng/g thì hiệu suất thu hồi
trung bình là 88,9 %, độ sai số ± 2,6 %. Giới hạn phát hiện của phương pháp này
là 1 ng/g.
2.3.3 Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ
bằng sắc ký lỏng và sắc ký lỏng ghép với phổ khối lượng
Phương pháp xác định dư lượng MG và LMG trong cá hồi Bắc Mỹ bằng
sắc ký lỏng được báo cáo bởi nhóm tác giả: Halme K, Lindfors E, Peltonen K , có
giới hạn phát hiện tương ứng là 0,8 và 0,6 µg/kg. Hai hợp chất trên được chiết với
một hỗn hợp dung dịch đệm acetate-acetonitrile và được chiết tách lại trong
methylene chloric. Sử dụng hệ thống chiết pha rắn tự động gồm những cột chiết
chứa pha rắn acid propylsufonic và alumina để làm sạch dịch chiết. Sự phân tách

MG và LMG hoàn toàn trên cột Chrompher 5B, sử dụng pha động là dung dịch
đệm acetate-acetonitrile. LMG được chuyển về dạng MG bằng phản ứng sau cột
trước khi đo phổ ở bước sóng 600 nm. Hiệu suất thu hồi của MG và LMG trong
một dãy mẫu kiểm sốt có thêm chuẩn từ 2 đến 50 µg/kg tương ứng là 65 %
(trong dãy 63,4 – 65,9 %, độ sai số 3,9 – 16,1 %) và 74 % (trong dãy 58,3 – 82,6
%, độ sai số 3,3 – 11,4 %).
Việc xác định dư lượng các cặn bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép với
phép ghi phổ khối lượng, phương pháp này có giới hạn phát hiện là 2,5 và 1
µg/kg tương ứng với MG và LMG.
2.4 Mức độ tồn lưu của chất kháng sinh
11

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Theo quy định của Bộ Thủy Sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng
sinh trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên. Viện nghiên cứu và phát triển thủy sản
Hàn Quốc- NFRDI (2002) thử nghiệm tồn lưu của 2 chất Oxytetracyline HCl và
Sulfadimethoxine trên đối tượng cá catfish cho kết quả thời gian đào thải là sau
30 ngày, đối với Lươn sự đào thải của Ciprofloxacine và Ofloxacin là 35 ngày.
Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu trong cá Chình ni sau khi trị bệnh
khơng dưới 100 ngày, với cá Hồi chấm là không dưới 10 tháng (Raoul và ctv,
2002).
Theo q trình theo dõi và phân tích sự tồn lưu MG trên cá tra để trị bệnh
kí sinh trùng cho thấy (www.vietlinh.com.vn):
Sau 1 tháng sử dụng MG : tồn lưu 35 ppb
Sau 2 tháng
Sau 3 tháng
vẫn còn.

: mức phát hiện còn 10 ppb
: MG = 0. Nhưng dẫn xuất của MG là LMG thì

Vậy thời gian có thể làm MG không tồn lưu trong thịt cá là rõ ràng. Việc
tích lũy MG mang tính cộng dồn. Sau khi cá nhiễm MG sẽ tích lũy dần trong thịt
và tế bào mỡ, đặc biệt trong mỡ ln tích lũy hàm lượng MG cao gấp nhiều lần so
với trong thịt. Như vậy, nếu tích lũy ở mức độ cao có thể ảnh hưởng xấu đến
người tiêu dùng sau khi ăn cá bị nhiễm.
2.5 Một số qui định của các quốc gia về việc cấm sử dụng một số loại thuốc
và hố chất
Trước tình hình sử dụng kháng sinh trong ni trồng thủy sản một cách
tràn lan, Bộ Thủy Sản đã ra quyết định số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24/2/2005 về
ban hành danh mục hoá chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng trong sản xuất,
kinh doanh thủy sản; Chỉ đạo các cơ quan Báo, Đài tại địa phương tuyên truyền
về tác hại của các loại thuốc thú y, hoá chất, kháng sinh trong danh mục hạn chế
sử dụng và cấm sử dụng theo quy định của Bộ Thủy sản, đặc biệt là MG
( cập nhật ngày 27/9/2006).
Khối EU có những qui định nghiêm ngặt cho phép sử dụng kháng sinh,
hoá chất trong nuôi trồng thủy sản, Theo chỉ thị EC số 2377/90 qui định danh
mục cấm sử dụng gồm 10 kháng sinh và 01 hoá chất Malachite green, 31chất hạn
chế sử dụng (Theo website: NAFIQAVED cập nhật
ngày 25/3/2006).
12

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Mỹ là Quốc gia có qui định nghiêm ngặt về việc cho phép sử dụng thuốc,
hố chất trong ni trồng thủy sản. Danh mục các chất cấm sử dụng là 11 chất
(. NAFIQAVED, cập nhật ngày 7/9/2006).

Theo qui định của Bộ Thủy sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng
sinh trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên. Nhiều tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu
trong cá Chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới 100 ngày, với cá Hồi chấm
không dưới 10 tháng. (Raoul et al, 2002).

13

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Chương 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm
Thực hiện trong khoa thủy sản- Đại học Cần Thơ
Thời gian từ tháng 01/2009 đến tháng 05/2009
3.1.2 Nguyên vật liệu
Nguyên liệu cá tra
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ
Bể thí nghiệm có thể tích 500 L.
Các hố chất, dụng cụ và phương tiện sử dụng trong phịng thí nghiệm Bộ
Môn Dinh Dưỡng và Chế Biến Thủy Sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học
Cần Thơ.
Trang thiết bị
Các loại dụng cụ thơng thường trong phịng thí nghiệm.
Máy li tâm lạnh.
Hệ thống máy LC-MS.
Máy lắc vortex.
Máy cô quay chân khơng và bình cầu quả lê 100 ml.
3.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát các phương pháp kiểm tra dư lượng kháng
sinh MG trong cá tra bằng sắc kí lỏng cao áp ghép khối phổ
Mục đích: chọn ra phương pháp có hiệu suất tốt nhất từ đó áp dụng tiến
hành cho thí nghiệm xác định sự tồn lưu của MG và LMG trong nguyên liệu cá
tra.
Phương pháp gây nhiễm

14

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Cá được chọn là sạch bệnh, không nhiễm MG. Tiến hành gây nhiễm bằng
cách cho trực tiếp MG và LMG với nồng độ 1 ppm vào mẫu cá sau khi chuẩn bị
mẫu xong để phân tích.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí với 1 nhân tố với 2 lần lặp lại.
Nhân tố phương pháp kiểm tra dư lượng MG trong nguyên liệu cá tra.
M1: Phương pháp 1
M2: phương pháp 2
M3: phương pháp 3
Số nghiệm thức: 3 nghiệm thức.
Số mẫu thí nghiệm: 3 nghiệm thức × 3 lần lặp lại = 9 mẫu.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Cá tra
Chuẩn bị mẫu
Nghiền đồng nhất mẫu

M1

M2

M3

Máy phân tích
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Tiến hành thí nghiệm
Cá Tra fillet tiến hành xay nhỏ qua cối xay thịt có đường kính lỗ sàng 2-3
mm. Mẫu thử sau khi đã chuẩn bị xong được gây nhiễm hóa chất MG, LMG ở
nồng độ biết trước và tiến hành khảo sát 3 phương pháp kiểm ra dư lượng MG,
LMG trong cá tra.

15

LUAN VAN CHAT LUONG download : add