PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM lá mía BẰNG kỹ THUẬT ELISA và bước đầu NGHIÊN cứu PHÁT HIỆN BỆNH cằn mía gốc BẰNG kỹ THUẬT PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
….  ….

NGUYỄN ANH KHOA

PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ
THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU
PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC
BẰNG KỸ THUẬT PCR

Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Tp. HCM, 8/2006

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
….  ….

PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ
THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU
PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC
BẰNG KỸ THUẬT PCR

Luận văn kỹ sƣ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giáo viên hƣớng dẫn

Sinh viên thực hiện

PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN

NGUYỄN ANH KHOA
Niên khóa: 2002 - 2006

Tp. HCM, 8/2006

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY

SURVEYING SUGARCANE MOSAIC DISEASE
BY ELISA AND THE FIRST STEP TO RESEARCH
AND DETECT RATOON STUNTING
DISEASE BY PCR

Graduation thesis
Major: Biotechnology

Professor
BUI CACH TUYEN

Student
NGUYEN ANH KHOA
Term: 2002- 2006

HCMC, 9/2006

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

….  ….

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA
VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH
CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2002 – 2006
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 / 2006

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC

….  ….

PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA
VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH
CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR

Giáo viên hƣớng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN

NGUYỄN ANH KHOA

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 / 2006

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


iii

LỜI CẢM ƠN
 Tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến:

 PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện
thuận lợi giúp tơi hồn tất khóa luận tốt nghiệp này.
 TS. Bùi Minh Trí đã chỉ bảo cho tơi nhiều kiến thức trong thời gian thực
hiện đề tài.
 ThS. Nguyễn Văn Cƣờng cùng các anh chị trong Trung tâm Phân tích
Thí nghiệm Hóa Sinh – trƣờng Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh đã
tận tình giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
 ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng Bến Cát đã giúp
đỡ tơi trong q trình thu mẫu tại đây.
 Xin chân thành cảm ơn đến q Thầy Cơ bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học đã
nhiệt tình chỉ dạy cũng nhƣ đóng góp ý kiến chân thành cho tơi trong suốt thời
gian làm khóa luận này.
 Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã ln ủng hộ,
động viên và giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Anh Khoa

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


iv

TĨM TẮT
NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8 năm 2006.
“PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC
ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT
PCR”
Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến.
Đề tài khảo sát sự nhiễm bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic) và cằn mía gốc

(Ratoon stunting disease) đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng
(TTNCMĐ) tỉnh Bình Dƣơng và nơng trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. Đây là nghiên
cứu nhằm góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên
một số giống mía sản xuất và nhập nội tại 2 vùng trồng mía này. Đặc biệt đề tài là
bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu, phát hiện bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia
xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra trên cây mía ở nƣớc ta bằng kỹ thuật PCR. Nghiên cứu
góp phần quan trọng trong công tác tuyển chọn giống sạch bệnh cũng nhƣ công tác
phịng chống và kiểm sốt dịch bệnh trên cây có mía hiệu quả hơn.
Kết quả đạt đƣợc
-

Các giống mía sản xuất và nhập nội đƣợc khảo sát đều không bị nhiễm bệnh
khảm lá mía thơng qua kết quả chẩn đốn bằng ELISA.

-

Phát hiện đƣợc bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi
và nhuộm mơ mẫu. Kết quả: tỉ lệ mô khoẻ mạnh trên các giống mía khảo sát tại
TTNCMĐ là 70,5%, tại nơng trƣờng Thọ vực là 75,18%.

-

Xác định sơ bộ các nhân tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy vi khuẩn Lxx.

-

Đề xuất phƣơng pháp ni cấy vi khuẩn Lxx và hồn thiện quy trình phát hiện
vi khuẩn Lxx bằng kỹ thuật PCR.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

v

SUMMARY
This is Nguyen Anh Khoa studying at Nong Lam University and finishing the
thesis on 9th 2006. The thesis entiled “Surveying sugarcane mosaic disease by
ELISA and the first step to research and detect ratoon stunting disease by PCR ”.
Surveying sugarcane mosaic disease and ratoon stunting disease (RSD) on some
sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh
Duong and at Tho Vuc farm at Dong Nai. That is basic to contribute statistics to
situation of sugarcane mosaic disease at the areas. Specially, the thesis is the first step
to research and detect RSD caused by bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) on
sugarcane in our country. The researching is an important contribution to select
pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane
effectively.
The results of this research are as follows:
- DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species
produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not
found SCMV.
- Detecting Lxx by microscopy and STM stainning. Results: 70,5% of phloem
vessel do not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and
75,18% phloem of vessel do not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm.
- Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process.
- Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria
detecting process by PCR.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

vi

MỤC LỤC
Nội dung

Trang

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iii
TÓM TẮT.......................................................................................................................iv
MỤC LỤC ......................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................................ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ HÌNH CHỤP ................................................................x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................xi
Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu ......................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu .........................................................................................2
1.3. Giới hạn đề tài ...................................................................................................2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................3
2.1. Sơ lƣợc về cây mía............................................................................................3
2.1.1. Lịch sử phát hiện .......................................................................................3
2.1.2. Phân loại ....................................................................................................3
2.1.3. Nguồn gốc và phân bố ...............................................................................3
2.1.4. Nhân giống ................................................................................................4
2.1.5. Sản lƣợng...................................................................................................4
2.1.6. Chế biến và sử dụng ..................................................................................5
2.2. Bệnh trên cây mía .............................................................................................5
2.3. Bệnh khảm lá mía .............................................................................................7
2.3.1. Nguồn gốc và phân bố ...............................................................................7
2.3.2. Triệu chứng................................................................................................7
2.3.3. Tác nhân gây bệnh .....................................................................................8

2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía.....................................................9
2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh .............................................................9
2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế .............................................................................9
2.3.7. Phòng trừ .................................................................................................10
2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía ........................................10

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


vii

2.3.8.1.

Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh ......................................................10

2.3.8.2.

Phƣơng pháp chẩn đốn dùng kính hiển vi ......................................10

2.3.8.3.

Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) ..............10

2.3.8.4.

Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ...........................12

2.4. Bệnh cằn mía gốc ............................................................................................14
2.4.1. Nguồn gốc và phân bố .............................................................................14
2.4.2. Triệu chứng..............................................................................................14

2.4.2.1.

Triệu chứng bên ngoài .....................................................................14

2.4.2.2.

Triệu chứng bên trong cây ...............................................................15

2.4.3. Tác nhân gây bệnh ...................................................................................16
2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh ..........................................................16
2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế ...........................................................................17
2.4.6. Kiểm soát bệnh ........................................................................................17
2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía .................17
2.4.7.1.

Phƣơng pháp chẩn đốn trực tiếp bằng kính hiển vi .......................17

2.4.7.2.

Phƣơng pháp huyết thanh học ..........................................................17

2.4.7.3.

Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) ...............19

2.4.7.4.

Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ...........19

2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc .................19

2.5.1. Trên thế giới ............................................................................................19
2.5.2. Trong nƣớc ..............................................................................................20
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................22
3.1. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................22
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................22
3.3. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................22
3.3.1. Các giống mía nghiên cứu .......................................................................22
3.3.2. Virus gây bệnh.........................................................................................22
3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh ...................................................................................22
3.3.4. Hóa chất thí nghiệm ................................................................................23
3.3.5. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................23
3.4. Phƣơng pháp tiến hành ...................................................................................23
3.4.1. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu .................................................................23

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


viii

3.4.2. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA ............................24
3.4.3.1.

Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm .............................24

3.4.3.2.

Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA ..........................26

3.4.3. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng ..................27
3.4.4. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng phƣơng

pháp nhuộm STM ....................................................................................27
3.4.5. Phƣơng pháp nuôi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx ................28
3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx..............................................29
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................31
4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA.........................................31
4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR .........................32
4.2.1. Điều tra sự nhiễm bệnh cằn mía gốc dựa vào triệu chứng. Phát hiện vi
khuẩn Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp
nhuộm STM. ............................................................................................32
4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến q trình ni cấy vi khuẩn Lxx
và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên mơi trƣờng ni cấy.......................36
4.2.3. PCR phát hiện vi khuẩn Lxx ....................................................................37
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 41
5.1. Kết luận .......................................................................................................... 41
5.2. Đề nghị ............................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................43
PHỤ LỤC ................................................................................................................... xii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
BẢNG

TRANG

Bảng 1.1. Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh. ........................ 6
Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt ..................... 30

Bảng 4.1. Kết quả chẩn đốn bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp
quan sát dƣới kính hiển vi ........................................................................ 34
Bảng 4.2. Kết quả chẩn đốn bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại
TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp nhuộm STM. .. 35
Bảng 4.3. So sánh kết quả chẩn đoán của hai phƣơng pháp:
dùng kính hiển vi và nhuộm STM. .......................................................... 36
Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp ..................................... 11
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT - PCR ................................................. 13
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra .......................................................................................... 24
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA ........................................................ 25
Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA .......................................................... 25

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


x

DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1. Cây mía ..................................................................................................... 3
Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên cây mía ............................................................... 6
Hình 2.3. Triệu chứng bệnh khảm lá mía ................................................................ 7
Hình 2.4. Sugarcane mosaic virus ............................................................................ 8
Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA......................................... 12
Hình 2.6. Lxx gây những vết chuyển màu ở thân mía. ............................................. 15
Hình 2.7. Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli dƣới kính hiển vi điện tử
(x30.000 lần) (K. E. Damann, 2002). ..................................................... 16

Hình 4.1. Kết quả chẩn đoán SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA. ..... 32
Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần) ........................ 34
Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi
(x 40 lần (A) và x 100 lần (B)). ............................................................... 35
Hình 4.4. Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx trên môi trƣờng
sau 2 ngày nuôi cấy (A); và khuẩn lạc của nó sau khi phân lập (B). ...... 36
Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng và thu mẫu. ........................................................ xvi
Hình PL2. Lá mía có triệu chứng khảm. .................................................................. xvi
Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích ELISA. ................................................ xvi
Hình PL4. Bệnh đốm vòng thƣờng xuất hiện trên các cây khảo sát. ....................... xvi
Hình PL5. Quá trình điều tra và thu mẫu. ................................................................ xvi
Hình PL6. Gốc mía bị cằn. ....................................................................................... xvi
Hình PL7. Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên ngắn lại. ................................................ xvii
Hình PL8. Thân mía bị bệnh có đƣờng kính nhỏ hơn thân bình thƣờng. ................ xvii
Hình PL9,10. Vết đổi màu bên trong thân........................................................................ xvii

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


xi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ELISA: enzym linked immunosorbent assay.
DAS-ELISA: double antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay.
TTNCMĐ:

Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng.

RT-PCR:

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction.

cDNA:

Complementary Deoxyribonucleotide acid.

ctv:

Cộng tác viên.

NCM:

Màng nitrocellulose

ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate.
DEPC:

Diethyl pyrocarbonate.

dNTP:

Deoxyribonucleoside triphosphate.

p-NPP:

p - nitrophenol phosphate.

PVP:

Polyvinylpyrrolidone.

BSA:

Bovine serum albumin.

PBS:

Dung dịch chứa PVP, BSA, Tween–20 và sodium azide.

RNA:

Ribonucleic acid.

bp:

Base pair.

EDTA:

Ethylenediaminetetraacetic acid.

mRNA: Messenger RNA.
PCR:

Polymerase chain reaction.

RNase:

Ribonuclease.

SCMV: Sugarcane Mosaic Virus.
RSD:

Ratoon stunting disease.

Lxx:

Leifsonia xyli subsp. xyli.

STM:

Stainning transpiration.

TTPT:

Trung tâm phân tích.

Taq:

Thermus aquaticus.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


1

Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1.

Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu

Hiện nay cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp
cho hiệu quả kinh tế cao ở nƣớc ta cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Cuba, Ấn
Độ, Australia,.v.v. vì vậy diện tích trồng mía cũng nhƣ sự ra đời của nhiều giống mới
không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên mía là cây trồng một lần
nhƣng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều
kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh gây hại tồn tại và phát triển (Nguyễn Huy Ƣớc,
1994). Hơn nữa khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến
đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh đa dạng hơn. Các bệnh quan trọng ảnh hƣởng
đến năng suất mía hiện nay có rất nhiều, trong đó phải kể đến bệnh khảm lá mía và
bệnh cằn mía gốc.
Bệnh khảm lá mía do virus Sugarcane Mosaic gây ra là bệnh rất phổ biến và có ảnh
hƣởng lớn đến ngành sản xuất mía đƣờng của nhiều nƣớc trên thế giới. Thiệt hại
nghiêm trọng về năng suất đã đƣợc ghi nhận tại các vùng trồng mía lớn thuộc châu
Mỹ, châu Úc; mức thiệt hại có thể lên đến 50% đối với các giống mẫn cảm (Lê Lƣơng
Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Bệnh thƣờng gây hại ở các vùng ơn đới và ít hơn tại các
vùng nhiệt đới. Cụ thể theo kết quả điều tra của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987), bệnh
khảm lá mía đã xuất hiện nhƣng rải rác, thiệt hại gây ra chƣa ở mức đáng quan tâm.
Chính vì vậy mà hiện nay ở nƣớc ta bệnh khảm lá mía chƣa đƣợc quan tâm đúng mức
trên cả phƣơng diện thống kê giống – vùng bị bệnh và các phƣơng pháp chẩn đoán
bệnh hiệu quả. Do vậy việc điều tra phát hiện bệnh khảm lá trên các giống mía nhập
nội và sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng nhằm thống kê lại tình hình nhiễm
bệnh khảm lá mía trên các giống khảo sát, kiểm định giống mới nhập nhằm nâng cao
hiệu quả chọn lọc giống và kiểm sốt bệnh.
Bệnh cằn mía gốc (RSD) gây ra bởi vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) đây là
một loại vi khuẩn gram dƣơng nhỏ chỉ gây bệnh trên mía. Bệnh có thể gây tổn thất lên
đến 50% tổng sản lƣợng mía thu đƣợc (Davis, 1980). Việc chẩn đốn phát hiện Lxx rất
khó vì nó ít gây ra các triệu chứng lâm sàng đặc trƣng có thể phát hiện đƣợc trên đồng
ruộng. Nhìn chung cây bị nhiễm Lxx sẽ phát triển chậm hơn so với các cây khác cùng

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


2

độ tuổi. Do vậy ngƣời sản xuất thƣờng lầm tƣởng hay lẫn lộn nguyên nhân của sự
chậm lớn trên là do vùng đất trồng kém dinh dƣỡng, độ ẩm không thích hợp hay cây bị
thiếu chất. Các phƣơng pháp phát hiện Lxx nhƣ là nhìn dƣới kính hiển vi, phát hiện
bằng phƣơng pháp miễn dịch học,.v.v. cũng đƣợc phát triển nhƣng độ chính xác và độ
nhạy chƣa cao. Do vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đốn
nhanh và chính xác bệnh là một u cầu cần thiết, có ý nghĩa rất quan trọng, phục vụ
cho cơng tác chọn giống, kiểm định giống từ đó đề ra các khuyến cáo nhằm kiểm sốt
và quản lí bệnh có hiệu quả.
Trƣớc tình hình trên, đƣợc sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Bùi Cách Tuyến và sự hỗ
trợ từ TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng chúng tơi đã thực hiện đề tài “Phát hiện bệnh
khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn
mía gốc bằng kỹ thuật PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện trên một số giống mía nhập nội
và sản xuất tại tỉnh Bình Dƣơng (Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng) và Đồng Nai
(Nơng trƣờng Thọ Vực)”.
1.2.
-

Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc trên một số
giống mía sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng và nơng trƣờng Thọ Vực
tỉnh Đồng Nai.

-

Kiểm định các giống mía mới nhập nội năm 2005.

-

Phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát vi khuẩn Lxx dƣới kính
hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM (Stainning transpiration).

-

Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx.

-

Phát hiện trực tiếp vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía bằng kỹ thuật PCR.

1.3.
-

Giới hạn đề tài
Thời gian thực hiện đề tài có hạn vì vậy khơng thể tiến hành điều tra khảo sát và
theo dõi diễn biến bệnh trên các giai đoạn tăng trƣởng đƣợc.

-

Nghiên cứu phân lập vi khuẩn Lxx cần thời gian dài vì đây là loại vi khuẩn khó
ni cấy trên mơi trƣờng.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Sơ lƣợc về cây mía

2.1.1. Lịch sử phát hiện
Cây mía (Saccharum spp.) đã đƣợc biết từ rất lâu (cách nay
khoảng 2200 năm), khi quân đội của Alexander chinh phục Ấn
Độ vào năm 326 trƣớc Công Ngun họ đã thấy đƣợc cây mía
(Hình 2.1). Cây mía đến Persia vào thế kỉ thứ 6 và ngƣời Ả Rập
đã mang cây mía đến Ai Cập vào năm 641 sau Cơng Ngun
trong q trình chinh phục các miền đất của họ. Cây mía cũng
đƣợc mở rộng phân bố bằng cách này đến Syria, Cyprus, Crete,
và đến Tây Ban Nha vào khoảng những năm 714 sau cơng

Hình 2.1. Cây mía

ngun. Vào những năm 1150 ngành cơng nghiệp mía đƣờng ở

(Nguồn:

Tây Ban Nha rất phát triển với khoảng 30000 ha mía đƣợc

Rott, 2000)

Philipe

trồng. Vào khoảng năm 1420 ngƣời Bồ Đào Nha đã đƣa cây mía đến Madeira nơi mà
chúng ngay lập tức lan rộng sang các quần đảo Canary, Azores. Nhà máy xử lí mía

hoạt động đầu tiên vào năm 1516 ở nƣớc cộng hòa Dominica. Sản phẩm đƣờng đƣợc
đƣa đến Cuba, Jamaica, Puerto Rico vào những năm cuối của thế kỷ 15.
2.1.2. Phân loại
Cây mía thuộc họ Gramineae, giống Saccharum (S) là hỗn hợp của sáu loài cỏ lƣu
năm thuộc giống Saccharum L., trong đó có hai lồi hoang dại (S. spontaneum L. và S.
robustum Brvaes & Jeswiet ex Grassl) và 4 loài cây trồng ở vƣờn (S. officinarum L., S.
barberi Jeswiet, S. sinense Roxb., và S. edule Hassk . Bốn lồi cây trồng ở vƣờn có sự
lai giống phức tạp và ln có thể giao phấn chéo với nhau. Tất cả các loại giống mía
thƣơng mại đƣợc trồng hiện nay đều là các giống lai giữa các loài này với nhau.
2.1.3. Nguồn gốc và phân bố
Cây mía đƣợc cho là có nguồn gốc từ vùng nam Thái Bình Dƣơng.
 S. spontaneum xuất hiện trong quần thể hoang dại ở phía đơng và nam Châu
Phi, từ suốt vùng trung đơng đến Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên và Malaysia,
và từ suốt vùng Thái Bình Dƣơng đến New Guinea.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


4

 Trung tâm xuất xứ của cây mía có thể là ở miền nam Ấn Độ nơi đã xuất hiện
giống S. robustum có số lƣợng NST nhỏ nhất dọc theo bờ sơng ở New Guinea
và một ít ở các đảo liền kề và đã trở thành cây bản xứ của khu vực này.
 S. officinarum còn gọi là “noble cane” giống với các cây mía nguồn gốc ở
New Guinea. Loại mía này chỉ phù hợp với vùng nhiệt đới với điều kiện đất
đai và khí hậu thuận lợi.
 S. barberi có thể có nguồn gốc ở Ấn Độ.
 S. sinense có xuất xứ một phần ở Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, nam Trung
Quốc và Triều Tiên.
 S. edule là loại không thể sản xuất mùa màng nhƣ S. robustum và chỉ tìm thấy

đƣợc ở New Guinea và các đảo kế cận.
Cây mía hiện tại là cây trồng chính tại nhiều nƣớc vùng nhiệt đới. Vĩ độ cao nhất
mà cây mía đƣợc trồng là tại Natal, Argentina và tại cực nam của Australia (khoảng 30
độ S), và khoảng 34 độ N phía tây nam Pakistan, và 37 độ N ở nam Tây Ban Nha.
2.1.4. Nhân giống
Để nhân giống mía ngƣời ta thƣờng trồng bằng thân mía cắt từ cây mía chƣa
trƣởng thành có thời gian trồng từ 6 - 8 tháng tuổi. Những đoạn thân này đƣợc gọi là
"setts", "seed", "seed - cane" hay "seed - pieces". “Sett” đƣợc cho là tốt nhất nếu đƣợc
lấy từ đốt thứ ba từ dƣới lên của cây mía vì chồi ở đốt này cịn non và ít bị khơ. “Sett”
có thể đƣợc trồng xiên theo một góc 45OC hay cũng có thể đặt nằm ngang ln lên trên
luống. Ƣớc tính cần 12.500 - 20.000 “sett” để trồng hết 1 hecta. Mía là cây trồng
quanh năm với thời gian từ 3 - 6 năm trƣớc khi đƣợc đốn bỏ và trồng lại. Vụ đầu tiên
đƣợc gọi là mía tơ và thƣờng mất khoảng 9 - 24 tháng để cây trƣởng thành, nó phụ
thuộc vào vùng địa lý. Các vụ mía gốc mất khoảng 1 năm để trƣởng thành và thƣờng
thì sau khoảng hai vụ mía gốc là ngƣời ta đã thay bằng các ruộng mía mới, điều này
phụ thuộc vào năng suất và sự chậm suy tàn của giống.
2.1.5. Sản lƣợng
Năng suất cao nhất của mía về chỉ số calories trên đơn vị diện tích là 10 tấn đƣờng
(sucrose) trên hecta ở Barbardos. Sản lƣợng cao nhất đạt đƣợc ở Hawaii là 22 tấn
sucrose trên hecta, nhƣng giống mía này cần đến 2 năm hay hơn mới có thể đạt đƣợc
trạng thái thành thục ở khu vực này. Sản lƣợng mía đã đƣợc cải thiện và gia tăng đáng

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


5

kể trong suốt 100 năm qua nhờ quá trình cải tiến giống, đặc biệt là nhờ vào việc sử
dụng phân bón, kiểm sốt đƣợc cơn trùng và các loại bệnh, cơ giới hóa đồng ruộng và
nhà máy, và việc tạo ra nhiều giống mới cho năng suất cao.

2.1.6. Chế biến và sử dụng
Trƣớc khi sản phẩm đƣờng đƣợc làm ra lần đầu tiên ở Ấn Độ khoảng 1000 năm
trƣớc công ngun, nhờ vào việc đun sơi dịch chiết nƣớc mía thì cây mía ban đầu đƣợc
trồng chỉ nhằm mục đích làm thực phẩm mà thơi. Ngày nay cây mía đƣợc nhiều ngành
công nghiệp sử dụng và là một trong những sản phẩm đƣợc sử dụng rộng rãi và có giá
trị của mỗi quốc gia.
- Khoảng 1 tấn đƣờng thơ có thể thu đƣợc khi chế biến 8 - 9 tấn mía. Loại đƣờng
thơ màu nâu này có thể đƣợc tinh chế thành đƣờng trắng sạch hơn.
- Cây mía đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích khác hơn nữa chứ khơng riêng gì
việc sản xuất ra đƣờng:
 Mật đƣờng là sản phẩm phụ trong q trình chế biến đƣờng, nó là chất lắng
xuống khi khơng cịn khả năng kết tinh thành đƣờng. Gần 2,7% mật đƣờng
hình thành khi chiết xuất 1 tấn mía. Mật đƣờng đƣợc sử dụng cho nhiều mục
đích khác nhau: dùng để làm phân bón cho đất trồng mía, đƣợc vơ trùng và lên
men để tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau nhƣ cồn vô trùng, rƣợu rum, hay
ethyl alcohol.
 Sản phẩm cịn lại sau q trình ép nƣớc mía đó là bã mía đƣợc dùng nhƣ là
nguồn nhiên liệu chính của các nhà máy đƣờng, nó cịn đƣờc dùng để làm
giấy, bìa cứng, bảng và tƣờng bằng giấy ép cứng.
2.2.

Bệnh trên cây mía

Theo thống kê ở các nƣớc trồng mía hiện nay thì có tất cả 126 bệnh hại mía trên thế
giới (Philippe Rott, 2000), trong đó có 73 bệnh hại phổ biến. Bệnh hại đƣợc gây ra bởi
8 nhóm tác nhân chính cho ở Bảng 1.1.
Trong đó bệnh do virus là loại bệnh khó kiểm soát nhất và gây thiệt hại nghiêm
trọng nhƣ bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic), bệnh vàng gân lá (Yellow leaf
syndrome), bệnh Fiji (Fiji disease),.v.v.
Bệnh do nấm gây ra có số lƣợng nhiều nhất cũng nhƣ là gây thiệt hại nhiều nhất

nhƣ bệnh đốm vòng (Ring spot), bệnh mốc sƣơng (Downy mildew), bệnh than (Smut).

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


6

Bảng 1.1. Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh đang xảy ra trên cây
mía (Hà Đình Tuấn, 2004).
Nhóm tác nhân gây bệnh

Số lƣợng bệnh gây ra

1. Bệnh do virus

9

2. Bệnh do phytoplasma

2

3. Bệnh do vi khuẩn

9

4. Bệnh do nấm

68

5. Tuyến trùng và chƣa rõ tác nhân

24

6. Thực vật bán ký sinh

3

7. Dinh dƣỡng, môi trƣờng

9

8. Hình hƣởng của thuốc trừ cỏ

2

Tổng cộng

126

Vi khuẩn gây ra 4 loại bệnh nghiêm trọng là bệnh gôm (Gumming), bệnh cháy lá
(Leaf scald), bệnh cằn mía gốc (Ratoon strunting disease) và bệnh sọc đỏ (Red stripe).

Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên mía cây mía (Philippe Rott, 2000)
Chú thích: A: Bệnh khảm lá mía; B: Bệnh vàng gân lá (YLSD); C: Bệnh thối đỏ; D:
Bệnh than (Smut); E: Bệnh gôm (Gumming disease); F: Bệnh cằn mía gốc.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


7

2.3.

Bệnh khảm lá mía

2.3.1. Nguồn gốc và phân bố
Bệnh khảm đƣợc công nhận đầu tiên vào năm 1892, đƣợc xem nhƣ là một đặc tính
bất thƣờng trên mía bởi Musschenbrock ở Java. Ơng đã đặt tên cho nó là bệnh đốm
sọc vàng “gelestrepenziekte”.
Nguồn gốc của bệnh khảm trên mía thì không đƣợc biết rõ, nhƣng qua các lần quan
sát, theo dõi thì Brandes đã kết luận rằng kí chủ là virus có cùng một điểm phát sinh.
Nên theo ơng virus này phải xuất phát từ New Guinea, nơi mà mía là một lồi địa
phƣơng. Ngƣời ta phỏng đốn rằng bệnh có từ thời kì tiền sử và lan đến các vùng khác
cùng với sự di chuyển của cây mía từ New Guinea.
2.3.2. Triệu chứng
Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1999), triệu chứng đặc trƣng của bệnh là các
vết khảm xanh nhợt hoặc vàng trên lá. Vết bệnh sau đó sẽ chuyển thành vết chết hoại,
hiện tƣợng này đơi khi còn thấy trên thân. Sự biểu hiện triệu chứng cịn phụ thuộc vào
chủng virus, cây kí chủ và điều kiện môi trƣờng, đặc biệt là yếu tố nhiệt độ.
Bênh khảm virus đƣợc xác định chủ yếu trên lá, mức độ khác nhau tùy vào dịng
mía, điều kiện sinh trƣởng, nhiệt độ và chủng virus có liên quan. Triệu chứng thông
thƣờng là vết đốm đặc trƣng màu xạnh nhạt mờ ảo, tƣơng phản trên phiến lá, hoặc
những vùng màu xanh nhạt hay biến vàng là kết quả phân bố của các mức độ hàm
lƣợng diệp lục tố khác nhau (Hình 2.3).

A

B

C

Hình 2.3. Triệu chứng của bệnh khảm lá mía. (Bailey, 1998)
Chú thích: A: Cây cịi cọc và vàng lá; B: Vết khảm màu xanh nhợt trên lá; C: Vết
khảm vàng trên lá non.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


8

Những vùng biến vàng thông thƣờng thấy rõ nhất ở lá non, lá đang sinh trƣởng
mạnh. Sự phân bố của những vùng biến vàng cũng khác nhau, đôi khi chỉ xuất hiện
những vết sọc rất nhạt trên mặt lá, nhƣng phổ biến hơn là các vùng biến vàng chiếm
phần lớn trên nền lá màu xanh bình thƣờng, và phân bố đều hơn trên mặt lá. Bệnh đôi
khi gây những vùng hoại tử kéo dài bên trong mô tế bào thân. Ở phần mắt lóng của
thân nhiễm bệnh có màu hồng đến hơi nâu.
Sau khi cây bị nhiễm bệnh, virus có thể lan đến toàn bộ các bộ phận của cây, nhƣng
triệu chứng khảm chỉ xuất hiện trên lá non, đang phát triển, và không xuất hiện ở chổ
khác đã phát triển đầy đủ trƣớc đó.
Ở lá bị bệnh, tế bào của vùng biến vàng có thể bị kìm hãm nên tại đó sự sinh
trƣởng giảm, có ít hoặc khơng có sự khác biệt về cấu trúc mô về tế bào so với lá bình
thƣờng. Lục lạp ở những vùng biến vàng thì nhỏ, ít về số lƣợng và phần lá biến vàng
mỏng hơn so với vùng màu xanh của lá bình thƣờng.
2.3.3. Tác nhân gây bệnh
Sugarcane mosaic virus là tác nhân gây ra bệnh
khảm lá mía, thuộc nhóm Potyvirus. Những nghiên cứu
về điện di cho thấy virus SCMV có hình sợi, kích thƣớc
750 x 13nm, acid nucleic của virus là dạng sợi đơn
RNA, RNA có hệ số kết tủa là 34 - 38,9 S. Trọng lƣợng
phân tử là 2,7 - 3,1 x 106 daltons, trong đó gồm 33,5%

A, 20,3% G, 16,2% C và 30% U. Á đơn vị protein của

Hình 2.4. SCMV dƣới kính

SCMV có trọng lƣợng phân tử là 28.500 - 36.500

hiển vi điện tử (x 30.000 lần)

daltons và có 264 - 273 gốc amino acid. Thể vùi của

(Nguồn: www. Plantpathology)

virus trong tế bào cây có dạng hình trụ. Ngƣỡng pha
loãng là 10-2 - 10-5. Những phân tử virus đƣợc sắp xếp ngẫu nhiên trong tế bào chất,
trong khi những siêu thể vùi với lớp màng mỏng xuất hiện giữa chất nguyên sinh và
thành tế bào.
Nhiều đặc tính của virus SCMV cũng đƣợc nghiên cứu. Hệ số lắng đọng là 176 ±
5S và mật độ lơ lửng là 1,3327 của SCMV-D, và giá trị 148 ± 2 – 170 ± 5S tƣơng ứng
với 1,285 – 1,3421 của SCMV –J.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


9

2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía
Có nhiều chủng virus khác nhau, khác biệt trong khả năng gây nhiễm và mức độ
thiệt hại do chúng gây ra. Những chủng virus khác nhau thƣờng tạo ra những triệu
chứng tƣơng tự nhau trên hầu hết các dịng mía thƣơng mại hiện nay. Tuy nhiên chúng
cũng có thể đƣợc phân biệt bằng các dòng chỉ thị chọn lọc.

Theo Koike và Gillaspie (1989) thì có tổng cộng 14 chủng virus SCMV gây bệnh
khảm lá phân bố khắp thế giới là A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N.
2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh
Virus khảm lá mía lan truyền qua nhiều loại rệp muội theo phƣơng thức nửa bền
vững. Rệp ngô Rhapalosiphum maidis Fitch, rệp bơng Aphis gossipii, rệp đào Myzus
persicae, rệp mía Melanaphis sacchari … là mơi giới chủ yếu truyền bệnh. Ngồi ra
bệnh cịn có thể truyền qua con đƣờng nhân giống vơ tính. Virus gây bệnh cũng có thể
truyền qua hạt ngơ.
Cây mía mẫn cảm với bệnh ở giai đoạn cây con. Sự phát triển của bệnh trên đồng
ruộng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: sức chống chịu của giống mía, sự có mặt của
các chủng virus gây bệnh và sự tồn tại của quần thể rệp trên đồng ruộng. Điều kiện
canh tác cũng ảnh hƣởng đến sự mẫn cảm của cây và hoạt động của rệp.
Virus có phạm vi kí chủ rộng, gây hại trên một số loại cây trồng nhƣ ngô, cao
lƣơng và nhiều loại cỏ khác.
2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế
Trong suốt thời kì từ năm 1928 - 1930, khi bệnh khảm lan rộng nhanh chóng ở Tây
Hamiphere, thì việc năng suất giảm 30 - 40% là phổ biến, đôi khi lên đến 60 - 80%.
Bệnh khảm thƣờng xuyên kéo dài là yếu tố gây ra sự giảm tồn bộ năng suất, khơng kể
có hay khơng các yếu tố khác có liên quan đến (Koike và Gillaspie, 1989).
Sự mất mát về kinh tế phụ thuộc vào tính mẫn cảm với bệnh của các dịng mía,
chủng virus gây bệnh, sự tƣơng tác với các bệnh khác, quần thể môi giới, thời tiết và
điều kiện môi trƣờng canh tác.
Sự kết hợp của bệnh khảm và các bệnh khác làm giảm sự sinh trƣởng của cây cao
hơn khi bệnh tác động riêng rẻ. Ngƣời ta đã theo dõi và nhận thấy rằng có sự giảm sút
lớn về năng suất khi bệnh khảm và bệnh cằn gốc mía cùng xuất hiện trên các giống
CP44-101, CP52-68 và NCo hơn từng bệnh riêng lẻ (Koike và Gillaspie, 1989).

LUAN VAN CHAT LUONG download : add

10

2.3.7. Phòng trừ
Sử dụng giống kháng, chọn nguồn giống khỏe, sạch bệnh làm vật liệu trồng.
Tiêu diệt cây bệnh và cỏ dại, hạn chế bệnh lây lan, ẩn náu trên đồng ruộng.
Luân canh với cây trồng khác họ.
Xử lí hom giống bằng nhiệt độ hoặc thuốc hóa học.
Ni cấy mơ phân sinh ngọn hoặc nuôi cấy mô kết hợp với xử lí nhiệt.
Tránh trồng và đốn mía vào thời kỳ có mật độ cao của quần thể mơi giới.
2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía
2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh
Phƣơng pháp này đơn giản và nhanh nhất nhƣng hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm
tính giả cũng cao nhất. Đơn giản vì vết bệnh dễ biến đổi, nhiều khi cây bị bệnh mà vết
bệnh không phát ra ngoài. Một số trƣờng hợp khác nhƣ vết bệnh không rõ ràng, bệnh
trong giai đoạn tiềm ẩn cũng gây khó khăn trong chẩn đốn.
2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đốn dùng kính hiển vi
Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dịch chiết từ lá cây bệnh hoặc thông qua làm tinh
khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Đây
là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản.
2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay)
Phƣơng pháp ELISA là phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzym. Năm 1972 - 1973,
ELISA đƣợc sử dụng đầu tiên trong y học để chẩn đoán virus. Đến năm 1977 Clark và
Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định virus hại thực vật tại Scottlen. Đây là
kỹ thuật khá nhạy và tƣơng đối đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) và
kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml), rẻ tiền, an toàn và độ chính xác
cao (Phạm Văn Ty, 2001).
Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là:
-

Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó,

kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc
phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme).

-

Indirect ELISA: Phƣơng pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng
nguyên khơng đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng
thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme).

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


11

-

Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực
tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Đƣợc gọi là “sandwich” là do kết quả thí
nghiệm đƣợc đánh giá thơng qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể
bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kỹ thuật
này cũng đƣợc phân làm hai dạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA - Triple
antibody sandwich).
Trong phạm vi khóa luận này, chúng tơi đã sử dụng kỹ thuật DAS ELISA (Double

Antibody Sandwich) để thực hiện chẩn đoán SCMV. Đây là một dạng của Direct
sandwich ELISA với kháng thể sử dụng là kháng thể đa dòng. Quy trình các bƣớc thực
hiện DAS ELISA đƣợc sơ đồ hóa nhƣ Sơ đồ 2.1.
Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA
Ủ, rửa
Thêm kháng nguyên vào

Ủ, rửa
Bổ sung kháng thể có gắn enzyme
Ủ, rửa
Thêm cơ chất tạo màu
Ủ, đọc kết quả
Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp
Phân tích kết quả ELISA dựa trên sự đổi màu của các giếng (Hình 2.5) và bằng
máy đọc ELISA. Máy đọc ELISA hoạt động dựa trên nguyên lí quang phổ kế, đo giá
trị OD của các giếng ở bƣớc sóng 405 nm.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add