Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt pptx

TCNCYH 23 (3) 2003
Xác định tính đặc hiệu enzym giới hạn bằng phân tích
đầu tận cùng của các đoạn ADN bị cắt

Lê Thị Kim Tuyến
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng, Hà Nội

Các enzym giới hạn cắt ADN kép ở các vị trí đặc hiệu ngoài hoặc trong trình tự nucleotid đợc
nhận ra và để lại 3 dạng các đầu tận cùng: phẳng; chéo có ADN đơn 3 thừa, chéo có ADN đơn 5
thừa. Nghiên cứu này dùng một phơng pháp cho phép xác định kiểu cắt của các enzym giới hạn.
Phơng pháp giải trình tự Sanger đợc sử dụng để phân tích ADN ở xung quanh vị trí cắt nhng
dùng chất không phóng xạ. Song song các đoạn ADN tổng hợp kéo dài đợc cắt bằng enzym giới
hạn. Phản ứng Klenow mang hai hoạt tính là tổng hợp ADN 5 3 và exonucleasa 3 5 cho
phép xác định kiểu cắt của enzym giới hạn. Kết quả đã cho phép xác định vị trí cắt của hai enzym
mới. Điểm cắt Sml I nằm trong trình tự đối xứng đợc nhận: 5- C TPuPy AG - 3. BciV I nhận ra
một trình tự không đối xứng và cắt ngoài vị trí nhận : 5 - GTATCC(N)
6
- 3/3- CATAGG(N)
5
- 5.

I. Đặt vấn đề
Trong y học việc chẩn đoán và nghiên cứu
bệnh lý ở mức độ ADN ngày càng quan trọng.
Để phân tích đợc các ADN genom cần dùng
đến phản ứng cắt ADN giới hạn để tạo thành
các mảnh nhỏ có kích thớc nhất định. Phản
ứng này đợc xúc tác bắng các enzym giới hạn
thuỷ phân ADN ở các vị trí quyết định sau khi
đã nhận trình tự đặc hiệu gồm từ 4 đến 8 bp.
Tập hợp các enzym giới hạn là hết sức đa dạng

và có nguồn gốc phong phú là các vi khuẩn
không phân biệt loại chi. Hiện nay, trên thế
giới đã thu thập hơn 200 enzym giới hạn có
tính đặc hiệu khác nhau. Nếu tính đủ các loại
trình tự từ 4 đến 8 nucleotid có tính liên tục hay
không, số enzym giới hạn phải hơn 1000 [1].
Với mục đích có đợc enzym để có thể cắt
ADN ở bất cứ vị trí mong muốn nào, chúng tôi
tiếp tục khảo sát các enzym giới hạn có tính
đặc hiệu mới [2].
Đến nay, các enzym giới hạn đợc xác định
chủ yếu bằng các trình tự nucleotid đợc nhận
ra trên ADN. Nhng các enzym giới hạn nhận
ra cùng một trình tự có thể cắt ADN ở các vị trí
khác nhau nằm trong vị trí nhận đối với các
trình tự đối xứng hoặc ngoài vị trí nhận cách xa
và nucleotid đối với các trình tự không đối
xứng. Hai enzym mới đợc tìm ở Việt Nam,
Sml I nhận ra trình tự đối xứng 5-CTPuPyAG-
3 [3] và BciV I nhận ra trình tự không đối
xứng 5-GTATCC-3/3-CATAGG [4] đợc
xác định vị trí cắt.
Mục tiêu công trình này là xác định tính đặc
hiệu các enzym giới hạn bằng phân tích vị trí
cắt của nó trên ADN.
II. Phơng pháp và vật liệu
nghiên cứu
1. Các sinh phẩm
ADN đích M13 mp18 và ADN mồi ngợc
có vị trí 944-924 gắn biotin.

ADN đích pUC19 và ADN mồi ngợc có vị
trí 2627-2608 gắn biotin.
Sml I và BciV I là hai enzym giới hạn mới
đợc tìm ở hai chủng vi khuẩn thiên nhiên phân
lập tại Việt Nam từ Stenotrophomonas
maltophilia và Bacillus circulans. Sml I nhận
trình tự 5-CTPyPuAG-3. BciV I nhận trình tự
5-GGATAC-3 /5-GTATCC-3.

106
TCNCYH 23 (3) 2003
2. Phơng pháp giải trình tự nucleotid
Phơng pháp của Sanger [5] đợc sử dụng
nhng dùng các hoá chất không phóng xạ. Các
đoạn ADN điện di trên gel acrylamid đợc
truyền lên màng nylông theo phơng pháp
Southern blot [6]. Các đoạn ADN hiện lên bằng
phơng pháp miễn dịch học dùng avidine, cộng
hợp biotin-phosphatase và cơ chất CDP star tạo
sản phẩm phát quang của Phototope-Star
Chemiluminescent Detection kit (New England
Biolabs).
3. Xác định dạng cắt của các đoạn ADN
giới hạn
Đoạn dài ADN đợc tổng hợp và cắt với
enzym giới hạn phân tích, 30 phút, 37C. Tiếp
theo 3 àg ADN cắt đợc sử lý với 2U Klenow,
ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
III. Kết quả
Sml I cắt ADN của phagơ M13mp18 tại bốn

vị trí. Một trong các vị trí cắt là 868. Hình 1 chỉ
trình tự ADN của M13mp18 xung quanh vị trí
đó là:
3-GAGTAGTAATTGGG CTTGAG
ATGGTTT-5.

Đoạn ADN cắt với Sml I [Hình 1, (-)] kết
thúc bằng nucleotid C nằm trong trình tự nhận
ra. Sau khi phản ứng với Klenow, đoạn ADN
đợc dài ra thêm 4 nucleotid là TTGA. Sự tổng
hợp này chứng tỏ rằng đầu tận cùng do Sml I để
lại có chuỗi đơn 5 thừa gồm có 4 nucleotid.
Kết quả này cho phép xác định vị trí cắt của
Sml I là: 5- C TPuPy AG - 3.
BciV I nhận trình tự 5-GGATAC-3 /5-
GTATCC-3 và cắt pUC19 hai lần. Vị trí cắt
đợc phân tích là 2542 (Hình 2). Trình tự đợc
xác định trên gel nucleotid là 5-
CGACCCTGCCGCTTACC GGATAC CC-3.
Các đoạn ADN cắt kết thúc bằng C nằm
trớc trình tự nhận ra GGATAC cách 5
nucleotid. Phản ứng Klenow để lại một đoạn
ADN nhỏ hơn một nucleotid kết thúc bằng G.
Kết quả chỉ rằng phần exonucleasa của Klenow
đã phân huỷ chuỗi ADN đơn 3 thừa gồm có
một nucleotid. Vị trí cắt của BciV I là: 5-
GTATCC(N)
6
-3/3-CATAGG (N)
5

-5.
+ A T G C - C - T A G C +


Hình 1: Vị trí cắt Sml I:
5C T Pu Py A G 3
3G A Py Pu T C 5
-: không có Klenow +: có Klenow
Hình 2: Vị trí cắt BciV I:
5GTATCC(N)
6


3
3CATAGG(N)
5

5
-: không có Klenow +: có Klenow

107
TCNCYH 23 (3) 2003
IV. Bàn luận
Đến nay, các enzym giới hạn đợc xác định
chủ yếu bằng các trình tự nucleotit đặc hiệu
nhận ra. Nhng vị trí cắt có thể xẩy ra ở nhiều
điểm khác nhau hoặc ngay trong các trình tự có
tính chất đối xứng hoặc ở ngoài các trình tự
không đối xứng cách vài nucleotit [7]. Các
enzym giới hạn nhận cùng một trình tự có khả

năng cắt ở các vị trí khác nhau nh trờng hợp
của Sma I và Xma I [8]. Tuy nhiên những vị trí
cắt này sẽ gần nhau cách xa một vài nucleotit
thôi. Do vậy các hình vạch của một ADN
chuẩn cắt với các enzym giới hạn nhận ra cùng
một trình tự sẽ hiện lên giống nhau khi quan sát
trên gel agarose. Phơng pháp dùng trên cho
phép xác định dạng ADN tận cùng do enzym
giới hạn để lại, trên cơ sở đó có thể kết luận vị
trí cắt một cách chính xác.
Dựa vào phơng pháp giải trình tự Sanger
kết quả thu đợc cho phép quan sát các đoạn
ADN khác nhau một nucleotit đối với các phân
tử gồm từ 30 đến 200 nucleotit. Do đó các
ADN chuẩn M13mp18 và pUC19 đợc tổng
hợp từ các ADN mồi nằm từ 50 đến 100
nucleotit trớc vị trí cắt của enzym giới hạn
đang xác định. Song song ADN đợc tổng hợp
kéo dài và cắt bằng enzym giới hạn cho biết
nucleotit cuối cùng của phần kép ở các tận
cùng cắt. Ba dạng tận cùng có thể xuất hiện:
Phẳng do ADN là hoàn toàn kép; chéo với
ADN đơn 3 thừa; chéo với ADN đơn 5 thừa.
Phản ứng Klenow cho phép phân biệt giữa 3
khả năng đó vì enzym mang 2 hoạt tính
exonucleasa thuỷ phân ADN đơn 35 và
endonucleasa tổng hợp ADN đơn 53 [9].
Hai hoạt tính đó kết thúc tạo ra các chuỗi ADN
hoàn toàn kép. Nh thế kết luận dựa vào 3 tình
huống có thể xảy ra là: ADN đơn 3 thừa, phần

exonucleasa của enzym Klenow để lại sản
phẩm ADN nhỏ hơn; ADN đơn 5 thừa, phần
endonucleasa tổng hợp để lại sản phẩm ADN
dài hơn; ADN cắt phẳng có đặc điểm hoàn toàn
kép, Klenow không có tác động và ADN vẫn
giữ nguyên.
Phơng pháp đợc áp dụng trong trờng
hợp của hai enzym giới hạn đợc tìm ở Việt
Nam. Vị trí cắt của Sml I là 5- C TPuPy AG
- 3 nằm ngay trong trình tự đối xứng đợc
nhân ra. Vị trí cắt của BciV I là: 5-
GTATCC(N)
6
- 3/3- CATAGG(N)
5
- 5
nằm phía ngoài trình tự không đối xứng cách
vài nucleotit.
Phơng pháp này không dùng phóng xạ
hoàn toàn phù hợp với nhiều phóng thí nghiệm
không có điều kiện làm thí nghiệm với các chất
phóng xạ.
V. Kết luận
Phơng pháp đợc tả trong công trình này
cho phép phân tích các đầu tận cùng của các
đoạn ADN giới hạn. Trên cơ sở đó có thể xác
định thêm một đặc điểm quan trọng của một
enzym giới hạn nhất định là điểm cắt của nó.
Hai enzym giới hạn mới tìm ở Việt Nam đã
đợc phân tích.

Vị trí cắt Sml I là 5- C TPuPy AG - 3.
Vị trí cắt BciV I là 5- GTATCC(N)
6
-
3/3- CATAGG(N)
5
- 5
Tài liệu tham khảo
1. Schildkraut I. (1984). Screening and
characterizing restriction endonucleases. Genet.
Eng., 6: 117-140.
2. Lê Thị Kim Tuyến, Vũ Thị Kim Liên,
Vũ Hồng Nga (1996). Phát hiện enzym giới
hạn trong vi khuẩn tự nhiên phân lập ở Việt-
Nam. Hội nghị khoa học chuyên đè vi sinh học,
dịch tễ học, miễn dịch học, tháng 1/1996,
Thành phố Hồ Chí Minh: 112-116.
3. Lê Thị Kim Tuyến, Vũ Thị Kim Liên
(1997). Sml I, một enzym giới hạn mới tách
chiết từ chủng Stenotrophomonas maltophilia.
Tạp chí Y học Dự phòng, VII, 4 (34): 11-16.

108
TCNCYH 23 (3) 2003
4. Lª ThÞ Kim TuyÕn, Vò Hång Nga. Ph¸t
hiÖn vµ x¸c ®Þnh mét enzym giíi h¹n míi BciV
I, t¸ch tõ Bacillus circulans. T¹p chÝ Y häc Dù
phßng, 1997, VII, 4 (34): 5-10.
5. Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R
DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. 1977,
74:5463-67.
6. Southern E.M Detection of specific
sequences among DNA fragments separated by
gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 1975, 98 :
503-517.
7. Szybalski W., Kim S. C., Hasan N. and
Podhajska A. J. Class-IIs restriction enzymes-a
review. Gene, 1991, 100: 13-26.
8. Endow S.A., Roberts R.J. Two
restriction-like enzymes from Xanthomonas
malvacearum. J. Mol. Biol., 1977, 112: 521-
529.
9. Klenow H., Henningsen I. Selective
elimination of the exonuclease activity of the
deoxyribonucleic acid polymerase from
Escherichia coli B by limited proteolysis. Proc.
Natl. Acad. Sci., 1970, 65:168.
Summary
Nucleotide analysis of restricted fragment DNA
extremities for characterizing the restriction enzyme
cutting activity
The analysis of genomic DNA requires mostly its restriction into small fragments of definite
sizes. This reaction is catalyzed by restriction enzymes recognizing specific sequences 4-8
nucleotides long. Each restriction enzyme is characterized by one recognition nucleotide sequence
and its cut site on DNA. So far, more than 200 restriction enzymes with different specificities have
been found. If considering all the possibilities of palindrome sequences of 4-8 nucleotides,
interrupted or not, the number of restriction enzymes should be more than one thousand. With the
purpose to get a collection of restriction enzymes that cut DNA anywhere, we still continue to find
restriction enzymes having new specificities. This study presents a method able to characterize

unknown restriction enzymes by analyzing the cutting extremities of restricted fragments. The
method is based on the Sanger sequencing of DNA around the cut site. The non-radioactive
chemical biotin has been used instead of 32P.
The cut sites of two new enzymes have been determined. For Sml I, the cut site occurs within the
recognition nucleotide sequence: 5’- C↓ TPuPy A↑G - 3’. Bci VI recognizing a non-palindrome
sequence cuts outside this sequence: 5’- GTATCC(N)6 ↓ - 3’/3’- CATAGG(N)5 ↑- 5’.

109