Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới của icaritin và β anhydroicaritin trên cơ sở phản ứng mannich và thử hoạt tính sinh học trên một số dòng tế bào ung thư ở người

Mẫu IUH1521

BỘ CÔNG THƯƠNG
ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới của icaritin và βanhydroicaritin trên cơ sở phản ứng Mannich và thử hoạt tính sinh học
trên một số dịng tế bào ung thư ở người
Mã số đề tài: 171.4201
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Văn Sơn
Đơn vị thực hiện: Khoa Công Nghệ – Cơ sở Thanh Hóa

Tp. Hồ Chí Minh, ........…


PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG
1.1. Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới của icaritin và βanhydroicaritin trên cơ sở phản ứng Mannich và thử hoạt tính sinh học trên
một số dòng tế bào ung thư ở người
1.2. Mã số: 171.4201
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT

Họ và tên
(học hàm, học vị)
TS. Nguyễn Văn Sơn

Đơn vị cơng tác

Vai trị thực hiện đề tài

Khoa Công Nghệ – Chủ nhiệm đề tài
Cơ sở Thanh HóaIUH

GS.TS. Wang Qiu An

Viện Hoa học Đại Thành viên
Học Hồ Nam

TS. Lê Đình Vũ

Khoa

cơng

nghệ Thành viên

Hóa-IUH
1.4. Đơn vị chủ trì: Khoa Cơng Nghệ – Cơ sở Thanh Hóa
1.5. Thời gian thực hiện:
1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 04 năm 2017 đến tháng 3 năm 2018
1.5.2. Gia hạn (nếu có):

Khơng

1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng12 năm 2016 đến tháng 12 năm 2017
1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):
(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực
hiện; Nguyên nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)

1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: bốn mươi hai triệu đồng.
PHẦN II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Đặt vấn đề
Flavonoid là những chất chuyển hóa thứ cấp của phenol, được phân bố
rộng rãi khắp trong vương quốc thực vật. Chúng đã được phân lập từ các
lớp thực vật khác nhau và chúng là một lớp các sản phẩm tự nhiên quan
trọng. Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học và các ứng dụng y
1


dược, như hoạt động chống khối u và ngừa ung thư, hoạt tính kháng khuẩn
và kháng virut, chống bệnh tim mạch, hoạt động ức chế enzym, hoạt động
chống gốc tự do và chống oxy hóa, vv.
Prenyl flavonoids là một lớp của flavonoids có trong tự nhiên duy nhất
có đặc trưng bởi sự có mặt của một chuỗi bên prenyl trên bộ khung
flavonoid. Các prenyl flavonoid có thể làm tăng sự liên kết gắn kết với pglycoprotein và tăng khả năng thấm qua màng tế bào, điều này có thể cải
thiện đáng kể hoạt tính sinh học của prenyl flavonoid. Do đó, flavonoids
được thay thế nhóm prenyl hứa hẹn như là hợp chất duy trì để phát triển
các dưỡng chất dinh dưỡng trong thực vật và nó như là các tác nhân dư ợc
lý mới để điều trị các bệnh ở người. Mặt khác, tài nguyên thiên nhiên của
flavonoids và prenylflavonoid bị hạn chế do hàm lượng thấp trong vương
quốc thực vật. Chúng đã ảnh hưởng tiêu cực đến việc đánh giá hoạt tính
sinh học và ứng dụng của chúng. Do đó, tổng hợp hóa học của flavonoid
và prenylflavonoid sẽ là một cách tiếp cận thay thế rất quan trọng để giải
quyết vấn đề về sự sẵn có của nó.
Phản ứng Mannich là một phản ứng hữu cơ bao gồm một alkyl hóa của
một proton có tính axit đặt bên cạnh một nhóm chức cacbony bằng
formaldehyde và amin bậc nhất hoặc bậc hai hoặc amoni. Sản phẩm cuối
cùng là một hợp chất β-amino-cacbonyl còn được gọi là các bazơ Mannich.
Phản ứng giữa amin và cacbonic α-methylen cũng được coi là phản ứng

Mannich bởi vì các amin này tạo thành giữa amin và aldehyd. Phản ứng
này được đặt tên theo nhà hoá học Carl Mannich.
Phản ứng Mannich còn là một phương pháp hiệu quả để tổng hợp các
hợp chất O-amin liên kết nitơ với các hợp chất xeton và các hợp chất
phenol, nó được sử dụng rộng rãi trong q trình tổng hợp các sản phẩm tự
nhiên cũng như các phân tử thuốc hữu cơ. Cấu trúc cơ bản dẫn xuất bazơ
Mannich có chứa nitơ là một nhóm quan trọng của các nhóm hoạt chất
dược học có thể cải thiện hiệu quả hoạt động sinh học, khả dụng sinh học,
và hòa tan trong nước của các hợp chất. Việc tổng hợp dựa trên phản ứng
Mannich tạo ra dẫn xuất thế với các amin trên bộ khung flavonoid có ý
nghĩa rất lớn. Vì vậy, trên cơ sở của phản ứng Mannich có thể thế các
2


amin bậc một và bậc hai vào vị trí 6 trên vịng A của hợp chất icaritin và
β-anhydroicaritin, nó có thể tạo ra một lớp hợp chất thiên nhiên mới có
chứa nitơ mà những nghiên cứu gần đây đã trở nên rõ ràng hơn rằng, hầu
hết các lớp quan trọng của thuốc, đặc biệt là những hợp chất chứa nitơ có
nguồn gốc từ các sản phẩm tự nhiên. Các phản ứng Mannich là một phản
ứng linh hoạt dẫn đến sự kết hợp của các amin thành các phân tử hữu cơ có
chứa nitơ. Mà những nghiên cứu gần đây cho thấy sự hiện diện của nitơ
trong nhiều sản phẩm tự nhiên có thể làm tăng hiệu lực sinh học do số
lượng lớn các lớp phân tử có thể tấn cơng các điện tử vào thành mao mạch
của các tế bào bệnh và nó cũng làm cho dễ bị xạ trị trong điều trị các khối
u. Các hợp chất có chứa nitơ trong loại thuốc này cũng có thể tăng cường
các tính chất hóa lý (ví dụ: độ tan trong nước) và tăng cường khả năng
hoạt tính sinh học so với các hợp chất khơng có chứa nitơ.
Những hợp chất dẫn xuất thế các amin bậc hai vào vị trí 6 trên vòng A
của hợp chất icaritin và β-anhydroicaritin ở Việt Nam và trên thế giới cho
đến nay chưa được nghiên cứu.

Với những ý nghĩa nêu trên ‘’Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới
của icaritin và β-anhydroicaritin trên cơ sở phản ứng Mannich và thử
hoạt tính sinh học trên một số dòng tế bào ung thư ở người’’ là rất quan
trọng và cần thiết nhằm tổng hợp những hợp chất mới và thử các hoạt tính
sinh học trên một số dịng tế bào ung thư ở người từ đó tìm ra những hợp
chất có hoạt tính sinh học tốt giới thiệu chúng như những loại thuốc mới
trong tương lai.
2. Mục tiêu
-Tổng hợp khoảng 15-20 dẫn xuất mới của icaritin và β-anhydroicaritin
trên cơ sở phản ứng Mannich
- Thử hoạt tính sinh học trên một số dòng tế bào ung thư ở người như:
ung thư vú MCF-7, MDA-MB-453s, ung thư tử cung Hela, ung thư biểu
mô HCC1954 và ung thư buồng trứng SK-OV-3..., từ đó tìm kiếm một số
hợp chất mới có hoạt tính sinh học tốt ứng dụng làm thuốc chữa một số
bệnh ung thư trên người trong tương lai.
3


- Viết được một bài báo đăng trên tạp chí chuyên ngành Hóa hữu Cơ hoặc
Hóa dược thuộc hạng ISI/Scopus.
3. Phương pháp nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu tổng quan về tài liệu liên quan tới đề tài
3.2.

Nghiên cứu thực nghiệm

3.2.1. Điều kiện thiết bị và hóa chất
3.2.1.1. Điều kiện thiết bị
Các điểm nóng chảy được xác định bởi thiết bị XRC-1 và không được
điều chỉnh khi đo. Phổ IR được ghi lại trên một quang phổ tensor-27 của

máy quang phổ. Phổ cộng hưởng từ 1 H và

13

C-NMR được ghi lại trên một

quang phổ Bruker-AV400, sử dụng tetrametylsilan làm tiêu chuẩn nội bộ,
sự dịch chuyển hoá học (δ) trong ppm và hằng số liên kết (J) trong Hz
(Hz). Phổ khối lượng (MS) hoặc (HRMS) được xác định bằng phương pháp
EI hoặc ESI với VG Autospec-3000 hoặc Mat 95 XP spectrometer. Lị vi
sóng chiếu xạ được thực hiện với lò phản ứng vi sóng XH-MC-1 (Cơng ty
Phát triển Khoa học và Cơng nghệ Bắc Kinh Xinghu, Trung Quốc).
3.2.1.2. Điều kiện hóa chất
Sắc ký cột được thực hiện trên silica gel (200-300 µm) của Trung
Quốc. Các thuốc thử tinh khiết AR hoặc hóa chất tinh khiết hóa học của
Sigma và dung mơi khan đã được loại bỏ nước bằng cách cất lại.
Icaritin đã được chuẩn bị từ 2,4,6-trihydroxyacetophenone được cung
cấp từ quá trình tổng hợp trong báo cáo trước đây của chúng tôi [76].
Các hóa chất sử dụng trong ni cấy tế bào động vật như môi trường
E’MEM

(Eagle’s

minimum

essential

medium),

MTT

(3 -(4,5-

dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), AO (acridine
orange), EB (ethidium bromide), proteinase K, RNase A, trypsin,
amphotericin B, penicillin, streptomycin được mua từ Sigma (St. Louis,
MO). Huyết thanh được mua từ Biowest (Pháp). Các dụng cụ dùng trong

4


ni cấy tế bào như bình Roux, đĩa ni cấy 24 và 96 giếng được mua từ
Nunc (Roskilde, Đức).
3.2.1.3. Nuôi cấy tế bào
Ni cấy ba dịng tế bào ung thư ở người (HeLa, HCC1954 và SKOV-3) do Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (NCI – Frederick, MD, USA)
cung cấp. Tế bào được ni trong mơi trường E’MEM có bổ sung
Lglutamine (200 mM), HEPES (1M), amphotericin B (0.1%), penicillin streptomycin 200X và 10% (v/v) FBS và ủ ở 37 o C, 5% CO 2 .
3.2.1.4. Phương pháp thực nghiệm
3.2.1.4.1. Tổng hợp β-anhydroicaritin (2).
Hợp chất icaritin (1,5 g, 4,07 mmol) trong axit formic 30 mL đư ợc
khuấy dưới bức xạ bằng vi sóng (600W, 2450 MHz) và b ảo vệ nitơ ở 120
o

C trong 30 phút, sau đó đổ vào nước đá. Chất rắn thu được từ đó được

tinh chế bằng sắc ký cột trên silica gel (ete đầu hỏa/ EtOAc (v/v), 10: 1)
để thu được bột màu vàng 2 (1,3 g, năng suất: 89%).
3.2.1.4.2. Quy trình tổng hợp chung đối với các dẫn xuất bazơ
Mannich của flavonoid 3-20.
Một hỗn hợp formaldehyde (0.22 mmol) và amine b ậc hai (0.22 mmol)

trong 10 mL methanol và 0.02 mL HCl (aq) 15% đư ợc khuấy ở 80 °C cho
đến khi đồng nhất hoàn toàn. Dung dịch thu được đã được đưa từ từ vào
dung dịch (70 mg, 0,19 mmol) icaritin (1) hoặc β-anhydroicaritin (2) trong
methanol, và hỗn hợp phản ứng đã được đun hồi lưu trong 1-3 giờ. Sau khi
hoàn thành, hỗn hợp phản ứng đã được quay chân không để cất dung mơi.
Sau đó thêm nước, pha dung dịch nước được chiết xuất ba lần với EtOAc,
làm khan dich chiết EtOAc bằng Na 2 SO 4 khan. Dung mơi sau đó đã được
loại bỏ dưới áp suất giảm bằng máy quay chân không. Phần cặn thô thu đã
được kết tinh trong EtOAc/ete dầu hỏa thu được các hợp chất 3-20 là các
tinh thể màu vàng với hiệu suất 63-93%.

5


3.2.1.4.3. Thử nghiệm hoạt tính sinh học
Q trình thử hoạt tính sinh học của các hợp chất 1-20 đối với ba dòng
tế bào ung thư của con người (Hela, HCC1954 và SK-OV-3) được đánh giá
bằng phương pháp MTT [93]. Có thể tóm tắt như sau: Lấy 5x10 3 tế bào /
giếng đã được gieo trong 96 giếng trong môi trường tăng trưởng (100 μL)
và ủ ở 37 o C trong 5% khí CO 2 . Sau 24 giờ, mơi trường đã được loại bỏ, và
sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau của hợp chất (100, 25, 6.25,
1.56, 0.39, 0.0976, 0.0244, 0.0061 μM) trong 48 giờ. Sau đó thêm 5%
MTT vào mỗi giếng và ủ ở độ ẩm 95% và 5% khí CO 2 trong khoảng 1-3
giờ. Các lớp phủ đã được loại bỏ và 0,1 mL DMSO đã được thêm vào để
giải quyết lượng dư. Hỗn hợp được rung lên trên máy vi xử lý trong vòng 5
phút và độ hấp thụ được đo tại bước sóng 570 nm bằng quang phổ quang
học với đầu tự dị Microxplated EL×800 (Bio-Rad 680) để xác định nồng
độ giết chết 50% tế bào (IC 5 0 ) [94]. Đường cong đáp ứng liều sẽ thu được
trên máy tính. Các phép đo cùng với các chất có khả năng kiểm sốt tích
cực được thực hiện với cis-Platin và Paclitaxel. Giá trị IC 50 được định

nghĩa là nồng độ gây ức chế 50% tế bào thử nghiệm.
Để ngăn chặn phản ứng màu tiếp tục bằng cách thêm 10 μL 1% Sodium
dodecyl sulfate (SDS) [(hòa tan 0,1 g SDS v ới dung dịch đệm phosphate
buffer (PBS) để tạo thành dung dịch 10 mL)] hoặc thêm 10 μL 0,1 mol / L
acid như axit clohiđric vào.

6


4. Kết quả nghiên cứu
4.1. Tổng hợp β-anhydroicaritin (2)
Hợp chất icaritin (1,5g, 4,07 mmol) trong axit formic 30 mL đư ợc
khuấy dưới bức xạ bằng lị vi sóng (600W, 2450 MHz) và đư ợc bảo vệ
bằng nitơ ở 120 o C trong 30 phút, sau đó đổ vào nước đá. Chất rắn thu
được sau đó được tách bằng sắc ký cột trên silica gel (Ete dầu hỏa/EtOAc,
v/v, 10:1) để thu được bột màu vàng 2 (1,3 g, năng suất: 89%). nhiệt độ
nóng chảy. 221-222 o C (lit [ 9 5] . 223 o C); 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ
11.88 (s, 1H, 5-OH), 7.78 (d, J = 7.9 Hz, 2H, 2’-H and 6’-H), 6.95 (d, J =
7.8 Hz, 2H, 3’-H and 5’-H), 6.20 (s, 1H, 6-H), 3.82 (s, 3H, 4’-OCH 3 ), 2.77
(t, J = 6.2 Hz, 2H, 2’’-H), 1.80 (t, J = 6.3 Hz, 2H, 1’’-H), 1.30 (s, 6H, 4’’CH 3 and 5’’-CH 3 );

13

C- NMR (100 MHz, CDCl 3 ): δ 175.9, 162.0, 160.6,

159.4, 155.8, 154.1, 131.2, 129.8, 122.2, 114.3, 105.2, 100.5, 99.8, 76.1,
55.5, 31.7, 26.6, 16.3; EIMS: m/z 368 [M] + .
4.2. Quy trình thí nghiệm chung tổng hợp đối với các dẫn xuất
Mannich của flavonoid (3-20).
Một hỗn hợp formaldehyt (0.22 mmol) và amin b ậc hai (0.22 mmol)

trong 10 ml methanol và 0.02 mL 15% HCl (aq) đư ợc khuấy ở 80 °C cho
đến khi đồng nhất hoàn toàn. Dung dịch thu được đã được đưa từ từ vào
dung dịch (70 mg, 0,19 mmol) icaritin (1) hoặc β-anhydroicaritin (2) trong
methanol và hỗn hợp phản ứng đã được đun hồi lưu trong 1-3 giờ. Sau khi
hoàn thành, hỗn hợp phản ứng đã được quay chân khơng để chưng cất dung
mơi. Sau đó thêm nước, pha dung dịch được chiết xuất ba lần với EtOAc,
thu pha hữu cơ và làm khan bằng Na 2 SO 4 khan. Sau đó dung mơi đã được
loại bỏ dưới áp suất giảm bằng máy quay chân không. Phần cặn thô đã
được kết tinh trong EtOAc/ete dầu hỏa thu được các hợp chất 3-20 là các
tinh thể màu vàng với hiệu suất 63-93%.

7


OCH3

OCH3
HO

O

O

a

O
OH

OH
OH O

OH O

2

1
b

b

OCH3
OCH3
HO

O

O

O

1 2

R RN

OH

1 2

R RN

OH

OH O

OH O
12-20

3-11
3. NR1R2 = N(CH3)2

8. NR1R2 = N

N H

5. NR1R2 = N(CH2CH2CH3)2

17. NR1R2 = N

N H

1 2

13. NR R = N(CH2CH3)2

1 2

4. NR R = N(CH2CH3)2

12. NR1R2 = N(CH3)2

9. NR1R2 = N

14. NR1R2 = N(CH2CH2CH3)2

18. NR1R2 = N

6. NR1R2 = N[CH(CH3)2]2

10. NR1R2 = N

O

15. NR1R2 = N[CH(CH3)2]2

19. NR1R2 = N

O

7. NR1R2 = N

11. NR1R2 = N

N CH3

16. NR1R2 = N

20. NR1R2 = N

N CH3

Hóa chất và điều kiện phản ứng: (a) HCOOH, lị vi sóng, hồi lưu, 30 phút;
(b) 37% , HCHO, Amin, CH 3 OH, HCl, hồi lưu, 1-3 h.
Sơ đồ 4.1. Tổng hợp các dẫn xuất Mannich của icaritin và βanhydroicaritin
4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học
Table 4.1 Nồng độ chết một nửa [IC 50 (μM)] của các hợp chất 1-20 trên
ba dòng tế bào ung thư ở người.
Hợp chất

Hela

HCC1954

SK-OV-3

1

17.952

8.004

16.042

2

9.803

10.506

26.521

3

16.416

11.758

>100

4

31.902

5.396

34.582

5

23.676

18.344

11.263

6

>100

36.383

10.593

7

14.615

20.142

>100

8

8.179

12.705

4.352

9

>100

15.706

10.581

10

>100

42.706

10.572

8


a

Hợp chất

Hela

HCC1954

SK-OV-3

11

9.752

>100

8.934

12

24.234

9.508

19.620

13

11.350

>100

16.071

14

31.108

>100

42.580

15

>100

12.668

>100

16

7.330

40.557

35.393

17

13.149

8.749

7.714

18

>100

13.421

12.621

19

6.543

>100

>100

20

5.776

22.510

7.835

cis-Platin a

41.252

34.776

21.278

Paclitaxel a

0.040

0.004

0.003

cis-Platin và a Paclitaxel đã được sử dụng như là chất kiểm sốt tích

cực.

9

Hình 3.1: Đường cong đáp ứng liều đối với thử hoạt tính sinh học bằng
phương pháp MTT đối với các hợp chất 19, 20 và cis-Platin trên tế bào
Hela, hợp chất 4 trên dòng tế bào HCC1954 và 8, 20 đối với dòng tế bào
SK-OV-3.
5. Đánh giá các kết quả đã đạt được và kết luận
5.1. Đánh giá các kết quả đã đạt được
Các con đường tổng hợp được thông qua để tổng hợp các dẫn bazơ
Mannich của icaritin và β-anhydroicaritin được minh họa trong sơ đồ 4.1
Icaritin (1) được tổng hợp thông qua một chuỗi phản ứng gồm 8 bước, bắt
đầu từ 2,4,6-trihydroxy acetophenone và 4-hydroxybenzoic acid với năng
suất tổng thể là 23%. Các icaritin khi cho phản ứng trong axit formic dưới
sự hỗ trợ của vi sóng thu được β-anhydroicaritin (2), do phản ứng cycliza
hóa của nhóm prenyl với nhóm OH bên cạnh trong các điều kiện axit chỉ
cho sản phẩm, trong đó tạo thành một Xyclo ete như được mơ tả nó đặc
trưng có thể xác nhận bằng 1 H-NMR ở ba pic với δ (ppm) 1,80 (t, J = 6,3
Hz, 2H) và 2,77 (t, J = 6,2 Hz, 2H).
Phản ứng Mannich được tổng hợp bằng các dẫn xuất của phenol khác
nhau và được sử dụng rộng rãi trong việc tạo thành chuỗi amino alkyl
[96,97]. Các dẫn xuất bazơ Mannich của các hợp chất được tổng hợp bằng
cách phản ứng của icaritin hoặc β-anhydroicaritin với các amin bậc hai
khác

nhau

như:

(dimethylamin,

dietylamin,

dipropylamin,

diisopropylamin, pyrrolidin, piperidin, morpholin, piperzine hoặc N10


methylpiperzin) và formaldehyt. Các điều kiện cổ điển của phản ứng
Mannich đối với các hợp chất của phenol thu được dựa trên chất nền, amin
và tỷ lệ formaldehyt trong rượu với sưởi ấm kéo dài [98-103]. Trong
trường hợp của chúng tôi, icaritin ho ặc β-anhydroicaritin, formaldehyt và
các amin bậc hai lần lượt ở tỷ lệ 1: 1.2: 1.2 và khuấy hồi lưu ở 80 o C trong
1-3 giờ. Chúng tôi đã aminomethyl hóa tại vị trí C-6 của icaritin tạo ra 311 và aminomethyl hóa tại C-6 của β-anhydroicaritin thu được các hợp
chất 12-20.
Nghiên cứu này được bắt đầu với giả thuyết cho rằng việc đưa nitơ vào
một phân tử flavonoid sẽ cải thiện hoạt tính sinh học của phân tử. Do đó
chúng tơi đã khởi xướng nghiên cứu này với sự tổng hợp của một loạt các
dẫn xuất của flavonoid chứa nitơ bằng cách thực hiện phản ứng Mannich
đối với icaritin và β-anhydroicaritin.
Các cấu trúc của các dẫn xuất cơ bản Mannich đã được khẳng định
bằng các phân tích phổ IR, 1 H-NMR,

13

C-NMR, IR và MS. Trong phổ 1 H-

NMR của 3-20 chỉ rõ sự vắng mặt của tín hiệu ở δ (ppm) 6.30 đối với
proton H-6 của hệ vòng icaritin (1) hoặc ở δ 6.17 đối với proton H-6 của
β-anhydroicaritin (2). Trong vịng A, và một tín hiệu ở δ 3.6-4.1 chỉ ra sự
hiện diện của một nhóm amino methyl trên hợp chất icaritin tại C-6 (1)
hoặc β-anhydroicaritin (2).
Tất cả các hợp chất tổng hợp được đánh giá dựa trên khả năng độc tế

bào của chúng đối với ba dòng tế bào ung thư của người (Hela, HCC1954
và SK-OV-3) bằng phương pháp chuẩn MTT. Các kết quả được trình bày
trong Bảng 4.1. Đường cong đáp ứng liều đối với xét nghiệm MTT của các
hợp chất 19, 20 và cis-Platin đối với tế bào Hela, hợp chất 4 trên các tế
bào HCC1954 và 8, 20 đối với sự gia tăng tế bào SK-OV-3 được thể hiện
trong hình 4.1. Nhìn chung, phần lớn các hợp chất dẫn xuất bazơ Mannich
này hiển thị bằng hoặc cao hơn (giá trị thấp hơn IC 5 0 ) hoạt tính gây độc tế
bào hơn thuốc kiểm sốt dương tính cis-platin. Một số hợp chất có giá trị
IC 50 dưới 10 μM.
Đối với dịng tế bào Hela, trong loạt các dẫn xuất bazơ Mannich của
icaritin, dữ liệu của chúng tơi cho thấy rằng nhóm piperazinyl hoặc (411


metylpiperazin-1-yl) methyl trong hợp chất 8 hoặc 11 cho thấy hoạt tính
mạnh nhất so với hợp chất gốc icaritin, hợp chất 8 và 11 với (IC 5 0 8.1799.752 μM) mạnh hơn icaritin (1) hai lần (IC 5 0 17.952 μM). Trong loạt các
dẫn xuất bazơ Mannich của β-anhydroicaritin, dữ liệu của chúng tơi cho
thấy nhóm (4-metylpiperazin-1-yl) methyl cho thấy hoạt tính mạnh hơn so
với hợp chất gốc β-anhydroicaritin (2), hợp chất 20 với (IC 50 5,776 μM )
mạnh hơn hai lần β-anhydroicaritin (2) có (IC50 9.803 μM).
Trong trường hợp dòng tế bào HCC1954, hợp chất 4, 12 và 17 có hoạt
tính ức chế mạnh nhất có giá trị IC 5 0 dưới 10 μM, đối với chuỗi dẫn xuất
bazơ Mannnich của icaritin, sự thay thế của (dietylamino) metyl (ở hợp
chất 4) cho thấy hoạt tính cao hơn với giá trị IC 5 0 là 5.396 μM so với hợp
chất cha mẹ icaritin (1) (IC 5 0 8.004 μM). Đối với chuỗi dẫn xuất bazơ
Mannich của β-anhydroicaritin, dữ liệu của chúng tơi cho thấy khi thế
nhóm (dimethylamino) metyl hoặc (piperazinyl) metyl có hoạt tính cao
nhất có giá trị IC 50 là 9.508 hoặc 8.749 μM so với hợp chất gốc βanhydroicaritin (2) (IC 50 10.508 μM).
Trong trường hợp dòng tế bào SK-OV-3, các hợp chất 8, 11, 17 và 20
là những chất hoạt động mạnh nhất có giá trị IC 5 0 dưới 10 μM, đối với các
dẫn xuất bazơ Mannich 5, 6 và 8-11 đã biểu hiện hoạt tính cao hơn với

IC 50 4.352-11.263 μM so với hợp chất cha mẹ icaritin (1) (IC 50 16.042
μM). Đối với chuỗi dẫn xuất bazơ Mannich của β-anhydroicaritin, 12, 13,
17, 18 và 20 cho thấy hoạt tính cao hơn (IC 50 7.714-19.620 μM) so với hợp
chất gốc β-anhydroicaritin (2) (IC 50 26.521 μM).
Từ q trình thử hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất 3 và 7 có độc
tính chọn lọc đối với dòng tế bào Hela và HCC1954, các h ợp chất 6, 9, 10
và 18 cho thấy có độc tính chọn lọc đối với dòng tế bào HCC1954 và SKOV-3, và các hợp chất 11, 13 và 14 cho thấy gây độc tế bào có chọn lọc
đối với dịng tế bào Hela và tế bào SK-OV-3. Hợp chất 15, đặc trưng với
nhóm diisopropylamino methyl, cho th ấy có độc tính ức chế chống lại
dòng tế bào HCC1954, hợp chất 19, khi thế nhóm (morpholinyl)methyl,
cho thấy các ức chế chọn lọc đối với tế bào Hela, và không ảnh hưởng đến
sự gia tăng của hai tế bào khác ở mức tối đa nồng độ thử nghiệm (100 μM.
12


Q trình thử hoạt tính sinh học cho thấy các hợp chất 15 và 19 có thể làm
thuốc chống ung thư tiềm năng và chọn lọc, nó xứng đáng phát triển hơn
nữa.
5.2. Kết Luận
Quá trình nghiên cứu đề tài này chúng tôi đã thu được những kết quả
sau:
1. Đã tổng hợp được sản phẩm tự nhiên β-anhydroicaritin (2) xuất phát từ
incaritin (1) bằng sự hỗ trợ vi sóng trong axit formic với năng suất 89%.
2. Dựa trên phản ứng Mannich của các hợp chất flavonoids (1) và (2), đã
tổng hợp được 18 chất dẫn xuất bazơ Mannich mới là: 3-11 và 12-20. Tất
cả các hợp chất đã được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ IR,
phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H,

13

C-NMR và phổ MS.

3. Hơn nữa, qua q trình thử hoạt tính sinh học trên ba dòng tế bào ung
thư ở người (Hela, HCC1954 và SK-OV-3) bằng phương pháp chuẩn MTT.
Các kết quả cho thấy hầu hết các dẫn xuất bazơ Mannich của flavonoid
hiển thị bằng hoặc cao hơn (giá trị IC 5 0 ) về hoạt động gây độc tế bào so
với thuốc kiểm soát tích cực cis-platin. Trong đó một số hợp chất có giá trị
IC 50 dưới 10 μM như: Các hợp chất 20,19,16,8 và 2 gây độc tế bào Hela ở
các nồng độ IC 5 0 tương ứng 5.776, 6.543, 7.330, 8.179 và 9.803 µM, các
hợp chất 4,7,12 gây độc tế bào HCC1954 ở các nồng độ IC 5 0 tương ứng
5.396, 8.749 và 9.508 µM, các h ợp chất 8, 20 và 11 gây độc tế bào SKOV-3 ở các nồng độ IC 50 tương ứng 4.352, 7.714 và 8.934 µM.
4. Trong đó đáng chú ý là hợp chất 15 và hợp chất 19 cho thấy độc tính
chọn lọc đối với dòng tế bào HCC1954 và dòng tế bào Hela, chúng có thể
làm các thuốc chống ung thư tiềm năng và nó xứng đáng được phát triển
hơn nữa.
6.Tóm tắt kết quả (Tiếng anh và tiếng việt)
6.1. Tóm tắt bằng tiếng việt
Sản phẩm tự nhiên β-anhydroicaritin (2) được tổng hợp từ incaritin (1)
bằng sự hỗ trợ vi sóng trong axit formic. Dựa trên phản ứng Mannich của 1
13


và 2, hai loạt 18 chất flavonoid mới của các dẫn xuất bazơ Mannich của
các hợp chất 3-11 và 12-20 đã được tổng hợp. Hơn nữa, các hoạt động
chống lại sự gia tăng chống lại ba dòng tế bào ung thư ở người (Hela,
HCC1954 và SK-OV-3) đã được đánh giá bằng phương pháp chuẩn MTT.
Kết quả cho thấy hầu hết các dẫn xuất bazơ Mannich của flavonoids đều có
giá trị bằng hoặc thấp hơn (giá trị thấp hơn IC 5 0 ) so với thuốc kiểm sốt
dương tính cis-platin. Một số hợp chất có giá trị IC 5 0 dưới 10 μM. Hợp
chất 15 và hợp chất 19 cho thấy có khả năng gây độc tính tế bào chọn lọc

đối với dòng tế bào HCC1954 và dòng tế bào Hela, chúng có thể là các
thuốc chống ung thư tiềm năng trong tương lai và xứng đáng phát triển
hơn nữa.
Từ khóa: Icaritin; β-anhydroicaritin; Các dẫn xuất bazơ Mannich; Tổng
hợp; Hoạt tính sinh học.
6.2. Tóm tắt bằng tiếng anh
The natural product β-anhydroicaritin (2) was synthesized from
incaritin (1) by microwave assistance in formic acid. Based on Mannich
reaction of 1 and 2, two series eighteen new flavonoids Mannich base
derivatives 3-11 and 12-20 were synthesized. Furthermore, their antiproliferative activities against three human cancer cell lines (Hela,
HCC1954 and SK-OV-3) were evaluated by the standard MTT method. The
results showed that most of these flavonoid Mannich base derivatives
displayed equal or higher (lower IC 5 0 values) cytotoxic activities than the
positive control drug cis-Platin. Some compounds possess the IC 50 value
below 10 μM. Compound 15 and compound 19 showed selective
cytotoxicity against HCC1954 cell lines and Hela cell lines respectively,
they are potential and selective anticancer agent and worthy of further
development.
Keywords:

Icaritin;

β-anhydroicaritin;

Synthesis; Cytotoxic activity

14

Mannich

base

derivatives;


III. Sản phẩm đề tài, công bố và kết quả đào tạo
3.1. Kết quả nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3)
Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu
kinh tế - kỹ thuật

TT Tên sản phẩm

Đăng ký
1

Bài

báo

khoa

thuộc

học Bài báo khoa học Một bài báo SCIE
hạng thuộc

ISI/Scopus
2

Tài

Đạt được

liệu

hạng

ISI/Scopus
phục

vụ Bài

giảng dạy (bài giảng)

giảng

trong Bài

giảng

trong

môn

môn tổng hợp Hữu tổng hợp Hữu cơ trong
cơ

trong

chương chương trình KOSEN

trình KOSEN
…

3.2. Kết quả đào tạo
Thời gian
Tên đề tài
Đã
thực hiện đề tài Tên chuyên đề nếu là NCS
vệ
Tên luận văn nếu là Cao học
Nghiên cứu sinh

TT Họ và tên

Học viên cao học
Sinh viên Đại học

15

bảo


IV. Tình hình sử dụng kinh phí
Kinh
T
T

phí

được
Nội dung chi

duyệt
(triệu
đồng)

Kinh

phí

thực hiện

Ghi

(triệu

chú

đồng)

A

Chi phí trực tiếp

42.000.000

42.859.000

1

Th khốn chun mơn

6.000.000

6.395.000

2

Ngun, nhiên vật liệu, cây con…

19.000.000

19.000.000

3

Thiết bị, dụng cụ

2.700.000

3.992.000

4

Cơng tác phí

5

Dịch vụ th ngồi

12.300.000

12.000.000

6

Hội nghị, hội thảo,thù lao nghiệm thu giữa

1.500.000

kỳ
7

In ấn, Văn phòng phẩm

1.000.000

8

Chi phí khác

1.000.000

B

Chi phí gián tiếp

1
2

Quản lý phí
Chi phí điện, nước
Tổng số

42.000.000

42.851.000

V. Kiến nghị ( về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài)

Quá trình nghiên cứu đề tài này chúng tơi mới chỉ thử nghiệm hoạt tính
sinh học trên ba dòng tế bào ung thư người: Hela, HCC1954 và SK-OV-3
còn nhiều dòng tế bào ung thư khác chưa thử nghiệm nên đề tài có thể tiếp
tục thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các dịng tế bào bệnh khác nhằm tìm
kiếm những hoạt tính sinh học mới.
Đề tài có thể tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học của các
hợp chất có hoạt tính sinh học tốt (có giá trị IC 5 0 ˂ 10 µM) như: hoạt tính
sinh học và độc tính trên động vật sống.
16


VI. Phụ lục ( liệt kê minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)
Tp. HCM, ngày

tháng........ năm .......

Chủ nhiệm đề tài

Phòng QLKH&HTQT

TS. Nguyễn Văn Sơn

17

(ĐƠN VỊ)
Trưởng (đơn vị)
(Họ tên, chữ ký)


PHẦN II. BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Mục Lục
Trang
Danh sách các ký hiệu và chữ viết tắt .................................................. 20
MỞ ĐẦU ............................................................................................... 22
1. Lý do chọn đề tài .............................................................................. 22
2. Mục tiêu đề tài ............................................................................ 23
1.1.

Tổng quan về Flavonoids ....................................................... 25
1.1.1. Cấu trúc của flavonoid và các sản phẩm tự nhiên liên quan26
1.1.2.Hoạt tính dược lý của flavonoid……………………………27

1.2. Prenyl flavonoids ..................................................................... 28
1.3.

Tổng hợp flavonoid .............................................................. 29

1.4. Phản ứng Mannich .................................................................... 33

1.5. Vài nét về các dòng tế bào thử nghiệm ................................... 35
1.5.1. Dòng tế bào Hela............................................................. 36
1.5.2. Dòng tế bào SK-OV-3 (dòng tế bào ung thư buồng trứng ở
người) ....................................................................................... 37
1.5.3. Dòng tế bào HCC1954 (dòng tế bào ung thư vú) ........... 38
1.6. Phương pháp thử hoạt tính sinh học ...................................... 39
Chương 2: THỰC NGHIỆM ................................................................... 40
2.1. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất .................................................... 40
2.1.1. Dụng Cụ và thiết bị ......................................................... 40
2.1.2. Hóa chất.......................................................................... 40
2.2. Phương pháp thực nghiệm ......................................................... 41
2.2.1. Điều kiện thiết bị và hóa chất .......................................... 42
2.2.1.1.Điều kiện thiết bị .......................................................... 42
2.2.3. Phương pháp thực nghiệm ...................................................... 43
2.2.3.1. Tổng hợp β-anhydroicaritin (2). ................................. 44
2.2.3.2. Quy trình tổng hợp chung đối với các dẫn xuất bazơ
Mannich của flavonoid 3-20. .................................................... 44
2.2.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học ............................................... 44
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 45
3.1. Tổng hợp β-anhydroicaritin (2) .............................................. 46
18


3.2. Quy trình thí nghiệm chung tổng hợp đối với các dẫn xuất
Mannich của flavonoid (3-20). ......................................................... 46
3.3. Các dự liệu cấu trúc của các hợp chất dẫn xuất bazơ Mannich
của icaritin và β-anhydroicaritin (3-20) ........................................ 47
3.4. Kết quả thử hoạt tính sinh học .................................................. 52
3.5. Thảo luận ................................................................................. 53
KẾT LUẬN ............................................................................................ 58

Tài Liệu Tham Khảo .............................................................................. 59
Publication ............................................................................................ 69
PHỤ LỤC BỔ SUNG ............................................................................. 70
Một Số Phổ Của Các Hợp Chất Đã Tổng Hợp ................................... 71

19


Danh sách các ký hiệu và chữ viết tắt
SAR
µL, mL, L, µM
pH
Min
%
MS
s, d, t, q, b, m
IR
C NMR
H NMR
HRMS
ESI-MS
EI-MS
Hz
Mp
Δ
Ppm
DMSO
CDCl 3
IC 50
PMS

NADH
Ar
Hela
SK-OV-3
HCC1954

Structure-Activity Relationship
Mối quan hệ cấu trúc hoạt động
Microliter, milliliter, liter, micromole
Potential of Hydrogen
Thang đo độ axít
Minute
Phút
Percent
Phần trăm
Mas spectrometry
Phổ khối lượng
Singlet, doublet, triplet, quartet, broad,
multiplet
Infrared spectroscopy
Phổ hồng ngoại
Carbon Nuclear Magnetic Resonance
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon
Proton Nuclear Magnetic Resonance
Phổ cộng hưởng từ hật nhân hydro
High-resolution mass spectrometry
Phổ khối phân giải cao
Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Quang phổ khối lượng ion hóa điện tử
Electron ionized mass spectrometry

Phổ khối electron ion hóa
Hertz
Hàng số độ chuyển dịch
Melting points
Nhiệt độ nóng chảy
Shifts
Sự thay đổi
Parts per million
Phần triệu
Dimethylsulfoxyd
Chloroform
Half maximal inhibitory concentration
Nồng độ lớn nhất ức chế 1/2
Phenazine methosulphate
Nicotinamide adenine dinucleotide
Aryl
Vòng thơm
Human cervical cancer
Ung thư cổ tử cung ở người
Human Ovarian Cancer Cell
Ung thư buồng trứng người
20


MCF-7
MDA-MB-453

HL-60
LLC
A549 cells

E’MEM
MTT
AO
EB

Human breast carcinoma cell lines
Dòng tế bào ung thư vú của con người
Human breast cancer
Ung thư vú ở người
Androgen-responsive
human
breast
carcinoma cell line
Dòng Androgen-responsive ung thư vú ở
người
Human acute promyelonic leukemia
Ung thư máu ở người
Lewis lung carcinoma
Ung thư phổi
Adenocarcinomic human alveolar basal
epithelial cells
Tế bào biểu mô tế bào ung thư trực tràng của
người

Eagle’s minimum essential medium
Môi trường tối thiểu cần thiết của Eagle
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide
Acridine orange
Ethidium bromide

21


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Flavonoid là những chất chuyển hóa thứ cấp của phenol, được phân bố
rộng rãi khắp trong vương quốc thực vật. Chúng đã được phân lập từ các
lớp thực vật khác nhau và chúng là một lớp các sản phẩm tự nhiên quan
trọng. Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học và các ứng dụng y
dược, như hoạt động chống khối u và ngừa ung thư, hoạt tính kháng khuẩn
và kháng virut, chống bệnh tim mạch, hoạt động ức chế enzym, hoạt động
chống gốc tự do và chống oxy hóa, vv.
Prenyl flavonoids là một lớp của flavonoids có trong tự nhiên duy nhất
có đặc trưng bởi sự có mặt của một chuỗi bên prenyl trên bộ khung
flavonoid. Các prenyl flavonoid có thể làm tăng sự liên kết gắn kết với pglycoprotein và tăng khả năng thấm qua màng tế bào, điều này có thể cải
thiện đáng kể hoạt tính sinh học của prenyl flavonoid. Do đó, flavonoids
được thay thế nhóm prenyl hứa hẹn như là hợp chất duy trì để phát triển
các dưỡng chất dinh dưỡng trong thực vật và nó như là các tác nhân dược
lý mới để điều trị các bệnh ở người. Mặt khác, tài nguyên thiên nhiên của
flavonoids và prenylflavonoid bị hạn chế do hàm lượng thấp trong vương
quốc thực vật. Chúng đã ảnh hưởng tiêu cực đến việc đánh giá hoạt tính
sinh học và ứng dụng của chúng. Do đó, tổng hợp hóa học của flavonoid
và prenylflavonoid sẽ là một cách tiếp cận thay thế rất quan trọng để giải
quyết vấn đề về sự sẵn có của nó.
Phản ứng Mannich là một phản ứng hữu cơ bao gồm một alkyl hóa của
một proton có tính axit đặt bên cạnh một nhóm chức cacbony bằng
formaldehyde và amin bậc nhất hoặc bậc hai hoặc amoni. Sản phẩm cuối
cùng là một hợp chất β-amino-cacbonyl còn được gọi là các bazơ Mannich.

Phản ứng giữa amin và cacbonic α-methylen cũng được coi là phản ứng
Mannich bởi vì các amin này tạo thành giữa amin và aldehyd. Phản ứng
này được đặt tên theo nhà hoá học Carl Mannich.

22


Phản ứng Mannich còn là một phương pháp hiệu quả để tổng hợp các
hợp chất O-amin liên kết nitơ với các hợp chất xeton và các hợp chất
phenol, nó được sử dụng rộng rãi trong quá trình tổng hợp các sản phẩm tự
nhiên cũng như các phân tử thuốc hữu cơ. Cấu trúc cơ bản dẫn xuất bazơ
Mannich có chứa nitơ là một nhóm quan trọng của các nhóm hoạt chất
dược học có thể cải thiện hiệu quả hoạt động sinh học, khả dụng sinh học,
và hòa tan trong nước của các hợp chất. Việc tổng hợp dựa trên phản ứng
Mannich tạo ra dẫn xuất thế với các amin trên bộ khung flavonoid có ý
nghĩa rất lớn. Vì vậy, trên cơ sở của phản ứng Mannich có thể thế các amin
bậc một và bậc hai vào vị trí 6 trên vịng A của hợp chất icaritin và βanhydroicaritin, nó có thể tạo ra một lớp hợp chất thiên nhiên mới có chứa
nitơ mà những nghiên cứu gần đây đã trở nên rõ ràng hơn rằng, hầu hết các
lớp quan trọng của thuốc, đặc biệt là những hợp chất chứa nitơ có nguồn
gốc từ các sản phẩm tự nhiên. Các phản ứng Mannich là một phản ứng linh
hoạt dẫn đến sự kết hợp của các amin thành các phân tử hữu cơ có chứa
nitơ. Mà những nghiên cứu gần đây cho thấy sự hiện diện của nitơ trong
nhiều sản phẩm tự nhiên có thể làm tăng hiệu lực sinh học do số lượng lớn
các lớp phân tử có thể tấn cơng các điện tử vào thành mao mạch của các tế
bào bệnh và nó cũng làm cho dễ bị xạ trị trong điều trị các khối u. Các hợp
chất có chứa nitơ trong loại thuốc này cũng có thể tăng cường các tính
chất hóa lý (ví dụ: độ tan trong nước) và tăng cường khả năng hoạt tính
sinh học so với các hợp chất khơng có chứa nitơ.
Những hợp chất dẫn xuất thế các amin bậc hai vào vị trí 6 trên vòng A
của hợp chất icaritin và β-anhydroicaritin ở Việt Nam và trên thế giới cho

đến nay chưa được nghiên cứu.
Với những ý nghĩa nêu trên ‘’Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới
của icaritin và β-anhydroicaritin trên cơ sở phản ứng Mannich và thử
hoạt tính sinh học trên một số dòng tế bào ung thư ở người’’ là rất quan
trọng và cần thiết nhằm tổng hợp những hợp chất mới và thử các hoạt tính
sinh học trên một số dịng tế bào ung thư ở người từ đó tìm ra những hợp
chất có hoạt tính sinh học tốt giới thiệu chúng như những loại thuốc mới
trong tương lai.
23


2. Mục tiêu đề tài
- Tổng hợp khoảng 15-20 dẫn xuất mới của icaritin và β-anhydroicaritin
trên cơ sở phản ứng Mannich
- Thử hoạt tính sinh học trên một số dịng tế bào ung thư ở người như:
ung thư vú MCF-7, MDA-MB-453s, ung thư tử cung Hela, ung thư biểu
mô HCC1954 và ung thư buồng trứng SK-OV-3..., từ đó tìm kiếm một số
hợp chất mới có hoạt tính sinh học tốt ứng dụng làm thuốc chữa một số
bệnh ung thư trên người trong tương lai.
- Viết được một bài báo đăng trên tạp chí chun ngành Hóa hữu Cơ
hoặc Hóa dược thuộc hạng ISI/Scopus.

24