Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng và nồng độ Ba, Kinetin, IBA, NAA, IAA đến quá trình tạo chồi và tạo rễ cây Măng Tây (Asparagus Officinalis L.) in vitro

ĐẠI HOC
NGUYỄN TẤT THÀNH
NGUYEN T/\T THANH

THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỤC DANH - THỤC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHÀN

KHỐNG VÀ NỒNG Độ BA, KINETIN, IBA, NAA, IAA

ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO CHỒI VÀ TẠO RẺ CÂY
MĂNG TÂY (Asparagus officinalis L.) IN VITRO

Sinh viên thực hiện

: Hoàng Thị Thúy

MSSV

: 1600002711

GVHD

: ThS. ĐỒ Tiến Vinh

ThS. Mai Thị Phương Hoa

TP. HCM, 2020


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN......................................................................................................................... i
MỤC LỤC...............................................................................................................................ii

TÓM TẮT.............................................................................................................................. iv
SUMMARY.............................................................................................................................V
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH......................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG BIẺU............................................................................................... vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT........................................................................................viii

ĐẶT
• VÁN ĐÈ........................................................................................................................ ix
1 Tính cấp thiết của đề tài.................................................................................................... ix

2. Mục tiêu của đề tài............................................................................................................ X
3. Giới hạn và phạm vi nghiên cứu..................................................................................... X
CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................... 1
1.1

Cây Măng Tây................................................................................................................. 1

1.1.1 Đặc điểm phân bố......................................................................................................... 1

1.1.2 Đặc điểm thực vật......................................................................................................... 1
1.1.3 Thành phần hóa học và cơng dụng............................................................................ 2

1.1.4 Giá trị kinh tế .............................................................................................................. 3

1.2

Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học................................................... 3

1.2.1 Nuôi cấy mô.................................................................................................................. 3
1.2.2 Cơ sở khoa học.............................................................................................................4

1.2.3 Ưu thế và phạm vi ứng dụng...................................................................................... 5
1.3

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật....................................................................... 6

1.3.1 Nhóm auxin.................................................................................................................. 6

ii


1.3.2 Nhóm các cytokinin..................................................................................................... 7

1.4 Các cơng trình nghiên cứu trong và ngồi nước......................................................... 8
1.4.1 Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới...................................................................8

1.4.2 Các cơng trình nghiên cứu ở trong nước................................................................. 8
CHƯƠNG 2. NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu............................. 10

2.1 Nơi thực hiện................................................................................................................. 10
2.2 Nội dung nghiên cứu....................................................................................................10
2.3 Phương pháp nghiên cứu.............................................................................................. 10

2.3.2 Nội dung nghiên cứu................................................................................................... 11
2.4 phương pháp thu thập xử lý số liệu............................................................................. 14

2.4.1 Phương pháp thu thập số liệu....................................................................................14
2.4.2 . Xử lý số liệu............................................................................................................. 14
CHƯƠNG 3. KÉT QƯẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................... 15

3.1 Kết quả thí nghiệm 1: Vơ trùng mầu........................................................................... 15
3.2 Kết quả thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng thành phần mơi trường khống đến sự

sinh trưởng và phát triển cây Măng Tây.............................................................................. 17
3.3 Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ BA và Kinetin đến q trình ni

cấy tạo chồi cây Măng Tây.................................................................................................... 20
3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA, IAA đến quá trình tạo rề cây Măng Tây

in vitro..................................................................................................................................... 22
KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ............................................................................................... 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................26
PHỤ LỤC.............................................................................................................................. 27

iii


TÓM TẮT
Măng tây (Asparagus oficinalis) là một loại thực vật dùng làm rau có giá trị kinh
tế cao và rất được ưa chuộng trên thị trường. Đề tài: Kháo sát ảnh hưởng của thành
phần khoáng và nồng độ BA, kinetin, IBA, NAA, IAA đến q trình tạo chịi và rễ
cây Măng Tây (Asparagus officinalis L.) ìn vitro. Được thực hiện từ tháng 10/2019 đến

4/2020 tại Phịng Ni cấy mơ Thực vật, khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học

Nguyễn Tất Thành với mục tiêu xác định thành phần khống thích hợp và nồng độ chất
điều hịa sinh trưởng thích họp đến quá trình tạo chồi và tạo rễ cây Măng Tây (Asparagus
oficinalis L.) in vitro.

Đề tài có bốn nội dung: (Các thí nghiệm được bổ trí theo kiểu hồn tồn ngầu nhiên)

-

Vô trùng mẫu cây Măng Tây

-

Khảo sát môi trường khống cơ bản ni cấy cây Măng Tây in vitro

-

Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ BA và Kinetin đến q trình ni cấy tạo chồi cây

Măng Tây

-

Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA, IAA đến quá trình tạo rễ cây Măng Tây in
vitro.

Những kết quả đạt được sau 6 tháng nghiên cứu:

-

Nồng độ javel 75% trong 10 phút là thích họp để vơ trùng mẫu hạt Măng Tây

-

Mơi trường LV thích họp để nhân giống cây Măng Tây

-

Mơi trường thích họp để tạo chồi của cây Măng Tây: LV bổ sung BA 1 mg/1

-

Mơi trường thích họp để tạo rễ của cây Măng Tây: LV bổ sung NAA 3 mg/1.

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cây Măng Tây....................................................................................................... 1
Hình 2.1 Sơ đồ tổng quan nội dung nghiên cứu................................................................. 10
Hình 3.1 Vơ trùng mẫu cây Măng Tây................................................................................ 17
Hình 3.2 Chồi Măng Tây ni cấy trên các mơi trường................................................. 19
Hình 3.3 Chồi Măng Tây ni cấy trên các mơi trường có bổ sung kinetin.................21
Hình 3.4 Chồi Măng Tây ni cấy trên các mơi trường có bổ sung BA....................... 22
Hình 3.5 Chồi Măng Tây ni cấy trên các mơi trường có bổ sung: IBA; IAA và

NAA..................................................................................................................... 24

VI


DANH MỤC
• BẢNG BIỂU
Bảng 2.1 Nồng độ javel và thời gian thí nghiệm vơ trùng mẫu....................................... 11
Bảng 2.2 Mơi trường khống cơ bản ni cấy cây Măng Tây......................................... 12
Bảng 2.3 Nồng độ BA và kinetin sử dung nuôi cấy tạo chồi cây Măng Tây................. 13
Bảng 2.4 Nồng độ IAA, IBA và NAA sử dụng nuôi cấy tạo rề....................................... 14
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian vô trùng mầu............................. 16

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát môi trường khống cơ bản ni cấy cây Măng Tây.......... 19
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA và kinetin đến q trình ni cấy tạo
chồi cây Măng Tây................................................................................................21
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IAA, IBA và NAA đến q trình

ni cấy tạo rề cây Măng Tây............................................................................. 23

vii


DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT
BA

Benzyladenine

B5

Môi trường Gamborg 1968

CTV

Cộng tác viên

IBA

Indolebutyric acid

LV

Môi trường Litvay 1985

MS

Môi trường Murashige-Skoog 1962

Môi trường thạch

Môi trường có bổ sung agar 8 g/L

NAA

a-Naphthalene acetic acid

NT

Nghiệm thức

TN

Thí nghiệm

ĐHST

Điều hịa sinh trưởng

WPM

Mơi trường Loyd & McCown 1980

V111


ĐẶT VẤN ĐỀ
1 Tính cấp thiết của đề tài

Măng Tây {Asparagus officinalis L.) có nguồn gốc từ các nước Châu Âu (phía bắc
Tây Ban Nha, Vương quốc Anh, và tây bắc Đức). Ở Việt Nam Măng Tây đà được du

nhập vào từ những năm 1960 - 1970. Măng Tây được biết đến là một loại rau xanh rất

ngon và bổ dường, hàm lượng dinh dưỡng cao và có nhiều dược tính. Mãng Tây chứa
nhiều nước, chất xơ, vitamin và khống chất nên nó đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.
Măng Tây còn là nguồn cung cấp đạm giúp người lao động trí óc giảm stress, tăng cường

sinh lực và sức dẻo dai khi làm việc, chống béo phì và chống lão hóa da, ổn định kinh
nguyệt, tốt cho sữa mẹ, làm giảm cholesterol, giúp ổn định huyết áp, phòng ngừa xơ vừa

động mạch vành và bệnh đột quỵ tim mạch rất hữu hiệu. Không chỉ được biết đến với

công dụng là rau xanh làm thực phẩm mà Măng Tây cịn được biết đến với cơng dụng
là làm kiểng.

Măng Tây trên thị trường được sử dụng nhiều dạng, bên cạnh sử dụng măng tươi
Măng Tây còn là nguyên liệu cho cơng nghệ đồ hộp, là mặt hàng xuất khẩu có giá trị
kinh tế cao. Những năm gần đây, để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường, diện

tích trồng Măng Tây tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, việc này đòi hởi rất nghiêm ngặt về
điều kiện trồng và chăn sóc cũng như khả năng kháng sâu bệnh nên quy mơ trồng Măng
Tây cịn hạn chế chưa đáp ứng được nhu cầu rất lớn của thị trường. Để đáp ứng nhu cầu

làm thực phẩm và dược liệu với số lượng lón thì cần phải có nguồn giống Măng Tây có

năng suất cao, nguồn giống sạch bệnh. Tuy nhiên, do việc phát triển diện tích trồng hiện
nay mang tính tự phát, tính tạp giao tự nhiên phức tạp và việc thiếu chiến lược chọn tạo

giống họp lý đã ảnh hưởng rất lón đến năng suất và chất lượng của sản phẩm Măng Tây.
Đẻ có chiến lược phát triển lâu dài đem lại hiệu quả kinh tế - kĩ thuật cao, vấn đề tuyển

chọn và xây dựng quy trình nhân giống loài cây này là rất cần thiết.
Hiện nay, cây Măng Tây chủ yểu được nhân giống theo phương pháp truyền thống
từ cây Măng Tây mẹ được tách thành 2-4 phần để nhân lên cây con, phương pháp này
cho hệ số nhân thấp và khó đảm bảo được cây sạch bệnh. Nhân giống cây Măng Tây

bằng hạt khó có thể thực hiện vì là cây có hoa đực và hoa cái khác thân và là cây có hoa

đực và hoa cái dị hợp từ. Nguồn giống nhập khẩu nên giá thành hạt giống cao, tỷ lệ nảy

IX

mầm thấp làm tăng chi phí sản xuất. Ni cấy mô thực vật là một phương phát rất được

quan tâm hiện nay đây là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công nổi
bật của công nghệ sinh học thực vật. Nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy mơ có thể sản

xuất số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn, chất lượng cây con đồng đều và giữ
được đặc tính ưu việt của cây mẹ, giá thành cây con thấp, kiểm sốt được mầm bệnh.
Vì vậy phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô in vitro là giải pháp khả thi cần được

nghiên cứu và áp dụng. Ổ Việt Nam việc nghiên cứu nhân giống cây Măng Tây chưa
được nghiên cứu nhiều. Việc nghiên cứu xác định quy trình xử lý mẫu in vitro, thành
phần khống, nồng độ và hoạt chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích họp cho việc tạo

chồi và rề cây Măng Tây in vitro. Do đó, tơi thực hiện đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của
thành phần khoáng và nồng độ BA, kinetin, IBA, NAA, IAA đến quá trình tạo chồi
và rễ cây Măng Tây (Asparagus officinalis L.) ìn vitro”.

2. Mục tiêu của đề tài

Xác định thành phần khống thích họp và nồng độ chất điều hịa sinh trưởng thích
họp đến q trình tạo chồi và tạo rễ cây Mãng Tây (Asparagus oficinalis L.) in vitro.

3. Giói hạn và phạm vi nghiên cúu
Đề tài được thực hiện trên quy mơ phịng thí nghiệm.

Thời gian thực hiện: Từ tháng 10/2019 đến tháng 04/2020.

X

Chương 1. Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cây Măng Tây
Măng Tây tên khoa học: Asparagus officinalis L.
Giới: Plantae
Bộ: Asparagales

Họ: Asparagaceae

Chi: Asparagus
Hình 1.1 Cây Măng Tây

Lồi: A. officinalisc
1.1.1 Đặc điểm phân bố

Măng Tây hoang dại có nguồn gốc từ Châu Âu, Bắc Phi và Tây Á, sau đó được
trồng trọt canh tác như một loại rau xanh ở nhiều nước trên thế giới như Pháp, Đức...

Các nước Tây Âu là nơi có nhu cầu tiêu dùng Măng Tây nhiều nhưng do khí hậu lạnh,
mồi năm chỉ trồng được một vụ vào mùa xuân và năng suất không cao. Riêng Việt Nam,
đặc biệt là Lâm Đồng, Đà Lạt, nơi có khí hậu ơn đới quanh năm thích họp cho việc trồng

và thu hái Măng Tây quanh năm đem lại giá trị kinh tế cao cho người trồng. Từ năm
1960 - 1970, nhiều vùng trong nước ta đã trồng Măng Tây để chế biến xuất khẩu như

Đông Anh (Hà Nội), Kiến Anh (Hải Phòng) và Long Xuyên (An Giang). Thị trường
nhập khẩu Măng Tây chủ yếu là các nước Tây Âu, tổng lượng Măng Tây mà các nước
Tây Âu nhập khẩu lên tới hàng trăm ngàn tấn/năm. Các nhà hàng trong nước hiện cũng

có nhu cầu tiêu thụ sản phẩm này.

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Măng Tây thuộc cây trồng lâu năm, dạng bụi, thân thảo, cây có hoa đơn tính khác

gốc. Có khoảng một nửa số cây mang hoa đục, một nửa mang hoa cái. Hoa có màu đỏ.
Mồi ngăn có 1 - 2 hạt đen, vỏ hạt rất cứng. Hạt Măng Tây có thể nảy mầm ở nhiệt độ
20°C nhưng thích họp là 25°c và đây cũng là nhiệt độ trung bình cần thiết cho cây phát

tiển. Ngay sau khi hạt nảy mầm rề chính rất ngắn bị chết thay vào đó là một rề trụ thẳng

đứng được tạo thành và các rề khác mọc ngang từ rề trụ này. Sau đó ở khoảng cách gần
mặt đất, trên các đốt của rề trụ hình thành các thân mầm mới - được gọi là măng. Măng

1


Chương 1. Tổng quan tài liệu

là nơi tập trung các chất dinh dường của cây khi còn non. Măng được thu hoạch trong

nhiều năm (8-10 năm) nhưng sản lượng lớn thường tập trung ở các năm thứ 3 - thứ 5.
Các cây hoa đực hình thành rất nhiều mầm và sống lâu hơn, cho sản lượng măng cao
hơn cây hoa cái khoảng 25% nhưng chất lượng kém hơn. Trước khi nhú khỏi mặt đất,

mãng có màu trắng, mềm, khi mọc cao khỏi mặt đất chúng ngả màu xanh và phát sinh

cành có thể dài tới 2 m.

Măng tây là cây ưa ánh sáng. Vì vậy, nếu trồng Măng Tây ở nơi bị che lọp thì hiệu

suất quang họp sẽ thấp, cây sinh sản kém, năng suất măng sẽ giảm. Ngoài ra, măng tây
rất mẫn cảm với đất trồng. Đất trồng măng tây phải có độ phì cao, tơi xốp, giàu mùn.

Măng tây không chịu được đất chua, độ pH 6 - 7. Để có măng mềm, ngọt, cần phải giữ
ẩm đều. Độ ẩm đất khoảng 65 - 70%.

1.1.3 Thành phần hóa học và cơng dụng

Măng Tây thường được trồng với mục đích thu hoạch chồi non làm rau xanh '.về
dinh dưỡng, chồi Măng Tây non chứa rất nhiều chất bổ dưỡng cho cơ thể. Các thành

phần đã biết là nước 90 - 95% glucid 1,70 - 2,50% lipid 0,10 - 0,15%, protid 1,60 -

1,90%, cellulose 0,55 - 0,70%, các vitamin A, Bl, B2, c, khoảng 10% chất khoáng với

mangan, sắt, photpho, kali, calcium four, brome, iod, một ít tanin, một saponosid mà
genin là sarsasapogenin, các chồi non chứa asparagin, coniferin, một ít rutosid2.
Măng Tây chứa nhiều nước, giàu chất xơ, vitamin và khống chất nên nó đem đến

nhiều lợi ích sức khỏe như giúp giảm cân. Măng Tây không chỉ ít chất béo, ít calo mà
còn chứa rất nhiều chất xơ hịa tan và khơng hịa tan, vì vậy măng tây rất thích hợp cho

người cần giảm cân. Chất xơ nhiều trong măng tây giúp tiêu hóa chậm nên bạn cảm thấy
no trong các bừa ăn. Ngoài ra, Măng Tây có chứa dồi dào chất glutathione. Nó cũng

chứa crom, một khoáng chất giúp cải thiện khả năng tiết insulin của cơ thể để loại bỏ

glucose từ các tế bào, rất tốt cho bệnh nhân tiểu đường. Là loại thực phẩm cao cấp, có

giá trị kinh tế cao vì rất giàu chất dinh dường và có tác dụng tốt cho tim mạch, hỗ trợ
điều trị bệnh goutte, tiểu đường, đẹp da, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể 3. Măng
Tây giàu folate, loại vitamin B có thể nâng cao tinh thần và giúp tránh khỏi những khó

chịu. Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy mối liên hệ giữa mức độ thấp của folate và vitamin

B12 ở những người bị trầm cảm2. Theo các nhà nghiên cứu, bổ sung 2 loại vitamin này
2


Chương 1. Tổng quan tài liệu

hằng ngày cho bệnh nhân trầm cảm giúp giảm triệu chứng bệnh. Măng Tây còn chứa
hàm lượng cao tryptophan, loại axit amin cải thiện tâm trạng.
1.1.4 Giá trị kinh tế
Măng Tây là loại thực phẩm giàu dinh dưỡng, được sử dụng làm thực phẩm cũng
như cây trang trí. Cũng như những cây họ nhà măng khác, Măng Tây là một trong những

loài cây phát triển nhanh nhất, có thể mọc lên tua tủa chỉ sau một trận mưa, và rất ít bị
sâu bệnh. Vì thực tế này, người nông dân gần như không cần phải phun thuốc trừ sâu
hay bón thêm bất kỳ loại phân hữu cơ nào cho Măng Tây. VI thế, măng tây trở thành

loài rau sạch rất được thị trường ưa chuộng và có giá trị kinh tế cao. Mỗi ngày 1000 m2

Măng Tây có thể cho thu hoạch từ 8 - 12 kg măng tươi. Tùy thuộc vào chất lượng và
chủng loại mồi kg Măng tây thương phẩm hiện có giá dao động từ 50.000 - 70.000

đồng/kg. Mồi năm sau khi trừ chi phí đầu tư, các hộ trồng có thể lãi từ 350 - 450 triệu
đồng/ha Măng Tây xanh.

1.2 Phuong pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học
1.2.1 Nuôi cấy mơ
Nhân giống in vitro là hình thức sử dụng chồi đỉnh, lá, hoa, cuống lá, đoạn thân

non nuôi dưỡng trong các điều kiện đặc biệt để hình thành một cơ thể mới hoàn chỉnh.

Ưu điểm của nhân giống in vitro là hệ số nhân giống cao, đồng đều, sạch bệnh, chủ động
trong việc sản xuất cây con phục vụ cho công tác giống, không phụ thuộc nhiều vào điều

kiện thời tiết, có thể tiến hành quanh năm. Ngồi những ưu điểm vượt trội thì bên cạnh
đó nhược điểm của ni cấy mơ là cây con có kích thước nhỏ, xảy ra đột biến biến dị

làm xuất hiện những cây không mong muốn, cần sử dụng các thiết bị đặc biệt.
Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi một số

nhược điểm như: Việc nuôi cấy in vitro sử dụng nguồn hydrocacbon nhân tạo do đó mà
khả năng tự tổng họp chất hữu cơ kém, đồng thời cây ni cấy in vitro được ni trong

bình thủy tinh có độ ẩm bão hịa, do vậy mà khi trồng cây ra ngoài điều kiện tự nhiên
cây thường bị mất nước, khơng thích nghi được cây ra ngồi điều kiện tự nhiên cây

thường bị mất nước, khơng thích nghi được cây dề bị héo và chết. Hạn chế về chủng
loại sản phẩm: nhiều loại thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành nhân giống do gặp khó

3


Chương 1. Tổng quan tài liệu

khăn liên quan tới lý thuyết ni cấy và tái sinh thực vật. Chi phí sản xuất cao do nhân
giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao động có tay nghề. Hiện tượng sản
phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến bị soma, đã làm cho các cây con

khơng giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi ni cấy từ calus).
Nhân giống vơ tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống là một lĩnh vực ứng dụng

hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bao gồm: Nuôi cấy tế bào
đơn; nuôi cấy mô sẹo (callus); nuôi cấy cây con và cây trưởng thành; nuôi cấy phôi (phôi
non và phôi trưởng thành); nuôi cấy cơ quan (rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, nỗn chưa

thụ tinh); ni cấy protoplast (nuôi cấy phần bên trong tes bào thực vật sau khi tách vỏ
cịn được gọi là ni cấy tế bào trần).

Kĩ thuật nhân nhanh in vitro nhằm phục vụ các mục đích: Duy trì và nhân nhanh
các kiểu gen q hiếm và làm vật liệu cho công tác chọn giống; nhân nhanh và duy trì
các cá thể đầu dịng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây

lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm thân
thảo; nhân nhanh và duy trì các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép
trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gồ; nhân nhanh ở điều kiện
vô trùng và cách ly tái nhiễm kểt hợp với làm sạch virus; bảo quản các tập đồn giống

nhân vơ tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen.
1.2.2 Co’ sõ’ khoa học

Kỳ thuật nuôi cấy mơ tế bào nói chung hay kỳ thuật nhân giống vơ tính nói riêng
đều dựa trên nền tảng khoa học là tính tồn năng, sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào.

Q trình từ nguồn vật liệu ban đầu là tế bào hoặc mô thực vật nuôi cấy phân hóa

thành cây hồn chỉnh được gọi là sự biểu hiện về tính tồn năng của tế bào thực vật.
Khả năng thể hiện tính tồn năng của các tể bào, mô của cơ thể thực vật là khác nhau.

Mồi một tể bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát
triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mồi tế bào
riêng lẻ đã phân hóa đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền cần thiết và đầy đủ của

cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng phát triển
thành một cá thể hồn chỉnh. Đó là tính tồn năng của tế bào.

4


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Sự phân hóa tế bào là tế bào đã trải qua cảm ứng quyết định, trong điều kiện nhất
định thì có thể phân hóa thành mô, cơ quan và cây khác nhau, quá trinh này gọi là sự tái
phân hóa.

Sự phản phân hóa tế bào là q trình mà tế bào đã phân hóa trong một điều kiện

nhất định, khôi phục khả năng phân chia, chuyển thành tế bào phân sinh và hình thành
mơ sẹo. Trong đó, có một bộ phận hình thành tể bào cảm ứng phát sinh hình thái, tức là

tế bào có thể cảm thụ tín hiệu kích thích phân tử, từ đó xác định đường hướng mới của
sự sinh trưởng và phát triển của tế bào. Có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng tới sự phân hóa
của tế bào và mơ tách rời, trong đó nhân tố chủ yếu là chất điều hịa sinh trưởng thực

vật thuộc nhóm auxin và cytokinin. Tế bào và mơ thực vật khác nhau thì điều kiện phân
hóa của chúng là khơng giống nhau.

1.2.3 Ưu thế và phạm vi úng dụng

Nuôi cấy mô thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công
nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Bằng các kỳ thuật nuôi cấy trong điều kiện vô
trùng các bộ phận tách rời của cơ thể thực vật, người ta đã nhân giống in vitro thành

cơng nhiều lồi cây trồng có giá trị mà trước đây các phương thức nhân giống truyền
thống gặp nhiều khó khăn. Bên cạnh đó, một số kỳ thuật khác cũng đã được ứng dụng

có kết quả như: nuôi cấy đơn bội (In) để tạo dòng thuần chủng phục tráng giống cây

trồng, dung hợp protoplast giúp mở rộng nguồn gen tạo ra nhiều loài thực vật mang tính
trạng mới hữu ích, chọn dịng biến dị soma và biến dị giao tử có khả năng chống chịu

các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh như nóng - lạnh, phèn mặn, khô hạn, sâu bệnh...,

và cuối cùng sản xuất các cây trồng sạch bệnh virus từ những cá thể nhiễm bệnh virus.

Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to
lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử

dụng các mơ ni cấy ở kích thước nhỏ. Ớ kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào
trong mô sè đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô nuôi cáy

dễ phân hố và sau đó dễ tái sinh hơn. Do đó, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

được sừ dụng với nhiều mục đích khác nhau.

5

Chương 1. Tổng quan tài liệu

1.3 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc
nhiều chất ĐHST như auxin, cytokinin, gibberellins... là rất cần thiết để kích thích sự

sinh trưởng, phát triển và phân hố cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ
chức. Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo lồi thực vật, loại mơ,

hàm lưọng chất ĐHST nội sinh của chúng.
1.3.1 Nhóm auxin
Mơi trường nuôi cấy được bổ sung các auxin khác nhau như: 1H- indole-3-acetic

acid (IAA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), lH-indole-3-butyric acid (IBA), 2,4-

dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthoxyacetic acid (NOA). IAA là auxin tự
nhiên có trong mơ thực vật; cịn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo,

thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do đặc điểm phân tử của chúng
nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin-oxydase) khơng có tác dụng. Những auxin có

hiệu lực riêng biệt trong nuôi cấy tế bào thực vật là 4-chlorophenoxyacetic acid (4-CPA)
hoặc p-chlorophenoxyacetic acid (PCPA), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T),

2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid
(picloram), và 3,6-dichloro-2-methoxybenzoic acid (dicamba). Đặc điểm chung của các

auxin là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như:

tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo

rễ, và phân hóa mạch dần. Nói chung, các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc
trong NaOH lỗng.

Auxin là nhóm chất điều hịa sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên
trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin kết họp chặt chẽ với các thành phần khác của

mơi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và
điều hịa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phổi họp sử dụng với các

cytokinin. Nó có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào.. Đặc điểm chung của các auxin
là tính chất phân chia tế bào. Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng

trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và
phân hóa mạch dần. Nói chung các auxin được hịa tan hoặc trong ethanol hoặc trong
NaOH loãng.

6


Chương 1. Tổng quan tài liệu

Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rề... Đối với nuôi cấy mô,

auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin dùng
rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric axid), IAA (3-indole acetic axid),

NAA (Napthaleneaxetic axid), 2,4-D (2,4-D-Dichlorophenoxyaxetic axid) và 2,4,5-T

(Trichlorophenoxyacetic axid). Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho

môi trường ra rề và phối họp với cytokinin sừ dụng cho môi trường ra chồi. 2,4-D và
2,4,5-T rất có hiệu quả đối với mơi trường tạo và phát triển callus.

1.3.2 Nhóm các cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu
đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong ni cấy mơ.

Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-

benzyladenin (BA), 6-Ỵ-Y-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-l-H-

purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine

(zeatin). Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin
nhân tạo. Nói chung, chúng được hịa tan trong NaOH hoặc HC1 loãng.
Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis)
trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus

và rề cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự
sinh sản chồi và chồi nách, vấn đề quan trọng khơng kém là nồng độ của hai nhóm chất
điều khiển sinh trưởng này. Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích

sự tạo thành callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích

tạo chồi mặc dù trong cả 2 trường họp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1. Cơ chế hoạt động
của cytokinin là chưa được biết rõ ràng mặc dù có một số kểt quả về sự có mặt của các

họp chất mang hoạt tính cytokinin trong RNA vận chuyển (transfer RNA). Các
cytokinin cũng có hoạt tính tổng hợp RNA, tăng hoạt tính enzyme và protein trong các

mơ nhất định.
Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi... Trong mơi trường

ni cấy mơ, cytokinin cần cho sự phân chia tể bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ
các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ.

7


Chương 1. Tổng quan tài liệu

1.4 Các cơng trình nghiên cứu trong và ngồi nước
1.4.1 Các cơng trình nghiên cứu trên thế giới
Kết quả nghiên cứu “Sự sinh trưởng và hình thái của tế bào Măng Tây ni cấy in

vitro của tác giả Cecile Wilmar và Marja Hellendoom năm 1968 đã cho thấy tính tồn

năng của tế bào thực vật, hình thái của các mơ thực vật thường được nghiên cứu. Sự
hình thành phơi chỉ được tìm thấy trong cây 2 lá mầm4.

Năm 1994 B. Delbreil và M. Jullien đã công bố “Bằng chứng về đột biển in vitro

giúp cải thiện sự hình thành phơi soma ở cây Măng Tây (Asparagus officinalis L.)” đã
cho thấy “Sự hình thành phơi soma từ các kiểu gen khác nhau của Asparagus officinalis

L. có thể thu được bằng nuôi cấy in vitro của các chồi. Đầu tiên được nuôi cấy trên môi
trường cảm ứng giàu chất phụ gia và sau đó được chuyển lên mơi trường phát triển

khơng có hormone. Tất cả các kiểu gen được thử nghiệm theo cách này đã tạo ra một
vài phơi soma. Trong một số thí nghiệm, trong giai đoạn phát triển, một loại mơ phơi có
khả năng sinh sản cao mới xuất hiện một cách ngẫu nhiên. Những mơ này có thể được

cấy liên tục trên mơi trường khơng có hormone và được đặt tên là dịng phơi. Năm trong
số các dịng phơi này tái sinh thực vật từ phôi soma. Những cây tái sinh này cho thấy

một phản ứng phơi tăng so với cây mẹ; ví dụ. nuôi cấy apex sản xuất phôi soma mà

không cần bất kỳ phương pháp điều trị phụ trợ. Đối với một trong những dịng phơi, một
phân tích di truyền cho thấy phản ứng phôi được cải thiện của cây tái sinh được kiểm

soát bởi một đột biến đơn bội chiếm ưu thế của mendelian 5”.
Kết quả nghiên cứu về “ Bảo quản Măng Tây in vitro'" của Shawky A. Bekheet

vào năm 2000 cho thấy các hệ thống và mơi trường thích hợp để lưu trữ in vitro mần

cây Măng Tây6.

1.4.2 Các cơng trình nghiên cứu ờ trong nước

Cơng bổ của Vũ Ngọc Bội, Nguyền Thị Mỹ Trang, Đặng Xuân Cường vào năm

2015 khi làm về “Ảnh hưởng của nồng độ Oligochitosan tới chất lượng của Măng Tây
(Asparagus officinalis L.) theo thời gian bảo quản cho thấy sử dụng cos trong bảo

quản Măng Tây giúp hạn chế sự hao hụt khối lượng, giảm thiểu sự phá hủy chlorophyll,

ức chế sự phát triển của vi sinh vật tổng số và hạn chế mức độ giảm chất lượng cảm

8


Chương 1. Tổng quan tài liệu

quan của Măng Tây theo thời gian bảo quản. Nồng độ cos phù họp để bảo quản Măng
tây trong 25 ngày là 0,8%. Sau 25 ngày bảo quản Măng Tây được xử lý cos 0,8% có

hàm lượng chlorophyll đạt 0,73 mg chlorophyll/g DW, TĐCỌỌ đạt là 11,2 điểm, độ
hao hụt khối lượng là 6,8% so với ban đầu và tổng số vi sinh vật hiếu khí chỉ bằng 1/9

lần so với mầu ĐC 7. Cũng trong năm 2015 Ngô Phương Ngọc và Lâm Ngọc Phương

đã nghiên cứu về đề tài “Vi nhân giống cây Măng Tây” cho thấy giai đoạn nhân chồi,
môi trường MS bổ sung Kinetin 4 mg/1 là thích họp cho việc nhân chồi, số chồi hình
thành nhiều, chiều cao chồi đạt tương đối. Giai đoạn tạo rễ, môi trường MS bổ sung

NAA 3mg/L thích họp tạo rề cho cây Măng Tây. Giai đoạn thuần dưỡng, giá thể mụn
dừa + trấu + đất (1:1:1) thích hợp cho cây Măng Tây sinh trưởng8.

9


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Noi thực hiện
Phòng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật, khoa Công nghệ sinh học, trường

Đại học Nguyễn Tất Thành.

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Vô trùng mầu cây Măng Tây
- Khảo sát mơi trường khống cơ bản ni cấy cây Măng Tây in vitro
- Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ BA và kinetin đến q trình ni cấy tạo chồi cây
Măng Tây

- Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA, IAA đến quá trình tạo rễ cây Măng Tây in
vitro.
2.3 Phương pháp nghiên cúu

2.3.1 Sơ đò tổng quan nội dung nghiên cúu

Xác định thời gian vô trùng

và nồng độ javel

Môi trường MS - LV WPM - B5

Khảo sát ảnh hưởng của
BA và Kinetin
Khảo sát ảnh hưởng của

IAA - NAA - IBA

Hình 2.1. Sơ đồ tổng quan nội dung nghiên cứu

10

Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.2 Nội dung nghiên cứu

2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Vơ mẫu tạo ngun liệu cây Măng Tây in vitro

- Mục đích: Xác định được thời gian, nồng độ javel thích họp cho quá trình vơ
trùng mẫu.

-

Ngun liệu: Hạt giống cây Măng Tây.

- Mơi trường ni cấy: Mơi trường MS có bổ sung đường sucrose (30 g/1), agar (8
g/1).

- Phương pháp thực hiện: Tiến hành vô trùng mẫu 3 lần trong javel (25 - 50 và 75%)
với các khoảng thời gian (5 và 10 phút).

-

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mầu vô trùng (%), tỷ lệ tạo chồi (%).

-

Thời điểm thu số liệu: 30 ngày sau khi vô mầu.

Bảng 2.1 Nồng độ javel và thời gian thí nghiệm vơ trùng mầu

Nghiệm thức

Nồng độ javel (%)

Thời gian (phút)

1.1

25

5

1.2

25

10

1.3

50

5

1.4

50

10

1.5

75

5

1.6

75

10

2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát mơi trường khống CO’bản ni cấy cây Măng Tây ìn

vitro
- Mục đích: Xác định được thành phần khống cơ bản thích hợp cho q trình ni
cấy cây Măng Tây in vitro.

-

Ngun liệu: Chồi Măng Tây in vitro.

- Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS, B5 9, LV 10, WPM 11 có bổ sung sucrose (30
g/1), agar (8 g/1).

11


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thực hiện: Chồi Măng Tây được cắt thành các đoạn có chiều dài 2
cm. Sau đó, cấy vào các bình mơi trường thí nghiệm (5 chồi/bỉnh).

- Chỉ tiêu khảo sát: Tỷ lệ tạo rề (%), chiều dài rễ (cm), chiều cao cây (cm), số lá
(lá/cây), số chồi (chồi/cây), đặc điểm chồi.

-

Thời gian thí nghiệm: 45 ngày.

Bảng 2.2 Mơi trường khống cơ bản ni cấy cây măng tây

Nghiệm thức

Mơi trường ni cấy

2.1

LV

2.2

MS

2.3

B5

2.4

WPM

2.3.2.3 Thí nghiệm 3.: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ BA và Kinetin đến q trình
ni cấy tạo chồi cây Măng Tây

- Mục đích: xác định được thành phần khống cơ bản thích hợp cho q trình nuôi
cấy cây Măng Tây in vitro.

-

Nguyên liệu: Chồi Măng Tây in vitro.

- Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy: mơi trường khống cơ bản thích họp

nhất cho ni cấy cây Măng Tây in vitro (kết quả thí nghiệm 2), bổ sung đường sucrose
(30 g/1), BA, kinitin với các nồng độ thí nghiệm (0,1 ; 0,5 ; 1 và 2 mg/1).

- Phương pháp thực hiện: Chồi Măng Tây được cắt thành các đoạn có chiều dài 2
cm. Sau đó, cấy vào các bình mơi trường thí nghiệm (5 chồi/bình).

- Chỉ tiêu khảo sát: Tỷ lệ tạo rề (%), chiều dài rề (cm), chiều cao cây (cm), số lá
(lá/cây), số chồi (chồi/cây), đặc điểm chồi.

-

Thời gian thí nghiệm: 45 ngày.

12


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Bảng 2.3 Nồng độ BA và kinetin sử dung nuôi cấy tạo chồi cây măng tây

Kinetin (mg/1)

Nghiệm thức

BA (mg/1)

ĐC3.1

-

-

3.2

0,1

-

3.3

0,5

-

3.4

1

-

3.6

-

0,1

3.7

-

0,5

3.8

-

1

Z.3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA, IAA đến quá trình tạo rễ
cây Măng Tây in vitro
- Mục đích: Xác định được nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích họp

cho q trình ni cấy tạo rễ cây Măng Tây ỉn vitro.

-

Nguyên liệu: Chồi Măng Tây in vitro.

- Mơi trường ni cấy: Mơi trường khống cơ bản thích họp nhất cho nuôi cấy cây

Măng Tây in vitro (kết quả thí nghiệm 2), bổ sung đường sucrose (30 g/1), IBA, NAA,
IAA với các nồng độ thí nghiệm (1 ; 2 ; 3 mg/1).

- Tiến hành: Chồi Măng Tây được cắt thành các đoạn có chiều dài 2 cm, có 2 lá.
Sau đó, cấy vào các binh mơi trường thí nghiệm (5 chồi/bình).

- Chỉ tiêu khảo sát: Tỷ lệ tạo rề (%), chiều dài rễ (cm), chiều cao cây (cm), số lá
(lá/cây), số chồi (chồi/cây), đặc điểm chồi.

-

Thời gian thí nghiệm: 45 ngày.

13


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Bảng 2.4 Nồng độ IAA, IBA và NAA sử dụng nuôi cấy tạo rễ
Nghiệm thúc

Điều hòa sinh trưởng

Nồng độ (mg/1)

ĐC 4.1

-

-

4.2

NAA

1

4.3

NAA

2

4.4

NAA

3

4.5

IBA

1

4.6

IBA

2

4.7

IBA

3

4.8

IAA

1

4.9

IAA

2

4.10

IAA

3

2.4 phương pháp thu thập xử lý số liệu

2.4.1 Phương pháp thu thập số liệu

- Tỷ lệ mầu vô trùng (%) = (tổng số mẫu vô trùng/tổng số mầu ban đầu) X 100.

- Tỷ lệ mầu tạo chồi (%) = (tổng số mầu tạo chồi/tổng số mầu vô trùng) X 100.
- Số lá phát sinh được tính bằng cách đếm số lá sau 4 tuần trừ cho số lá ban đầu.
- Số chồi phát sinh được tính bằng số chồi sau 4 tuần nuôi cấy trừ cho số chồi ban đầu.
- Chiều cao của chồi được tính từ phần tiếp giáp giữa thân với rề tới đỉnh chồi cao nhất.
- Chiều dài rễ được tính từ phần tiếp giáp giữa thân với rề đến chóp rễ của rễ dài nhất.
- Số rễ được tính bằng cách đếm số rề sau 4 tuần ni cấy.
2.4.2 . Xử lý số liệu

- Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngầu nhiên với 3 lần lặp lại. mỗi lần lặp lại cấy

3 chai, mồi chai 5 chồi.
- Các số liệu thu thập được được xừ lí thống kê bằng phần mền SAS 9.1.

14


Chương 3. Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ VÀ THÀO LUẬN
3.1 Kết quả thí nghiệm 1: Vơ trùng mẫu
Khi tiến hành nghiên cứu một quy trình nhân nhanh của bất kì đối tượng cây trồng
nào cũng cần phải có một số lượng lớn mẫu khởi đầu với chất lượng đồng đều. Do vậy,

việc xác định loại mầu cấy và chế độ khử trùng phù họp có vai trị quan trọng trong việc
tạo được các vật liệu ban đầu cho nghiên cứu. Quy trình nhân nhanh cần những đối

tượng ban đầu và chất lượng mầu tương đồng vì vậy nên tơi tiến hành q trình vơ mầu.
Và trong q trinh vô mầu như vậy thường thường hay bị nhiễm. Các mầu ngồi tự

nhiên trong q trình vật liệu ban đầu thì trong q trình ngồi tự nhiên vào trong phịng

thí nghiệm thì thường hay bị nhiễm các bào tử nấm ở dưới các bộ phận của cây như là

lá cây thân cây và rễ cây vì vậy việc lựa chọn các đối tượng trong q trình vơ mẫu là
rất quan trọng. Các bộ phận của thực vật như: chồi, lá, thân, hạt,... nói chung là bộ phận
cịn xanh của thực vật đều có thể đưa vào ni cấy ỉn vitro. Tuy nhiên các bộ phận như

chồi, lá, thân rất dề bị nhiễm và rất dễ bị tổn thương bởi các chất khử trùng nên sè tốn
rất nhiều thời gian để quá trình khử mẫu và làm sạch mầu.

Bên cạnh đó thành phần mơi trường ni cấy mơ thực vật rất giàu dinh dường
với đường, muối khoáng và vitamin. Đây là điều kiện vô cùng thuận lợi cho các vi

sinh vật phát triển (đặc biệt là nấm mổc). Bởi vậy q trình vơ trùng mầu có ý nghĩa

quyết định đến sự thành bại của mẫu nuôi cấy in vitro. Mầu hạt thường thì nó dễ xử lí,
khử trùng và khó bị tổn thương hơn các bộ phần khác bởi vậy nên vô mẫu hạt tiết kiệm
được nhiều thời gian hơn và ít bị nhiễm nấm vì vậy trong thí nghiệm này tôi sử dụng

mầu hạt để vô mầu kết họp với chất khử trùng là javen. Javel là chất được sử dụng
nhiều nhất vì khả năng vơ trùng tốt, dề tim và chi phí thấp. Nồng độ javel đóng vai
trị quan trọng trong việc làm sạch và khử trùng mẫu. Mồi loại cây khác nhau khi

vô mẫu sẽ yêu cầu một nồng độ và thời gian ngâm mẫu khác nhau. Nếu nồng độ
javel quá cao sẽ làm chết mầu, còn nồng độ thấp thì mầu sẽ khơng sạch và dề nhiễm
nấm, khuẩn. Do đó, việc lựa chọn nồng độ javel thích họp để khử trùng mẫu rất quan
trọng và cần thiết. Nó ảnh hưởng tới sự sống và phát triển của mầu cấy, quyết định tốc
độ nhân giống cây con in vitro. Mầu vật sử dụng trong thí nghiệm này là hạt giống được

15

Chương 3. Kết quả và thảo luận
bảo quản trong điều kiện sạch do đó chúng tơi chỉ sử dụng 3 nồng độ 25%, 50% và 75%

trong các khoảng thời gian 5 và 10 phút để tiến hành thí nghiệm.

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát nồng độ javel và thời gian vô trùng mầu

Nghiệm
thức
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6

Nồng độ

Thời gian

javel (%)
25
25
50
50
75
75

(phut)

5
10
5
10
5
10

Tỷ lệ mẫu vô
trùng (%)
oe
oe
39,32d
52,08c
94,69b
100a

Tỷ lệ mẫu nảy
mầm (%)
oc
oc
50,82a
48,35ab
46,53b
45,81b

*Các kỷ tự theo sau giá trị trung bình trong cùng một cột thê hiện sự khác biệt giữa các nghiệm thức với mức ý
nghĩa p <0,01 bang trắc nghiệm phân hạng LSD.

Kết quả thí nghiệm thể hiện ở bảng 3.1 cho thấy nghiệm thức 1.1 và 1.2 tương ứng

với nồng độ javel (25%) trong các khoảng thời gian 5 và 10 phút khơng có tác dụng vô
trùng mầu hạt cây Măng tây, hạt bị nhiễm nấm và khuẩn hoàn toàn sau 7 đến 10 ngày.
Khi tăng nồng độ javel lên 50%, tỷ lệ mầu vô trùng tăng lên và tăng tỷ lệ thuận với thời

gian khử trùng. Cụ thể: Nghiệm thức 1.3 với thời gian khử trùng 5 phút kết quả cho thấy
tỷ lệ mầu vô trùng đạt 39,32%, mầu nảy mầm sau 1 tuần nuôi cấy với tỷ lệ 50,82%, các

chồi phát triển to khởe; tỷ lệ mẫu vô trùng tăng lên đáng kể đạt 52,08%; tỷ lệ mẫu nảy

mầm là 48,35% ở nghiệm thức có thời gian khử trùng 10 phút, mẫu khơng xuất hiện
nhiễm sau 30 ngày nuôi cấy.

Căn cứ vào các kết quả trên chúng tôi tiếp tục tiến hành nâng nồng độ Javel lên
75%. Kết quả thu được sau 30 ngày nuôi cấy cho thấy: Nghiệm thức 1.6 nồng độ javel
75% trong thời gian 10 phút cho kết quả tỷ lệ mầu nảy mầm có sự suy giảm (đạt
45,81%) so với các nghiệm thức sử dụng nồng độ javel 50% (đạt 50,82%). Tuy nhiên,
tỷ lệ mẫu vô trùng lại tăng lên gấp hai lần đạt 100%.

Như vậy, nồng độ javel 75% trong 10 phút là thích hợp nhất để vơ trùng mẫu hạt
cây Măng Tây. Chồi cây Măng Tây phát triển bình thường sau 30 ngày ni cấy được

sử dụng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.

16