Phân lập, định danh và xác định đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



HOÀNG NGUYÊN




PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH
VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC
ĐIỂM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
KỊ KHÍ, ƯA NHIỆT, SINH CELLULASE






CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH
MÃ NGÀNH: 60 42 30
HDKH: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH

TP. HỒ CHÍ MINH, 06/2011

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các
thầy cô, các anh chị và các bạn. Xin được tỏ lòng cảm ơn chân thành đến:
Thầy tiến sỹ Hoàng Quốc Khánh, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh
học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam người đã tận tình hướng
dẫn và tạo điều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận.
Anh Ngô Đức Duy, anh Nguyễn Duy Long, chị Đào Thị Thu Hiền cùng
toàn bộ các anh chị phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn trực tiếp hoàn thành khóa luận.
Thầy cô và các anh chị ở Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học
Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Thầy cô bộ môn sinh hóa, cùng toàn thể các thầy cô khoa Sinh học
Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí
Minh cũng như các thầy cô trước đây đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt nhiều kiến
thức quí báu trong suốt nhiều năm học qua.
Các bạn lớp cao học khóa 18 đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ niềm vui
nỗi buồn trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng con xin cảm ơn ba mẹ đã nuôi nấng, chăm sóc, luôn dạy
con điều hay lẽ phải và cho con ăn học thành người có ích cho xã hội. Em cũng
xin cảm ơn các anh chị đã luôn quan tâm, chăm sóc, khích lệ em trong những lúc
khó khăn nhất để em có thể vững bước trên đường đời.
TP Hồ Chí Minh, 06/2011

Hoàng Nguyên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
LỜI MỞ ĐẦU

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1
1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose 1
1.1.1. Cấu trúc của cellulose 1
1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật 2
1.2. Các chủng sinh vật sinh cellulase 3
1.2.1. Nấm mốc 3
1.2.2. Vi khuẩn sản xuất cellulase 5
1.3. Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase 7
1.3.1. Đặc điểm chung 7
1.3.1.1. Cơ chất ưu tiên 7
1.3.1.2. Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe 7
1.3.1.3. Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose 8
1.3.1.4. Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng 10
1.3.2. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình 10
1.4. Hệ thống enzym cellulase 12
1.4.1. Thành phần của cellulase 12
1.4.2. Cơ chế thủy giải cellulose 13
1.4.3. Ứng dụng enzyme cellulase 14
1.4.4. Hệ thống cellulase không phức hợp 15
1.4.5. Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp 16
1.4.5.1. Đặc điểm chung 16
1.4.5.2. Cấu trúc cellulosome 18

1.4.5.3. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào 20
1.4.5.4. Sự sắp xếp của
cellulosome 22
1.4.5.5.

Sự điều hòa nguồn carbon 24
1.5.

Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase 25
1.6.

Phương pháp định danh sinh học phân tử 26

2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29
2.1.

Vật liệu 29
2.1.1.

Nguồn phân lập 29
2.1.2.

Thiết bị dụng cụ 29
2.1.2.1.

Thiết bị thông dụng 29
2.1.2.2.

Thiết bị phân lập vi khuẩn kị khí 29
2.1.2.3.

Môi trường 30
2.1.2.4.

Hóa chất 31
2.1.2.5.

Chủng vi khuẩn đối chứng 35
2.2.

Phương pháp thực hiện 35
2.1.1.

Phương pháp tạo môi trường kị khí 35
2.1.2.

Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase 36
2.2.2.

Đặc tính sinh lí hình thái vi khuẩn 37
2.2.2.1.

Đặc điểm khuẩn lạc 37
2.2.2.2.

Phương pháp nhuộm Gram 37
2.2.2.3.

Phương pháp nhuộm bào tử 38

2.2.3.

Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS 39
2.2.3.1.

Khả năng sử dụng giấy lọc 41
2.2.3.2.

Khả năng sử dụng rơm rạ 41
2.2.3.3.

Xác định hàm lượng protein ngoại bào 42
2.2.3.4.

Định lượng hoạt tính cellulase tổng số 43
2.2.3.5.

Bán định lượng hoạt tính endoglucanase 44
2.2.3.6.

Hoạt tính endoglucanase xác định
In-situ
trên gel
polyacrylamide 45
2.2.3.6.1.

Lượng protein tối ưu thủy phân CMC 47
2.2.3.6.2.

Sự khác biệt giữa dung dịch protein A và protein B 47
2.2.3.6.3.

Khả năng thủy phân CMC của các chủng 47
2.2.3.7.

Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase 48
2.2.3.8.

Tối ưu hóa hoạt tính cellulase 48
2.2.3.8.1.

Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 48
2.2.3.8.2.

Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase 48
2.2.4.

Định danh vi khuẩn 49
2.2.4.1.

Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng
cho vi khuẩn
Clostridium
50
2.2.4.2.

Phản ứng PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại
loài 51

3.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52
3.1.

Phân lập các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase 52
3.2.

Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase 54
3.2.1.

Đặc điểm khuẩn lạc 54
3.2.2.

Nhuộm Gram 55
3.2.3.

Nhuộm bào tử 56
3.3.

Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS 57
3.3.1.

Khả năng sử dụng giấy lọc 57
3.3.2.

Khả năng sử dụng rơm rạ 58
3.3.3.

Xác định hàm lượng protein ngoại bào 59
3.3.4.

Xác định hoạt tính cellulase tổng số 60
3.3.5.

Bán định lượng hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC 62
3.3.6.

Hoạt tính endoglucanase xác định
In-situ
trên gel polyacrylamide
64
3.3.6.1.

Nồng độ protein tối ưu cho khả năng thủy phân CMC 64
3.3.6.2.

Sự khác biệt giữa dung dịch protein B và protein A 65
3.3.6.3.

Khả năng thủy phân CMC của 6 chủng khảo sát 68
3.4.

Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase 71
3.5.

Tối ưu hóa hoạt tính cellulase 73
3.5.1.

Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 73
3.5.2.

Ảnh hưởnng pH lên hoạt tính cellulase 74
3.6.

Định danh vi khuẩn 75
3.6.1.

Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi
khuẩn
Clostridium
76
3.6.2.

PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại 77

4.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81
4.1.

Kết luận 81
4.2.

Kiến nghị 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
PHỤ LỤC 5
PHỤ LỤC 6

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc 57
Biểu đồ 3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ 58
Biểu đồ 3.3. Nồng độ protein ngoại bào của các chủng 59
Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng 61
Biểu đồ 3.5. Sự tương quan giữa lg(trọng lượng phân tử) protein thang chuẩn với
Rf 67
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase 72
Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính celluase 73
Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính celluase 85







DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật 3
Hình 1.2. Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum 9
Hình 1.3. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình 11
Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của hệ enzym cellulase của Trichoderma reesei 13
Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C. thermocellum 18

Hình 1.6. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào 21
Hình 1.7. Cấu trúc của phức hợp Coh-XDoc loại II của loài C. thermocellum 23
Hình 2.1. Quy trình thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi universal 52
Hình 3.1. Vòng phân giải cellulose của mẫu DR5 và DM7 53
Hình 3.2. Khuẩn lạc chủng DR5-1 54
Hình 3.3. Kết quả nhuộm Gram chủng TQ1-2 55
Hình 3.4. Kết quả nhuộm bào tử chủng DR5-1 56
Hình 3.5. Vòng phân CMC của dung dịch protein B và protein A của TQ1-2 62
Hình 3.6. Vạch phân giải CMC trên gel với lượng protein khác nhau của dung
dịch Protein B chủng TQ1-2 64
Hình 3.7a. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1 66
Hình 3.7b. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2 66
Hình 3.8a. Vạch phân giải CMC của dung dịch Protein B và protein A chủng
DM5-1, DM7-1, DR5-1 69

Hình 3.8b.
Vạch phân giải CMC của dung dịch ProteinB và protein A chủng
DM8-1, DT2-1, TQ1-2 69
Hình 3.9.

Sản phẩm PCR cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205-A-21
.
76
Hình 3.10.
Sản phẩm PCR cặp mồi universal 77
Hình 3.11.
Cây phân loại loài của các chủng khảo sát 80
1

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose 5
Bảng 1.2. Vi khuẩn sản xuất hệ thống
cellulosome 17
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 54
Bảng 3.2. Nhuộm Gram và khảo sát các đặc điểm hình thái tế bào 55
Bảng 3.3. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng 61
Bảng 3.4. Hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC 62
Bảng 3.5. Trọng lượng phân tử của các vạch protein trên SDS-PAGE 68
Bảng 3.6. Trọng lượng phân tử của các vạch protein phân giải CMC trên gel 70





Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
1

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose
1.1.1. Cấu trúc của cellulose
Cellulose là polimer được cấu thành từ các đơn phân glucose được liên kết
bởi β-1,4 glycoside, là vật liệu chủ yếu của vách tế bào thực vật và là nguồn
carbohydrate phong phú nhất trong tự nhiên. Mức độ polimer hóa thường từ 100
đến 20.000. Các chuỗi cellulose gần nhau được liên kết với nhau tạo thành các tấm
cellulose qua liên kết hydrogen và liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh
thể, phân tử dạng sợi, bền vững [43].
Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ được sắp xếp thành đơn vị lớn hơn gọi
là sợi cơ bản, sau đó được bó thành sợi lớn hơn gọi là vi sợi và được cấu trúc thành
những sợi cellulose. Sợi cellulose bền vững bởi các liên kết nội phân tử cũng như

liên kết hydrogen nội phân tử. Sự xắp xếp các chuỗi riêng lẻ bên trong những sợi
cơ bản đã được tìm hiểu từ sự phân tích tán xạ tia X [23].
Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm những cấu trúc cố định trong những vị
trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với những vị trí khác. Chúng có khả năng ngăn
ngừa sự xâm nhập không chỉ enzym mà thậm chí những phân tử nhỏ như nước.
Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, những sai sót trong cấu trúc tinh thể đã dẫn
đến hình thành một nhóm sợi cellulose có cấu trúc vô định hình. Sợi cellulose còn
có những cấu trúc bất quy tắc khác như: những chỗ xoắn trong vi sợi, những lỗ
trống trên bề mặt, những lỗ, hốc nhỏ và một số mạch nhỏ. Tổng diện tích tiếp xúc
của sợi cellulose lớn hơn bề mặt tinh thể trong cấu trúc cùng kích thước. Sự không
đồng nhất trong cấu trúc làm cho sợi bị hydrate bởi nước khi nhúng vào môi
trường lỏng và cho phép sự xâm nhập bởi các phân tử lớn bao gồm các enzym
thủy phân cellulose [23].
Phân tử cellulose rất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho sự
phân cắt liên kết β-1,4 glycoside tại 25
o
C. Trong khi, quá trình phân hủy sinh học
thường nhanh hơn và cung cấp dòng carbon cho khí quyển [43].


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
2

1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật
Sinh khối thực vật chiếm giữ khoảng một nửa nguồn carbon trong sinh
quyển. Người ta ước tính rằng lượng carbon được thực vật đồng hóa hàng năm
khoảng 200 tỷ tấn [29]. Khoảng 70% sinh khối thực vật được cấu thành từ các đơn
vị đường chứa 5, 6 carbon [27]. Phân tử cellulose kết hợp thành những sợi có cấu
trúc tinh thể hình thành nên bộ khung cho vách tế bào thực vật. Sợi cellulose được
liên kết chéo với các polysaccharide khác gọi là hemicellulose để làm tăng độ bền

cho vách tế bào. Hemicellulose bao gồm xylan (đơn phân -D-xylose với liên kết -
1,4-), glucomannan (đơn phân -D-mannose và -D-glucose với liên kết -1,4-),
xyloglucan (đơn phân -D- glucose với liên kết 1,4-, và -D-xylose và -D-glucose
với liên kết -1,6-), 1,3-1,4-glucan (đơn phân -D-glucose với liên kết -1,3- và -1,4-),
và số lượng nhỏ polysaccharide khác bao gồm -D-glucose, -D-xylose, -D-mannose
và đơn vị đường khác với các liên kết khác nhau. Bộ khung cellulose và
hemicellulose còn được liên kết với pectin (đơn phân -D-galacturonic acid với liên
kết chủ yếu -1,4-), với chức năng là chất gắn trong vách tế bào [23].
Thành phần và cấu trúc của vách tế bào có sự khác biệt lớn giữa các loài
thực vật, hàm lượng cellulose thông thường chiếm từ 35 đến 50% trọng lượng khô
thực vật. Trong một số trường hợp, sợi cellulose được gắn vào mạng lưới các sợi
sinh học khác, chủ yếu là hemicellulose chiếm khoảng 20 đến 35% và lignin chiếm
khoảng đến

30% trọng lượng khô thực vật [23].

Lignin, hiện diện cùng với cellulose trong nhiều loài thực vật giúp làm cứng
vách tế bào thực vật. Các loại thực vật khác nhau thì có thành phần lignin khác
nhau. Tuy nhiên, sự hiện diện của lignin ngăn cản sự chuyển đổi các
polysaccharide thành các đơn phân dưới tác động của enzym [6].


Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
3


Hình 1.1. Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật [46]
Sự sử dụng sinh khối cellulose phức tạp hơn so với cellulose thuần khiết
không chỉ bởi thành phần phức tạp của chúng mà còn bởi vì cấu trúc đa dạng của
tế bào thực vật. Tế bào thực vật rất khác nhau về kích thước và tổ chức. Một số

loại tế bào thực vật có vách mỏng, ít bị lignin hóa thì dễ dàng bị thủy phân bởi các
enzym thủy giải polysaccharide

[23].
Sinh khối thực vật khó khăn trong việc thủy giải bởi vì: chúng liên kết với
hemicellulose, được bao bọc bởi lignin và có cấu trúc tinh thể có khả năng hình
thành sáu liên kết hydrogen: bốn liên kết nội phân tử và hai liên kết liên phân tử.
Do đó, trước khi thủy giải với enzym, việc tiền xử lý là cần thiết để gia tăng diện
tích bề mặt của cellulose bằng cách loại bỏ lớp lignin, hòa tan hemicellulose, phá
vỡ cấu trúc tinh thể và gia tăng cấu trúc lỗ trong tinh thể [11].

1.2. Các chủng sinh vật sinh cellulase
1.2.1. Nấm mốc
Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose nhưng chỉ có một vài vi
sinh vật có khả năng phân hủy hiệu quả cellulose tinh thể [27]. Các sinh vật phân
hủy cellulose hiếu khí như vi khuẩn và nấm, sử dụng cellulose thông qua sản xuất
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
4

số lượng lớn cellulase ngoại bào trong dịch nuôi cấy, mặc dù thỉnh thoảng cũng có
sự hiện diện trên bề mặt tế bào. Hầu hết các loài nấm đều có khả năng sử dụng
cellulose như là nguồn cơ chất cho sự phát triển. Nhiều loài nấm nguyên thủy, như
lớp nấm Chytridomycete kị khí, có khả năng thủy giải cellulose trong vùng ruột
của động vật nhai lại. Khả

năng thủy giải cellulose cũng được tìm thấy ở nhiều
loài nấm kị khí khác [23].

Với xấp xỉ 700 loài nấm Zygomycete, nhưng chỉ một vài loài thuộc giống
Mucor cho thấy có hoạt tính thủy giải cellulose. Trái lại,

ngành nấm Ascomycete,
Basidiomycete

và Deuteromycete, mỗi ngành có hơn 15,000 loài, thủy giải mạnh
cellulose. Nhiều giống nấm thu hút nhiều sự nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải
cellulose và gỗ như: Chaetomium và Helotium (Ascomycete); Coriolus,

Phanerochaete, Poria, Schizophyllum và Serpula (Basidiomycete);

và Aspergillus,
Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium,

Paecilomyces, Penicillium
và Trichoderma (Deuteromycete) [23].
Nấm mốc thuộc giống Trichoderma và Aspergillus là hai loài sản xuất được
số lượng lớn cellulase và đã có nhiều sản phẩm thương mại dùng trong công
nghiệp. Trichoderma sản xuất ra lượng lớn endo-ß-glucanase và exo-ß-glucanase
nhưng với mức độ thấp ß-glucosidase, trong khi đó giống Aspergillus sản xuất số
lượng lớn endo-ß-glucanase và ß-glucosidase nhưng với số lượng thấp exo-ß-
glucanase [27].

Phức hợp cellulase của Trichoderma reesei có thể chuyển đổi hoàn toàn
cellulose tự nhiên cũng như các dẫn xuất của cellulose thành glucose. Sự phát triển
của các loại nấm cũng như sự sản xuất của các loại enzyme cellulase phụ thuộc
nhiều vào thành phần môi trường, nước, pH, nhiệt độ và ánh sáng, và không khí
môi trường xung quanh [34].
Chủng Aspergillus fumigatus cho thấy khả năng sử dụng cellulose tinh thể
như là nguồn carbon duy nhất. Chúng tạo ra nhiều loại cellulase ngoại bào, trong
đó có 6 vạch có hoạt tính endoglucanase khi điện di trên gel polyacrylamide. Hoạt

tính CMCase tối ưu tại 65°C và pH 2, cho thấy đây là loài vi sinh vật sản xuất
endoglucanase ưa nhiệt và acid [13].

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
5

1.2.2. Vi khuẩn sản xuất cellulase
Trong số các loài vi khuẩn, khả năng thủy giải cellulose được tìm thấy ở hai
bộ: Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí. Dựa vào các đặc điểm sinh lí,
vi khuẩn thủy giải cellulose có thể thấy bao gồm những nhóm sinh lí sau [23]:
o Vi khuẩn kị

khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, và
Caldicellulosiruptor)
o Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas và Thermobifida)
o Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga, và Sporocytophaga)
Thông thường, chỉ một vài loài trong những giống trên có hoạt tính thủy giải
cellulose. Các vi khuẩn này khác nhau trong việc sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy,
nồng độ muối và cellulose trong môi trường tự nhiên. Việc phân loại các vi khuẩn
kị khí sử dụng cellulose là hết sức phức tạp bởi vì gần đây nhiều chủng vi khuẩn
không có khả năng thủy giải cellulose nhưng lại có hệ thống gen cellulosome
không được biểu hiện do sự sai hỏng của trình tự promoter như loài Clostridium
acetobutylicum [33].
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose [23]
Tiêu
thụ
oxy
Giống Loài tiêu biểu Gram

Kiểu

hình
T
o
tối
ưu
Tạo
bào tử
Di động Hệ thống
cellulase
Acidothermus A. cellulolyticus + Que Ưa
nhiệt
- - Không phức
hợp
Bacillus B. pumilis + Que Trung
bình
Nội
bào tử
Flagellar

Không phức
hợp
Caldibacillus C. cellovorans + Que Ưa
nhiệt
- Không phức
hợp
Cellulomonas
c
C. flavigena, C.
uda
+ Que Ưa

nhiệt
- Flagellar

Không phức
hợp
Cellvibrio C. fulvus, C.
gilvus
- Que
cong
Trung
bình
- Flagellar

Không phức
hợp
Cytophaga C. hutchinsonii - Que Trung
bình
- Gliding Không phức
hợp
Erwinia C. carotovora - Que Trung
bình
- Flagellar

Không phức
hợp
Micromonospora M. chalcae
+
Que
sợi
Trung

bình
Bào tử -
Pseudomonas P. fluorescens var.
cellulosa
- que Trung
bình
- Flagellar

Không phức
hợp
Sporocytophaga S. myxococcoides - que Trung
bình
Bào tử Gliding Không phức
hợp
Hiếu
Khí
Rhodothermus R. marinus que Ưa
nhiệt

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
6

Streptomyces S. reticuli + Que
sợi
Trung
bình
Bào tử - Không phức
hợp
Thermobifida T. fusca + Que
sợi

Ưa
nhiệt
Bào tử - Không phức
hợp
Acetivibrio D. cellulolyticus - Que
cong
Trung
bình
- - Phức hợp
Anaerocellum D. thermophilum + Que Ưa
nhiệt
- Flagellar

Không phức
hợp
Butyrivibrio B. fibrisolvens + Que
cong
Trung
bình
- Flagellar

Không phức
hợp
Caldicellulosiruptor

C.
saccharolyticum
- Que Ưa
nhiệt
- Flagellar

Không phức
hợp
Clostridium C. thermocellum,
C. cellulolyticum
+ Que Ưa
nhiệt,
trung
bình
Nội
bào tử
Flagellar

Phức hợp
Eubacterium E. cellulosolvens + Que Trung
bình
- -
Fervidobacterium F. islandicum - Que Ưa
nhiệt
- Que
Fibrobacter F. succinogenes - Que Trung
bình
- - Phức hợp
Halocella H. cellulolytica - Que Trung
bình
- Flagellar

Không phức
hợp
Ruminococcus R. albus, R.

flavefaciens
+ Cầu Trung
bình
- - Phức hợp
Spirochaeta S. thermophila + Xoắn

Ưa
nhiệt
- Không phức
hợp
Kị
Khí
Thermotoga T. neapolitana - Que Ưa
nhiệt


Các nhóm vi khuẩn kị khí và hiếu khí có sự khác nhau trong cơ chế thủy
giải cellulose. Hầu hết các vi khuẩn kị khí phân hủy cellulose thông qua hệ thống
cellulase phức hợp được tổ chức tốt như polycellulosome của Clostridium

thermocellum [33].

Mặc dù, các vi khuẩn kị khí tùy ý phân bố rộng rãi, giống Cellulomonas là
giống vi khuẩn kị khí tùy ý duy nhất có hoạt tính phân hủy cellulase. Các vi khuẩn
thủy giải cellulose hiếu khí trong đất thường được tìm thấy: Bacillus,
Micromonospora

và Thermobifida [23].
Gần đây, chủng Bacillus subtilis DR được phân lập từ suối nước nóng tạo ra
một vài loại cellulase bền nhiệt. Nhiệt độ môi trường cao cho phép sản xuất ra loại

endocellulase CelDR bền nhiệt với nhiệt độ tối ưu lên đến 50°C và hoạt tính này
vẫn còn đến 70% tại 75°C sau khi ủ 30 phút. Chủng vi khuẩn này cho thấy có
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
7

nhiều tiềm năng dùng trong công nghiệp lọc dầu bởi vì khả năng chịu được nhiệt
độ cao [27].
Chủng vi khuẩn ưa nhiệt thủy giải cellulose Brevibacillus sp. JXL có khả
năng sử dụng nhiều loại cơ chất như cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose,
glucose và xylose. Enzym của Brevibacillus sp. JXL có khả năng bền nhiệt rất cao,
vẫn giữ được 50% sau khi xử lý tại 100°C trong một giờ.

1.3. Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase
1.3.1. Đặc điểm chung
1.3.1.1. Cơ chất ưu tiên
Những loài vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose (Fibrobacter, Ruminococcus
và Clostridium) thường giới hạn trong phạm vi sử dụng carbohydrate, phát triển
trên cellulose và những sản phẩm thủy phân của chúng nhưng không phát triển
trên đường đơn, đường đôi, đường đa được cấu thành bởi các đơn phân khác
glucose. C. thermocellum phát triển chậm trên môi trường glucose và cả C.
thermocellum và

R. albus dùng cellobiose ưu tiên hơn so với glucose. Một vài loài
vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose có thể sử dụng xylan [23].
Một vài báo cáo gần đây cho thấy các vi khuẩn kị khí phân giải cellulose
(Anaerocellum thermophilum, C. saccharolyticus

và Halocella cellulolytica) có
phạm vi rộng trong việc sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau với các hợp chất
tinh bột, đường đơn, đường đa. Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của

những loài thủy giải cellulose bao gồm: nitrogen, phospho, lưu huỳnh, các khoáng
đa lượng, vi lượng và một số loại vitamin. Một vài vi khuẩn thủy giải cellulose cần
các yếu tố cho sự phát triển mạnh như pepton hay dịch chiết nấm men [23].

1.3.1.2. Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe (CEM)
Sự biến dưỡng cellulose bắt đầu từ sự thủy phân cellulose thành các loại
đường đơn hoặc đôi và sau đó sử dụng các sản phẩm thủy giải này. Có 2 cách thủy
giải cellulose [23]:
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
8

o Vi khuẩn hiếu khí và nấm: enzyme cellulase thường không gắn hay
gắn yếu vào cellulose, sản xuất cellulase ngoại bào và oxy hóa sản phẩm
thủy phân thành CO
2
và nước.
o Vi khuẩn và nấm kị khí cho thấy khuynh hướng gắn enzyme
cellulase vào cellulose, sản xuất ra phức hợp cellulase được tổ chức thành
các cellulosome và tạo ra nhiều sản phẩm lên men khác nhau.
Yêu cầu đầu tiên cho sự thủy giải cellulose là sự liên kết enzym vào
cellulose hình thành phức hợp enzyme-cơ chất hoặc hình thành phức hợp CEM
[23]. Chủng đột biến C. thermocellum và F. succinogenes không có sự kết dính
này giảm khả năng thủy phân cellulose. Do đó, sự gắn kết phức hợp CEM là một
yêu cầu quan trọng cho sự sử dụng cellulose giữa các vi khuẩn kị khí, là tác nhân
quan trọng cho thủy giải cellulose [23].
Phức hợp CEM có nhiều thuận lợi hơn trong hoạt tính thủy giải cellulose
trong môi trường nuôi cấy: tập trung enzym trên bề mặt cellulose, cho phép vi sinh
vật thủy giải cellulose tiếp xúc với các sản phẩm thủy phân, bảo vệ vi khuẩn dưới
tác động của bacteriophage và các enzym thủy giải protease trong môi trường.
Nhìn chung, việc tạo các yếu tố liên kết cellulose có nhiều lợi ích trong việc tiết

kiệm phí tổn năng lượng cho vi khuẩn [23].

1.3.1.3. Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose
Sự hấp thu glucose và cellodextrin được tìm thấy ở nhiều loài thủy giải
cellulose. C. thermocellum cho thấy sự hấp thu [
14
C]cellobiose và cellodextrin bởi
hệ thống phụ thuộc ATP trong khi đó glucose cũng được hấp thụ theo cơ chế riêng
biệt và phụ thuộc ATP. Sự sụt giảm vận chuyển cellobiose và cellodextrin nhanh
chóng khi giảm nồng độ ATP nội bào.
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
9


Hình 1.2. Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum [35]
Chú thích: G-1-P, glucose-1-phosphate; G-6-P, glucose-6-phosphate; Pi, phosphate vô
cơ; CBPase, cellobiose phosphorylase; CDPase, cellodextrin phosphorylase; HK,
hexokinase; PGM, phosphoglucomutase.
Chủng vi khuẩn thủy giải cellulose Streptomyces reticuli

sản xuất protein
ABC (ATP-binding cassette protein) có khả năng hỗ trợ vận chuyển cellobiose,

cellotriose và cellodextrin. Trái lại, F. succinogenes dùng nồng độ điện hóa cho sự
hấp thu glucose và cellobiose. Sự yêu cầu Na
+
cho sự

phát triển trên cellulose cho
thấy rằng Na

+
cũng

là động lực cho sự hấp thụ cellodextrin [26].
Nồng độ cellodextrin và các cơ chất khác như cellulose hoặc cellobiose
quyết định con đường biến dưỡng cellodextrin cũng như sự phân cắt thủy giải
phosphoryl hóa hay sự thủy giải không phosphoryl hóa.

Sự điều hòa dòng cơ chất
thông qua hai con đường biến dưỡng có lẽ cung cấp một phương cách để điều
chỉnh cung cấp ATP đáp ứng với các yếu tố môi trường. Sinh khối tế bào gia tăng
cùng với sự gia tăng chiều dài chuỗi cellodextrin, sản lượng tế bào trên cellulose
cao hơn trên cellobiose [26].



Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
10

1.3.1.4. Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng
Đối với Clostridium và R. albus,

ethanol và H
2
là sản phẩm biến dưỡng cuối
cùng

và acetyl coenzyme A (acetyl-CoA) có vai trò quan trọng tạo ra ethanol và
acetate [14]. Sự sản xuất ethanol trong nuôi cấy mẻ của C. thermocellum được gia
tăng khi cho thêm acetate và lactate và sụt giảm khi cho thêm ethanol [23]. Chủng

Anaerocellum thermophilum là chủng duy nhất trong số vi khuẩn kị khí thủy giải
cellulose, tạo ra lactate là sản phẩm chính của sự lên men cellulose [38].
Sản phẩm cuối cùng được điều hòa ở vài mức độ: nồng độ các chất trung
gian,

sản phẩm lên men, chất mang electron, hoạt tính và sự tổng hợp enzym.
Chủng

F. succinogenes S85, R. albus 7, và R. flavefaciens

FD-1 ít thay đổi sản
phẩm lên men khi thay đổi tỷ lệ phát triển, pH, nguồn carbohydrate trong tự nhiên.
C. cellulolyticum và C. thermocellum có sự gia tăng tỉ lệ chuyển đổi ethanol thành
acetate và thay đổi tỷ lệ sản phẩm sau cùng khi có sự hiện diện của dịch chiết nấm
men trong môi trường [23].
Hầu hết các vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose phát triển tối ưu khi tiếp xúc
trực tiếp với cơ chất, một vài loài sự tiếp xúc này là bắt buộc. Giống như các vi
khuẩn kị khí khác, vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose thường có sinh khối thấp,
phần lớn cơ chất được chuyển thành các sản phẩm lên men khác nhau: ethanol,
acid hữu cơ, CO
2
và H
2
[23].

1.3.2. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình
Clostridium thermocellum: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, thủy giải
cellulose và có khả năng sinh ethanol, chuyển đổi trực tiếp cơ chất cellulose thành
ethanol. Chúng phân hủy vật liệu cellulose thông qua một phức hợp cellulase lớn
gọi là cellulosome. Đây là một phức hợp protein rất phức tạp bao gồm khoảng 20

loại enzym có hoạt tính xúc tác khác nhau có trọng lượng từ 40-180 KDa.
Cellulosome của C. thermocellum được nghiên cứu nhiều và được dùng như là
kiểu mẫu trong nghiên cứu cellulosome ở các loài khác. Enzym thủy giải cellulose
trong môi trường nuôi cấy C. thermocellum

được

phân bố trong cả dịch lỏng và
trên bề mặt tế bào [23].
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
11






C. thermocellum Anaerocellum thermophilum C. saccharolyticus

Hình 1.3. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình
C. thermocellum thủy phân cellulose tạo thành sản phẩm trung gian
cellobiose và cellodextrin, sau đó tiếp tục được biến dưỡng và tạo thành sản phẩm
cuối cùng là ethanol, acetic acid, lactic acid, hydrogen và carbon dioxide [23].
C. thermocellum được quan tâm nghiên cứu nhiều bởi vì: chúng có thể sử
dụng chất thải thực vật và tạo ra ethanol, gián tiếp thủy giải vật liệu chứa lignin
như các loại gỗ cứng thay thế cách tiền xử lý bởi acid, giảm chi phí cung cấp oxy,
giảm tạp nhiễm và chi phí làm mát trong quá trình lên men
,
dễ dàng hơn trong quá
trình thu nhận ethanol, vi sinh vật ưa nhiệt có sức sống mạnh và hệ enzym bền

vững, sinh khối tế bào thấp nên cơ chất chuyển thành ethanol sẽ nhiều hơn [11].
Anaerocellum thermophilum: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, phát triển tối
ưu tại 75°C, không tạo bào tử, Gram dương được phân lập ở suối nước nóng
Kamchatka, Russia. Chúng phát triển nhanh chóng tại 75°C.
Anaerocellum thermophilum dùng nhiều loại polysaccharide, bao gồm
cellulose tinh thể, hemicellulose, pectin, tinh bột và sinh khối thực vật chưa được
tiền xử lý.

Chúng tạo sản phẩm cuối cùng chủ yếu như lactate, acetate, CO
2
và H
2
.
Anaerocellum thermophilum có trình tự bộ gen dài 2.97 Mb, bao gồm một
chromosome và hai plasmid (8.3

và 3.6 Kb). Bộ gen mã hóa nhiều loại enzym thủy
giải cellulose, vận chuyển, biến dưỡng đường đơn và có cấu trúc giống như loài ưa
nhiệt kị khí khác Caldicellulosiruptor saccharolyticus

DSM 8903 [21].

Caldicellulosiruptor saccharolyticus: là vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, Gram
dương lên men sinh khối thực vật chứa cellulose, hemicellulose và pectin tạo thành
acetate, CO
2
và hydrogen. Chúng sử dụng nhiều loại cơ chất, khả năng tạo
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
12

hydrogen cao và xử dụng được cả đường glucose và xylose. Bộ gen của C.
saccharolyticus có kích thước 2,970,275 bp mã hóa cho khoảng 2,679 protein.
Phân tích trình tự gen của C. saccharolyticus cho thấy chúng có nhiều gen
mã hóa cho enzym thủy giải polysaccharide, cellulose, hemicellulose, pectin, và
tinh bột, nhiều protein vận chuyển ABC cho hấp thụ đường đơn, đôi và các
cellodextrin. Chúng có khả năng biến dưỡng nhiều loại đường rhamnose, fucose,
arabinose, glucuronate, fructose và galactose. Khả năng sử dụng nhiều loại sinh
khối thực vật lên men đồng thời nhiều loại carbohydrate là những đặc điểm tiềm
năng cho sử dụng sinh khối thực vật cho sản xuất nhiên liệu sinh học [41].

1.4. Hệ thống enzym cellulase
1.4.1. Thành phần của cellulase
Phân tích sinh hóa của hệ thống cellulase từ vi khuẩn kị khí, hiếu khí và từ
nấm đã cho những kiến thức tổng quan về hệ thống enzym này. Hệ thống cellulase
được phân loại dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc của chúng.
Ba loại hoạt tính enzym cellulase cơ bản [19], [23], [22]:
o Endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (EC
3.2.1.4), phân cắt tại vị trí vô định hình bên trong phân tử cellulose tạo ra
các chuỗi oligosaccharide.
o Exoglucanase, bao gồm 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase
(cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase
(cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91). Exoglucanase phân cắt từ đầu khử hoặc
không khử của chuỗi cellulose tạo ra sản phẩm chính glucose hay
cellobiose. Exoglucanase hoạt động chủ yếu trên vùng cellulose tinh thể.
o β-glucosidase hoặc β-glucoside glucohydrolase (EC3.2.1.21). Thủy
phân cellodextrin hòa tan và cellobiose thành glucose.
Cellulase là một cấu trúc nhiều đơn vị bao gồm vị trí liên kết và thủy phân
carbonhydrate (CBD). CBD là tiểu phần có trong cấu trúc của cellulases và được
phân chia thành 54 họ khác nhau. Chức năng chủ yếu của CBD gắn kết vùng xúc
tác vào cellulose tinh thể. Sự gắn kết đưa vùng xúc tác lại gần vùng cellulose tinh

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
13

thể cho sự thủy giải hiệu quả. Sự gắn kết cellulase thông qua CBD bền vững, cũng
cho thấy khả năng xúc tác cắt đứt các tương tác không cộng hóa trị giữa các chuỗi
cellulose của vùng cellulose tinh thể [23]. Một vài CBD khác ưu tiên gắn kết với
vùng cellulose vô định hình [19]. Mô hình thủy phân cellulose được đề nghị lần
đầu bởi Reese và các cộng sự, các CBD có vai trò làm “tróc” những đoạn cellulose
từ bề mặt, gia tăng sự thủy giải cellulose [23].
Hệ thống cellulase hoạt động phối hợp để nâng cao hiệu quả thủy phân
cellulose. Vi sinh vật đã thích ứng theo nhiều cách khác nhau để gia tăng hiệu quả
thủy phân cellulose cũng như hemicellulose và lignin trong tự nhiên [23].
Cellulase từ những nguồn khác nhau có những đặc điểm khác nhau về pH
tối ưu, độ hòa tan và thành phần amino acid. Khả năng chịu nhiệt cũng như cơ chất
tối ưu cũng thay đổi theo nguồn thu nhận. pH tối ưu thường khoảng 4 - 5 và nhiệt
độ là 40-50°C [30].

1.4.2. Cơ chế thủy giải cellulose
Cơ chế thủy giải cellulose được chấp nhận hiện nay do hoạt động phối hợp
của endoglucanase, exoglucanase (cellobiohydrolase) và β-glucosidase.
Endoglucanase thủy giải liên kết
β
-1,4
-
glucosidic bên trong phân tử,
exoglucanase tiếp tục phân cắt chuỗi cellulose tại hai đầu cuối tạo ra cellobiose
hoặc glucose và β-glucosidase thủy giải cellobiose thành glucose [43].

Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của hệ cellulase của Trichoderma reesei
[43]

Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
14

Trong quá trình thủy giải cellulose, cơ chất có sự thay đổi: sự thay đổi số
lượng đầu khử tạo ra bởi endoglucanase và các chuỗi này được exoglucanase sử
dụng, sự thay đổi trong khả năng xâm nhập vào phân tử cellulose của enzym từ
sự thủy phân cơ chất [43]. Hoạt động phối hợp của endoglucanase và
exoglucanase làm thay đổi bề mặt cellulose qua thời gian làm cho thay đổi tỷ lệ
thủy phân [23].
Endoglucanase hoạt động trên vùng cellulose vô định hình và hoạt tính của
chúng có thể được thử nghiệm bằng cơ chất cellulose hòa tan như
carboxymethylcellulose. Tuy nhiên, một vài cellulases cho thấy cả hai hoạt tính
endo- và exo Chúng có sự phối hợp rất cao giữa hai hoạt tính endo- và exo- cần
thiết cho sự thủy phân cellulose hiệu quả [23].

1.4.3. Ứng dụng enzyme cellulase
Công nghiệp dệt nhuộm: cellulase là một trong ba nhóm enzym được
ứng dụng nhiều nhất trong công nghiệp dệt. Chúng giúp cho vải bông mềm và
sáng màu hơn thay thế cho đá bột được dùng truyền thống, giúp vết cắt hoàn hảo
hơn, giúp điều chỉnh độ đậm nhạt cho vải sợi [3], [4].
Công nghiệp tẩy rửa: cellulase, đặc biệt là EGIII và CBHI, thông
thường được dùng làm sạch vải sợi. Những cellulase thu nhận từ những chủng nấm
mốc: T.reesei, T. viride, T.Harzianum, H.Insolens… hoạt động trong môi trường
kiềm nhẹ thường được ứng dụng trong công nghiệp tẩy rửa. Chúng thường được
dùng kết hợp với bột giặt và chất tẩy [3], [4].
Công nghiệp thực phẩm và thức ăn gia súc: trong công nghiệp thực
phẩm cellulase được dùng trong dịch chiết làm trong nước ép trái cây, dùng trong
dịch chiết dầu oliu. Glucanase được thêm vào để cải thiện dịch mạch nha trong sản
xuất bia rượu. Cellulase cũng được dùng trong dịch chiết carotenoid cho sản xuất
chất màu thực phẩm. Sự điều chế phối hợp hoạt động cellulase, hemicellulase và

pectinase cải thiện chất lượng dinh dưỡng thức ăn cỏ cho vật nuôi [3], [4].
Công nghiệp sản xuất giấy: cellulase và hemicellulase đã được sử dụng
chuyển đổi bột gỗ thô thành bột gỗ mịn, loại màu bột gỗ tái sử dụng và cải thiện hệ
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
15

thống thoát nước trong các nhà máy bột gỗ. Chúng cũng được dùng sản xuất bột
giấy mềm làm nguyên liệu cho sản xuất khăn giấy và giấy vệ sinh [3], [4].
Sản xuất nhiên liệu sinh học: có lẽ ứng dụng quan trọng nhất của
cellulase hiện nay được dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật.
Cellulase có thể chuyển đổi sinh khối thực vật thành đường glucose và các đường
khác mà chúng có khả năng được vi sinh vật sử dụng như là nguồn cơ chất sản
xuất ethanol và protein đơn bào. Hiện nay, sản xuất ethanol từ sinh khối thực vật
trải qua quá trính gồm nhiều bước: tiền xử lý loại bỏ lignin, thủy giải cellulose
thành các loại đường có khả năng lên men bằng cellulase ở nhiệt độ 50
0
C và cuối
cùng dùng vi sinh vật để sản xuất ethanol. Tuy nhiên, quá trình này lại chưa hiệu
quả về mặt kinh tế [3], [4], [37], [22].

1.4.4. Hệ thống cellulase không phức hợp
Nấm sợi sản xuất lượng lớn cellulase ngoại bào. Các loại enzym này không
hình thành phức hợp phân tử có trọng lượng lớn nên thường được gọi là “Hệ thống
cellulase không phức hợp”. Hệ thống cellulase của T. reesei được tập trung nghiên
cứu trong hơn 50 năm qua và có nhiều ứng dụng trong công nghiệp. T. reesei tạo
ra hai loại exoglucanase (CBHI

và CBHII), năm loại endoglucanase (EGI, EGII,
EGIII, EGIV, và

EGV) và hai loại ß-glucosidase (BGLI và BGLII) [23].
Hai loại exoglucanase chuyên biệt cho hoạt tính phân cắt từ đầu đường khử
CBHI và đầu không khử CBHII chiếm tương ứng 60

và 20% hệ thống cellulase T.
reesei. Mô hình tinh thể đã giải thích cấu trúc của hai loại exoglucanase này. CBHI
có bốn vòng trên bề mặt tạo ra một ống với chiều dài 50

Å, CBHII có hai vòng trên
bề mặt tạo ra một ống với chiều dài 20

Å. Cấu trúc ống cần thiết cho quá trình
phân cắt cellulose từ đầu khử và không khử. Tuy nhiên, hoạt tính cả hai loại
cellobiohydrolase giảm khi mức độ polymer hóa của cellulose giảm. Cellobiose,
sản phẩm chính của hoạt tính thủy giải CBHI và CHBII, sẽ kìm hãm hoạt tính
cellobiohydrolase và endoglucanase [23].
Cấu trúc EGI bao gồm nhiều vòng ngắn tạo ra một đường rãnh. Các rãnh
cho phép cellulose đi vào và thủy giải. EGIII có cấu trúc tương tự EGI, đây là
endoglucanase thiếu vùng

CBD [23]. Tuy nhiên, các endoglucanase của T. reesei
Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên
16

chiếm vai trò không lớn trong quá trình thủy giải cellulose, chúng chiếm không tới
20% tổng số cellulase [40].
T.

reesei tạo ra ít nhất hai loại ß-glucosidase tham gia thủy giải cellobiose
và các oligosaccharide

thành glucose. Cả hai loại BGLI và BGLII thu nhận được
trong dịch nuôi cấy và cũng được gắn lên vách tế bào. ß-glucosidase

trên vách tế
bào làm giảm khả năng mất glucose vào môi trường khi thủy phân cellobiose. T.

reesei sản xuất ß-glucosidase thấp hơn những loại nấm khác như Aspergillus Sp.
Hơn nữa, ß-glucosidase của T.

reesei bị kìm hãm mạnh bởi glucose so với
Aspergillus. Trong công nghiệp hiện nay, cellulase của T. reesei được bổ sung với
ß-glucosidase của Aspergillus làm tăng khả năng đường hóa của chúng [31].
Loài nấm trắng Phanerochaete chrysosporium được dùng cho nghiên cứu
phân hủy lignocellulose. Chúng tạo ra nhiều phức hợp enzym phân hủy cellulose,
hemicellulose,

và lignin là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật. Sự phân
hủy cellulose và hemicellulose

thường được xảy ra trước, trong khi sự biến dưỡng
lignin xảy ra sau khi có sự giới hạn nguồn carbon, nitrogen, hoặc sulfur [23].

1.4.5. Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp
1.4.5.1. Đặc điểm chung
Những vi khuẩn kị khí thiếu khả năng xâm nhập vào bên trong vật liệu
cellulose và do đó chúng phải tìm ra một cơ chế hữu hiệu cho sự phân hủy
cellulose khi có sự hiện diện cạnh tranh của nhiều vi sinh vật khác và bị giới hạn
bởi ATP cho sự tổng hợp cellulase. Điều này đã dẫn đến sự phát triển của “Hệ
thống cellulase phức hợp”, gọi là cellulosome, thường được tìm thấy ở các loài

Clostridia và Ruminococcus [23].
Các cellulosome kết hợp với nhau tạo thành các polycellulosome và được
gắn lên vách tế bào
có đường kính
60-200
nm
.
Mỗi
polycellulosome chứa đựng
vài trăm

cellulosome [7]. Cellulosome là phức hợp ngoại bào lớn và tương đối bền
vững, trọng lượng phân tử từ 2-16 MDa đối với cellulosome và có thể đạt đến trọng
lượng 100 MDa đối với polycellulosome [12], [33].
Cellulosome được phát hiện lần đầu bởi Bayer và Lamed
khi quan sát