NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus) GIAI ĐOẠN GIỐNG ppt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN










DƯƠNG HẢI TOÀN







NGHIÊN CỨU SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE
GREEN LÊN SỰ BIẾN ĐỔI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HOÁ
VÀ TỒN LƯU TRONG CÁ TRA (Pangasius hypophthalmus)
GIAI ĐOẠN GIỐNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THUỶ SẢN









2006
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
ii



TÓM TẮT

Đề tài ”Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số chỉ
tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn
giống” được thực hiện từ tháng 03/2006 đến 06/2006 nhằm mục đích xác định
thời gian tồn lưu của Malachite Green và một số biến đổi sinh hóa trên cá tra.
Thí nghiệm gồm hai nồng độ MG gây nhiễm: 0,1mg/l trong 12 giờ và 1mg/l
trong 60 phút. Kết quả cho thấy hoạt tính của các men trong não, gan của cá
Tra đều bị biến đổi và khả năng phục hồi lại trạng thái bình thường tuỳ thuộc

vào nồng độ và thời gian gây nhiễm MG. Sau 60 ngày thí nghiệm MG vẫn còn
tồn lưu trên cá tra (2,01±1,88ppb và 1,50±2,59ppb).
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
iii
ABSTRACT

“Studying the effect of Malachite Green on some biomarkers and residues in
the fingerling stages of catfish (Pangasius hypophthalmus) “ was implemented
from March to July 2006. The aim of the study was to determine the changes
of some biomarkers and the residues of MG on catfish. The experiment
included two treatments, 0.1 mg MG/l in 12 hours and 1 mg MG/l in 1 hours,
each applied in 3 replicates. The results showed that the biomarkers activity in
brain and liver tissues were changed and restored ability depending on the
treatment. After 60 days of decontamination, MG still contaminated on catfish
(2.01 ± 1.88 ppb and 1.50 ± 2.59 ppb).
Keywords: Malachite Green, biomarker, residue.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
iv

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM TẠ
TÓM TẮT
DANH SÁCH BẢNG
DANH SÁCH HÌNH
CÁC TỪ VIẾT TẮT
CHƯƠNG 1 1
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 2 3
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về Malachite Green 3
2.1.1 Sơ lược về Malachite Green 3
2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của
Malachite Green 3
2.1.3 Độc tính của Malachite Green 4
2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green 5
2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite Green trên thế giới 5
2.2.2 Tính hình sử dụng Malachite Green ở Việt Nam 6
2.3 Ảnh hưởng của Malachite Green 6
2.4 Một số nghiên cứu về chỉ tiêu sinh hóa
LPO, ACHE, GST, CAT,G6PD 7
CHƯƠNG 3: 9
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 9
3.1.1 Địa điểm 9
3.1.2 Thời gian thực hiện 9
3.2 Phương pháp nghiên cứu 9
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 9
3.2.2 Cá thí nghiệm 9
3.2.3 Bố trí thí nghiện 10
3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu 10
3.2.5 Chuẩn bị mẫu 11
3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu 11
3.3. Xử lí số liệu 16

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
v

CHƯƠNG 4 17
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
4.1 Biến động nhiệt độ, oxy hoà tan (DO) và pH trong thời gian gây nhiễm
Malachite Green 17
4.2 Sự tồn lưu MG và LMG trên cá Tra giống 19
4.2.1 Sự tồn lưu Malachite green + Leuco Malachite green 20
4.2.2 Sự tồn lưu Malachite green 21
4.2.3 Sự tồn lưu Leuco Malachite green 22
4.3 Sự biến đổi của các chỉ tiêu sinh hoá trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm 23
4.3.1 Hoạt tính của Acethylcholine (AchE) trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm 23
4.3.2 Hàm lượng của Lipid peroxidation (LPO) trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm 25
4.3.3 Hoạt tính của men Gutatehion-S-transferas (GST) trong não, gan cá tra
trong quá trình thí nghiệm 26
4.3.4 Hoạt tính của men Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)
trong não, gan cá tra trong quá trình thí nghiệm 27
4.3.5 Hoạt tính của men Catalase (CAT) trong não, gan cá tra trong
quá trình thí nghiệm 28
CHƯƠNG 5 30
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30
5.1 Kết luận 30
5.2 Đề xuất 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
PHỤ LỤC 34

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
vi




DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC
50
của Malachite Green
trên cá da trơn 4
Bảng 2: Quá trình phân tích AchE 12
Bảng 3: Cách pha đường chuẩn MDA 13
Bảng 4: Quá trình phân tích GST 14
Bảng 5: Quá trình phân tích G6PDH 14
Bảng 6: Quá trình phân tích CAT 15
Bảng 7: Quá trình phân tích Prôtêin 16
Bảng 8: Nhiệt độ trong quá trình gây nhiễm MG 17
Bảng 9: pH trong quá trình gây nhiễm MG 18
Bảng 10: Oxy hoà tan trong quá trình gây nhiễm MG 18
Bảng 11: Sự tồn lưu MG + LMG theo thời gian thí nghiệm 19
Bảng 12: Sự tồn lưu MG theo thời gian thí nghiệm 21
Bảng 13: Sự tồn lưu LMG theo thời gian thí nghiệm 22
Bảng 14: Biến đổi hoạt tính của AchE trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu 23
Bảng 15: Biến đổi hàm lượng của LPO trong não, gan theo thời gian

qua các đợt thu mẫu 25
Bảng 16: Biến đổi hoạt tính của GST trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu 26
Bảng 17: Biến đổi hoạt tính của G6PD trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu 27
Bảng 18: Biến đổi hoạt tính của CAT trong não, gan theo thời gian
qua các đợt thu mẫu 28


Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
vii





DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Sự tồn lưu MG và LMG theo thời gian thí nghiệm 20
Hình 2: Sự tồn lưu MG & LMG theo thời gian thí nghiệm 22
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
viii
CÁC TỪ VIẾT TẮT

ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long
LMG Leucomalachite green
MG Malachite Green
AchE Acethylcholine
LPO lipid peroxidase
GST Glutathione S-transferase

G6PD Glucose-6-phosphate dehydrogenase
CAT Catalase
UBND Ủy ban nhân dân
EU Thị trường chung Châu Âu
BTS Bộ Thủy Sản
HAE 4- hydroxyalkenals
MDA malondialdehyde
DCP 2,4-dichlorphenol
MC-RR micocystin-RR
TCA Trichloroacetic acid
DMSO Dimethyl sulfoxide
TBA Thiobarbituric acid minimum
DTNB 5,5 dithiobis 2nitrobenzoic acid
CDNB 50 mM 1-chloro 2,4-dinitro benzene
GSH Glutathione 50mM
G-6-P D-glucose 6 phosphat
NADP nicotin amiđe adenine đinucleotide phosphate
LOOP lipid hydrerxdes

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
1
CHƯƠNG 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 600.000 ha diện tích mặt nước
ngọt, là nơi có tiềm năng rất lớn cho việc nuôi các loài cá nước ngọt như: Cá tra,
basa, vồ đém, hú, tra bần…trong đó cá tra (Pangasius hypophthalmus) là đối tượng
được nuôi chính và truyền thống. Đối tượng này được người nuôi ưa chuộng vì có
những ưu điểm như: dễ nuôi, tăng trọng nhanh, kích cở lớn dễ thích nghi với môi

trường khắc nghiệt, dễ sử dụng thức ăn, có thể nuôi ở mức độ thâm canh cao.
Trong những năm gần đây, do việc quảng bá, thúc đẩy xuất khẩu mặt hàng cá tra
của ngành thuỷ sản nên uy tín, số lượng và thị trường của mặt hàng cá Tra Việt Nam
được nâng cao rất nhiều. Theo số liệu thống kê của 2 tỉnh An Giang, Cần Thơ năm
2005, tình hình nuôi cá tra ở khu vực đã có bước phát triển đáng kể, sản lượng loài
cá này trong khu vực An Giang và Cần Thơ năm 2004 là trên 160.000 tấn (Cục
thống kê An Giang và Cục thống kê Cần Thơ, 2005). Từ đó kỹ thuật nuôi phát triển
rất nhanh, năng suất sản lượng gia tăng đáng kể, tăng cường nuôi thâm canh, mật độ
thả nuôi tăng (120-130 con/m
3
trong nuôi bè và 25-35con /m
2
trong nuôi ao đất
(Nguyễn Chính, 2005).
Tuy nhiên vì muốn gia tăng năng suất, sản lượng mà người nuôi đã thả mật độ dày
đặc, cho thức ăn thừa dẫn đến môi trường bị ô nhiễm, dịch bệnh thường xảy ra dẫn
đến việc sử dụng các loại thuốc, hoá chất trong phòng trị bệnh cho thuỷ sản nuôi là
vấn đề cần thiết và hợp lý và được sử dụng nhiều dẫn đến lạm dụng (Nguyễn Thị
Phương Nga, 2004). Đặc biệt là thường xuyên sử dụng một số hóa chất cấm sử dụng
như là Malachite Green.
Chất Malachite Green được dùng rất phổ biến trên thế giới trị các bệnh nấm bên
ngoài và kí sinh trùng trong ương nuôi cá và các loài sò hến (nhuyễn thể). Đó là một
loại thuốc trị nấm rất công hiệu và thường xuyên dùng để tẩy trùng các bể ương cá
giống. Chất Leucomalachite green (LMG) là chất được tạo thành trong quá trình
chuyển hóa của Malachite Green và thường tồn dư trong cá một thời gian dài, ngay
Malachite Green không còn tồn lưu nữa (CFIA, 2005). Chính vì sự tồn lưu này ảnh
hưởng đáng kể đến ngành xuất khẩu thủy sản sang các nước Châu Âu, Mỹ, Canada,
Nhật,…Cụ thể là cuối năm 2004 hàng chục container cá da trơn, cá rô phi và cá trê
xuất khẩu của các doanh nghiệp An Giang, Đồng Tháp,…bị trả về do phát hiện
nhiễm chất Malachite Green (www.vietnam.net, 28/2/2005). Ngoài ra việc sử dụng

hoá chất còn ảnh hưởng đến một số biến đổi sinh hoá gây ức chế đến hoạt động sống
của cá.
Do đó đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng của Malachite Green lên sự biến đổi một số
chỉ tiêu sinh hóa và tồn lưu trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) giai đoạn
giống” được thực hiên là rất cần thiết, nhằm mục đích xác định thời gian tồn lưu và
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2
đào thải của Malachite Green trên cá tra và một số biến đổi sinh hóa. Từ đó đề xuất
giải pháp hợp lý để sản xuất sản phẩm có chất lượng và an toàn.
Nội dung nghiên cứu:
• Ảnh hưởng của sử dụng Malachite Green lên sự biến đổi Acetylcholine,
lipid peroxidation, Glutathione S-transferase, Glucose-6-phosphate
dehydrogenase, Catalase trong cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở giai đoạn
giống.
• Phân tích sự tồn lưu Malachite Green trong cá tra (Pangasius
hypophthalmus) ở giai đoạn giống.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3
CHƯƠNG 2

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 SƠ LƯỢC VỀ MALACHITE GREEN

2.1.1 Sơ lược về Malachite green
Malachite Green ( MG) có tên hóa học là Triphenylmethane. MG là một loại bột
rất mịn có màu xanh được dùng để nhuộm tơ, vải, giấy, da. MG cũng được dùng
trong phòng thí nghiệm để nhuộm vi khuẩn và bào tử của nó. Từ lâu MG được
xem là chất diệt nấm ( loại saprolegnia ssp ) và diệt ký sinh trùng nhóm nguyên
sinh vật (protozoa). MG khác với sulfate đồng copper sulfate (CuS0
4
) mà còn gọi

là phèn xanh dùng để diệt ốc, diệt nấm và rong rêu trong nông nghiệp. MG đã
được giới nuôi trồng thủy sản trên thế giới sử dụng một cách rộng rãi từ lâu để
phòng và trị bệnh cho cá tôm và hến. Tại Canada trước 1992 các trại sản xuất cá
giống cũng thường sử dụng MG để ngăn ngừa trứng cá bị nhiễm nấm. Ngày nay
Canada cũng như hầu hết các quốc gia khác trên thế giới trong đó có Trung Quốc
và Việt Nam đều nghiêm cấm việc sử dụng chất MG trong việc nuôi trồng thủy
sản. Chloramphenicol, Nitrofurans , xanh Malachite được liệt kê trong danh mục
các chất cấm sử dụng của Bộ Thủy Sản Việt Nam. Tại VN, MG vẫn còn được các
hộ nuôi trồng thủy sản sử dụng để vệ sinh ao hồ, tắm cá trước khi thả chúng vào
lồng nhằm mục đích ngừa cá bị nhiễm nấm hoặc nhiễm ký sinh trùng. Khi vào cơ
thể cá, MG sẽ bị phân hủy ra thành chất chuyển hóa (metabolite) là Leucomalachite
Green (LMG). Thời gian đào thải của MG nhanh, ngược lại chất LMG có thể tồn
tại trong 1 thời gian rất lâu dài trong thịt và nhất là trong mỡ của cá đã bị nhiễm
MG.( www.khoahoc.net,22/12/2005)
2.1.2 Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hóa của Malachite green.






Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
4
Công thức cấu tạo
[ __ ]
[ / \__N(CH2)2 ]
[ __ / \__/ ] _
[ / \__C __ + ] Cl
[ \__/ \ / \__N (CH2)2 ]
[ \__/ ]

[ ]
Công thức phân tử : C
23
H
25
N
2
.CL
Một số tên thường gọi:
• Malachite green chloride
• C.i. Basic green 4
• Benzaldehyde green
• n-(4-((4-(dimethylamino)phenyl) phenylmethylene)-2,5-cyclohexadiene-
1- ylidene) -n-methyl-chloride
• Acryl brilliant green
• Aniline green
• Aizen malachite green
2.1.3 Độc tính Malachite green.
Độc tính của MG có liên hệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá tôm có thể chịu
đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng sẽ dẫn
đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng MG vào
lúc sáng sớm khi nhiệt độ nước chưa tăng cao là tốt nhất. Đặc biệt trong các tháng
mùa hè nóng bức, thời gian tiếp xúc khi xử lý MG nên giảm xuống. (Lê Thị Kim
Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004).
Kết quả thí nghiệm xác định LC
50
của Malachite Green trên cá da trơn (Ictarulus
punctatus) của Bills và ctv (1997) được trình bày ở bảng sau:
Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định LC
50

của Malachite Green trên cá da trơn
LC
50
(mg/l) pH Nhiệt độ (
o
C) Thời gian (giờ)
0,4 7,5 22 6
1,72 8 12 6
1,3 8 12 6
0,286 8 12 24
0,238 7,5 22 6
0,519 9,5 12 6
Kết qủa này cho thấy nhiệt độ càng tăng thì độc tính của MG càng tăng. pH càng
cao thì độc tính của MG càng cao.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
5
Một nghiên cứu về độc tính của MG và LMG được tiến hành trong thời gian 2 năm
của Trung tâm Nghiên cứu Độc tố Quốc gia Hoa kỳ cho thấy MG và LMG làm hại
gan, làm biến đổi tuyến giáp trạng, gây ra tình trạng mất máu, làm đột biến thay đổi
gene (mutagenic) và gây ung thư (carcinogenic) trên loài chuột thí nghiệm. Qua
việc thẩm định các kết quả trên, giới khoa học đưa ra kết luận rằng MG và LMG là
2 chất nguy hại có tiềm năng gây ung thư cho người. (Sở Nông Nghiệp An Giang,
2/2/2005).
Năm 2002 Canada cũng như nhiều quốc gia khác đã nhận thấy chất Malachite
Green có thể là một mối đe dọa cho sức khỏe nên bắt đầu đề ra những chương
trình kiểm nghiệm MG ở một số loại cá tôm bán ở thị trường. Các quốc gia trong
khối Liên minh Châu Âu và Châu Úc ấn định giới hạn tồn lưu tối đa của MG và
LMG trong sản phẩm thủy sản là 2 ng/g (ppb). Hoa kỳ và Canada thì cho áp dụng
nguyên tắc zero tolerance, nghĩa là không chấp nhận sự hiện diện của bất kỳ 1 dư
lượng nào dù là thật thấp của MG và LMG. (www.khoahoc.net,22/12/2005).

Trước những tác hại có thể gây ra đối với sức khỏe con người và nhằm đảm bảo an
toàn thực phẩm, đáp ứng yêu cầu khắt khe của thị trường xuất khẩu thủy sản, theo
chỉ thị của Bộ Thủy Sản 7/3/2005 về việc ngừng sản xuất, tiêu thụ và sử dụng MG
trong nuôi trồng thủy sản và đề nghị tất cả các hộ nuôi thủy sản không được sử
dụng MG để phòng và trị bệnh cho thủy sản.
2.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG MALACHITE GREEN
2.2.1 Tình hình sử dụng Malachite green trên thế giới
Trong các thập niên vừa qua ngành nuôi trồng thủy sản thế giới đã có những bước
tiến bộ vượt bậc. Do việc áp dụng kỹ thuật nuôi mới, nuôi thâm canh mật độ cao để
gia tăng năng suất, sản lượng, nạn dịch bùng phát, ô nhiễm môi trường làm cho
thủy sản nuôi chết hàng loạt, đòi hỏi người nuôi phải tìm biện pháp khắc phục,
trong đó việc sử dụng thuốc, hóa chất trong việc phòng và trị bệnh là biện pháp hữu
hiệu.
Tháng 6/2005, các cơ quan chức năng Trung Quốc đã phát hiện thấy một vài tỉnh
vẫn còn sử dụng và chính các chuyên gia nước này thừa nhận, lâu nay MG vẫn được
sử dụng rộng rãi tại các cơ sở nuôi như một chất diệt nấm. Nguyên nhân là do loại
chất này có giá rẻ, khoảng 30 NDT/kg và rất dễ mua. ( www.vietnam.net).
Theo Bộ Nghề Cá và hàng hải Hàn Quốc (MMAF), MG đã được tìm thấy trong các
trại nuôi cá hồi và cá chép ở tám vùng của Hàn Quốc. Trong các ngày từ 15/9/2005
đến 3/10/2005, Cục thanh tra chất lượng thủy sản quốc gia Hàn Quốc (NEPQIS) đã
tiến hành kiểm tra khắp các trại nuôi cá nước ngọt và nước lợ trên cả nước và đây là
lần đầu tiên Hàn Quốc phát hiện thấy MG trong các trại nuôi cá ở nước này. Lượng
hóa chất tìm thấy dao động từ 0,1-3 ppm (www.Intrafish.com, 6/10/2005).

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
6
2.2.2 Tình hình sử dụng Malachite Green ở Việt Nam.
Sau khi hàng loạt lô hàng thủy sản của Việt Nam bị các nước nhập khẩu phát hiện
nhiễm kháng sinh cấm đã gây thiệt hại lớn về tài chính cũng như uy tín hàng thủy
sản Việt Nam. Nhà nước và các cơ quan chức năng ngành thủy sản Việt Nam đã đưa

ra và thường xuyên có rà soát, bổ sung các quy định tương đối chặt chẽ về việc sử
dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm
cho người tiêu dùng, ổn định và phát triển xuất khẩu, đảm bảo nuôi trồng thủy sản
phát triển bền vững. Tuy nhiên việc chấp hành các quy định của nhà nước là chưa
triệt để vì thỉnh thoảng vẫn còn một số lô hàng thủy sản Việt Nam nhập khẩu phát
hiện nhiễm kháng sinh cấm hoặc hoặc vượt quá giới hạn đối với những kháng sinh
cho phép sử dụng có giới hạn, trong chương trình kiểm soát dư lượng các chất độc
hại trong thủy sản nuôi do Nafiqaved thực hiện năm 2003 và 2004 thỉnh thoảng vẫn
phát hiện mẫu thủy sản, mẫu nước môi trường nuôi nhiễm thuốc, hóa chất bị cấm sử
dụng như Choramphenicol, các dẫn xuất Nitrofuran, gần đây và theo diện rộng là
tồn lưu Green Malachite (NAFIQAVED, 2004).
Về tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra công nghiệp ở Đồng Tháp
(Phạm Thanh Tuấn, 2004) ghi nhận được có 90 loại thuốc, hóa chất được sử dụng
trong nuôi trồng thủy sản với các mục đích: diệt tạp, xử lý nước, trộn vào thức ăn để
phòng và trị bệnh. Riêng kháng sinh trị bệnh cho cá có 58 loại thì hầu hết nằm trong
danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại ở dạng nguyên liệu và nguồn gốc không rõ
ràng, riêng chất MG là chất nằm trong danh mục cấm nhưng vẫn được người nuôi
sử dụng ở đây.
Theo một số hộ nuôi cá tra ở khu vực Thốt Nốt, Cần Thơ, An Giang thì cho biết
không sử dụng MG trong quá trình nuôi nhưng qua phân tích thì hiện hiện đến 10/64
mẫu trong cá thương phẩm, và nồng độ tồn lưu là 2 - 4,9 ppb. Đối với cá đang nuôi
thì hiện diện 9/30 mẫu được kiểm tra, nồng độ tồn lưu là 2,4 - 4,18 ppb. (Nguyễn
Chính, 2005).
2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA MALACHITE GREEN
Theo quy định của Bộ Thủy Sản (2001) thì thời gian ngưng sử dụng kháng sinh
trước khi thu hoạch 28 ngày trở lên. Viện nghiên cứu và phát triển thủy sản Hàn
Quốc –NFRDI (2002) thử nghiệm tồn lưu của 2 chất Oxytetracyline HCl và
Sulfadimethoxine trên đối tượng cá catfish cho kết quả thời gian đào thải là sau 30
ngày, đối với lươn sự đào thải của Ciprofloxacin và Ofloxacin là sau 35 ngày. Nhiều
tài liệu cho thấy chất MG tồn lưu trong cá chình nuôi sau khi trị bệnh không dưới

100 ngày, với cá hồi chấm là không dưới 10 tháng (Raoul và ctv, 2002).
Theo quá trình theo dõi và phân tích sự tồn lưu MG trên cá tra để trị bệnh kí sinh
trùng cho thấy (vietlinh.com.vn):
Sau 1 tháng sử dụng MG : tồn lưu 35ppb
Sau 2 tháng : mức phát hiện còn 10ppb
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
7
Sau 3 tháng : MG = 0. Nhưng dẫn xuất của MG là LMG thì vẫn
còn.
Vậy thời gian có thể làm MG không tồn lưu trong thịt cá là rõ ràng. Việc tích lủy
MG mang tính cộng dồn. Sau khi cá nhiễm MG sẽ tích lủy dần trong thịt và tế bào
mỡ, đặc biệt trong mỡ luôn tích lủy hàm lượng MG cao gấp nhiều lần so với trong
thịt. Như vậy nếu tích lủy ở mức độ cao có thể ảnh hưởng xấu đến người tiêu dùng
sau khi ăn cá bị nhiễm.
2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ CHỈ TIÊU SINH HÓA Lipid peroxidase
(LPO), Acetylcholinestrease (AChE), Catalase (CAT), Glutathione S-
transferease (GST), Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD).
Acelthylcholine là một chất hoá học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân dẫn
truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman và ctv, 1961)
Lipid peroxidation chất có liên quan đến các tác nhân oxy hóa trong cơ thể thường
góp phân vào các tiến trình phát sinh bệnh. Khi oxy hóa lipid nó liên quan đến sự
hấp thụ allylic hydrogen bằng việc tạo ra gốc hydroperoxyl để hình thành nên lipid
hydroperoxides (LOOPs). LOOPs tạo ra malondialdehyde (MDA) và 4-
hydroxyalkenals (HAE) khi phân hủy (Amad và ctv, 2000)
Từ nghiên cứu của Bhavan và Geraldine (2000) ở nồng độ thấp 10.6 - 32.0 ng/l
Endosulfan có thể làm thay đổi về sinh hoá và sinh lý bên trong cơ thể của
Macrochrachium malcolmsonii giai đoạn giống, làm sụt giảm hoạt tính của enzyme
Acetylcholinesterase (AChE), hàm lượng protein trong máu.
Theo Pandey và ctv (2000) nghiên cứu về cơ chế gây độc của endosulfan làm gia
tăng LPO. Tác giả tiến hành thí nghiệm trên cá Channa punctatus (23 – 50g/con),

khi cho tiếp xúc với endosulfan nồng độ thấp 5ug/l, kết quả LPO gia tăng có ý nghĩa
so với đối chứng ở các cơ quan gan, thận, mang. Sự gia tăng của LPO kéo theo các
nhân tố chống oxy hoá cũng tăng theo. Theo tác giả, sự thay đổi hoạt tính của các
nhân tố chống oxy hóa và chỉ số của LPO có thể là chỉ thị sinh học. Như vậy, có thể
dựa và sự thay đổi của LPO để đánh giá sự tác động của endosulfan lên các đối
tượng khác.
Elif Ozan Oruc (2000) tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng của 2,4D và azinphosmethyl
lên các men chống oxy hoá và lipid peroxidase ở gan cá rô phi (Oreochromis
niloticus). Khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp 2,4-D ở nồng độ 27ppm và 0,03ppm
azinphosmethyl trong các khoảng thời gian 24, 48, 72 và 96 giờ. Kết quả cho thấy
cá rô phi có khả năng chống lại stress oxy hoá bằng các cơ chế kháng oxy hoá và
chống lại sự gia tăng của hàm lượng lipid peroxydase. Hoạt tính G6PD tăng so với
đối chứng khi sử dụng riêng lẻ 2,4-D sau 24 giờ, ở 96 giờ không ảnh hưởng đến
hoạt tính G6PD, trong khi đó khi sử dụng kết hợp làm tăng G6PD đáng kể.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
8
Theo Horsberg và ctv.(1989) thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ (Dichlorvos) gây ức
chế men AchE trong não cá hồi (Salmon) mạnh nhất ở nồng độ tồn lưu trong cơ thể
cao nhất. Ông cũng cho biết việc xác định hoạt tính của men AchE có thể tin cậy
hơn việc phân tích lượng thuốc tồn lưu khi chẩn đoán việc cá hồi có bị nhiễm độc
thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ hay không.
Theo Zinkl và ctv. (1980) và Fleing à Grue (1981) thì nếu như hoạt tính của men
AchE trong não giảm 20% so với đối chứng thì cơ thể xem như là cá có tiếp xúc với
thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ. Chính do sự rất nhạy cảm về hoạt tính của men AchE
đối với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ mà có thể dùng đo hoạt tính của men như là
một công cụ trong việc đánh giá môi trường có bị nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu
cơ (FanCey và ctv. 1987, Morgan và ctv. 1990) Alexander và ctv. 19 ) dã nghiên
cứu và đề nghị một phương phát đơn giản và cho kết quả nhanh qua việc do tỉ lệ
hoạt tính của men AchE để biết cá nhiễm độc thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ như
parathion, malathin,

Weiss ( 1958) nghiên cứu sự ảnh hưởng của thuốc trừ sâu lên cá và thấy rằng mức
độ hoạt hóa của AchE trong não bị ức chế tùy thuộc vào nồng độ thuốc. Ở nồng độ
500mg/kg của Folidol 600 (Methyl parathino làm AchE trong huyết tương của cá bị
ức chế 90% sau 4h thí nghiệm duy trì mức ức chế này trong 4 ngày vài hồi phục 80-
90% múc bình thường sau 8-10 ngày và đạt được mức bình thường sau 35 ngày
(Silva và ctv 1993).
Hiran M. Dutta và Dane. A. Arends (2003). Thí nghiệm ảnh hưởng của endosufan
lên hoạt động AchE trên não của cá bluegill sunfish (Lepomis macrochius). Thí
nghiệm được tiến hành gây nhiễm trong các khoảng thời gian là 0, 24, 48, 72, 96
giờ và 1 tuần ở nồng độ 1.0 µg/l (dựa vào LC
50
của endosulfan đối với cá bluegill
sunfish là 1,2 µg/l ). Kết quả cho thấy hoạt động của AchE trong não giảm tương
ứng là 0%, 3,57%, 12,65%, 14,23%, 16,31% và 23,11%.
J. Zhang và ctv (2004) nghiên cứu sự ảnh hưởng của độc tính 2,4-dichlorphenol
(DCP) trên gan của cá Carassius auratus ở nồng độ 0,005mg/l 2,4-DCP sau 40
ngày hoạt động của CAT không có sự biến đổi, nhưng ở nồng độ 0,01- 1,0mg/l hoạt
dộng của CTA tăng cao hơn so với đối chứng.
Jimena Cazenave và ctv (2005) thí nghiệm sự ảnh hưởng của micocystin-RR (MC-
RR) đến hoạt động của các men trên gan, mang, não của cá Corydoras paleatus.
Tiến hành gây nhiễm MC-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5; và 10µgL
-1
sau 24 giờ. Kết
quả cho thấy ở nồng độ MC-RR (lớn hơn hoặc bằng 2µgL
-1
thì LPO trong não có sự
thay đổi trong khi đó ở gan, mang vẫn bình thường. Đối với hoạt tính GST ở gan,
não giảm ở nồng độ 0,5µgL
-1
và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm.

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
9

CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu :
3.1.1 Địa điểm:
Khoa Thủy Sản -Trường Đại Học Cần Thơ
3.1.2 Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2006 đến 06/2006
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm
Bể thí nghiệm có thể tích 0,5 m
3

Xô nhựa, cân tiểu ly
Bộ đồ giải phẩu (kéo, nhíp, dao)
Pipet, ống đong
Máy ly tâm, máy so màu quang phổ (Thermo, Anh sản xuất)
Dụng cụ, thiết bị, phương tiện dùng trong thí nghiệm được sử dụng từ phòng thí
nghiệm Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ.
Hóa chất thí nghiệm:
Malachite Green 80% hoạt chất (Merck)
Từ kết quả khảo sát thực tế tại Thốt Nốt, Cần thơ, người nuôi cá thường sử dụng
MG nồng độ 0,05-0,1ppm tắm cá trong thời gian 12 giờ hoặc tắm ở nồng độ cao 1-
2ppm trong thời gian 30-60 phút mục đích trị bệnh nấm thủy mi cho cá Tra. Ngoài
ra, một số hộ dân tắm cá bằng MG nồng độ 0,1-0,2ppm trong thời gian 30-60 phút
hoặc kết hợp với CuSO
4

0,5ppm và MG 0,01-0,02ppm trong thời gian 15-30 phút.
Căn cứ vào thực tế trên, sử dụng nồng độ 1ppm tắm cá trong 60 phút và nồng độ 0,1
ppm tắm cá trong 12 giờ được chọn thí nghiệm.
Phương pháp pha Malachite Green thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 1g MG cho vào 1lít nước cất, khuấy đều bằng
khuấy từ. Sau đó định lượng lượng nước trong mỗi bể. Mỗi bể chứa 410 lít nước.
- Nồng độ 0,1 mg/l (0,1 ppm): lấy 41 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít
nước
- Nồng độ 1,0 mg/l (1,0 ppm): lấy 410 ml dung dịch chuẩn cho vào bể chứa 410 lít
nước.
3.2.2 Cá thí nghiệm
Cá được mua tại trại cá giống tại Cần Thơ kích cỡ từ 20 - 30g. Cá có màu sắc sáng,
khỏe mạnh, không bị dị tật, không có dấu hiệu bệnh tật .
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
10
3.2.3 Bố trí thí nghiện
Nguồn nước ngọt sử dụng cho thí nghiệm cấp từ nước máy và nước giếng đã được
lọc tại Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức. Hai nghiệm thức
có nồng độ gây nhiễm MG là 0,1ppm và 1 ppm và 1 nghiệm thức đối chứng. Mỗi
nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thí nghiệm gồm 9 bể (thể tích 500 lít) chứa 410 lít
nước, mỗi bể bố trí 50 con.
Nghiệm thức 1: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 0,1ppm trong thời gian
12 giờ.
Nghiệm thức 2: Cá được gây nhiễm MG trên bể với nồng độ 1ppm trong thời gian 1
giờ.
Nghiệm thức 3: (đối chứng): không gây nhiễm Malachite green.
3.2.4 Theo dõi, chăm sóc cá và thu mẫu
Hệ thống thí nghiệm được sục khí liên tục.
Thức ăn: Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là thức ăn viên có hàm lượng đạm là

28%, mỗi ngày cá được cho ăn 2 lần (8h, 16h) .
Các yếu tố nhiệt độ, oxy hòa tan, pH được theo dõi 2 giờ 1 lần trong 2 ngày đầu
thí nghiệm để xem ảnh hưởng của các yếu tố này đến độc tính của MG.
ü Thu mẫu phân tích sự tồn lưu của MG trong cá tra theo thời gian


Ngày 0 Ngày7 Ngày 30 Ngày 60
Tiến trình thí nghiệm và thu mẫu
Ngày 0: mẫu cá thu ngay sau khi kết thúc gây nghiễm
Ngày 7: mẫu cá thu 7 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước
Ngày 30: mẫu cá thu 30 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước
Ngày 60: mẫu cá thu 60 ngày sau khi kết thúc gây nghiễm và mẫu nước
ü Thu mẫu phân tích sự biến đổi thành phần sinh hoá trên não, gan cá tra dưới
tác động của MG theo thời gian.


Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4

Lần 1: mẫu cá trước khi gây nhiễm MG
Lần 2: mẫu cá sau khi kết thúc gây nhiễm MG
Nhiễm

Không nhiễm
Nhiễm
Không nhiễm
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
11
Lần 3: mẫu cá 12 giờ sau khi kết thúc gây nhiễm MG
Lần 4: mẫu cá 4 ngày sau khi kết thúc gây nhiễm MG
Mẫu nước sau khi thu được trữ đông -20 độ cho đến khi phân tích. Mẫu cá được

giải phẩu lấy gan và não sử dụng cho phân tích sinh hóa, giữ nhiệt độ -80 độ đến khi
phân tích, phần còn lại được xây nhuyễn và giữa nhiệt độ -20 độ đến khi phân tích
Mẫu phân tích Malachite green được phân tích tại Trung Tâm Quản Lý Chất Lượng
và Thú Y Thuỷ Sản – Vùng 6. Phương pháp phân tích MG (Tav.Chim.aliment.hyg.
88,293-304, 1997 AOAC Vol 78, No.6, 1997) dựa trên hệ thống sắc kí HPLC với
đầu dò huỳnh quang với giới hạn phát hiện (LOD) là 1ppb.
3.2.5 Chuẩn bị mẫu
Mẫu não, gan giải đông và trử lạnh trong nước đá

Cân trọng lượng mẫu (A)

Nghiền mẫu trong dung dịch phosphate 50mM KH
2
PO
4
/K
2
HPO
4
50mM (pH=7.5)
(1:5 w/v)

Cân mẫu (bao gồm mẫu và dung dịch đệm) (B)

Mẫu phân tích (AchE, CAT, GST, G6PD ) (D) Mẫu phân tích LPO(C)

Ly tâm 10.000 g (10 phút, 4
o
C) Trữ -80
o

C đến khi phân tích

Lấy phần nổi (trữ -80
o
C đến khi phân tích )
3.2.6 Phương pháp phân tích mẫu:
Phân tích Acetylcholinestrease (AchE)
Nguyên tắc:
Hoạt tính của AchE được xác định theo phương pháp của Ellman và ctv (1961).
Phương pháp này sử dụng acetylthiocholine iodide (ATChI) như là cơ chất của
AchE. ATChI bị phân hủy tạo thành thiocholine và acetate bởi AchE và thiocholine
phản ứng với dithiobisnitrobenzoate (DTNB) tạo ra sản phẩm có màu vàng. Cường
độ màu dần đậm theo thời gian và hoạt tính của AchE được đo bằng máy so màu
quang phổ.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
12
Phương trình phản ứng minh họa
Acetylthiocholine iodide
AchE


thiocholine + acetae
Thiocholine + dithiobisnitrobenzoate sản phẩm có màu vàng
Quá trình phân tích:
Chuẩn bị hóa chất:
- DTNB 167µM: 66.1mg/ml sodium phosphate 50mM, pH = 7.5
- Acetylthiocholine iodine (cơ chất) 30mM: 8,67mg Acetylthiocholine
iodine/1ml sodium phosphate, pH = 7.5
Bảng 2: Quá trình phân tích AchE
Hóa chất Mẫu trắng (µl) Mẫu (µl)

DTNB ( 150 µM nồng độ cuối) 800 800
Sodium phosphate 150 100
Mẫu / 50
Cơ chất (1.5mM nồng độ cuối) 50 50
Hoạt tính AchE được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 412 nm trong 5
phút
Công thức tính
Abs * pha loãng
R =
(thể tích mẫu (ml) * 0.0136)/protein (mg/ml)
R = số mole cơ chất thủy phân/phút/mg protein
0.0136 là hệ số Acetylthiocholine iodide chuyển thành thiocholine và acetate.
Lipid peroxidation
Nguyên tắc
LPO được xác định thông qua lượng thiobarbituric acid reactive substance
(TBARS) trong mẫu nghiền theo phương pháp của Fatima và ctv (2000), có bổ
sung. Sử dụng, 500 µl mẫu nghiền với 500µl trichloroacetic acid (TCA, Sigma) 5%
và 500µl 0.67% thiobarbituric acid (TBA, Sigma). Sau khi ủ hỗn hợp trong 15
phút, đem ly tâm ở 3000 rpm trong 10 phút ở 4°C, lấy phần nổi. Sau đó cho phần
nổi vào ống thuỷ tinh đun trong nước sôi 10 phút. Tiếp đến lấy ống thuỷ tinh ra, làm
mát ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thụ được xác định ở 535nm bằng máy so màu quang
phổ.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
13
Chuẩn bị đường chuẩn: sử dụng malondialdehyde (MDA) làm đường chuẩn và
chuẩn bị như sau:
Bảng 3: Cách chuẩn bị đường chuẩn MDA
Nồng độ MDA Thể tích pha loãng
Dung dịch chuẩn 500µM
1 100µM 1ml dung dịch chuẩn + 4ml nước

2 50µM 2ml dung dịch 1 + 2ml nước
3 10µM 1ml dung dịch 2 + 4ml nước
4 5µM 2ml dung dịch 3 + 2ml nước
5 2.5µM 2ml dung dịch 4 + 2ml nước
6 1.25µM 2ml dung dịch 5 + 2ml nước
7 0.625µM 2ml dung dịch 6 + 2ml nước
8 0µM nước

Sau đó lấy 1ml thể tích pha loãng ở các nồng độ của MDA làm đường chuẩn. Sử
dụng đường chuẩn với malondialdehyde (MDA) cho phép xác định được LPO thể
hiện qua nmole MDA tương đương/g mẫu.
Glutathione S-transferase
Nguyên tắc
GST được phân tích theo phương pháp của (Habig và ctv, 1974). Để đo hoạt tính
của GST cơ chất được sử dụng là 1-chloro-2,4-, dinitrobenzen (CDNB), một hợp
chất có tính kỵ nước. Nhìn chung CDNB có ái lực với enzyme phân tích hơn các cơ
chất khác và nó cũng là đồng cơ chất trong quá trình chuyển hóa của nhiều enzyme
đồng đẳng với GTS. Ngoài ra glutathion (GSH) cũng là đồng cơ chất trong phản
ứng.
CDNB + GSH CDNB – GS + HCl
Hoạt tính của đựoc đo bằng máy so màu quang phổ thông qua độ hấp phụ của cơ
chất (CDNB-GSH) ở bước sóng 340nm trong 3 phút
Quá trình phân tích:
Chuẩn bị hóa chất:
- HEPES: cách pha HEPES
- 50mM CDNB : 50.5mg CDNB/5ml ethanol).
- 50mM GSH: 76,83mg/5ml dung dịch HEPES, pH = 7.5

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
14
Bảng 4: Quá trình phân tích GST
Hóa chất (µl) Mẫu trắng (µl) Mẫu (µl)
HEPES 700 700
CDNB ( nồng độ cuối 1.5mM ) 30 30
H
2
O 240 220
GSH 30 30
Mẫu / 20
Công thức tính:
Hoạt tính của GST = (A
340/min
– A
blank
) x độ pha loãng x coff.ExMol
CDNBcoeff = 9.6mM
-1
cm
-1

9.6mM
-1
cm
-1
hệ số CDNB chuyển thành CDNB – GS + HCl dưới tác dụng của
GST
Đơn vị tính của GST là nmol/mg protein/phút

Glucose-6-phosphate dehydrogenase ( G6DPH)
Nguyên tắc:
D- glucose-6-phosphat + NAD(P) ó D-gluconod-lactone-6-phosphat + NAD(P)H
2
Quá trình phân tích
Chuẩn bị hóa chất:
- Tris- HCl buffer 1M, pH = 7.8: 121g Tris- HCl /1000ml H
2
O
- MgCl
2
0.2M : 10,15g/250ml H
2
O
- Nicotin amiđe adenine đinucleotide phosphate (NADP) 50mM: 76,5mg
NADP/2ml H
2
O
- Hỗn hợp G6PDH bao gồm: 2,36 ml Tris- HCl 1M, pH = 7.8 + 1,2ml MgCl
2
0.2M + 0,48ml NADP 50mM + 15,96ml H
2
O.
- 17,89mM G6P (D-glucose 6 phosphate) : 12,16mg G6P/2ml H
2
O
Bảng 5: Quá trình phân tích G6PDH
Hóa chất Mẫu trắng hiệu
chỉnh máy
Mẫu trắng hiệu

chỉnh mẫu
Mẫu
G6PDH mix (µl) 600 600 600
H
2
O (µl) 400 390 360
Mẫu (µl) / 10 10
G6P (µl) / 30
Hoạt tính G6PDH được đo bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 340 nm trong
3 phút.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
15
Cách tính:
A
OD
( A
OD Test
-A
OD blank
) x tổng thể tích(ml)x hệ số pha loãng
6.22 x 1.0 x thể tích mẫu (ml)
Đơn vị tính của G6PD là nmol NADPH/phút/mg protein
Chú ý: mẫu não pha loãng 2 lần, mẫu gan pha loãng 2 lần, pha loãng mẫu bằng
dung dịch đệm potasium phosphate 50mM
Catalase (CAT)
Nguyên tắc :
Catalse là enzyme hiện diện trong peroxisom của hầu hết các tế bào hiếu khí và có
chức năng bảo vệ tế bào chống lại độc chất hydrogen peroxide bằng việc phân huỷ
H
2

O
2
:
2H
2
O
2
2H
2
O + O
2

CAT được xác định theo phương pháp của Baudhuin và ctv, 1964 có bổ sung.
Trước tiên, dung dịch đầu BC được chuẩn bị gồm 1 g (BSA); 100 ml Imidazol
buffer 0.2M, pH 7.0 . Sau đó, một lượng H
2
O
2
30% thích hợp được sử dụng là 40
µl H
2
O
2
30% cho vào 250 ml of BC tạo thành dung dịch SC. Chuẩn bị 0.75 ml
TiOSO
4
vào 1.25 ml SC và đọc ở bước sóng 420 nm. Độ hấp thụ phải nằm trong
khoảng 0.75 và 0.95. Hỗn hợp phản ứng gồm 1250µl SC, 25µl Triton X-100 0.02%,
12.5µl mẫu, được ủ khoảng 6 phút ở 0
o

C. Sau đó, 750µl of TiOSO
4
được thêm vào
để dừng phản ứng. Độ hấp thụ được đo ở 420 nm bằng máy so màu quang phổ. Một
đơn vị hoạt tính được định nghĩa là lượng enzyme tạo ra sự phân huỷ 90% cơ chất
trong một phút.
Quá trình phân tích:
Bảng 6: Quá trình phân tích CAT
Hoá chất
Mẫu (µl) Mẫu trắng 1 (µl) Mẫu trắng 2 (µl)
SC 1250 / /
BC / 1250 1250
Triton X- 100 25 25 25
Phosphate buffer 12.5 25 12.5
Mẫu 12.5 / /
Ủ mẫu trong 6 phút ở O
o
C
TiSO4 750 750 750
Đọc ở bước sóng 420nm sau 5 đến 10 phút
Đơn vị tính hoạt tính CAT là U/mgprotein.
Chú ý: mẫu não pha loãng 2 lần, mẫu gan pha loãng 2 lần

Ho
ạt tính của G6PD
=

Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
16
Cách tính CAT(U/mg protein)= logSC-log(hấpthụ)*V

(ml)
phản ứng/V
(ml)
SC/V
(ml)

mẫu/T
(phút)
phản ứng * độ pha loãng/mg protein
Prôtêin
Nguyên tắc:
Protein được phân tích theo phương pháp Lowry, 1951 sử dụng Albumine bovine
làm đường chuẩn. Trong môi trường kiềm đồng sẽ tạo phức với protein. Khi chất
folin phenol được đưa vào, folin phenol sẽ kết dính với protein. Phản ứng này là
phản ứng khử và chuyển màu từ màu vàng sang màu xanh.
Quá trình phân tích:
Chuẩn bị hóa chất:
- BSA: 10mg/mlH
2
O
- Hỗn hợp A :150ml Na
2
CO
3
2% + 1,5ml CuSO
4
1% + 1,5ml NaK Tartrate
2%.
- Folin : 10ml Folin + 10ml H
2

O
Bảng 7: Quá trình phân tích Prôtêin

Hóa chất
Đường chuẩn Mẫu
0 mg
protein
0.05 mg
protein
0.1mg
protein
0.2 mg
protein
0.5 mg
protein

BSA 0µl 5 µl 10 µl 20 µl 50 µl /
Mẫu / / / / / 10
H
2
O 500 µl 495 µl 490 µl 480 µl 450 µl 490 µl
NaOH 1N 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl
Ủ trong 30 – 120 phút
Hỗn hợp A 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml
Ủ trong 15 phút
Folin 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl
Ủ trong 30 phút
Đọc ở bước sóng 660nm
Hoạt tính protein được đọc ở bước sóng 660nm bằng máy so mày quang phổ. Đơn
vị tính của protein là mg protein/ml

3.3. Xử lí số liệu
Tất cả số liệu về sinh hóa như AchE, LPO, GST, CAT, G6DP được kiểm tra dạng
phân phối trước khi xử lý thống kê. Số liệu phân phối chuẩn được xử lý bằng
phương pháp phân tích phương sai one-way ANOVA và dùng Post hoc, Duncan
test so sánh với đối chứng. Phần mềm Satistica 5.0 được dùng để xử lý thống kê.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
17
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Biến động nhiệt độ, oxy hoà tan (DO) và pH trong thời gian gây nhiễm
Malachite Green
Các chỉ tiêu nhiệt độ, oxy hoà tan, pH được ghi nhận trong quá trình tiến hành thí
nghiệm trong thời gian hai ngày tính từ khi gây nhiễm với MG, ghi nhận các chỉ
tiêu 2 giờ 1 lần sau đó lấy trung bình giữa buổi sáng và buổi chiều để xem ảnh
hưởng của chúng đến quá trình biến đổi MG trong cơ thể cá.
Nhiệt độ
Bảng 8: Nhiệt độ trong quá trình gây nhiễm MG
Ngày 1 Ngày 2
Nghiệm thức

Sáng Chiều Sáng Chiều
Trung bình 2
ngày
Đối chứng 29,1±0,,19

29,8±0,45

29,2±0,10

30,4±0,06

29,5±0,22

0,1 ppm 28,7±0,20

29,8±0,28

29,2±0,06

30,3±0,00

29,4±0,25

1 ppm 29,1±0,07

30,4±0,41

29,8±0,06

30,2±0,06

29,6±0,35

Qua bảng 8 cho thấy nhiệt độ trung bình dao động trong khoảng 29,4±0,25 đến
29,6±0,35
o
C. Nhiệt độ buổi chiều (30,4±0,41
o
C) luôn cao hơn buổi sáng (28,7±0,20
o

C)
do ảnh hưởng của ánh sáng mặt trời. Toàn bộ hệ thống thí nghiệm bố trí trong mái
che nên nhiệt độ khá ổn định và khoảng chênh lệch trung bình giữa 2 buổi là 1,2
o
C.
Nhiệt độ trung bình ngày vào khoảng 29,5
o
C thích hợp cho sự sinh trưởng và phát
triển của cá tra. Theo Đỗ Thị Bích Ly (2004) cá tra có thể sinh trưởng và phát triển
tốt ở 26-30
o
C. Giữa các nghiệm thức sự khác biệt về nhiệt độ nằm trong giới hạn
không lớn hơn 1
o
C. Điều này cho thấy nhiệt độ hầu như đồng nhất trong quá trình
thí nghiệm.
Ngoài ra độc tính của MG có liên hệ tới nhiệt độ nước. Ở nhiệt độ thấp, cá tôm có
thể chịu đựng được nồng độ thuốc cao hơn ở nhiệt độ cao, và thời gian tiếp xúc tăng
sẽ dẫn đến độ độc tăng lên một cách rõ rệt. Dĩ nhiên ở các nước nhiệt đới sử dụng
MG vào lúc sáng sớm khi nhiệt độ nước chưa tăng cao là tốt nhất. Đặc biệt trong
các tháng mùa hè nóng bức, thời gian tiếp xúc khi xử lý MG nên giảm xuống. (Lê
Thị Kim Liên, Nguyễn Quốc Thịnh, 2004).
Theo Bill và ctv (1977) độc tính của MG tác động lên cá sẽ tăng theo sự tăng của
nhiệt độ. Cá nheo giống (Italurus punctatus) ở pH là 7,5 thời gian thí nghiệm là 6
giờ, LC
50
ghi nhận được ở nhiệt độ 12
o
C là 0,96mg/l trong khi đó ở nhiệt độ 22
o

C là
0,23mg/l.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu