Luận văn:Nghiên cứu vai trò vi khuẩn lactic trong quá trình lên men tạo hương cà phê hạt tươi ppt

- 1 -

B
B
Ộ
Ộ


G
G
I
I
Á
Á
O
O


D
D
Ụ
Ụ
C
C


V
V
À

À


Đ
Đ
À
À
O
O


T
T
Ạ
Ạ
O
O


Đ
Đ
Ạ
Ạ
I
I


H
H
Ọ

Ọ
C
C


Đ
Đ
À
À


N
N
Ẵ
Ẵ
N
N
G
G










HOÀNG THỊ HỒNG ÁNH




NGHIÊN CỨU VAI TRÒ VI KHUẨN LACTIC TRONG
QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO HƯƠNG CÀ PHÊ HẠT TƯƠI



Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
M
M
ã
ã


s
s
ố
ố
:
:


6

6
0
0
.
.
5
5
4
4
.
.
0
0
2
2














T

T
Ó
Ó
M
M


T
T
Ắ
Ắ
T
T


L
L
U
U
Ậ
Ậ
N
N


V
V
Ă
Ă
N

N


T
T
H
H
Ạ
Ạ
C
C


S
S
Ĩ
Ĩ


K
K
Ỹ
Ỹ


T
T
H
H
U

U
Ậ
Ậ
T
T









Đà Nẵng, năm 2010



- 2 -


MỞ ĐẦU
1. Lý do lựa chọn ñề tài.
Hiện nay, “cà phê chồn” là loại cà phê ñắt giá và ñược ưa
chuộng nhất trên thế giới về hương vị. Tuy nhiên, loại cà phê này khá
hiếm, người ta chỉ thu ñược khoảng 224kg trong một năm. Vậy ñiều
gì ñã khiến cho loại cà phê chồn này có giá trị sử dụng cao như vậy?
Chính hệ vi sinh vật yếm khí trong ñường ruột của con chồn ñã tạo ra
hương vị ñặc biệt của cà phê.
Quả cà phê tươi sau khi thu hoạch có vị ngọt dịu và màu ñỏ ở

phần vỏ ngoài, hoàn toàn không có hương thơm. Hương và màu sắc
của hạt cà phê chúng ta cảm nhận ñược chỉ hình thành sau khi “ủ”. Ủ
là quá trình lên men yếm khí nhờ hệ vi sinh vật tự nhiên bao gồm:
nấm men, nấm mốc và vi khuẩn. Trong ñó, nấm men và vi khuẩn
lactic là hai tác nhân vi sinh vật có vai trò quan trọng quyết ñịnh ñến
chỉ tiêu chất lượng về hương vị của hạt cà phê sau lên men. Nhiều
nghiên cứu khẳng ñịnh sự có mặt của nấm mốc, nấm men, vi khuẩn
(lactic, axetic, coliform) và một số vi khuẩn gram âm. Trong ñó,
nhiều chủng vi khuẩn lactic trong khối hạt ủ ñược phân lập và ñịnh
tên.
Xuất phát từ bản chất của quá trình lên men yếm khí quả cà
phê tươi xảy ra trong hệ thống tiêu hóa của con chồn, chúng tôi chọn
vi khuẩn lactic làm ñối tượng nghiên cứu quá trình lên men trên quả
cà phê tươi sau thu hoạch, nhằm góp phần “công nghiệp hóa” giai
ñoạn lên men, cải thiện chất lượng về hương vị thay vì chỉ lên men cà
phê thóc như hiện nay. Vì mục ñích ñó, chúng tôi chọn ñề tài:
“Nghiên cứu vai trò của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men
tạo hương cà phê hạt tươi”.


- 3 -


2. Mục ñích nghiên cứu.
- Nghiên cứu vai trò của vi khuẩn lactic tham gia vào quá
trình tạo hương dựa trên khả năng chuyển hoá ñường tạo thành các
axit hữu cơ. Sản phẩm axit hữu cơ tham gia phản ứng este với rượu –
sản phẩm tạo hương chính cho cà phê nhân.
- Lựa chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng chuyển
hóa ñường mạnh ñể ứng dụng cho quá trình lên men cà phê hạt tươi.

- Từ kết quả ứng dụng, ñề xuất quy trình lên men mới thay
thế quy trình lên men thóc như hiện nay và ứng dụng vào giai ñoạn
lên men tại huyện EaH’leo – Daklak.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.
- Quả cà phê Robusta thu hái tại huyện EaH’leo, tỉnh Daklak.
- Các vi khuẩn lactic ñược tuyển chọn trong quá trình lên men
tự nhiên cà phê.
- Nấm men rượu vang từ bộ sưu tập giống của viện Công nghệ
sinh học Việt Nam.
4. Phương pháp nghiên cứu.
- Phương pháp vi sinh vật.
- Phương pháp hóa lý.
- Phương pháp hóa học.
- Phương pháp xử lý số liệu.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài.
5.1. Ý nghĩa khoa học.
- Phân lập và tuyển chọn ñược các chủng vi khuẩn lactic sinh
axit lactic cao.
- Xác ñịnh vai trò tạo hương cho hạt cà phê của các vi khuẩn
lactic thực nghiệm trên chỉ tiêu xác ñịnh.


- 4 -


5.2. Ý nghĩa thực tiễn.
- Ứng dụng vi khuẩn lactic lên men cà phê quả tươi tận dụng
ñược nguồn dinh dưỡng có trong vỏ quả chuyển hóa thành các chất
tạo hương nhằm chủ ñộng nâng cao chất lượng về hương của cà phê.
- Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào giai ñoạn ủ cà phê tươi ở

huyện EaH’leo, Daklak.
6. Cấu trúc luận văn.
Luận văn gồm các phần:
Mở ñầu.
Chương 1: Tổng quan tài liệu.
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu.
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục.














- 5 -


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây cà phê.
1.1.1. Nguồn gốc.

1.1.2. Các giống cà phê
1.1.2.1. Cà phê chè (coffea Arabica L).
1.1.2.2. Cà phê vối (Coffea Robusta).
1.1.2.3. Cà phê mít (Coffea Excelsa Chev).
1.1.3. Cấu tạo, thành phần hóa học của cà phê nhân.
1.1.3.1. Cấu tạo hạt cà phê.
1.1.3.2. Thành phần hóa học của hạt cà phê.
1.2. Hệ vi sinh vật tham gia quá trình lên men hạt cà phê .
1.2.1. Nấm men.
1.2.1.1. Sự tạo thành rượu etylic trong môi trường axit (pH =
4,5) và trong ñiều kiện yếm khí.
1.2.1.2. Sự tạo thành glycerin trong môi trường kiềm.
1.2.1.3. Sự tạo thành rượu cao trong ñiều kiện thành phần dinh
dưỡng của môi trường lên men có chứa nhiều axit amin khác nhau.
1.2.2. Vi khuẩn lactic.
1.2.2.1. Đặc ñiểm vi khuẩn lactic.
1.2.2.2. Môi trường sống.
1.2.2.3. Các quá trình trao ñổi chất của vi khuẩn lactic.
1.3. Môi trường dinh dưỡng và môi trường thực nghiệm
nuôi cấy chủng giống.
1.3.1. Môi trường dinh dưỡng cơ bản.
1.3.2. Môi trường thực nghiệm nuôi cấy chủng giống.
1.4. Nuôi cấy thuần chủng và hỗn hợp giống.
1.4.1. Nuôi cấy thuần chủng giống.


- 6 -

1.4.2. Nuôi cấy hỗn hợp chủng giống.
1.5. Sinh tổng hợp hương cà phê.

1.5.1. Khả năng tạo hương của vi khuẩn lactic.
1.5.2. Một số hợp chất tạo hương trong cà phê.
1.6. Quy trình lên men cà phê thóc.
1.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh
vực của ñề tài.
1.7.1. Những nghiên cứu ngoài nước.
1.7.2. Những nghiên cứu trong nước.





















- 7 -

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu.
2.1.1. Nguyên liệu và hệ vi sinh vật.
Quả cà phê chín ñược thu hái tại các vườn cà phê thuộc
huyện EaH’leo, tỉnh Daklak, chủ yếu là giống Robusta.
- Vi khuẩn lactic ñược phân lập và tuyển chọn từ khối cà phê
lên men tự nhiên.
- Nấm men rượu ñược sử dụng từ bộ sưu tập viện Công nghệ
sinh học Quốc gia.
2.1.2. Các môi trường phân lập, nhân giống vi khuẩn.
2.1.3. Hóa chất thí nghiệm.
2.1.4. Phương tiện thí nghiệm:
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.2.1. Chuẩn bị môi trường.
2.2.2. Phân lập và thuần chủng các chủng lactic.
2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào vi
khuẩn.
2.2.4. Đặc tính sinh lý, sinh hóa.
2.2.5. Phương pháp xác ñịnh khả năng sinh trưởng, phát
triển của vi khuẩn lactic.
2.2.6. Phương pháp xác ñịnh số lượng tế bào sống/1ml canh
trường.
2.2.7. Phương pháp xác ñịnh chỉ số este.
2.2.8. Phương pháp phân tích phương sai.




- 8 -

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả lựa chọn môi trường.
Phương pháp thực hiện theo mục…, tất cả các khuẩn lạc nghi
ngờ là vi khuẩn lactic như hình dáng khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng
hay vàng ngà mọc trên ñĩa petri có chứa môi trường MRS II, MRS
III, MRS IV, MRS V ñược phân lập và thuần chủng. Các chủng ñược
ñem nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng có bổ sung nước vắt và
tiến hành ño OD sau 48h. Ký hiệu các khuẩn lạc là C
1
, C
2
, C
3
, C
4
, C
5
,
C
6
, C
7
, C
8
, C
9
, C
10

, C
11
, C
12
, C
13
. Kết quả trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy ñến sự sinh trưởng
và phát triển của vi sinh vật.

Stt Chủng

MRS I MRS II MRS III MRS VI

MRS V
1

C
1
314 290 301 287 282
2 C
2
299 276 287 272 266
3 C
3
311 284 260 244 215
4 C
4
314 274 282 259 223
5 C

5
373 273 284 246 236
6 C
6
287 263 283 239 233
7 C
7
321 291 310 287 270
8 C
8
310 289 300 276 270
9 C
9
293 261 254 233 231
10 C
10
303 280 291 289 277
11 C
11
288 270 275 261 254
12 C
12
305 289 295 269 260


- 9 -

13 C
13
320 295 308 289 251

Đánh giá kết quả phát triển của các chủng vi sinh vật trên 5
môi trường cho thấy: tại môi trường dinh dưỡng MRS I không bổ
sung thêm nước vắt cà phê tất cả 7 chủng phát triển mạnh nhất. Tiếp
ñó là môi trường MRS III; MRS II; MRS VI; MRS V.
Do ñó, chúng tôi chọn môi trường III làm môi trường giữ giống
và nuôi vi khuẩn cho quá trình nghiên cứu.
Các chủng nghi ngờ là vi khuẩn lactic trên tiếp tục ñược giữ
giống và nuôi cấy trên môi trường MRS III ñể tiến hành xác ñịnh
hình thái và ñịnh tính.
3.2. Kết quả xác ñịnh hình thái của vi khuẩn.
Các chủng C
1
, C
2
, C
3
, C
4
, C
5
, C
6
, C
7
, C
8
, C
9
, C
10

, C
11
, C
12
, C
13

ñược thử catalase, nhuộm màu Gram và quan sát hình dạng tế bào
theo phương pháp ở mục 2.2.3 chương 2. Kết quả ñược trình bày ở
bảng sau:
Bảng 3.2: Đặc ñiểm hình thái các chủng vi khuẩn phân lập
từ cà phê lên men
Chủng

Hình thái khuẩn lạc
Hình dạng

tế bào
Nhuộm
Gram
Catalase

C
1
Màu trắng sữa, tròn, lồi,
mép phẳng.
Hình oval + +
C
2

Màu trắng trong, tròn, dẹt,
nhỏ.
Hình que dài

+ +
C
3

Trắng trong, mép phẳng,
khuẩn lạc to.
Hình que
ngắn
+ -
C
4
Trắng sữa, dẹt, cấu trúc Hình cầu + -


- 10 -

ñồng nhất.
C
5

Trắng sữa, tròn, mép
phẳng.
Hình que
ngắn
+ -
C

6

Tròn, bề mặt trơn, mép
răng cưa.
Hình que
ngắn
+ -
C
7

Trắng trong, mép nhẵn, bề
mặt lồi
Hình chuỗi - +
C
8

Trắng sữa, bề mặt xù xì,
mép lượn sóng.
Hình chuỗi + +
C
9

Trắng sữa, nhân hơi vàng,
cấu trúc ñồng nhất
Que ngắn,
mảnh
+ -
C
10
Trắng ñục, ñều, không lồi.

Hình que + +
C
11
Trắng ñục, ñều, hơi lồi Hình oval + +
C
12
Vàng nhạt, tròn ñều, lồi
Hình que
ngắn
+ -
C
13
Trắng ñục, mép răng cưa
Hình que
ngắn
+ -
Kết quả ở bảng (3.2) cho thấy có 7 chủng có thể là vi khuẩn lactic,
C
3
, C
4
, C
5
, C
6
, C
9
, C
12

, C
13
(Catalase ( - ); gram (+)).
Các chủng này ñược thử khả năng chuyển hóa ñường thành
axit lactic, từ ñó lựa chọn các chủng có khả năng chuyển hóa ñường
cao.
3.3. Khả năng chuyển hóa ñường thành axit lactic và khảo
sát ñộng thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn .
3.3.1. Kết quả ñịnh tính khả năng sinh axit lactic.


- 11 -

Kết quả cho thấy tất cả 7 chủng phân lập C
3
, C
4
, C
5
, C
6
, C
9
,
C
12
, C
13
có khả năng tạo axit lactic (làm chuyển màu tím của dung
dịch thuốc thử sang màu vàng chanh như mẫu ñối chứng). Xin xem

kết quả ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Định tính khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn.
Chủng khảo sát Kết quả
C
3
+
C
4
+
C
5
+
C
6
+
C
9
+
C
12
+
C
13
+
Ghi chú +: Sinh axit lactic.
3.3.2. Kết quả ñịnh lượng axit lactic của các chủng vi khuẩn.
Bảng3.4 : Lượng axit lactic tạo thành của các chủng vi khuẩn
Lượng axit tạo thành (mg/l)
Stt
Tên

Chủng
24h 48h 72h 96h
1 C
3
34,78

88,39

82,80

64,42

2 C
4
89,47

120,63

115,80

114,87

3 C
5
112,72

142,74

158,80

146,86

4 C
6
63,57

117,31

111,70

105,91

5 C
9
101,62

155,72

148,10

151,04

6 C
12
117,99

162,88

165,10

144,17

7 C
13
55,99

120,90

120,30

118,88




- 12 -


Từ bảng kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy các chủng
C
5
, C
12
có khả năng sinh axit lactic cao nhất, vì vậy, chúng tôi chọn 2
chủng ñó ñể tiếp tục khảo sát ñộng thái sinh trưởng.
3.3.3. Khảo sát ñộng thái sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn
lựa chọn.

Hình 3.3. Động thái sinh trưởng của 2 chủng C
5
và C
12
Trong khoảng thời gian từ 0 – 36h mật ñộ tế bào tăng lên rõ rệt
bởi ñây là giai ñoạn các chủng vi khuẩn lactic trong giai ñoạn thích
ứng và sinh trưởng, phát triển về sinh khối, nên giá trị OD
620nm
ño
ñược cũng là giá trị sinh khối tích lũy ñược trong thời gian 36h nuôi
cấy. Khoảng thời gian từ 48 – 72h, giá trị sinh khối của hai chủng C
5
,
C
12
có tăng nhưng không ñáng kể, ñiều ñó thể hiện các chủng vi
khuẩn lactic bước qua giai ñoạn phát triển cân bằng và chuyển dần
qua giai ñoạn suy vong.
0
50

100
150
200
250
300
350
400
OD
386nm
C5
11
172
276
310
320
332
337
C12
8
165
293
325
336
343
345
0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h


- 13 -

Dựa vào kết quả ño ñược, chúng tôi khẳng ñịnh 36h là mốc
thời gian hai chủng C
5
và C
12
phát triển mạnh nhất và tại thời ñiểm
ñó, chúng tôi xác ñịnh lượng tế bào sống/ml canh trường theo
phương pháp 2.4, phụ lục 2. Kết quả trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5 : Số tế bào sống/ml canh trường (CFU/ml) tương ứng
với ñộ pha loãng thập phân
Chủng vi khuẩn
C
5
C
12

Độ pha loãng
10
-6
10
-7
10
-7
10
-8
Số lượng khuẩn
lạc trên ñĩa
11 18 3 7 31 42 16 23
Số vi khuẩn/1ml
canh trường

(CFU/ml)
18 x 10
7
51 x 10
8

Vậy, sau 36h nuôi cấy trên môi trường MRS III, sinh khối vi
sinh vật ñạt giá trị cao nhất và tại thời ñiểm ñó, chủng C
5
tương ứng
số tế bào là 18x10
7
và C
12
là 51x10
8
. Chúng tôi chọn thời ñiểm này
bổ sung vào khối lên men cà phê hạt.
3.4. Nghiên cứu khả năng tạo este của các chủng giống.
3.4.1. Nuôi cấy thuần chủng.
3.4.1.1. Bố trí thí nghiệm.
- Mẫu M
1
, M
2
là các mẫu cà phê có bổ sung vi khuẩn tương
ứng là C
5
, C
12

. Mẫu ñối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn.
3.4.1.2. Kết quả.







- 14 -












Hình 3.5. Khả năng lên men tạo este của các chủng vi khuẩn
So sánh chỉ số este hai mẫu có bổ sung vi khuẩn với mẫu ñối
chứng (ĐC) cho thấy, chỉ số este trong hai mẫu cao hơn so với mẫu
ñối chứng.
Qua bảng biểu cũng cho thấy mẫu bổ sung chủng C
5
có chỉ số
este cao hơn hai mẫu còn lại. Nhằm thử khả năng lên men chuyển

hóa ñường của hai chủng C
5
và C
12
khi nuôi cấy hỗn hợp như thế
nào, chúng tôi ñã tiến hành lên men hỗn hợp hai chủng này và so
sánh với mẫu ñối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn.
3.4.2. Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi khuẩn C
5
, C
12
.
3.4.2.1. Bố trí thí nghiệm.
M
1
: mẫu bổ sung hỗn hợp vi khuẩn C
5
: C
12
(1:1).
M
2
: Mẫu ñối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn.
3.4.2.2. Kết quả



229.75a
222.08b
212.38c

200
205
210
215
220
225
230
Chỉ số este
M1 M2 MĐC
Mẫu lên men


- 15 -











Hình 3.7. Khả năng tạo este của hỗn hợp chủng vi khuẩn C
5
và C
12
Dựa vào bảng kết quả chúng ta thấy, khi bổ sung hỗn hợp hai
chủng giống C

5
và C
12
vào khối lên men, chỉ số este (239,86) cao hơn
so với mẫu ñối chứng (208,15) và mẫu chỉ bổ sung giống thuần
chủng(229,75).
Như ñã biết, vi khuẩn lactic lên men dị hình sản phẩm chủ yếu
tạo ra là axit lactic. Theo lý thuyết, phản ứng este chỉ xảy ra khi có
mặt của axit và rượu. Do ñó, ñể có ñược lượng rượu cao phân tử cao
trong quá trình lên men có ñịnh hướng, chúng tôi sử dụng phương án
sử dụng hỗn hợp hai chủng vi khuẩn C
5
và C
12
cùng với nấm men
rượu vang (từ bộ sưu tập giống của viện Công nghệ sinh học quốc
gia) ñể ñánh giá khả năng tạo este. Quá trình thực nghiệm và kết quả
ñược trình bày ở hình 3.8 và 3.9.
3.4.3. Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi khuẩn C
5
, C
12
với nấm
men.
3.4.3.1. Bố trí thí nghiệm.
239.86
208.15
190
200
210

220
230
240
Chỉ số este
M3 MĐC


- 16 -

Trong ñó: M
1
: mẫu bổ sung hỗn hợp vi khuẩn C
5
+ C
12
(mẫu
ñối chứng). M
2
: mẫu bổ sung hỗn hợp vi khuẩn C
5
+ C
12
và nấm men
3.4.3.2. Kết quả.

Hìn
Hình 3.9: Khả năng tạo este của hỗn hợp vi khuẩn và nấm men
Kết quả cho thấy, mẫu bổ sung nấm men có chỉ số este cao hơn
mẫu không bổ sung (380,11>243,56). Chúng tôi chọn mô hình này ñể
nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng ñến chỉ số este.
3.5. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng ñến chỉ số este.
3.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ hỗn hợp vi khuẩn bổ sung
lên men ñến chỉ số este.
Để xác ñịnh tỷ lệ vi khuẩn thích hợp cho hạt cà phê sau lên
men có hàm lượng este cao, chúng tôi tiến hành bổ sung hỗn hợp vi
khuẩn/khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với các tỷ lệ 2%, 4%,
6%, 8%.
3.5.1.1. Bố trí thí nghiệm.
243.56
380.11
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Chỉ số este
M4 M5

Mẫu lên men


- 17 -

Để xác ñịnh tỷ lệ vi khuẩn thích hợp cho hạt cà phê sau lên
men có hàm lượng este cao, chúng tôi tiến hành bổ sung hỗn hợp vi
khuẩn/khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với các tỷ lệ 2%, 4%,
6%, 8%.
3.5.1.2. Kết quả.











Hình 3.11. Ảnh hưởng tỷ lệ vi khuẩn bổ sung ñến chỉ số este
Kết quả thể hiện ở hình 3.11 cho thấy khi bổ sung 6% tỷ lệ hỗn
hợp vi khuẩn thì chỉ số este cao nhất là 369,72; và thấp nhất khi bổ
sung tỷ lệ 2% là 311,05.
Chúng tôi lựa chọn tỷ lệ bổ sung vi khuẩn/khối lượng hạt cà
phê tươi thích hợp nhất là 6% (v/w) ñể tiến hành nghiên cứu tiếp
theo.
3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ nấm men bổ sung ñến chỉ
số este.

3.5.2.1. Chuẩn bị mẫu.
Để xác ñịnh tỷ lệ nấm men thích hợp bổ sung vào khối lên men
cà phê kết hợp với hỗn hợp vi khuẩn lactic cho hạt cà phê có hàm
311,05d
356,38b
369,72a
340,47c
280
290
300
310
320
330
340
350
360
370
Chỉ số este
2 4 6 8
Tỷ lệ vi khuẩn (%)


- 18 -

lượng este cao, chúng tôi tiến hành bổ sung nấm men/ khối lượng hạt
cà phê ứng với các tỷ lệ 2%, 4%, 6%(v/w).
3.5.2.2. Kết quả.
Mẫu hạt cà phê sau khi lên men ñược ñem phân tích, kết quả
trình bày ở hình 3.13.

Hình 3.13. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men bổ sung và hỗn hợp
vi khuẩn ñến chỉ số este
Qua biểu ñồ, ta có thể nhận thấy, khi tăng tỷ lệ nấm men bổ
sung, chỉ số este càng giảm.
Dựa vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi chọn tỷ lệ bổ sung
nấm men là 2%, khi ñó chỉ số este ñạt giá trị cao nhất (528,12) ñể
tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men ñến chỉ số este.
3.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men ñến chỉ số
este trong hạt cà phê sau lên men.
3.5.3.1. Bố trí thí nghiệm.
528,12a
453,52b
418,26c
371,22d
0
100
200
300
400
500

600
Chỉ số este
2 4 6 8
Tỷ lệ nấm men bổ sung (%)


- 19 -

Để khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men ñến chỉ số este chúng
tôi tiến hành lấy mẫu phân tích sau 3, 4 và 5 ngày lên men. Kết quả
phân tích ñược thể hiện ở hình 3.15.
3.5.3.2. Kết quả.












Hình 3.15. Ảnh hưởng thời gian lên men ñến chỉ số este
Từ kết quả thu ñược chúng tôi nhận thấy, sau 4 ngày lên men
chỉ số este ñạt cao nhất (531,23) trong 3 khoảng thời gian khảo sát.
Sau 5 ngày, chỉ số este có giá trị thấp nhất (489,17). Chính vì vậy,
chúng tôi chọn thời ñiểm dừng quá trình lên men là sau 4 ngày.
3.6. So sánh hiệu quả lên men tạo hương cà phê hạt tươi với

cà phê thóc.
3.6.1. Sơ ñồ bố trí thí nghiệm.
Để so sánh hiệu quả tạo hương của hai phương pháp lên men
cà phê hạt tươi và cà phê thóc, chúng tôi tiến hành lên men hai mẫu
song song.
Trong ñó: M
1
: mẫu lên men cà phê thóc.
501,11b
531,23a
489,17c
460
470
480
490
500
510
520
530
540
Chỉ số este
3 4 5
Thời gian lên men (ngày)


- 20 -

M
2
: mẫu lên men cà phê hạt tươi có bổ sung hỗn hợp vi khuẩn

và nấm men
3.6.2. Kết quả.
Sau 4 ngày lên men, lấy mẫu hạt ñem rửa sạch và tiến hành
phân tích chỉ số este.
Kết quả thể hiện ở hình 3.17.












Hình 3.17. Chỉ số este theo hai phương pháp lên men.
Kết quả ở bảng biểu thể hiện chỉ số este của phương pháp lên
men cà phê thóc thấp hơn rất nhiều so với lên men cà phê hạt tươi
(211,15 <565,11)
Bằng việc phân lập, lựa chọn nguồn vi khuẩn lactic có sẵn
trong môi trường lên men cà phê tự nhiên và ứng dụng trở lại ñể chủ
ñộng cho quá trình lên men tạo hương, sau khi khảo sát thực nghiệm,
chúng tôi nhận thấy rằng việc lên men cả vỏ có bổ sung nguồn vi
khuẩn kết hợp với nấm men thì chỉ số este của hạt cà phê nhân sau
211,15
565,11
0
100

200
300
400
500
600
Chỉ số este
M17 M18
Mẫu lên men


- 21 -

giai ñoạn lên men cao hơn rất nhiều so với phương pháp lên men hạt
cà phê thóc như quy trình chế biến hiện nay

(63%).

Từ kết quả thu ñược, chúng tôi ñề xuất quy trình lên men cà
phê hạt tươi nhằm cải thiện quá trình tạo hương vị cho cà phê.
3.7. Đề xuất quy trình lên men hạt cà phê tươi.
• Quy trình lên men:
Quả cà phê sau khi thu hái ñược phân loại theo phương pháp
trọng lượng và màu sắc nhằm ñảm bảo ñộ ñồng ñều về chất lượng
ñầu vào. Cà phê trước khi lên men ñược tác ñộng cơ học ñể phá vỡ
cấu trúc vỏ bên ngoài và tiến hành lên men yếm khí trong các vể xi
măng, thùng nhựa, thùng gỗ hay các tank, bổ sung hỗn hợp vi khuẩn,
nấm men và lên men sau thời gian 4 ngày. Khi quá trình lên men kết
thúc, cào ñảo ñể rửa nhân cà phê và ñể nhân cà phê ñược tách ra khỏi
lớp vỏ ngoài. Ngâm rửa nhân cà phê ñể loại bỏ hết nhớt và ñưa phơi
sấy. Có thể phơi bằng năng lượng mặt trời (vào mùa khô) hay sấy

băng tải (mùa mưa) ñể ñưa cà phê thóc về ñộ ẩm an toàn (< 15%).














- 22 -

• Sơ ñồ quy trình.

Hình 3.18. Quy trình lên men cà phê hạt tươi bằng hỗn hợp
vi khuẩn – nấm men

Quả cà phê
Tác ñộng cơ học
Lên men
Tách vỏ

Ngâm rửa

Làm ráo nước
Phơi sấy
Cà phê thóc khô
Phân loại
Chuẩn bị hỗn hợp
vi khuẩn – nấm men

- 23 -

3.8. Ứng dụng lên men cà phê hạt tươi tại huyện EaH’leo -
Daklak
Từ quy trình ñề xuất, chúng tôi ứng dụng lên men cà phê hạt
tươi tại huyện EaH’leo – Daklak theo quy mô pilot và so sánh với
quy trình lên men hiện nay trên chỉ tiêu este.









Hình 3.20. Chỉ số este theo hai quy trình lên men
Dựa vào kết quả và bảng biểu chúng ta nhận thấy, ở mẫu M
1
là
mẫu lên men hạt cà phê sau khi ñã xát vỏ ( như quy trình sản xuất
hiện nay) có chỉ số este thấp hơn nhiều so với mẫu lên men quả cà
phê tươi bổ sung hỗn hợp vi khuẩn và nấm men (quy trình ñề xuất).
Điều ñó có thể giải thích ñược là do trong mẫu M
2
, chúng tôi ñem lên
men cả quả cà phê có bổ sung hỗn hợp vi khuẩn và nấm men, nên
toàn bộ chất dinh dưỡng trong vỏ quả ñược chúng sử dụng cho quá
trình sinh tổng hợp và chuyển hóa thành những sản phẩm trao ñổi

chất là axit và rượu, hai thành phần này tạo nên phản ứng este hóa và
thấm vào nhân. Do ñó, chỉ số este ño ñược cao hơn so với mẫu M
1




208,26b
516,71a
0
100
200
300
400
500
600
Chỉ số este
M1 M2
Mẫu lên men


- 24 -

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ


Kết luận.
Từ những kết quả thực nghiệm trong thời gian nghiên cứu,
chúng tôi có một số kết luận sau:
1. Lựa chọn ñược môi trường thực nghiệm tối ưu (MRSIII- môi

trường dinh dưỡng MRS cơ bản bổ sung 10ml nước vắt cà phê) nhằm
nuôi sinh khối các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ cà phê hạt tươi
lên men tự nhiên, giúp chúng có khả năng thích ứng tốt với môi
trường lên men từ cà phê hạt tươi.
2. Phân lập ñược 7 giống vi khuẩn lactic có khả năng chuyển
hóa ñường thành axit lactic. Từ 7 chủng ñã tuyển chọn ñược 2 chủng
C
5
và C
12
có khả năng chuyển hóa ñường thành axit lactic cao (158,8
và 165,1 mg/l).
3. Bổ sung hỗn hợp hai vi khuẩn C
5
, C
12
với nấm men ñể lên
men cà phê hạt tươi cho hạt cà phê nhân có chỉ số este (380,11) cao
hơn khi chỉ bổ sung vi khuẩn ở dạng ñơn (222,08 và 229,75) là 40 –
42%, và dạng hỗn hợp hai vi khuẩn (239,86) là 37%.
4. Tỷ lệ giữa vi khuẩn lactic và nấm men rượu vang sử dụng
trong nghiên cứu là 6 : 2 (theo v/w) ñể lên men tạo hương ñạt chỉ số
este cao nhất (528,12) ứng với thời gian sau 4 ngày lên men.
5. Phương pháp lên men cà phê hạt tươi ñược bổ sung bằng hỗn
hợp vi khuẩn với nấm men thì chỉ số este của cà phê nhân tăng 63%
so với phương pháp lên men hạt cà phê xát vỏ.
6. Đề xuất quy trình lên men cà phê hạt tươi có bổ sung hỗn
hợp vi khuẩn lactic với nấm men và ứng dụng tại huyện EaH’leo -

- 25 -

Daklak cho cà phê nhân có chỉ số este tăng 60% so với quy trình lên
men cà phê hiện tại.
Kiến nghị.
Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men tạo hương cà phê
là một lĩnh vực rộng, và hương cà phê ñược cấu thành từ rất nhiều
cấu tử khác nhau. Do ñó, nghiên cứu vai trò của các vi sinh vật tạo
hương chỉ có thể “phân ñoạn” trong một chừng mực có thể. Vì vậy,
ñề tài chưa thể hoàn thiện và còn nhiều vấn ñề cần ñề cập ñến. Do ñó,
chúng tôi có một số kiến nghị sau:
1. Cần ñịnh tên hai giống vi khuẩn sử dụng trong thực nghiệm
(C
5
và C
12
) ñể viết sắc sảo hơn phần bình luận kết quả và cũng là
thông số cần thiết ñể hoàn chỉnh phần lựa chọn chủng giống sau phân
lập cũng như ứng dụng.
2. Để so sánh về hương của hạt cà phê lên men, chúng tôi chỉ
kiểm tra ở một chỉ tiêu là chỉ số este - chỉ số quan trọng trong việc
ñánh giá hương cà phê. Tuy nhiên, một sản phẩm thực phẩm ñược
cho là giá trị sử dụng tốt không thể bỏ qua phương pháp ñánh giá
cảm quan. Do ñó, nghiên cứu cần hoàn thiện khi ứng dụng phương
pháp này ñể ñánh giá khách quan mẫu thực nghiệm.
3. Lấy chất lượng cà phê phân chồn làm tiêu chí phấn ñấu cải
tiến công nghệ nâng cao chất lượng cà phê nhân sẽ tiến hành nghiên
cứu hệ vi sinh vật yếm khí trong hệ tiêu hóa của con chồn – tác nhân
tạo hương thơm cho cà phê nhân.
4. Ngoài chỉ tiêu tạo este, vai trò của vi khuẩn và nấm men

thực nghiệm còn tạo ra những sản phẩm gì góp phần tạo hương cà
phê nhân cũng rất cần ñược xác ñịnh.