Định lượng mô, tế bào bằng phân tích hình ảnh (Quantifying tissues, cells by image anaslysis) potx

TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004

Định lợng mô, tế bào bằng phân tích hình ảnh

(Quantifying tissues, cells by image analysis)
Trịnh Bình*
Trờng Đại học Y Hà Nội
Phân tích hình ảnh bằng máy tính điện tử
thờng đợc dùng trong các lĩnh vực: chế tạo và
kiểm tra các sản phẩm, khoa học ngời máyVới
những u điểm của nó, phơng pháp này cũng đã
đợc áp dụng trong lĩnh vực y sinh học để phân
tích tế bào và mô qua kính hiển vi (sinh học, ung
th học, huyết học, phụ khoa, di truyền tế bào, mô
bệnh học).
Trớc đây, các phơng pháp định lợng mô tế
bào tốn rất nhiều thời gian vì cần phân tích trực
giác thông qua các phơng pháp đo đếm thủ công
ở một lợng không nhỏ các tiêu bản hiển vi và trên
các tấm ảnh siêu hiển vi, một việc làm rất mệt mỏi
và nhàm chán. Ngày nay, với sự trợ giúp của máy
tính điện tử, việc xử lý phân tích các hình ảnh và
định lợng các cấu trúc tế bào và mô đã đợc thực
hiện một cách nhanh chóng.
Trong công việc hàng ngày của các nhà sinh
học, tế bào học và di truyền, mô bệnh học
thờng có một số yêu cầu về định lợng nh sau:
Định lợng tế bào, mô để bổ sung cho những
đánh giá về mặt định tính.
Nhận dạng những đối tợng trong các mẫu
mô bổ sung cho những quan sát chủ quan của con

ngời (tế bào ác tính, tế bào gián phân, các nguyên
bào, phì đại cấu trúc)
Hiểu đợc cách sắp xếp phân bố của các đối
tợng thông qua những hình ảnh của chúng (động
học tế bào, mức bội thể, loạn sản, mức biệt hoá)
nhằm kiểm định những nhận xét trực giác theo thói
quen của ngời quan sát.
Để đạt đợc những yêu cầu này, cần có một tổ
hợp kính hiển vi định lợng, bao gồm một kính
hiển vi có chất lợng cao nối với một máy dò
quang và máy vi tính kèm theo phần mềm định
lợng chuyên dụng có đủ khả năng thu nhận, xử
lý, phân tích các hình ảnh của các tế bào và mô.
A.
Những nguyên lý của phơng
pháp định lợng hiển vi
Phơng pháp định lợng hiển vi là sự phối hợp
của hai kỹ thuật quen thuộc, đó là kỹ thuật hiển vi
và kỹ thuật đo ánh sáng, cho phép định lợng đợc
những hình ảnh hiển vi; trong những trờng hợp
nhất định, định lợng đợc hàm lợng của một số
chất ở mức tế bào và dới tế bào.
Lĩnh vực áp dụng của phơng pháp đo quang
hiển vi này đợc chia thành 2 loại, trên cơ sở cách
quan sát hiển vi, đó là:
- Quan sát bằng ánh sáng truyền qua một lát cắt
mô hoặc phiến đồ, lát cắt mô này có khả năng hấp thụ
ánh sáng. Sự hấp thụ ánh sáng có thể do chính chất
liệu của mẫu mô (phơng pháp hiển vi tơng phản),
hoặc do sự hấp thụ mầu sắc khác nhau của chất liệu

mẫu mô (phơng pháp tiêu bản nhuộm mầu).
- Quan sát bằng ánh sáng phát ra từ lát cắt mô
sau khi đợc một nguồn sáng kích thích phù hợp
(phơng pháp huỳnh quang nhân tạo gắn chất
huỳnh quang với các thành phần tế bào)
Phân tích hình ảnh bằng phơng pháp hiển vi
dựa trên cơ sở đo đếm những điểm của một cấu
trúc qua kính hiển vi mà lợng ánh sáng đi qua đã
bị hấp thụ hoặc đợc phát ra. Lặp lại việc đo đếm
này bằng cách quét tất cả các điểm thuộc cấu trúc
và nền bao quanh cấu trúc. Hình ảnh của cấu trúc
đó sẽ đợc tái hiện dới dạng một ma trận số và
sau đó đợc máy tính điện tử xử lý. Thứ tự các
bớc sơ đồ hoá nh sau:
Thu nhận hình ảnh với sự trợ giúp của thiết
bị có năng lực thu nhận ánh sáng và có độ phân
giải cao.
Cải thiện hình ảnh: Làm cho hình ảnh có độ
9
* GS. TS. Chủ nhiệm Bộ môn Mô - Phôi, Trờng Đại học Y Hà Nội.
TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004

tơng phản cao hơn và tính toán các tham số trác
quang.
Phân đoạn và xếp loại đối tợng: Nhận diện,
đánh dấu, giới hạn của cấu trúc cần đo đếm có
trong hình ảnh.
Tham số hoá: Mô tả các đối tợng cần đo
đếm bằng một danh mục các số đo về hình dáng,
mật độ, sự phát quang, mầu sắc và cách sắp xếp.

Phân tích các dữ liệu: Từ các dãy số của
từng đối tợng nghiên cứu so sánh giữa các số liệu,
lập biểu đồ, tìm ý nghĩa.
Thu nhận hình ảnh:
Hình ảnh trên kính hiển vi đợc một camera kỹ
thuật số (đen trắng hoặc mầu) chuyển thành dạng
một bảng trị số (đợc số hoá) và truyền sang máy
vi tính. Gồm các bớc:
Thu nhận hình ảnh quang học chuyển thành
tín hiệu điện, do thiết bị trác quang thực hiện.
Các tín hiệu đợc truyền qua một card thu
nhận gắn tại máy vi tính.
Chuyển những tín hiệu điện tơng đồng thành
những số tơng đồng; hình thành một ma trận số.
Thiết bị thu nhận và chuyển thành hình ảnh số
gồm: một máy dò quang kết hợp với hệ thống tìm
quét và thiết bị đổi tín hiệu điện tơng đồng thành tín
hiệu số. Thiết bị số hoá này đợc chế tạo tuỳ theo
chức năng và có năng lực làm việc riêng tuỳ loại.
Với những ảnh siêu cấu trúc (hình ảnh đen
trắng), việc thu nhận hình ảnh đợc thực hiện bởi
một máy quét ảnh kỹ thuật số. Sau thao tác quét
ảnh, hình ảnh siêu cấu trúc cũng đợc chuyển tới
máy tính dới dạng một ma trận số và đợc tái
hiện lên màn hình của máy vi tính.
Cải thiện hình ảnh
Thao tác trên máy vi tính theo chơng trình
phần mềm xử lý hình ảnh để tăng cờng chất lợng
ảnh (tăng độ tơng phản, xác định ranh giới, tăng
giảm mầu sắc); các tín hiệu số trong máy tính

cũng đợc tự động điều chỉnh theo.
Có 4 cách cải thiện hình ảnh:

* Thay đổi về biên độ (sửa đổi dãy số của giá
trị xám).
* Chuyển đổi hình ảnh trong không gian.
* Chuyển đổi hình ảnh mầu theo nguyên lý
phân tích của Fourier.
* Chuyển đổi hình ảnh bằng phơng pháp mầu
giả.
Lu ý là không có một cách tổng quát để cải
thiện hình ảnh. Vì vậy, cần lựa chọn cách thích
hợp cho mỗi loại đối tợng cần phân tích đo đếm.
Phân đoạn và xếp loại các đối tợng.
Việc phân đoạn các đối tợng cần định lợng
trong hình ảnh, do máy tính tự hoạt động, theo lệnh
của ngời điều khiển. Các thông tin thừa của ảnh sẽ
đợc loại bỏ. Có 2 phơng pháp phân đoạn đối tợng:
Phơng pháp dò tìm vùng - Nguyên lý của
phơng pháp này là xem xét một đối tợng trong
ảnh nh là một tập hợp các điểm giống và khác
nhau trong không gian, mà biểu hiện của chúng là
cờng độ sáng hoặc mầu sắc đối với cùng một
nguồn sáng chuẩn. Phơng pháp này đáp ứng yêu
cầu tìm hiểu sự phân bố của những mức độ xám
hoặc mức độ mầu có trong ảnh.
Phơng pháp phát hiện giới hạn - Ngời
điểu khiển chỉ cần làm thao tác viền quanh các đối
tợng cần đo đếm. Mỗi đờng viền quanh cấu trúc
là tập hợp các điểm giới hạn của cấu trúc đó. Máy

chỉ dò tìm và ghi nhận những cấu trúc có đờng
viền đợc giới hạn.
Những điều cần lu ý:
Phân đoạn hình ảnh là bớc khó khăn và đặc
hiệu khi áp dụng cho từng loại đối tợng. Cần có
những chỉnh lý cần thiết của ngời đo đếm bằng
cách nhắp chuột máy vi tính.
Việc phân đoạn đối tợng do máy đảm
nhiệm, cho nên về kết quả không thể so sánh đợc
với hình ảnh chính do mắt - não nhận biết.
Phân đoạn đối tợng là hình ảnh sinh học do
máy thực hiện tự động, khi tái lập hình ảnh không thể
hoàn hảo. Nếu phối hợp các phơng pháp phân đoạn
khác nhau, có thể giảm bớt các nhợc điểm này.
10
TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004

Sau phân đoạn là bớc xếp loại đối tợng theo
các tín hiệu số. Những điểm tơng đồng của cấu trúc
sẽ đợc sắp xếp lại dới cùng một nhóm.
Tham số hoá.
Đây là bớc tự động của máy, cho phép xác
định các số đo đối với đối tợng mà ngời quan sát
quan tâm. Có 4 loại tham số lớn:
Tham số hình thái
Tham số trác quang
Tham số đo màu
Tham số kết cấu
Tham số hình thái
Tham số hình thái đợc xác định trên hình ảnh

không gian hai chiều (hình ảnh nhị nguyên). Cứ
mỗi điểm là một thông tin về vùng (diện tích của
đối tợng hoặc chất nền) hoặc là một thông tin về
đờng viền quanh đối tợng (chu vi).
Hai loại tham số hình thái đợc dùng nhiều là:
diện tích và chu vi của đối tợng cần nghiên cứu.
Trên nguyên tắc, tham số diện tích của một đối
tợng là tổng số các điểm rơi vào bề mặt của đối
tợng; tham số chu vi là tổng số điểm rơi vào
đờng xác định ranh giới của đối tợng.
Tham số trác quang
Sự phát triển của phơng pháp đo quang đợc
đánh dấu bởi công trình của Casperson vào năm
1936 (phát triển lý thuyết cơ bản về việc lợi dụng
đặc tính phát quang của các thành phần cấu tạo tế
bào (nh ARN và ADN) để đo số lợng của chúng
trong các tế bào nguyên vẹn)
Phơng pháp đo quang phụ thuộc vào những
đặc tính của từng máy dò quang đợc chế tạo sẵn.
Máy dò quang sẽ tập hợp lại các tia sáng khi qua
cấu trúc bị mầu hấp thu, các chất phát huỳnh
quang, những chất đồng vị phóng xạ, những kháng
thể (gắn trực tiếp hoặc gián tiếp với enzyme hoặc
một chất phát huỳnh quang), những cơ chất sinh
mầu hoặc cơ chất sinh huỳnh quang, những acid
nucleic có khả năng lai cặp in situ với một enzyme
hoặc một chất phát huỳnh quang. Thí dụ: trên tiêu
bản hiển vi huỳnh quang, cờng độ phát huỳnh
quang đợc tính bằng tổng cờng độ phát huỳnh
quang ở mỗi điểm của đối tợng. Có 2 tham số

huỳnh quang hay đợc khai thác, đó là:
Tham số phát huỳnh quang toàn phần (tổng
cờng độ phát quang trên toàn bộ bề mặt đối tợng)
Tham số phát huỳnh quang trung bình
(cờng độ phát quang bình quân trên một đơn vị
diện tích bề mặt mẫu quan sát).
Tham số đo mầu
Trên cơ sở mô hình của Hering, Garbay (1979)
đã phát triển khái niệm đo mầu phù hợp với
nguyên lý tiếp nhận mầu sắc của mắt ngời. Ngời
ta nhận thấy: việc khôi phục lại một hình ảnh mầu
có thể đợc thực hiện khi làm chồng lên nhau của
3 hình ảnh đơn sắc đỏ, xanh lá cây và xanh da trời.
Khi ánh sáng đi qua một cấu trúc nhuộm mầu,
chúng sẽ bị hấp thụ khác nhau. Các tham số đo
mầu còn liên quan đến 3 khái niệm bổ trợ đó là: độ
chói, sắc thái và sự bão hoà của màu. Trong đó, độ
chói biểu hiện cờng độ của tia phát ra từ đối
tợng quan sát; sắc thái màu của đối tợng đợc
quyết định bởi bớc sóng phù hợp khi tia sáng đơn
sắc đi qua chúng; sự bão hoà biểu thị yếu tố phù
hợp với yếu tố loãng mầu kết hợp với bớc sóng
trội thu đợc sắc thái và ánh sáng trắng.
Những tiến bộ gần đây trong lĩnh vực camera
màu cho phép cùng một lúc xác định đồng thời 3
mà phát huỳnh quang.
Tham số kết cấu
Đây là những tham số giúp nhận biết đợc sự sắp
xếp, tổ chức của cấu trúc cần nghiên cứu. Thí dụ: nhận
biết đợc mật độ phát huỳnh quang các vùng khác

nhau của đối tợng; tần số xuất hiện và sự phân bố
trong không gian của các vùng phát quang này.
Trong thực tế, các nhà tế bào học và mô bệnh học
thờng quan tâm đến cách sắp xếp của chất nhiễm
sắc trong nhân tế bào, từ đó tìm hiểu mối liên quan
giữa kết cấu và trạng thái chức năng của tế bào đợc
quan sát. Từ thí dụ này, có thể ghi nhận 3 loại thông
tin có thể rút ra đợc (1) về độ tập trung của chất
nhiễm sắc, (2) sự phân bố của chất nhiễm sắc và (3)
cách sắp xếp của chất nhiễm sắc. Tất nhiên cả 3
thông tin này phụ thuộc rất nhiều vào tính phức tạp
của các hiện tợng sinh học.
11
TCNCYH phụ bản 32 (6) - 2004

1. Phải chuẩn hoá các phơng pháp chuẩn bị
các mẫu nghiên cứu (lát cắt mỏng, phiến đồ, tiêu
bản áp) ở tất cả các bớc nh cố định, cắt lát,
nhuộm mầu, làm phản ứng
Khi phân tích xác định tham số kết cấu một cấu
trúc, có thể dùng 3 cách tính gần đúng:
Tính số liệu gần đúng của toàn bộ hình ảnh
quan sát (không khai thác những kết cấu cơ bản)
2. Phơng pháp định lợng hiển vi dựa trên cơ
sở nguyên lý hoá sinh và vật lý, do đó các lĩnh vực
áp dụng phải hợp thức, đúng giới hạn và đợc kiểm
soát kỹ càng (lợng mầu và các thuốc thử phản
ứng, chiều dầy và khoảng cách giữa các lát cắt
mang phân tích)
Tính số liệu gần đúng ngẫu nhiên tuỳ theo

cách sắp xếp trong không gian của những kết cấu
cơ bản, sự phụ thuộc của các kết cấu cơ bản này
với kết cấu cơ bản khác. Nh vậy, kết cấu đầy đủ
của một đối tợng sẽ đợc xác định nh một thực
thể trọn vẹn.
3. Để có tính chính xác khi tái hiện và so sánh
kết quả trong cùng một labo. và giữa các labo.
khác nhau, phải:
Tính số liệu gần đúng của kết cấu đối tợng trên
cơ sở xác định rõ từng kết cấu cơ bản của đối tợng.
Mỗi kết cấu cơ bản đợc coi là một vùng trọn vẹn.
Qui định kiểm tra định kỳ chất lợng các
phơng tiện, kỹ thuật
Phân tích các dữ liệu
Các phơng pháp tập hợp các số liệu và thống
kê phân loại nhằm cung cấp các thông tin phục vụ
cho việc mô tả và tái hiện một cách khái quát các
tham số đã xác định trên một lợng lớn hình ảnh
đã phân tích.
Thống kê phân loại là phơng pháp đặt các trị
số đã đo đếm trên các quần thể tế bào giống nhau
và khác nhau trên cơ sở một số ít đặc điểm theo
một hớng khảo sát nh: phân tích các hàm số
phân bố, các số đo phối hợp (trung tuyến, trung
bình, phơng thức (mode), kiểu lệch, lệch đối
xứng, tham số độ thoải); các test so sánh các giá
trị trung bình, các tỉ lệ, các phơng sai và mối
quan hệ Mỗi phơng pháp phân tích là một công
cụ đặc biệt để cho phép giải một loạt những vấn đề
đặt ra, nh: (1) phán đoán những quần thể không

đồng nhất trên cơ sở phân tích so sánh, (2) so sánh
các quần thể bằng phân biệt các thừa số; (3) Xếp
loại các cấu thành của một quần thể bằng phân tích
biệt số; (4) Phân tích các quần thể bằng phơng
pháp tạo cụm và phân tích đa thừa số.
B. Vấn đề tiêu chuẩn hoá mẫu và
chuẩn hoá phơng tiện định lợng
phân tích hình ảnh
Những phơng pháp định lợng hiển vi đòi hỏi tính
chính xác và tính đặc hiệu của các tham số thu đợc,
đối với từng lĩnh vực áp dụng. Vì vâỵ, dù áp dụng
phơng pháp nào, cũng phải lu ý những yêu cầu sau:

Đa vào phần mềm định lợng những qui
trình thao tác của các test, sự định cỡ của dụng cụ
phơng tiện,
Thiết lập phơng pháp định lợng thích hợp
nhất chính xác nhất và có độ nhậy nhất
Thiết lập những mối liên hệ giữa các tham số
có ý nghĩa, xây dựng các chuẩn để chẩn đoán phân
biệt và so sánh với kết quả của các tác giả khác.
TàI liệu tham khảo
1. Weibel, E. R. And H. Elias (1967).
Quantitative methode in morphology. Springer,
Berlin, Heidelberg New York.
2. Weibel, E. R (1969). Stereological
principles for morphometry in Electronmicroscopy
cytology. Int. Rev. Cytol. 26, 235 - 302.
3. John J. Bozzola and Lonnie D. Russell
(1990). Quantitative Electron Microscopy.

Electron Microscopy Principles and Techniques
for Biologists. Jones and Bartlett Publishers.
Boston - London.
Metezeau, P and M. H. Ratinaud (1994).
Cytometrie par fluorescence. Apports comperatifs
des techniques: flux, image et confocale. Paris.
Inserm.

12