NGhiên cứu tạo cây thuốc lá chuyên gen kháng sâu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
----------





----------


TRẦN THỊ THANH HẢO


NGHIÊN CỨU TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN
KHÁNG SÂU vip3A





LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP


Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT
Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn: 1. TS. CHU HOÀNG HÀ
2. GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH

HÀ NỘI - 2009
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
i


LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là
trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
- Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn
ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả luận văn



Trần Thị Thanh Hảo

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
ii


LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành chương trình học tập, thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh
luận văn tốt nghiêp, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ vô cùng quý báu
của Ban giám hiệu, Khoa Sau ñại học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội,
Ban lãnh ñạo Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội và tập thể Phòng Công
nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Tiến sĩ Chu Hoàng Hà - Phó trưởng phòng

Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học ñã giúp ñỡ và tạo ñiều
kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu ñề tài và
hoàn chỉnh luận văn.
Tôi cũng xin ñược trân trọng cảm ơn và GS.TS Nguyễn Quang Thạch,
trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người luôn theo dõi và hướng dẫn chu
ñáo ñể tôi hoàn thành bản luận văn này.
Qua ñây, tôi cũng chân thành cảm ơn tập thể cán bộ bộ phòng Sinh học
Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội, Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ
Sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, những người thân trong gia
ñình và bạn bè ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành bản
luận văn tốt nghiệp.
Tác giả luận văn



Trần Thị Thanh Hảo
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iii


MỤC LỤC



Lời cam ñoan Error! Bookmark not defined.

Lời cảm ơn Error! Bookmark not defined.

Mục lục Error! Bookmark not defined.

Danh mục các chữ viết tắt Error! Bookmark not defined.

Danh mục bảng Error! Bookmark not defined.

Danh mục hình Error! Bookmark not defined.

1. MỞ ðẦU 1

1.1

ðặt vấn ñề 1

1.2

Mục ñích và yêu cầu 2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1

Giới thiệu chung về cây thuốc lá 3

2.1.1

Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá 4

2.1.2

Các ñặc ñiểm thực vật học cây thuốc lá 5

2.1.3

Tình hình sâu bệnh hại 6

2.1.5

Giá trị của cây thuốc lá 7

2.1.6

Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 7

2.2.

Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 9

2.2.1

Khái niệm chuyển gen 9

2.2.2

Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng 10

2.3

Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt) 19

2.3.1

Lịch sử phát hiện ñộc tố Bt 19

2.3.2

Các loại protein ñộc tố của Bt 20

2.4

Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới 22

2.5

Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước 23

3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1

Vật liệu, hoá chất, thiết bị 25

3.1.1

Vật liệu 25

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iv


3.1.2

Hoá chất, thiết bị 25

3.2

ðịa ñiểm và thời gian: 26

3.3

Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1

Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 26

3.3.2

Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens
bằng xung ñiện 31

3.3.3

Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens
(theo Topping, 1998 ) 31

3.3.4

Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 33

3.4

Các chỉ tiêu theo dõi: 36

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1

Thiết kế vector pBI121 mang gen vip3A 37

4.1.1

Thiết kế mồi 38

4.1.2

PCR nhân ñoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR 39

4.1.3

Ghép nối ñoạn gen vip3A vào vector tách dòng 40

4.1.4

Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 40

4.1.5

Chọn lọc plasmit tái tổ hợp 41

4.1.6

Tạo vector chuyển gen mang gen vip3A 42

4.2

Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá 45

4.2.1

Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A. tumerfaciens
bằng xung ñiện 45

4.2.2

Chuyển cấu trúc mang gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens 46

4.3

Kiểm tra và theo dõi kết quả chuyển gen 53

5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

5.1

Kết luận 57

5.2

Kiến nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 64

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
v


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BAP 6 - benzyladenine
bp Base pair = cặp bazơ
Bt Bacillus thuringiensis
Cefo Cefotaxime
CNSH Công nghệ sinh học
cry Crystal toxin gene = gen mã hóa protein nội ñộc tố δ
cs Cộng sự
CTTN Công thức thí nghiệm
CV Coefficient of variation = sai số thí nghiệm
DNA Deoxyribonucleic Acid
EtBr Ethidium bromide
GM Kan 30 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 30mg/l
GM Kan 50 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l
GM Môi trường tái sinh chồi
gus β - Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase
IBA Indole-3-butyric acid
Kan Kanamycin
kb kilo base
kDa kilo Dalton
LB Môi trường theo Luria và Bertani
LSD Least significant difference = sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa

MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)
MT Môi trường
OD Optical density = mật ñộ quang học
PCR Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymerase
RM Môi trường ra rễ
RM Kan 50 Môi trường ra rễ chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l
RNA Ribonucleic Acid
TAE Tris bazơ - Axit acetic – EDTA
T-DNA Transfer - DNA = ñoạn DNA ñược chuyển
TE Tris HCl - EDTA, pH = 8
Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u
v/p Vòng/phút
vip Vegetative insecticidal protein = gen mã hoá protein sinh dưỡng
diệt côn trùng
vir Virulence region = vùng gây ñộc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vi


DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang
2.1. Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới
giai ñoạn 2004 - 2008 8

2.2. Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008 9

4.1. Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân gen vip3A 38

4.2. Tỷ lệ tái sinh/sống sót của các mẫu qua các giai ñoạn 49

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vii



DANH MỤC HÌNH
STT Tên hình Trang
2.1 Cấu trúc Ti- Plasmit 12

2.2 Mô chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium 14

4.1 Kết quả ñiện di tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A 39

4.2 Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli
DH5α 40

4.3 Kết quả ñiện di sản phẩm cắt plasmit 41

4.4 Sản phẩm cắt bằng enzyme BamHI& SacI 43

4.5 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR từ 14 dòng khuẩn lạc cặp mồi ñặc
hiệu V1.2/V2.2 44

4.6 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt plasmit tái tổ
hợp bằng enzyme BamHI & SacI 45

4.7 Vi khuẩn A.tumerfaciens/ C58 /vip3A trên môi truờng LB ñặc
chọn lọc 48

4.8 Dịch huyền phù vi khuẩn 48

4.9 Mảnh lá CTTN trên MT GM Kan 30 50

4.10 Mảnh lá ð/C1 trên MT GM Kan 30 50

4.11 Mảnh lá ð/C2 trên MT GM 50

4.12 Cụm chồi CTTN trên MT GM Kan 50 50

4.13 Cụm chồi ð/C1 trên MT GM Kan 50 50

4.14 Cụm chồi ð/C2 trên MT GM 50

4.15 Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 1) 51

4.16 Cây tái sinh trên MT RM Kan 50 (chọn lần 2) 51

4.17 Cây ð/C trên MT RM Kan 50 51

4.18 Rễ cây chuyển gen trên môi trường RM Kan 50 51

4.19 Rễ cây ð/C trên môi trường RM Kan 50 51

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
viii


4.20 Cây trong bầu trấu cát 53

4.21 Cây trồng trong bầu ñất 53

4.22a Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 16 dòng thuốc lá với cặp
mồi 33S Fs/Rs 54

4.22b Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 6 dòng thuốc lá với cặp
mồi 35S Fs/Rs 55

4.23 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 22 dòng thuốc lá với cặp
mồi V2.1/V2.3 56


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
1


1. MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị
kinh tế cao. Sản phẩm thu hoạch là lá tươi, phải thông qua giai ñoạn chế biến ñặc
trưng (sấy, hong, phơi…) mới có thể dùng lá làm nguyên liệu sản xuất thuốc lá.
Ngoài ra cây thuốc lá cũng ñược sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, dùng
làm chế phẩm trừ sâu, axit hữu cơ, hạt dùng ñể chiết xuất dầu thực vật.
Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau ñược quan
tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Một trong
những hướng chọn tạo giống ñược quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ
biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại chính như kháng các
bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV,CMV), virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) hoặc

kháng sâu (sâu xanh, sâu xám...). Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu của
cây bằng gen cry mã hóa cho sự tạo nội ñộc tố δ trong pha sinh bào tử của vi
khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gần ñây các nhà khoa học ñã phát hiện các
gen vip (vegetative insecticidal protein - các protein sinh dưỡng diệt côn trùng)
mã hóa cho các protein trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn
Bt và Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác ñịnh trình tự và thử hoạt
tính sinh học. Kết quả cho thấy các protein Vip có hoạt lực và phổ tác dụng diệt
côn trùng cao hơn rất nhiều lần các protein do gen cry mã hóa. Gen vip3 tạo
protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA và có
phổ hoạt ñộng rộng như diệt ñược sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc lá [12].
Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày
có giá trị kinh tế cao [7]. Vấn ñề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những
nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu, do vậy ứng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
2


dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại là một
trong những hướng ñi ñể giải quyết vấn ñề ñó.
Viện Công nghệ Sinh học ñã bước ñầu chuyển thành công gen kháng
bệnh vào cây thuốc lá (kháng bệnh khảm lá thuốc lá TMV, khảm lá dưa chuột
CMV)… [2] nhưng chưa có nghiên cứu nào ñược công bố về sử dụng gen vip3A
trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng sâu.
Trên cơ sở ñó chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu tạo cây
thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A”
1.2 Mục ñích và yêu cầu
1.2.1 Mục tiêu của ñề tài:
Tạo ra cây thuốc lá chuyển gen mang gen kháng sâu (vip3A)
1.2.2 Nội dung nghiên cứu:
- Thiết kế vector chuyển gen mang gen vip3A.

- Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumerfaciens.
- Theo dõi, kiểm tra và ñánh giá các dòng thuốc lá chuyển gen.








Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
3


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có
tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ ñối với
trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công
nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn ñiếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu ñến cả
hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư
nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật
[16], [20]... Với tổng diện tích trồng trọt khoảng 4,0 - 5,5 triệu ha trải khắp từ
60
o
vĩ Bắc ñến 40
o
vĩ Nam và tổng sản lượng nguyên liệu thu ñược khoảng
6,5 - 8,5 triệu tấn (trong ñó khoảng 3,5 - 4,5 triệu tấn thuốc lá vàng; khoảng

0,6 - 1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental; còn lại là
các loại khác ñể sản xuất khoảng 6.000 tỷ ñiếu hàng năm [22], [47].
Theo Reed S. M. [41] thì cây thuốc lá ñược phân loại thuộc giới thực
vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt
kín, lớp phụ 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà. Họ này có tới trên 85 chi
với tổng số trên 1.800 loài. Một số loài trong họ này ñược trồng rộng rãi như
khoai tây, cà chua, ớt, các loại cà và trong ñó có chi Nicotiana. ðặc trưng của
các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alcaloid như solanin,
atropin, scopalamin, nicotine...
Chi Nicotiana ñược chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66
loài trong ñó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1
loài ở Châu Phi. Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là
cây lâu năm và 2 loài là cây bụi thân gỗ. Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài
chưa tìm thấy ở dạng hoang dại nhưng lại ñược trồng phổ biến làm thuốc lá là
Nicotiana tabacum (N. tabacum) và N. rustica.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
4


Loài N. tabacum có số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội
(Dihaploid = 4n), có biến ñộng lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, góc ñóng
lá so với thân, kiểu tai cuống lá, mầu sắc lá. Hoa tự chùm lưỡng tính mọc
trên ñỉnh sinh trưởng, hoa dài khoảng 5 cm, có 5 cánh với mầu từ hồng ñến
ñỏ (N. tabacum) hay màu vàng ñến vàng hơi xanh (N. rustica). Hoa thường
tự thụ phấn trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn ñến 95%. Mỗi cây có thể cho
200 - 400 quả và mỗi quả có khả năng cho khoảng 2000 - 4000 hạt. Trong
hạt chứa 32 - 42% dầu (Chủ yếu là Linoleic acid và Oleic acid), 20 - 30%
protein. Trong 1 gam hạt có từ 10.000 - 15.000 hạt và hạt có khả năng sống
rất lâu [16], [20], [22].
2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá

Trong lịch sử, cây thuốc lá ñược trồng ñầu tiên ở châu Mỹ từ hơn
6000 năm trước công nguyên và ñược sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo, làm
thuốc chữa bệnh [16], [22].
Thuốc lá là loài cây trồng có nguồn gốc Nhiệt ñới và Á nhiệt ñới,
hương vị ñặc biệt của nó ñã ñược biết ñến ở vùng Trung Mỹ có lẽ cách ñây
trên hai nghìn năm và trở nên phổ biến từ thế kỷ 15 [16], [20].
Sử viết về cây thuốc lá bắt ñầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, khi
Christopher Columbus ñặt chân lên bãi biển San Salvado ở Tây Ấn ðộ Dương.
Các thổ dân ở ñó ñã mang tới hoa quả và cả những nắm lá khô cho mùi thơm
quyến rũ khi chúng ñược châm hút ñể mời ñoàn thám hiểm [16], [20].
Người Tây Ban Nha bắt ñầu trồng thuốc lá ở Haiti vào năm 1531 với
nguồn hạt giống từ Mexico và sau ñó việc trồng thuốc lá lan rộng tới các hòn
ñảo lân cận khác. Trồng trọt thuốc lá bắt ñầu ở Cu Ba vào năm 1580, sau ñó
phát triển sang Guiana, Brazil [20] và dần dần phát triển trên các châu lục khác.
Một số tài liệu ñáng tin cậy cho rằng thuốc lá ñược trồng từ thời vua Lê
Thần Tông (1660) bằng nguồn hạt giống của các thương nhân Tây Ban Nha.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
5


Năm 1876, nghề trồng thuốc lá ở Việt Nam chính thức khởi sự tại Gia ðịnh,
tiếp theo là Tuyên Quang (1899) và thuốc lá ñiếu bắt ñầu ñược sản xuất tại Hà
Nội cùng thời gian này. Năm 1935, giống thuốc lá vàng sấy Blond cash ñầu
tiên ñược du nhập và trồng thử ở An Khê, ñến năm 1940 trồng thử ở Tuyên
Quang, Ninh Bình... [22].
2.1.2 Các ñặc ñiểm thực vật học cây thuốc lá
2.1.2.1. Rễ thuốc lá
Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm: rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên)
và rễ hấp thu. Ngoài ra, thuốc lá còn có rễ bất ñịnh mọc ở cổ rễ, phần trên sát
mặt ñất. Rễ trụ ñược hình thành từ phôi rễ. Rễ nhánh ñược phát sinh từ trục

của rễ cái, thường có ñộ xiên 30 - 40
o
. Rễ hấp thu ñược phát triển trên các rễ
nhánh, có nhiệm vụ cung cấp nước và dinh dưỡng cho cây. Rễ bất ñịnh mọc
từ thân, những rễ bất ñịnh ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi ñộ ẩm
không khí cao. Rễ thuốc lá tập trung dày ñặc ở lớp ñất 0 - 30 cm, phát triển
theo các hướng. Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin. Nicotin ñược
vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá.
2.1.2.2 Thân cây
Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân ñứng, tiết diện thân tròn, chiều
cao thân cây có thể ñạt từ 1 - 3 m, chia làm nhiều ñốt, mỗi ñốt mang một lá.
ðường kính thân ñạt 2 - 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là
chồi nách. Có 2 loại chồi nách: chồi nách chính và chồi nách phụ.
2.1.2.3 Lá thuốc lá
Trên thân chính của cây thuốc lá có nhiều lá. Số lượng lá trên cây thay
ñổi tuỳ theo giống. Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình
tim, hình elip, hình mũi mác. ðộ dày, màu sắc lá có thể thay ñổi.
Lớp ngoài của biểu bì có tầng cutin trong suốt và có lớp phấn sáp khi lá
bắt ñầu chín kỹ thuật. Lớp tế bào mô dậu và tế bào mô khuyết trong cấu trúc
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
6


lá quyết ñịnh ñộ dày mỏng, ñộ ñàn hồi của lá thuốc. Ở trên mặt lá còn có
nhiều tuyến lông ña bào, có hình dạng và kích thước khác nhau. Các tuyến
này chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên và tích luỹ nhiều khi lá chín kỹ thuật.
Trên mặt lá có gân chính và nhiều gân phụ.
2.1.2.4 Hoa
Hoa thuốc lá là hoa ñơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung
quanh có 5 nhị ñực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn,

ñược hình thành do sự phân hoá của ñỉnh sinh trưởng thân. Chính giữa chùm
hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa.
Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tự phối (97 - 98%), còn lại có thể
do thụ phấn chéo do gió hoặc côn trùng,..
2.1.2.5 Quả và hạt
Quả thuốc lá ñược hình thành trên ñài hoa. Mỗi cây có 100 - 150 quả
trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 - 500 quả trên
chùm hoa. Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra.
Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng
sấy lò là 0,07 - 0,10 gam, trong mỗi gam hạt có từ 10.000 ñến 15.000 hạt [14].
2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại
Cây thuốc lá bị các loại bệnh hại chính là bệnh khảm lá thuốc lá do
virus (TMV,CMV), bệnh xoăn lá thuốc lá do virus (TLCV), bệnh héo rũ vi
khuẩn , ñen thân, héo ñốm cà chua....
Các loại sâu chính gây hại trên thuốc lá là sâu xanh (Helicoverpa
assulta
)
, sâu khoang (Prodenia litura
)
, sâu xám (Agrotis ypsilon
)
...
Ở Việt Nam, tuy chưa có số liệu chính xác nhưng nhiều chuyên gia cho
rằng thiệt hại do bệnh và sâu ñối với thuốc lá khoảng 25 - 30%. Nếu sản
lượng hàng năm là 30.000 tấn với giá bình quân 12.000 ñ/kg thì sâu bệnh hại
ñã lấy ñi mất khoảng 100 tỷ ñồng/năm và mỗi phần trăm thu lại ñược từ phần
thiệt hại này trị giá hàng tỷ ñồng [9].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
7

2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá
Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao. Sản phẩm
chính là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá
trên toàn thế giới. Ngoài ra thuốc lá còn ñược sử dụng vào một số mục ñích
khác như:
- Trồng nhóm Nicotiana rustica ñể chiết xuất từ lá hàm lượng nicotin từ
4 - 5 % ñể sản xuất thuốc trừ sâu Sulfat nicotin.
- Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất ñược sclareol và 13 epi - sclareol
chống bệnh gỉ sắt cây họ ñậu.
- Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùng cho công nghiệp dược
phẩm.
- Hạt thuốc lá chiết xuất 34 - 40% dầu phục vụ trong công nghiệp, sử
dụng trong thực phẩm.
- Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao.
- Hoa chiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc lá.
- Một số phát hiện mới hiện nay, các nhà nghiên cứu ñã kết luận thuốc
lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin.
- Protit thuốc lá chứa nhiều axit amin quan trọng, tính chất bổ dưỡng
vượt cả Phomat Protein trong sữa [5].
2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu
2.1.6.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá nguyên liệu của thế giới
Thuốc lá nguyên liệu tham gia thương mại trên thế giới chủ yếu ñược sản
xuất ở các vùng từ 45
o
vĩ Bắc ñến 30
o
vĩ Nam. Diện tích trồng thuốc lá trên thế
giới trong những năm gần ñây luôn duy trì ở mức khoảng 3,5 triệu ha [55].
Trong tổng sản lượng thuốc lá nguyên liệu trên 5 triệu tấn ñược sản xuất

hàng năm, thuốc lá vàng sấy lò chiếm trên 60%, thuốc lá burley khoảng 15%,
thuốc lá oriental gần 10% và một số chủng loại khác [48].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
8


Bảng 2.1. Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới
giai ñoạn 2004 - 2008
ðVT: ngàn tấn
Năm Vàng sấy Burley Oriental Nâu Tổng
2004 3757,1 886,4 350,9 195,9 5190,3
2005 4035,6 771,8 353,1 181,9 5342,4
2006 3948,5 725,3 268,5 182,1 5124,4
2007 3872,6 620,6 237,0 185,5 4915,7
2008 4185,9 743,5 259,0 184,3 5372,7
Nguồn: USDA (Tobacco World Markets and Trade june – 2008) [48]
Số liệu ở bảng 2.1 cho thấy sản lượng các dạng thuốc lá chính của thế
giới những năm qua tương ñối ổn ñịnh, mặc dù ngành công nghiệp thuốc lá ở
các nước chịu nhiều áp lực.
2.1.6.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá lá ở Việt Nam
Hiện nay, thuốc lá ñược trồng ở nhiều ñịa phương trong cả nước (27/64
tỉnh, thành phố) [7] với 3 chủng loại thuốc lá vàng sấy, nâu và burley trong ñó
thuốc lá vàng sấy là loại nguyên liệu ñược trồng nhiều nhất ở nước ta hiện nay
chiếm tỷ trọng ñến 90% sản lượng thuốc lá nguyên liệu sản xuất nội ñịa.
Các ñịa phương trồng thuốc lá vàng sấy chủ yếu hiện nay là Cao Bằng,
Lạng Sơn, BắcKạn, Gia Lai, ðắklăk, Tây Ninh, Ninh Thuận, Phú Yên. Tổng
diện tích trồng thuốc lá vàng sấy trên cả nước hiện dao ñộng ở khoảng 14 - 16
ngàn ha với sản lượng hàng năm ước ñạt từ 22 - 26 ngàn tấn. Tại khu vực
phía Bắc, năng suất ñạt 1,5 - 1,8 tấn/ha. Năng suất bình quân tại các tỉnh phía
Nam hiện nay ñạt khoảng 1,8 - 2 tấn/ha [9], [15].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
9


Bảng 2.2. Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008
Năm 2006 2007 2008
TT
ðịa ñiểm DT SL NS DT SL NS DT SL NS
I Phía Bắc 5.875 8.912 1,52 5.615 8.737 1,56 7.066 11.144 1,58
II Phía Nam 9.683 17.184 1,77 7.564 13.725 1,81 6.165 11.229 1,82
Tổng /TB 15.558 26.096 1,68 13.18 22.462 1,70 13.23 22.373 1,69
Nguồn tài liệu: Tổng công ty thuốc lá Việt Nam [15]
Ghi chú: DT: diện tích (ha); SL: sản lượng (tấn); NS: năng suất (tấn/ha)
Số liệu bảng trên cho thấy sản lượng thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong
nước trong những năm qua tương ñối ổn ñịnh. Theo ñánh giá của các chuyên
gia, nguyên liệu thuốc lá vàng sấy của nước ta hiện nay có chất lượng tương ñối
tốt, có thể thay thế ñược nguyên liệu Trung Quốc. Vì vậy việc phát triển sản xuất
thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng nội ñịa
là một việc làm cần thiết trong giai ñoạn hiện nay. Nó vừa giúp cho ngành sản
xuất thuốc lá trong nước chủ ñộng ñược nguồn nguyên liệu ñầu vào vừa tạo công
ăn việc làm cho một bộ phận ñông ñảo bà con nông dân, tăng nguồn thu ngân
sách và tiết kiệm ñược nguồn ngoại tệ cho nhà nước.
2.2. Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài
2.2.1 Khái niệm chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết
kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các
sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật,...) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các
gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện

các ñặc tính mới của cơ thể chuyển gen [3], [12].
Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng ñịnh
tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hoá cho các tính
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
10


trạng nhất ñịnh, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền. Thông
qua chuyển gen, các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền có thể nghiên cứu các
quá trình ñiều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại
cảnh lên hoạt ñộng của gen.
2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại
thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và
phương pháp chuyển gen trực tiếp.
2.2.2.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp
- Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung ñiện
- Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm
- Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn
- Chuyển gen nhờ súng bắn gen
- Chuyển gen nhờ silicon carbide
2.2.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp
- Chuyển gen nhờ virus
- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.
Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñược nghiên cứu từ những
năm 1960 - 1970. Việc phát kiến ra Agobacterium tumefaciens
(A.tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào ñầu những năm
1980 ñã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của
Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật với những ưu ñiểm nổi trội: số bản sao
của gen biến nạp ñược chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1 - 2 gen,

trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn), do vậy, giảm tối thiểu sự không
biểu hiện của gen ñược chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả
chuyển gen cao; tránh ñược sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ
thuật ñơn giản, dễ thực hiện; không ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền [13].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
11


Phương pháp này ñã khắc phục ñược những hạn chế chủ yếu của các
phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận ñược cây trồng có
nhiều bản sao của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen
trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu ñược những cây
mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây...
ðặc biệt là khi nhược ñiểm của A. tumerfaciens chỉ chuyển gen trên cây
hai lá mầm ñược khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành
hiện thực và ñược ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi
khuẩn Agrobacterium ngày càng gây ñược sự quan tâm và dần trở thành một
phương pháp chuyển gen ñược ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các
nhà chọn tạo giống trên thế giới.
* ðặc ñiểm chung của vi khuẩn A. tumefaciens
Agrobacterium là các vi khuẩn ñất nhuộm gram (-) gây ra các triệu
chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương.
Trong chi Agrobacterium thì A. tumerfaciens ñược sử dụng nhiều nhất
cho việc chuyển gen.
Phân loại khoa học:
Giới Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhizobiales
Họ: Rhizobiaceae

Chi: Agrobacterium
Loài: A. tumefaciens
Danh pháp khoa học: Agrobacterium tumefaciens.
(Smith & Townsend, 1907) [52].
A. tumerfaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau ñó sử
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
12


dụng bộ máy thực vật ñể biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng
cho chúng. A. tumerfaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần ñiểm tiếp nối giữa
rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall disease), khi
ñó các tế bào khối u ở thực vật có gắn một ñoạn DNA từ vi khuẩn. Khi phân
tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình thành một số vật chất mới như:
nopaline, octopine goi chung là opine. Các chất này không hề có trước ñó và
không hề có ở cây trồng thông thường. Như vậy vi khuẩn ñã truyền vào cây
qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhân này có bản chất là
vật chất di truyền.

Hình 2.1. Cấu trúc Ti- Plasmit
(nguồn : )
Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chính là Ti-
plasmit có trong vi khuẩn A. tumerfaciens. Ti-plasmit này có ñặc ñiểm chung
như sau:
Ti-plasmit là một plasmit ñược cấu tạo bao gồm một phân tử DNA kép,
vòng tròn lớn có kích thước 200 kb, có khả năng tái bản ñộc lập với sự tái bản
của DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
13

Trên Ti-plasmit có ñoạn T-DNA ñược giới hạn bằng bờ phải (right
border) và bờ trái (left border) có trình tự nucleotid tương tự nhau. T-DNA là
ñoạn nucleotit có kích thước 25 kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư
(oncogenic gene), loại này mã hoá cho một enzyme liên quan tới tổng hợp các
auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ hai liên quan tới tổng hợp
opine. ðoạn này ñược gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì ñây là ñoạn sẽ ñược
chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh u. Trên Ti-plasmit
còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt ñộng lây nhiễm, chuyển
nạp và tiêu hoá opine [13].
Khi cây nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt
ñầu hoạt ñộng và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng
của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u.
Opine ñược vi khuẩn sử dụng như một loại thức ăn, nhờ gen chuyển hoá
opine trên Ti-plasmit.
Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn:
Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất ñộc vết thương có bản chất
phenol: acetosyringon và hydroxyacetosyringon. Các chất này sẽ thu hút vi
khuẩn tập trung vào vùng bị thương ñồng thời chúng hoạt hoá các gen ở vùng
vir là E, D, C, G, B, A, F và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này có
hai chức năng chính: cắt ñứt bờ phải và bờ trái ñể giải phóng ñoạn T-DNA,
bao bọc và vận chuyển ñoạn T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với
genom cây chủ.
Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A. tumerfaciens sang tế bào cây
chủ ñược thực hiện bởi hoạt ñộng của các gen vir A, B, C, D, E, G, F. Các
gen này có vai trò quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây
thông qua tín hiệu hoá học acetosyringon (AS). Tín hiệu hoá học ñược nhận
biết ñầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
14

màng tế bào ñể ñáp ứng sự trao ñổi chất của vết thương trên cây. Protein Vir
A tự photphoryl hoá ñồng thời làm cho protein Vir G ñược photphoryl hoá
(Jin và CS 2001) và kích hoạt sao mã của các gen vir B, C, E, F, G, H
(Ziemienowcz 2001).

Hình 2.2. Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium
(1). Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ;(2). Tổ hợp tín hiệu VirA/VirG của
Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật ñặc trưng;(3). Sự hoạt hoá của vùng gen
vir; (4). T-DNA ñược tách ra khỏi Ti-plasmit nhờ phức hợp protein VirD
1
/D
2;
(5). Sự tạo
thành phức hợp VirD
2
-DNA (phức hợp-T chưa thành thục), cùng với một vài protein Vir
khác, ñi vào nguyên sinh chất tế bào chủ; (6). Sự kết hợp của VirE
2
với sợi-T tạo thành
phức hợp-T thành thục ñi xuyên qua nguyên sinh chất tế bào chủ; (7). Phức hợp-T thành
thục chủ ñộng ñi vào nhân tế bào chủ; (8). T-DNA bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; (9). T-
DNA tách khỏi các protein bảo vệ; (10). T-DNA hợp nhất vào bộ gen chủ.
Tiếp ñó các protein ñược mã hoá bởi vir D, vir E thực hiện chức năng
giải phóng sợi T-DNA. Protein D
2
cắt T-DNA tại vị trí 5’ của bờ phải và 3’
của bờ trái và giải phóng sợi T-DNA. Protein E
2

bảo vệ T-DNA khỏi sự phân
giải của enzyme nuclease trong cây (Deng và cs 1998). ðồng thời thực hiện
chức năng này có các protein Vir C
1,
Vir C
2
có tác dụng tăng cường việc giải
phóng T-DNA.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
15


Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B ñảm nhiệm. Vir B có
chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi ñơn T-DNA vào
nhân tế bào. ðồng thời protein Vir B
4
, Vir B
11
có hoạt tính ATPase cung cấp
năng lượng cho vận chuyển T-DNA (Zhu và cs 2000).
Như vậy, thực chất ñã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn ñất vào
cây trồng tồn tại trong tự nhiên.
Dựa vào cơ chế này con người lợi dụng vi khuẩn ñất ñể chuyển các gen
mong muốn cho mình trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Ti-plasmit của vi khuẩn
sao cho vẫn ñảm bảo ñược chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen
gây ñộc cho cây.
Người ta ñã tạo ra các dạng vector mới ñể chuyển gen là những vector
liên hợp (co-intergrate vector) và vector nhị thể (binary vector) [3], [4].
Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai
loại plasmit: Ti-plasmit ñã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất

opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen
bị cắt bỏ là ñoạn tương ñồng với một ñoạn trên plasmit thứ hai (plasmit trung
gian) ñể phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmit. Plasmit trung gian là một
plasmit tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh ñược ở Agrobacterium.
Plasmit này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc
chọn lọc và có mặt ñoạn tương ñồng. Khi cho tương tác hai loại plasmit này với
nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao ñổi chéo giữa hai ñoạn tương ñồng và hình
thành nên vector liên hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A.
tumefaciens và hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn
ñất. Do tần số ñưa plasmit trung gian từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10
-
7
-10
-5
) nên vector này ít ñược sử dụng (John Draper, 1882).
Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector
(plasmit) cùng có mặt và hoạt ñộng trong Agrobacterium. Một plasmit tách
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
16


dòng từ E.coli trong ñó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là
các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmit thứ hai là Ti-plasmit cải
tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại
vùng vir, plasmit này ñược gọi là plasmit hỗ trợ. Hệ thống vector này cũng
hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn ñất Agrobacterium một cách
rất hữu hiệu (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2005) [12].
Thiết kế vector
Các nghiên cứu về vi khuẩn Agrobacterium và khả năng tự nhiên của
chúng trong việc biến ñổi vật chất sinh học của các tế bào thực vật bị nhiễm

ñã giúp các nhà khoa học thiết kế ñược những phân tử giúp chuyển gen mong
muốn vào tế bào thực vật: T-DNA ñược giới hạn hai ñầu bởi vùng biên (T-
DNA borders), phần còn lại trong vùng biên sẽ không có chức năng gì trong
quá trình chuyển gen. Nhờ vậy, có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA
bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong hai ñầu vùng biên
bằng các gen mong muốn. Khi các oncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực
vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các trường hợp, cho
cây hữu thụ. Quá trình tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây làm
ảnh hưởng ñến năng suất cuối cùng nên trong quá trình thiết kế cũng loại bỏ
các gen tổng hợp opine. Ti-plasmit có kích thước lớn (200 - 800 kb) nên
những ñoạn DNA không cần thiết cũng phải ñược cắt bỏ ñể chèn vào ñoạn
DNA mục tiêu. Ngoài ra, Ti-plasmit không tự tái bản trong E.coli nên cần
ñược bổ sung thêm gốc tái bản của E.coli. Cuối cùng, cần bổ sung các gen chỉ
thị ñể chọn lọc cây và vi khuẩn.
Các phân tử DNA kỹ thuật di truyền này ñược gọi chung là các vector.
Như vậy, cấu trúc của một vector chuyển gen bao gồm:
* Có gốc tái bản (ORI) có nguồn gốc từ vi khuẩn.
* Vùng khởi ñộng (promoter) có nguồn gốc từ thực vật.