Phân lập, định danh và xác định hiện trang kháng thuốc kháng sinh của một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá rô đồng

NTTU-NCKH-04

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÁP co SỞ
NĂM 2020 - 2021

Tên đề tài: PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH HIỆN TRẠNG KHÁNG THUỐC

KHÁNG SINH CỦA MỘT số CHỦNG VI KHUẦN GÂY BỆNH TRÊN CÁ RÒ ĐÒNG

Anasbas testudineus
Số hợp đồng: 2021.01.110

Chú nhiệm đề tài: TRẦN KIÊN CƯỜNG

Đơn vị công tác: Viện Kỳ thuật Công nghệ cao NTT

Thời gian thực hiện: 6 tháng

TP. Hồ Chỉ Minh, ngày 1 tháng 10 năm 2021


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT.................................................. V
DANH MỤC HÌNH ẢNH............................................................................................... vi

DANH MỤC BẢNG BIẾU............................................................................................ vii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, so ĐỊ, HÌNH ẢNHTĨM TẮT KẾT QUẢ

NGHIÊN cứu............................................................................................................... viii
MỞĐẢU............................................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1. TÓNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................................... 2

1.1 Tong quan về cá rô đong............................................................................................. 2

1.1.1 Phân loại................................................................................................................... 2
1.1.2 Đặc điếm hình thái.................................................................................................... 2
1.1.3 Đặc điếm sinh thái.................................................................................................... 2

1.1.4 Đặc điếm sinh trưởng............................................................................................... 3

1.1.5 Đặc điếm sinh sản..................................................................................................... 3
1.1.6 Tình hình khai thác................................................................................................... 3

1.2 Thực trạng kháng kháng sinh trong ni trồng thủy sản............................................. 4

1.2.1 Tình trạng lạm dụng kháng sinh trongngành nuôitrồng thúy sản trên thế giới........ 4

1.2.2 Hiện trạng lạm dụng kháng sinh trong nuôitrồng thủy sản ở Việt Nam.................. 6
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu................................. 9
2.1 Thu nhận và phân lập chủng vi khuẩn từ mầu cá bệnh/có dấu hiệu lạ........................ 9
2.2 Các phản ứng sinh hóa................................................................................................. 9
2.3 Tách chiết DNA......................................................................................................... 11

2.4 Giải trình tự............................................................................................................... 11
2.5 Phương pháp khảo sát loại kháng sinh, sự nhạy cảm cùa vi khuẩn......................... 12

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................. 12
3.1 Ket quả về tình trạng nhiềm khuân nội tạng của cá bệnh........................................... 13
3.2 Ket quả về đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn chiếm ưu thế phân lập và làm

thuần.................................................................................................................................. 15
3.3 Kết quả định danh sinh hóa các chủng khuẩn phân lập............................................. 20
3.4 Kết quả về độ nhạy cảm/tính kháng của vi khuẩn với các kháng sinh...................... 22

3.5 Ket quả về tỷ lệ khuấn kháng kháng sinh................................................................. 24
3.6 Kết quả định danh các chủng vi khuấn đa kháng..................................................... 26

iii


CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................ 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................29
PHỤ LỤC 3: MINH CHỬNG ĐI KÈM........................................................................ 33

PHỤ LỤC 4: (thuyết minh đề cương)............................................................................44

IV


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TSA

Trypsin soy agar

TSB

Trypsin soy broth

NA

Nutrient agar

TCBS

Thiosulfate citrate bile salts sucrose

BA

Blood agar

KIA

Kliger’s ion agar

MHA

Mueller Hinton agar

MR

Methyl red

BHIB

Brain heart infusion broth

CL

Cell lysis buffer

PBS

Phosphate-buffered saline

WB1

Washing buffer 1

WB2

Washing buffer 2

EB

Elution buffer

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute

V


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cá rơ đồng (Anabas testidineus).......................................................................... 2
Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện các phản ứng sinh hóa............................................................. 10

Hình 3.1 Hình ảnh ngoại thể cá rơ đồng có dấu hiệu bệnh............................................... 14
Hình 3.2 Hình ảnh giải phẫu nội tạng cá rơ đồng bệnh.................................................... 14
Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc phân lập ban đầu trên các mầu bệnh phấm thu nhận từ
nội tạng của cá rô bệnh..................................................................................................... 14

VI


DANH MỤC BẢNG BIẾU
Bảng 3.1 Số chủng vi khuân phân lập từ cá rô đồng bệnh thu nhận từ các trang trại cá

giống................................................................................................................................. 20
Bảng 3.2 Các khuấn lạc phân lập và làm thuần trên môi trường NA......................... 15-19

Bảng 3.3 Danh sách các chủng vi sinh dự kiến từ các sinh hóa cơ bản............................ 24
Bảng 3.4 Tính kháng kháng sinh của các chủng vi sinh phân lập từ cá rô với 10 loại
kháng sinh......................................................................................................................... 26

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG BIẾU, so ĐỊ, HÌNH ẢNH TĨM TẮT KẾT QUẢ

NGHIÊN cúu

Công việc thực hiện

Ket quà đạt được

Nôi dung 1: Thu mầu và phân lập

110 mầu cá có dấu hiệu lạ từ các trại

STT

1

mầu bệnh phấm cá có dấu hiệu nuôi, thu nhận được 65 khuân lạc khi
bệnh/biểu hiện lạ tại các trang trại cấy trên đìa mơi trường ni cấy.

ni tại TP.HCM
2

Nội dung 2: Quan sát hình thái, Từ 65 khuân lạc ban đầu, cấy làm

nhuộm Gram, thực hiện các test thuân chọn lọc ra được 14 khuân lạc

sinh lý sinh hóa gồm :KIA, blood đặc trưng thực hiện các phản ứng
ager,

MacConkey,

oxidase, sinh hóa, định danh dựa vào hình thái

catalase, TCBS, Simmon citrate được 11 chủng vi sinh.

3

Nội dung 3: Xác định tính nhạy 13 chủng vi sinh (trừ chủng XI) được
cảm với kháng sinh của các kiểm tra tính kháng kháng sinh, các

chủng vi khuẩn phân lập

chủng vi sinh đều kháng lạ nhóm
beta-lactam, 2 chủng đa kháng mạnh

nhất lần lượt là IV (7/10) và VIII
(6/10)
4

Nội dung 4: Giải trình tự 16S Đã định danh ba chủng vi khuấn là

rRNA của một số chủng vi khuấn IV, VIII, XIV có mức độ tưong đồng

phân lập được

khi so sánh trình tự gen 16S rRNA
lẩn lượt là: Pseudomonas aeruginosa
%),

(99,77

Aeromonas

caviae

(99,93%) và Edwardsiella ictaỉuri

(99,44%)

STT

Sản phâm đã đạt được

Sản phẩm đăng ký
viii


1

1 Bài báo trong nước

2

1 báo cáo tổng kết để tài

Thời gian thực hiện: 6 tháng từ tháng 4/2021-10/2021

Thời gian nộp cuốn báo cáo : 10/2021

IX



MỞ ĐÀU

Cá rô đồng (Anabas testudineus) đang được xem là đối tượng ni có giá trị kinh

tế cao, phân bố ở nhiều quốc gia châu Á và thế giới trong đó có Việt Nam. Việc lạm dụng

kháng sinh, hóa chất kháng khuẩn đã gây nhiều tác động tiêu cực, hệ quả là các thực

phàm thủy hải sản là nguồn chứa các vi khuấn/gen kháng kháng sinh có the lây lan từ
động vật thủy sản sang người thông qua chuồi thức ăn đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe

và môi trường. Nghiên cứu này đã phân lập được mười bốn chủng vi sinh thuần nhất từ
mầu cá có dấu hiệu lạ thu thập từ các trại nuôi trên địa bàn TP.HCM. Trong đó ở đề tài đà
định danh ba chủng vi khuẩn là IV, VIII, XIV có mức độ tương đồng khi so sánh trình tự

gen 16S rRNA lân lượt là: Pseudomonas aeruginosa (99,77 %), Aeromonas caviae

(99,93%) và Edwardsiella ictaluri (99,44%), có hình thái đặc trưng khi kiểm tra khuẩn
lạc trên các môi trường chọn lọc và các phản ứng sinh hóa. Bốn chủng khuẩn định danh
trên đều kháng lại nhóm beta-lactam, tetracyclin và một số nhóm kháng sinh khác đang
được sử dụng phồ biến trong ngành nuôi trồng thủy sản, cùng với đó là việc đánh giá

hành vi cá khi nhiễm bệnh gây ra bời từng loại bệnh khác nhau nhằm tạo ra một dừ liệu
tham khảo bệnh tích dùng cho việc chan đoán sớm các tác nhân gây hại. Ket quả này chỉ
ra được các chủng khuẩn trên cá rô đồng đang lưu hành tại các trại nuôi cũng như một số
địa điểm bán ở khu vực TP.HCM và hiện trạng kháng kháng sinh của chúng, chỉ ra

hướng giải pháp tiếp theo là tìm nguồn thay thế kháng sinh như là hợp chất thiên nhiên để
khắc phục tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá rô đồng.
Mục tiêu:

- Thu nhận và phân lập các chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá rô đồng (Anabas
testudineus') tại một số trại nuôi tại khu vực TP.HCM.

- Đánh giá mức độ đa kháng kháng sinh của các chủng khuẩn phân lập.

1


CHƯƠNG 1. TÔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cá rô đồng

1.1.1 Phân loại
Cá rô đồng được phân loại như sau:
Giới: Animalia
Ngành: Chordata
Lớp: Actinopterygii

Bộ: Anabantiformes
Họ: Anabantidae

Chi: Ancibas

Loài: Anabas testudineus
1.1.2 Đặc điểm hình thái

Hình 1.1 Cá rơ đồng
testudineus)

(Anabas

Cá rơ đồng có thân nhỏ, thon dài khoảng 10 - 13 cm và nặng khoảng 60 - 100
g/con, phía sau dẹp ngang, đầu và phần trước rộng, dẹt dần về phía sau. Miệng có nhiều

răng nhỏ và nhọn mọc trên hai hàm và xương lá mía. Đỉnh đầu và mặt bên đều phú vẩy,

rìa nắp mang có răng cưa, thân phủ vấy lược. Gai vây rất cứng và chắc, gốc vây đi có
đốm đen trịn. Vây lưng, vây đi và vây hậu mơn màu xanh đen, các vây khác màu nâu

nhạt (Mai Đình n và cs, 1992). Khi cá rơ cịn ở giai đoạn nhở, trên thân có sọc ngang
đậm, cuống đi và mép mang có chấm đen, khi lớn sọc ngang và chấm đen mờ dần.

1.1.3 Đặc điếm sinh thái

Cá rô đong (Anabas testudineus) sống ở nước ngọt, chúng thường sinh sống được
ở các loại hình mặt nước: ruộng lúa, ao mương, lung bào, đìa, sơng rạch,... Trên thế giới
cá rơ đồng phân bố ở Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Miến

Điện, Ấn Độ, Philippines, Châu Phi và các quần đảo giữa Án Độ và Châu úc (Trương
Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993). Khả năng thích nghi với môi trường sống cùa

cá rô rất tốt, đặc biệt cá có thể hơ hấp bằng khí trời nhờ có cơ quan hơ hấp phụ (cơ quan

mê lộ), cá có thế tồn tại và phát trien trong điều kiện môi trường bất lợi ngoài tự nhiên

2


(Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993). Điều kiện mơi trường nước thích

họp cho cá phát triển có nhiệt độ từ 22°c đến 36°c, DO (nồng độ oxi hòa tan) 2 mg/L trở
lên, độ mặn cao nhất 5 ppt và độ pH từ 5,5 đen 7,5.
1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng

Cá rơ có tốc độ tăng trưỏng chậm, cá cái lớn nhanh và có kích thước lớn hơn cá
đực. Cá nuôi thâm canh được cung cấp đầy đủ thức ăn, môi trường thuận lợi, sau 6-7
tháng nuôi cá đạt trọng lượng trung bình: con cái 80 - 120 g/con, con đực 50 - 80 g/con,

con lớn nhất có thể đạt 300 - 400 g/con. Cá tăng trưởng mạnh từ 3,5 - 6,5 tháng tuổi.

Giai đoạn trước và từ sau 6-7 tháng tuoi cá cái mang trứng nhưng vẫn tiếp tục tăng
trọng chậm, cá đực tăng trọng rất chậm, có con hầu như ngừng tăng trọng (Trưong Thủ

Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993).
1.1.5 Đặc điểm sinh sản
Mùa sinh sản tự nhiên của cá rô đồng từ tháng 4 đến tháng 8 âm lịch (tập trung

vào mùa mưa tháng 6-7) (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hồ, 2003). Buồng trứng và tinh

hồn được nhìn thấy rõ rệt vào tháng giêng và phát triển cực đại vào tháng 4 - 10 ở nhiệt
độ 25 - 29°c. Cá đẻ được từ 3 - 4 lần/năm, thời gian tái phát dục của cá là 20 - 30 ngày,

sức sinh sản trung bình khoảng 300.000 - 700.000 trứng/kg cá cái. Cá đẻ vào lúc mưa to
và thường đẻ vào ban đêm, làm tố nơi nước cạn. Trứng cá rơ đồng hình bầu dục, có màu

vàng hoặc hơi trang. Đường kính trứng khoảng 0,8 mm, trứng kết thành chùm noi lơ lửng
trên mặt nước (Nguyễn Thành Trung, 1998).

1.1.6 Tình hình khai thác

Theo thơng kê của Sở Nơng Nghiệp tỉnh cần Thơ năm 1997 thì cá rơ đồng đang
được chú ý ni theo nhiều hình thức khác nhau như nuôi trong ao, ruộng, bè,... đặc biệt

là nuôi thâm canh trong ao đất. Riêng tỉnh cần Thơ chỉ mới áp dụng nuôi cá rô đồng vào

năm 1997 với diện tích khoảng 4,9 ha, năm 1998 với diện tích là 27,5 ha, năm 2001 với
diện tích là 150 ha và 6 tháng đầu năm 2002 diện tích giảm cịn 86,7 ha. Hiện nay, cá rơ
đồng là một trong những đối tượng thủy sản quan trọng đã và đang nuôi phổ biến ở các
tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long, gần đây cịn phát trien nhiều ở miền Đơng Nam Bộ.

Nhưng với sự phát triến nhanh của các vùng ni cũng như mật độ ni cao như hiện nay
thì cá hay bị bệnh và chết. Tỷ lệ cá chết sau các đợt dịch bệnh khá cao trong cả giai đoạn

3


ương giống và nuôi thương phẩm. Những dịch bệnh này thường xuyên xảy ra và gây thiệt
hại kinh tế lớn cho người ni, cá trong ao có the hao hụt lên đến 20 - 30% sau mồi đợt

cá bị bệnh.
1.2 Thực trạng kháng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

1.2.1 Tình trạng lạm dụng kháng sinh trong ngành ni trồng thủy sản trên thế giới

Thuốc kháng sinh đã và đang được sử dụng hơn 50 năm qua với mục tiêu khởi
điểm bảo vệ và cải thiện sức khỏe con người và động vật (Flynn, 2012). Trong ngành

nuôi trồng thủy sản, kháng sinh đóng vai trị phịng trị bệnh do vi sinh vật, cải thiện

chuyển hóa thức ăn và thúc đẩy tăng trưởng vật nuôi (Cabello, 2004; Quesada và cs.,
2013; Awad, 2017). Oxytetracycline, orfenicol, enrofloxacin và erythromycin là những

thuốc kháng sinh đang được phép lưu hành và sử dụng trong nuôi trồng thủy sản trên

toàn thế giới (FAO, 2005). Tuy nhiên, vì lợi nhuận trước mắt và nhằm hạn che thiệt hại
kinh tế, các nhà sản xuất/các chủ trang trại thường phớt lờ các nguyên tắc sử dụng kháng

sinh với liều lượng thực dùng khơng chính xác, khơng đúng cách và khơng kiểm sốt; lâu
dần dần đến tình trạng kháng kháng sinh và sự tồn dư kháng sinh trong động vật thủy sản

và môi trường (Crumlish và cs., 2002; OIE, 2003; Van và cs., 2005). Thực tế, cá/động vật
thủy sản và mơi trường nước ao ni đang là nguồn chính yếu chứa vi khuân và các gen
kháng kháng sinh (Heuer và cs., 2009). Năm 2005, Hatha và cộng sự đã công bố khả

năng kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn Aeromonas được phân lập từ cá nước ngọt.

Kết quả cho thấy vi khuẩn này có khả năng kháng lại các loại kháng sinh như
oxytetracycline, amoxycillin, ampicillin, novobiocin, và polymyxin- B (Hatha, 2005).

Năm 2013, nhóm tác giả gồm Lim và cộng sự đã nghiên cứu sự đa kháng kháng

sinh của vi khuấn phân lập từ các thủy sản nước ngọt. Dựa trên kết quả giải trình tự 16S
rRNA, có tổng cộng 20 chủng vi khuẩn được phân lập và chủng Aeromonas sp chiếm ưu
thế hơn các chủng cịn lại. Ngồi ra, 58,3% các chủng vi khuấn phân lập được là những

chùng thể hiện khả năng đa kháng các loại kháng sinh (Lim et al., 2013).
Năm 2017, tại Bangladesh, Hossain và cộng sự đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn

xuất hiện trên cá koi nuôi (cultured Anabas testudineus). Các chủng vi khuẩn sau khi

phân lập được tăng sinh trong môi trường lỏng Brain Heart Infusion (BHI) và sau đó cấy
trên các mơi trường MacConkey Agar và Blood Agar để kiểm tra. Kết quả cho thấy các

4

chủng vi khuân Staphylococcus, s. saprophytỉcus, Pseudomonas, Aeromonas hiện diện ở
mang cá và da cá. Ngoài ra, các chủng vi khuẩn sau Enterobacter, Escherichia, Shigella,

và Vibrio thì được tìm thấy ở ruột cá (Hossain et al., 2017).
Năm 2019, Chhanda và cộng sự nghiên cứu phân lập được một số chủng vi khuẩn

gây bệnh trên đoi tượng cá koi Thái Anabas testudineus và định danh bằng một so test

sinh hóa như Methyl red (MR), Voges-proskaure test, Triple sugar iron test, Indole test,
catalase, và simmon citrate. Ket quả cho thấy nhóm tác giả đã phân lập được các chủng vi

khuẩn gồm Samonella spp., Shigella spp., Klebsiella spp., và Staphylococcus spp. Ngoài

ra, hai chủng vi khuẩn Staphylococcus spp. và Samonella spp. được xác định là tác nhân
gây bệnh lở loét trên con cá (Chhanda và cs., 2019).
Năm 2019, John Thomas và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng gây bệnh do

Pseudomonas aeruginosa gây ra trên cá rô phi Oreochromis mossambicus băng cách gây
cảm nhiễm theo phương pháp tiêm và ngâm. Ket quả xác định được Pseudomonas

auriginosa gây ra nhiễm trùng (Thomas et al., 2014).
Năm 2020, tại Án Độ, nhóm tác giả gom Haque và cộng sự công bố khả năng gây

bệnh của chủng vi khuẩn Pseudomonas trên cá rô đồng Anasbas testudineus. Vi khuẩn ở
các nồng độ 2,0 X 102 CFU/ml, 2,0 X 103 CFƯ/ml, 2,0 X 104 CFU/ml, 2,0 X 105 CFU/ml,

và 2,0 X 106 được tiêm vào cá. Ket quả nghiên cứu cho thấy, cá bị tiêm vi khuẩn đều có
nhừng biếu hiện như suy giảm hồng cầu và haemoglobin, nhưng số lượng bạch cầu lại

tang mạnh. Ngoài ra, khối lượng cá và chiều dài của cá đều bị giảm. Mang, gan, và thận

cá bị tiêm đều có chiêu trứng bị hoại từ và tăng sản mô (Haque và ca., 2020).
Ngoài ra, năm 2020, Zdanowicz và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn
Aeromonas từ các ao nuôi cá chép. Nhùng vi khuẩn thuộc chủng này được kiểm tra sự đa

dạng và kháng kháng sinh. Ket quả cho thấy các vi khuấn thuộc chủng Aeromonas thể
hiện khả năng kháng nhiều nhất đối với các loại kháng sinh gồm amoxicillin, ampicillin,
clindamycin, và penicillin (Zdanowicz và cs., 2020).

Việc lạm dụng kháng sinh, hóa chất kháng khuẩn đã gây nhiều tác động tiêu cực,
ức chế miền dịch, kìm hãm tăng trưởng và tích lũy thuốc trong cơ thể cá và các lồi động

vật thủy sản (FAO, 2003; Harikrishnan và cs., 2011). Hệ quả, các thực phẩm thủy hải sản
là nguồn chứa các vi khuẩn/gen kháng kháng sinh có thể lây lan từ động vật thủy sản

5


sang người thông qua chuỗi thức ăn. Các vi khuẩn gây bệnh này có thể chuyển trực tiếp

hoặc gián tiếp các gen kháng kháng sinh sang vi khuấn gây bệnh trên người, dẫn đến
những thất bại liên tiếp của các phương pháp trị liệu truyền thống hoặc việc giảm hiệu

quả điều trị tiếp theo (Miranda, 2001; Radu và cs., 2003), đe dọa nghiêm trọng sức khỏe

con người và môi trường (Abutbul và cs., 2004; Cabello, 2006).

1.2.2 Hiện trạng lạm dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam

Ngày nay, do quy mô thiếu quy hoạch, mật độ nuôi thả cao, các biện pháp nuôi
trồng/sản xuất bất hợp lý và các biến động thời tiết khiến tình trạng dịch bệnh thường

xuyên xảy ra, kéo dài và ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất, sản lượng và chất lượng
cá/thủy hải sản ở Việt Nam. Điên hình, bệnh gan thận mủ (Edwardsiellosis) do vi khuẩn

Edwarsiella ictaluri trên các loài cá da trơn, cá tra Pangasianodon hypophthalmus xảy ra
quanh năm, bùng phát vào mùa mưa hoặc mùa lạnh khi nhiệt độ thấp khiến tỷ lệ cá

chết/hao hụt nhiều, chi phí điều trị cao và mức thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá

tra, basa vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (Ferguson và cs., 2001; Dung và cs., 2004).
Tỷ lệ chết lên đến 100% với cá bột ương giống và khoảng 30 - 50% đối với cá thịt (Dung

và cs., 2010). Điều này khiến kháng sinh, hóa chất tiếp tục lạm dụng thiếu kiểm sốt
trong phịng trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá/động vật thủy sản mặc cho những cảnh báo về

tình trạng kháng thuốc trong nhiều năm qua.

Theo báo cáo của Rico và cs. (2013), 100% các trại nuôi cá tra ở Việt Nam có sử
dụng kháng sinh, chiếm tỷ lệ cao hơn hẳn so với Trung Quốc (16%) và Thái Lan (9,7%).
Đáng chú ý, dù mức giới hạn tối đa 2 loại kháng sinh cho một trang trại ở các quốc gia

Châu Á nhưng các trang trại cá tra ở Việt Nam đã sử dụng hơn 17 hợp chất kháng sinh

thuộc 10 nhóm khác nhau (penicillin, aminoglycoside, cephalosporin, quinolone,
tetracycline, amphenicols, polymyxin, diaminopyrimidine, rifamycins và sulfonamide);
trong đó, pho biến nhất là enrofloxacin (tỷ lệ sử dụng 69%), florfenicol (63%),
sulfamethoxazole tăng cường với trimethoprim (44%) và doxycycline (34%). Một so

công thức kháng sinh đang được các trại cá sử dụng là hồn họp của 2 kháng sinh như
sulfadimethoxine + ormetoprim, sulfamethoxazole + trimethoprim, apramycin +

levofloxacin. Kháng sinh được trộn vào từng bữa ăn trong mỗi ngày và liên tục từ 3 - 8
ngày. Qua khảo sát thực tế tại Việt Nam, các hộ dân ni cá tra sử dụng trung bình 3 loại
6


kháng sinh khác nhau và 10% sử dụng trên 5-6 loại kháng sinh khác nhau. Hầu hết các

hộ dân sử dụng kháng sinh để điều trị dịch bệnh và chỉ 5% trường cho mục đích phịng
ngừa bệnh (Rico và cs., 2013). Tương tự như các trang trại trên thế giới, lượng kháng

sinh ln vượt ngưỡng với liều lượng khơng chính xác (Dung và cs., 1997; Crumlish và
cs., 2002; Phuong và cs., 2005; Van, 2005).
Ket quả kháng gentemycin + streptomycin của hai chủng Streptococcus RI7 và

R47 và kháng trimethorime + sulfamethoxazole cùa chủng RI7 phân lập từ 62 mầu cá rô
bệnh đen thân và 4 mầu cá khỏe mạnh tại 9 ao nuôi ở cần Thơ và Hậu Giang (Nguyễn
Duy Khương, 2011) cho thấy, hiện tượng kháng kháng sinh và sự lan truyền các gen
kháng giừa các vi khuẩn gây bệnh thủy sản vào nước ao nuôi hoặc xung quanh khu vực

ni khi lạm dụng kháng sinh, hóa chất. Việc tích lũy tồn dư kháng sinh trong cá/động
vật thủy sản và nguồn nước sẽ tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe người tiêu
dùng như đà nêu trên (O’Neill và cs., 2015).

Năm 2012, tác giả Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự đã nghiên cứu phân lập được

chủng vi khuẩn Streptococcus agaỉactiae từ đối tượng cá rô đồng là tác nhân gây bệnh

xuất huyết ở cá cũng như cá bị nhiễm bệnh tự nhiên. Mười hai mầu cá rô đồng cịn sống
nhưng có những biểu hiện bất thường như lờ đờ và xuất huyết được thu thập tại các ao

nuôi ở tỉnh Đồng Tháp. Vi khuấn được phân lập từ các mầu cá rơ này và sau đó được
định danh dựa trên các chỉ tiêu về hình thái, sinh lý và sinh hóa (Oanh, Như, & Hiền,

2012).
Ngồi ra, trong năm 2012, tác giả Đặng Thụy Mai Thy và nhóm cộng sự sừ dụng

hai chủng vi khuẩn A. hydrophiỉa và Streptococcus sp phân lập từ cá rô bị bệnh phù mắt

và xuất huyết đe gây cảm nhiễm trên cá rô đồng. Vi khuẩn được tiêm trực tiếp vào cá ở
các nồng độ khác nhau và sau khi tiêm, cá được tiếp tục theo dõi trong 14 ngày. Ket quả
cho thấy, những nghiệm thức cá bị tiêm vi khuấn đều có các triệu chứng như cá bơi lờ đờ

mất thăng bằng, cá nởi đầu, và chết (Thy, Cúc, & Lam, 2012).
Năm 2013, Từ Thanh Dung và cộng sự lần đầu tiên nghiên cứu phân lập được

chủng vi khuẩn Streptococcus iniae từ cá rô đồng Anabas testudineus nuôi thâm canh tại
các tỉnh thuộc đồng bằng sơng Cửu Long. Nhóm tác giả phân lập vi khuẩn từ các mẫu

bệnh phẩm từ 114 mầu cá rơ. Sau đó, nhóm tác giả tiến hành nhuộm Gram, thực hiện các
7


test sinh hóa, sinh lý, và giải trình tự gene 16S rRNA đế xác định được vi khuẩn

Streptococcus iniae là tác nhân chính gây bệnh đen thân trên đối tượng cá rô đồng (Dung
và cs., 2013).

ớ Việt Nam, kế hoạch hành động quốc gia về quản lý sử dụng kháng sinh và
phòng chống kháng kháng sinh trong sản xuất chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản giai đoạn

2017 - 2020 đã được Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn ban hành (số 2625/ỌĐ-

BNN-TY). Vì vậy, các liệu pháp an toàn nhằm hạn chế/thay thế kháng sinh đang được
chú trọng trong nuôi trồng thủy sản nước ta.

8


CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1 Thu nhận và phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá bệnh/có dấu hiệu lạ

Thu mẫu: Cá rơ đồng A. testudỉneus bệnh/có dấu hiệu lạ (trọng lượng ~ 5 g) được
thu nhận từ các trang trại cá (Quận 12, Quận 9, Quận 8, Thủ Đức, cần Giờ,...) để phân
lập vi khuẩn gây bệnh. Mầu cá bệnh được chọn dựa trên các biểu hiện ban đầu như: cá lờ
đờ, bơi lội kém linh hoạt, bị cơ lập, có dấu hiệu bất thường (vảy bong tróc, đi mịn, đầu

và phần nắp mang trầy xước, mang cá nhạt màu...), biếu hiện cùa bệnh gan-thận-mủ trên
đuôi, thân, mắt hoặc bệnh xuất huyết (xuất huyết ở vùng mắt, xung quanh miệng, hậu

môn và ở các vây hoặc có dịch bên trong xoang bụng), hoặc cá vừa mới chết. Mầu cá có

the được giải phẫu, cấy vi khuấn trực tiếp tại địa diem thu mầu hoặc được cho vào trong
thùng đá (có sục khí) và mang về phịng thí nghiệm để tiến hành cơng tác phân lập vi

khuẩn. Thông tin về số mầu cũng như địa điểm thu mầu được ghi nhận.

Phân lập vi khuẩn từ nội tạng của cá bệnh/có dấu hiệu lạ: Nguồn cá rơ đong

bệnh/dấu hiệu lạ được thu nhận từ các trang trại nuôi cá và địa điếm phân phối thuộc các
quận (Quận 12, Quận 9, Quận 8, Thủ Đức, cần Giờ...) trên địa bàn TP.HCM vào khoảng
thời gian tháng 7-10 hàng năm. Cá thu nhận dựa trên các dấu hiệu bệnh như cá ít ăn/bỏ
ăn, cá bơi lờ đờ; thân đen, xuất huyết; hoặc thân xuất hiện các vết lở loét; vấy rụng; đi

mịn/cụt... Các mẫu lách, thận, mang, da, và gan được thu nhận và cấy lên đĩa môi trường

Trypton soy agar (TSA, Himedia). Đìa cấy được ù 24 giờ ở 28°c, sau đó các khuẩn lạc
rời được chọn làm thuần, tăng sinh và bảo quản trong môi trường Trypton soy broth

(TSB, Himedia) bổ sung 15% glycerol ở -80°C. Các chủng vi khuẩn được tái nuôi cấy
trên môi trường TSA, kiểm tra đặc điểm, hình thái, và sinh hóa trước khi sử dụng cho các

phân tích tiếp theo.
2.2 Các phản ứng sinh hóa

Sau khi phân lập được các chủng vi khuấn từ cá bệnh thì tiến hành thực hiện các

phản ứng sinh hóa để kiểm tra và định danh bước đầu. Các phản ứng được thực hiện trên
các môi trường chọn lọc hoặc thực hiện các phản ứng đặc trưng cho từng vi khuân.

9


14 chủng vi khuẩn đã
đưọc phân lập

Nhận định sơ bộ
bằng mơi trường

chọn lọc

Xác định bằng
phản ứng sinh hóa

Tên khoa học
dự kiến

Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện các phản ứng sinh hóa
Nhuộm Gram là phương pháp có thế phân biệt giữa nhóm vi khuan Gram dương

và Gram âm. Vi khuẩn Gram dương khi nhuộm có màu tím do thành tế bào của chúng có
một lớp peptidoglycan dày, do lớp này giữ lại hóa chất tím kết tinh trong dung dịch
nhuộm trong thành tế bào. Mặt khác, vi khuan Gram âm khi nhuộm sẽ màu đỏ, do lớp

peptidoglycan trong thành mỏng hơn nên nó khơng giữ tím kết tinh lại trong q trình
nhuộm (Lương Ngọc Kh và cs, 2017).

Mơi trường MacConkey Agar có tính chọn lọc đối với các sinh vật Gram âm và
giúp phân biệt thanh gram âm lên men lactose với thanh gram âm không lên men lactose

(Melab Diagnostics, 2010).

Môi trường thạch máu hay Blood Agar, là môi trường dung để kiểm tra khả năng
làm tan huyết của vi khuẩn. Dựa vào enzyme tiêu huyết hemolysin, thường dùng để phân
biệt các thành viên Staphylococcus, Streptococcus và Enterococcus (Melab Diagnostics,

2010).

10

Môi trường KIA dùng phân biệt, dựa vào lên men glucose và lactose, sinh hơi và

khử lưu huỳnh, thường dùng đe phân biệt các thành viên lên men và không lên men

lactose trong họ Enterobacteriaceae (Lương Ngọc Khuê và cs, 2017).
Thử nghiệm sinh oxidase là phản ứng dựa vào khả năng sinh enzyme cytochrome
oxidase của vi khuẩn, thường dùng để phân biệt họ Enterobacteriaceae (Ox (+)) với họ
Pseudomadaceae (Ox (-)). Khi vi sinh vật tiết cytochrome oxidase, enzyme này sè oxy

hóa chất cho điện tử nhân tạo, chuyến điện tử sang chất nhận điện tử nhân tạo và làm
xuất hiện màu tím thầm trên giấy thử (Lương Ngọc Khuê và cs, 2017).
2.3 Tách chiết DNA

DNA vi khuẩn được tách chiết bằng bô kit tách chiết DNA TopPƯREODNA

extraction kit (ABT, Việt Nam) (theo quy trình của nhà sản xuất)

Ly tâm dịch nuôi cấy ở tốc độ 13.000 rpm trong 5 phút, sau đó huyền phù trong
200 pl PBS (Phosphate-buffered saline), tiếp đó thêm 20 pl Proteinase K . Thêm 200 pl
CL buffer, vortex đều và ù khoảng 10 phút ở 60°C. Thêm 200 pL Ethanol (96 - 100%),
trộn đều và chuyển hồn hợp sang cột silica đặt sẵn trong tube 2 mL. Ly tâm ở tốc độ

13.000 rpm trong 60 giây. Giừ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng dưới đáy. Đặt lại cột vào

tube 2 ml cũ. Thêm 500 pl WB1 (Washing buffer) buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm
trong 60 giây. Giừ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng dưới đây. Đặt lại cột vào tube 2 ml
cũ. Thêm 500 pl WB2 buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 60 giây. Giừ lại cột và

loại bỏ phần chất lỏng ngay bên dưới. Đặt lại cột vào tube 2 ml cũ. Làm khô cột bằng

cách ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 60 giây. Chuyển cột sang tube 5 ml mới. Thêm 50
pl EB ( Elution Buffer) buffer và ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm
trong 60 giây, thu phần dịch chứa DNA bên dưới. DNA thu được sử dụng ngay hoặc bảo

quản ở -20°C.
2.4 Giải trình tự
Mầu được gửi giải trình tự gene với mồi đặc hiệu bằng phương pháp Sanger

sequencing (Nam Khoa, Việt Nam). Ket quả giải trình tự được kiếm tra lại bằng phần

mềm DNASTAR 5.01 và công cụ BLAST của cơ sở dừ liệu NCBI.

11


2.5 Phương pháp khảo sát loại kháng sinh, sự nhạy cảm của vi khuẩn

Tính nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đìa
khuếch tán (disk diffusion assay) của Kirby-Bauer (Bauer và cs., 1966) trên môi trường

thạch TSA/MHA dựa theo tiêu chuân của Clinical and Laboratory Standards Institute

(CLSI, 2011). Đĩa giấy kháng sinh được đặt lên đĩa vi khuẩn đã trải đều trên môi trường
MHA (0.5 McFarland, theo hướng dẫn của CLSI 2011). Trong nghiên cứu này, 10 loại
kháng sinh được chọn để thực hiện kháng sinh đồ với 13 chủng vi khuấn phân lập và làm

thuần được, gồm Am - Ampicillin; Ax - Amoxicillin; cp - Cefalexin; Ci - Ciprofloxacin;
Of - Oxfloxacin; Te - Tetracilin; Dx - Doxycyclin; Cl - Clindamycin; CL -

Chloramphenicol; Er - Erythromycin (Mekophar, Việt Nam). Sau đó, các đìa thạch được

ủ 24 giờ ở 28°c và ghi nhận sự kháng theo CLSI (2011).
Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho
vào ống nghiệm chứa 5 ml nước muối sinh lý NaCl 0,85% đã tiệt trùng. Trộn đều và so

sánh độ đục với ống McFarland số 3 (9,7 ml H2SO4 1% và 0,3 ml 1% BaCh). Nếu độ đục
ngang bằng với ống chuẩn McFarland thì mật số vi khuẩn trong ống nghiệm khoảng

9* 108 CFU/ml. Dùng pipet tiệt trùng hút lần lượt 0,1 ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi

trường thạch TSA và trãi đều vi khuẩn đen vừa khô. Đe yên khoảng 1 phút rồi dùng pel
tiệt trùng lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri sao cho khoảng cách giừa 2 tâm của đĩa

thuốc kháng sinh khoảng 24 mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa
petri khoảng 10-15 mm. Mồi đìa thạch dán tối đa 5 đĩa kháng sinh. Sau khi hồn tất

việc dán đìa thuốc kháng sinh thì đặt đĩa vào tủ ấm ở 28 - 30°C.
Đọc kết quả: sau 24 - 48 giờ, trên bề mặt đĩa thạch xuất hiện các vịng trịn khơng

có vi khuẩn phát triển (vịng vơ khuẩn). Đo đường kính vịng vơ khuẩn (mm) và dựa theo
tiêu chuấn của CLSI, 2011 để xác định tính khảng (resistant, R), nhạy trung bình
(intermediate, I) và nhạy cảm (susceptible, S) của vi khuấn đối với các loại kháng sinh.

12


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Ket quả về tình trạng nhiễm khuẩn nội tạng của cá bệnh

Từ 110 mẫu cá rơ đồng A. testudineus bệnh/có dấu hiệu lạ thu nhận từ năm trang
trại cá giống thuộc các quận trên địa bàn TP.HCM (Quận 12, Quận 9, Quận 8, Thủ Đức,

Cần Giờ,...), công việc lựa chọn ra số cá có dấu hiệu bất thường/biểu hiện bệnh rõ ràng,
đặc trưng nhất đế giải phẫu thu mẫu bệnh phẩm. Từ đó, công việc thu nhận được 65

khuẩn lạc trên môi trường ban đầu TSA, cụ thể gồm 14 chủng ở Quận 8 (chiếm 21,54%),
14 chủng ở Quận 9 (chiếm 21,54%), 11 chủng ở Quận 12 (chiếm 16,92%), 14 chủng ở

Thủ Đức (chiếm 21,54%), và 12 chủng ở cần Giờ (18,46%). Nhìn chung, hầu hết các

chủng vi khuẩn đều được phân lập từ các cơ quan như gan (30/65 chủng, chiếm 46,15%),

thận (19/65 chủng, chiếm 29,23%) và tỳ tạng (18/65 chủng, chiếm 27,69%) của cá rô
đồng bệnh (Bảng 3.1).
Bảng 3.1 Số chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng bệnh thu nhận từ các trang trại cá

giống
STT

Địa điềm

Số lượng

Số chủng

thu mẫu

cá (con)

khuẩn

Cơ quan phân lập*

1

Quận 8

24

14

Gan (6), thận (4), tỳ tạng (5)

2

Quận 9

23

14

Gan (6), thận (5), tỳ tạng (4)

3

Quận 12

21

11

Gan (7), thận (5), tỳ tạng (5)

4

Thủ Đức

22

14

Gan (7), thận (2), tỳ tạng (3)

5

Cần Giờ

20

12

Gan (4), thận (3), tỳ tạng (1)

Tổng

110

65

Gan (30), thận (19), tỳ tạng (18)

*Các số trong dấu ngoặc là số chủng vi khuẩn phần lập từ cơ quan cá bệnh gan-thận-mủ
và cá nhiễm kép hai bệnh gan-thận-mủ và xuất huyết.

Ngồi các dấu hiệu cảm quan ban đầu, cá rơ bệnh khi thu nhận đều lờ đờ, bơi lội

kém linh hoạt, cá bệnh bị những con cá khác cắn hoặc cơ lập, vảy bong tróc, đi mịn,
đầu và phần nắp mang trầy xước, mang cá nhạt màu, kèm theo biếu hiện đặc trưng bệnh

gan-thận-mù (cá bệnh có các đốm trắng nhỏ li ti trên da, gan, thận và tỳ tạng) hoặc bệnh
xuất huyết (xuất huyết ở vùng mắt, xung quanh miệng, hậu mơn và ở các vây hoặc có
13


dịch bên trong xoang bụng) hoặc có dấu hiệu nhiễm kép hai loại bệnh trên được thu ở các
ao nuôi (Hình 3.1 và Hình 3.2).

Hình 3.1 Hình ảnh ngoại thê của cá rơ Hình 3.2 Hình ảnh giải phầu nội tạng cá
đông bệnh. Cả bệnh được thu từ trại cả rô đông bệnh. Cả bệnh được giải phẫu
giong với các dấu hiệu bệnh/có dấu hiệu và ghi nhận tình trạnh nội tạng, như (A)
lạ bên ngoài, như (A) đầu và mang cá bị gan bầm đỏ, xuất hiện một vài đom
tróc và xuất huyết; (B) da bị bong tróc trắng; (B) tỳ tạng sưng to bất thường;
vảy và cỏ dấu hiệu xuất huyết dưới da; (C) thận có màu đỏ bầm, có dấu hiệu
(C) đi bị ăn mịn, ngan hơn so với bình sưng to.
thường
Kết quả sau 24 - 48 giờ nuôi cấy vi khuấn từ mẫu bệnh phấm của của cá rơ bệnh
trên mơi trường TSA (Hình 3.3) thu nhận được một tổ hợp các chủng vi khuẩn dựa theo

nhận định về hình thái khuấn lạc ban đầu. Các chùng vi khuẩn này sè được làm thuần và
bảo quản trong trong môi trường BHIB, glycerol 15% ở -80°C cho các phân tích tiếp

theo.

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc phân lập ban đầu trên các mầu bệnh phẩm thu nhận từ nội

tạng của cá rô bệnh. (A) Khuân lạc thu được từ mẫu bệnh phẩm gan, thận, tỳ tạng (lách),
và mang; (B) khuẩn lạc thu được từ mẫu bệnh phẩm da thân, và đuôi

14


dịch bên trong xoang bụng) hoặc có dấu hiệu nhiễm kép hai loại bệnh trên được thu ở các
ao nuôi (Hình 3.1 và Hình 3.2).

Hình 3.1 Hình ảnh ngoại thê của cá rơ Hình 3.2 Hình ảnh giải phầu nội tạng cá
đông bệnh. Cả bệnh được thu từ trại cả rô đông bệnh. Cả bệnh được giải phẫu
giong với các dấu hiệu bệnh/có dấu hiệu và ghi nhận tình trạnh nội tạng, như (A)
lạ bên ngoài, như (A) đầu và mang cá bị gan bầm đỏ, xuất hiện một vài đom
tróc và xuất huyết; (B) da bị bong tróc trắng; (B) tỳ tạng sưng to bất thường;
vảy và cỏ dấu hiệu xuất huyết dưới da; (C) thận có màu đỏ bầm, có dấu hiệu
(C) đi bị ăn mịn, ngan hơn so với bình sưng to.
thường
Kết quả sau 24 - 48 giờ nuôi cấy vi khuấn từ mẫu bệnh phấm của của cá rơ bệnh
trên mơi trường TSA (Hình 3.3) thu nhận được một tổ hợp các chủng vi khuẩn dựa theo

nhận định về hình thái khuấn lạc ban đầu. Các chùng vi khuẩn này sè được làm thuần và
bảo quản trong trong môi trường BHIB, glycerol 15% ở -80°C cho các phân tích tiếp

theo.

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc phân lập ban đầu trên các mầu bệnh phẩm thu nhận từ nội

tạng của cá rô bệnh. (A) Khuân lạc thu được từ mẫu bệnh phẩm gan, thận, tỳ tạng (lách),
và mang; (B) khuẩn lạc thu được từ mẫu bệnh phẩm da thân, và đuôi

14


3.2 Ket quả về đặc điểm hình thái các chiing vi khuẩn chiếm ưu thế phân lập và làm

thuần
Từ 110 mẫu cá rơ đồng A. testudineus bệnh/có dấu hiệu lạ thu nhận từ năm trang
trại cá giống thuộc các quận trên địa bàn TP.HCM, 65 khuẩn lạc phát triển trên môi

trường chọn lọc ban đầu TSA. Sau mồi 24 giờ cấy chuyển nhiều lần để làm thuần các
khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường NA, nghiên cứu chọn lọc được 14 chủng thuần nhất

(I - XIV) dựa theo đặc điểm hình thái khuẩn lạc ban đầu (Bảng 3.2). Các chủng vi khuẩn
sau khi tách khuẩn lạc thuần sẽ được trừ trong trong môi trường BHIB chứa glycerol 15%
ở -80°C. Các đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hóa co bản cùa chủng khuẩn sẽ được
kiểm tra trước khi sử dụng cho các phân tích tiếp theo.
Bảng 3.2 Các khuân lạc phân lập và làm thuần trên môi trường NA

15