Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang nano pamam dendrimer ứng dụng trong mang thuốc chống ung thư

BỘ CÔNG THƢƠNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG NANO
PAMAM DENDRIMER ỨNG DỤNG TRONG MANG
THUỐC CHỐNG UNG THƢ
Mã số: 112014

Chủ nhiệm đề tài: ThS.Nguyễn Thị Trâm Châu

TP. HỒ CHÍ MINH, 10/2015


BỘ CÔNG THƢƠNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG NANO
PAMAM DENDRIMER ỨNG DỤNG TRONG MANG
THUỐC CHỐNG UNG THƢ
Mã số: 112014

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

TP. HỒ CHÍ MINH, 10/2015


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

Đơn vị công tác và
Nội dung nghiên cứu
lĩnh vực chuyên môn
cụ thể đƣợc giao
ThS.NCS
Nguyễn - Trƣờng ĐHCN TPHCM, Chủ nhiệm đề tài
Thị Trâm Châu
CSQN.
- Tổng hợp hữu cơ.
PGS.TS Nguyễn Cửu - Viện Hàn lâm Khoa học và Hƣớng dẫn và tƣ vấn
Khoa
Công nghệ VN.
Họ và tên

- Vật liệu hóa dƣợc.
TS. Trần Ngọc Quyển - Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ VN.
Hƣớng dẫn và tƣ vấn
- Vật liệu hóa dƣợc.

Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. Bảng số liệu PAMAM dendrimer các thế hệ .................................................... 164
Bảng 2. Trọng lƣợng phân tử dựa trên 1H-NMR của PAMAM thế hệ -0.5, 2.0, 3.0 và
4.0 .......................................................................................................................................... 253
Bảng 3. Khối lƣợng phân tử của PEG, PAMAM G4 và G4-PEG ............................... 286
Bảng 4. Dữ liệu xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn ................................................... 308
Bảng 5. Kết quả lƣợng 5-Fu đƣợc mang trong G4-PEG-5-FU ..................................... 319


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Cấu tạo dendrimer ......................................................................................................2
Hình 2. Cấu trúc của PAMAM dendrimer ............................................................................3
Hình 3. Cấu trúc dendrimer các thế hệ ..................................................................................3
Hình 4. Sơ đồ tổng hợp PAMAM dendrimer các thế hệ ................................................ 153
Hình 5. Quy trình tổng hợp PAMAM G 0.5 .................................................................... 175
Hình 6. Quy trình tổng hợp PAMAM G 2.0 .................................................................... 186
Hình 7. Quy trình tổng hợp PAMAM G 3.0 .................................................................... 197
Hình 8. Quy trình tổng hợp PAMAM G4.0 ..................................................................... 208
Hình 9: Sơ đồ tổng hợp NPC-PEG-NPC (a), NPC-PEG-TA (b), PAMAM G4-PEG (c)
............................................................................................................................................... 219
Hình 10. Cơ chế mang thuốc trong cấu trúc PAMAM G4-PEG ..................................... 20

Hình 11. Minh họa PAMAM G4 với một số ghi chú proton đặc trƣng trong mỗi thế hệ
............................................................................................................................................... 231
Hình 12. Phổ 1 H-NMR của PAMAM dendrimer thế hệ G-0.5, G2.0, G3.0, G4.0 ..... 242
Hình 13. Kết quả 1H NMR của NPC-PEG-NPC (a) và NPC-PEG-TA (b) ................. 264
Hình 14. Kết quả FT-IR của PAMAM G4 (a) và G4-PEG (b) ..................................... 275
Hình 15. Kết quả 1H NMR của PAMAM G4 (a) và G4-PEG (b)................................. 286
Hình 16. Kết quả GPC của G4-PEG ................................................................................. 297
Hình 17. Hình ảnh TEM của PAMAM G4 (a), PAMAM G4-PEG (b) ....................... 297
Hình 18: Biểu đồ đƣờng chuẩn của 5-FU ........................................................................ 308
Hình 19: Biểu đồ sắc ký của 5-FU không đƣợc mang trong G4-PEG ......................... 308


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................................1
1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ
TÀI Ở TRO N G VÀ N GO ÀI NƢ ỚC ..............................................................................2
1.1. Giới thiệu đề tài.................................................................................................................2
1.2.Tình hình nghiên cứu biến tính PAMAM dendrimer nhằm giảm độc tính ................6
1.3. Tình hình nghiên cứu tăng cƣờng hiệu quả mang thuốc củar hệ PAMAM
dendrimer biến tính với PEG ............................................ Error! Bookmark not defined.
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI ......................................................................................................... 12
3. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ...................................................................................................................... 12
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu.................................................................................................... 12
3.2. Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................................... 12
3.3. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu................................................................. 13

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU............................................................................................ 14
4.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 142
4.2. Tổng hợp PAMAM các thế hệ từ G= -0.5 đến G= 4............................................... 153
4.3. Tổng hợp PAMAM G4-PEG ..................................................................................... 208
4.4. Ứng dụng nanocarrier PAMAM G4-PEG mang thuốc điều trị ung thƣ 5-FU ...... 20
5. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẠT ĐƢỢC .......................................................... 231
5.1. Kết quả phổ 1 H-NMR của PAMAM dendrimer các thế hệ .................................... 231
5.2. Kết quả phổ 1 H-NMR của NPC-PEG-NPC và NPC-PEG-TA .............................. 253
5.3. Kết quả của PAMAM G4 và PAMAM G4-PEG..................................................... 264
5.4. Kết quả mang thuốc 5-FU của G4-PEG ................................................................... 297
KẾT LUẬN .......................................................................................................................... 319
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................................1


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DMF

Dimethylformamide

EDA

Ethylenediamine

5-FU

5-Fluorouracil

GPC

Gel permeation chromatography

HPLC

High pressure liquid chromatography

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance

H-NMR

NPC

p-Nitrophenyl chloroformate

PAMAM

Polyamidoamine

PEG

Polyethylene glycol

TEM

Transition electron microscopy

THF

Tetrahydrofuran


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG
1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp hệ chất mang nano PAMAM dendrimer ứng
dụng trong mang thuốc chống ung thƣ.
- Mã số: 112014
- Chủ nhiệm đề tài: NCS.ThS.Nguyễn Thị Trâm Châu
Điện thoại: 0905.628 268

Email:

- Đơn vị quản lý về chuyên môn (Khoa, Tổ bộ mơn):
Khoa:

Cơng nghệ - Cơ sở Quảng Ngãi

Tổ bộ mơn:

Hóa – Môi trƣờng

- Thời gian thực hiện: 9 tháng
2. Mục tiêu:
Tổng hợp PAMAM G4, từ đó biến tính PAMAM G4 bằng polyethylene glycol
(PEG), làm chất mang thuốc chống ung thƣ 5-FU.
3. Nội dung chính:
(1) Tổng hợp PAMAM dendrimer các thế hệ từ G= -0.5 đến G= 4
(2) Xác định thành phần cấu trúc các PAMAM dendrimer
(3) Biến tính PAMAM G4 bằng polyethylene glycol (PEG).
(4) Xác định thành phần cấu trúc PAMAM G4-PEG.
4. Kết quả chính đạt đƣợc (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ...)
5. Sản phẩm khoa học: 2 bài báo khoa học
Bài báo quốc tế:
[1] Thi Bich Tram Nguyena, Thi Tram Chau Nguyenb, Hoang Chinh Tranc, Cuu
Khoa Nguyenc & Ngoc Quyen Tranc* (2015) 1H NMR Spectroscopy as an Effective
Method for Predicting Molecular Weight of Polyaminoamine Dendrimers and their
Derivatives, tạp chí quốc tế (SCIE) International Journal of Polymer Analysis and
Characterization, Taylor & Francis Group, No.20, pp.57-68, 2015, DOI:
10.1080/1023666X.2014.955632.
Bài báo trong nƣớc:
[2] Nguyễn Thị Trâm Châu* , Trần Ngọc Quyển**, Nguyễn Cửu Khoa**, Trần
Hữu Thái***, Bùi Văn Công***, Nguyễn Quang Thắng*** , Lê Thanh Lịch*** , Tôn Nữ Tố
Nhi*** , Trần Quang Tuệ *** (2015) Tổng hợp vật liệu nanocarrier mang thuốc 5Fluorouracil (5-FU) hiệu quả, Tạp chí Đại học Công Nghiệp, TP.HCM (đã đƣợc
duyệt đăng 4/2015);


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con ngƣời đã khơng ngừng
nghiên cứu để tìm ra những vật liệu mới nhằm phục vụ cho nhu cầu của cuộc sống.
Công nghệ nano ra đời đã đáp ứng đƣợc nhu cầu cấp thiết này. Trong những năm gần
đây, các nanopolymer đƣợc nghiên cứu rộng rãi về phía ứng dụng y sinh. Dendrimer là
một trong những nanopolymer đƣợc nghiên cứu nhiều nhất với cấu trúc hình cầu có
nhiều khoảng trống bên trong đƣợc ứng dụng làm chất mang thuốc, protein và phân
phối gen. Hiện nay có rất nhiều quốc gia, các trƣờng đại học, các trung tâm nghiên
cứu, công ty dƣợc phẩm đang đầu tƣ kinh phí nghiên cứu tổng hợp dendrimer để ứng
dụng nó trong y học và đời sống.
Với cấu trúc đặc biệt, cho phép dendrimer trở thành phƣơng tiện hiệu quả để
vận chuyển vật liệu y sinh. Ngày càng có nhiều loại thuốc đang đƣợc phát triển phải
đối mặt với các vấn đề về độ hòa tan, tác dụng sinh học và độ hấp thụ kém. Nhiều báo
cáo chỉ ra rằng việc đóng gói các loại thuốc điều trị ung thƣ vào các nanocarrier đã
nâng cao đáng kể độ tan trong nƣớc và độ ổn định việc lƣu trữ thuốc, giúp tăng cƣờng
hoạt động chống khối u và giảm tác dụng phụ của thuốc. PAMAM dendrimer là một
trong những nanocarrier có thể làm việc nhƣ một cơng cụ hữu ích cho việc phân phối
các loại thuốc, cũng nhƣ liệu pháp gen và hóa trị.
Tuy nhiên, có một vài nhƣợc điểm đi kèm với PAMAM dendrimer đó là gây ra
độc tính tan trong máu và ly giải tế bào do tƣơng tác mạnh mẽ của các nhóm -NH2 ở
bên ngồi PAMAM dendrimer mang điện tích dƣơng với các màng tế bào mang điện
tích âm dẫn đến sự phá vỡ màng tế bào, gây độc cho tế bào, đồng nghĩa với hiệu quả
điều trị chƣa cao[12-13, 23, 27]. Để giải quyết vấn đề này, trên bề mặt dendrimer đƣợc
thay các nhóm -NH2 bằng các nhóm -OH của polyethylene glycol đã hoạt hóa, làm
ngăn chặn sự tiếp xúc giữa các nhóm -NH2 với màng tế bào, giúp giảm độc tính tạo ra
khả năng tƣơng tác sinh học cao của chất mang, từ đó nâng cao hiệu quả mang thuốc
và điều trị [7, 24-25].

Trang 1

Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NG HIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA
ĐỀ TÀI Ở TRONG VÀ NG OÀI NƢỚC
1.1. Giới thiệu đề tài
1.1.1. Dendrimer là gì?
Dendrimer bắt nguồn từ tiếng Hylạp “dendron”, có nghĩa là nhánh cây. Phân tử
đƣợc tạo ra bằng cách thêm tiếp các đơn vị nhánh tỏa ra ngoài từ điểm khởi đầu. Nếu
phân tử dendrimer đủ lớn thì có dạng hình cầu, kích cỡ từ 1-10 nm. Gần đây nhất là
Polymer Dendrimer đƣợc tìm thấy các tính chất đặc biệt nhƣ: có khối lƣợng phân tử
cao, có tính chất của nhánh khác rất nhiều so với các polymer mạch thẳng. Polymer
dendrimers tổng hợp có khả năng phân nhánh cao, phân tử gần nhƣ đối xứng về cấu
trúc.
1.1.2. Cấu tạo dendrimer
Dendrimer đƣợc cấu tạo gồm 3 phần: phần lõi (ethylene diamine (EDA),
diaminobutyl (DAB), polyamidoamine (PAMAM), polypropylimine (PPI)), các nhánh
phát ra từ lõi tạo thành một vòng tròn đồng tâm, và nhóm chức ngồi cùng (amine,
carboxyl, rƣợu). Dendrimer có nhiều dạng khác nhau, mỗi dạng có những đặc tính sinh
học khác nhau, nên sự phân bố sinh học cũng khác nhau.

Hình 1. Cấu tạo dendrimer

1.1.3. Polyamidoamine (PAMAM) dendrimer
PAMAM dendrimer đƣợc tạo ra từ core ethylenediamine (EDA) và phát triển
nhánh bằng methylacrylate và ethylenediamine.

Trang 2

Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

Hình 2. Cấu trúc của PAMAM dendrimer
 Dendrimer các thế hệ:

Hình 3. Cấu trúc dendrimer các thế hệ
=> Là đối tượng nghiên cứu hấp dẫn chuyển tải các tác nhân hóa học trị liệu
vào tiếp xúc với khối u, điều trị đúng nơi có khối u, đồng thời kiểm sốt đƣợc thời gian
phóng thích thuốc, nhằm mục tiêu giảm tác dụng phụ không mong muốn và tăng
cƣờng hiệu quả điều trị.
1.1.4. Những khó khăn trong hóa trị liệu điều trị ung thƣ
Ung thƣ là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới.
Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới thì tốc độ tăng trƣởng bệnh ung thƣ đang đến
mức báo động toàn cầu. Cho đến nay, đã có nhiều phƣơng pháp điều trị ung thƣ đƣợc
phát triển và đạt đƣợc những thành công nhất định, giúp bệnh nhân ung thƣ kéo dài
thêm thời gian sống. Ngày nay, có rất nhiều các loại thuốc chống ung thƣ đã đƣợc
nghiên cứu và đƣa vào điều trị cho các bệnh nhân. Tuy nhiên, các loại thuốc chống
Trang 3


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

ung thƣ rất độc với cả tế bào bệnh lẫn tế bào lành. Hầu hết các thuốc chống ung thƣ
đều có tác dụng phụ cho ngƣời bệnh, có độ hịa tan kém và khó tồn trữ.
Độc tính của các thuốc trị ung thƣ

Tác dụng của các thuốc chữa ung thƣ không đặc hiệu. Các thuốc chữa ung thƣ
có tác dụng độc, ngăn cản sự phân bào của các tế bào ung thƣ, nhƣng đồng thời cũng
gây độc với cả tế bào lành. Hơn nữa, hầu hết thuốc trị ung thƣ có hệ số trị liệu thấp
(khoảng cách giữa liều điều trị và liều gây độc tính nhỏ), chúng có thể gây ảnh hƣởng
cho tế bào ngay ở liều điều trị, đó là điều làm giới hạn trị liệu.
Các mô tăng sinh nhanh nhƣ tủy xƣơng, tế bào sinh sản, niêm mạc, da, nang
tóc, và đặc biệt là bào thai,… là các nơi thƣờng biểu thị độc tính của thuốc trị ung thƣ.
Do độc tính cao nên việc sử dụng hóa trị liệu chữa ung thƣ là hạn chế. Các biểu hiện
độc thƣờng gặp là:
 Rối loạn tiêu hóa, buồn nơn và nơn, viêm loét niêm mạc, táo bón, tiêu chảy.
 Rối loạn chức năng gan, tổn thƣơng ống thận.
 Rụng tóc, ban đỏ, viêm loét da.
 Với tủy xƣơng, hầu hết các thuốc chữa ung thƣ đều làm suy yếu chức năng của
tủy xƣơng, hạn chế sự tạo ra hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, gây ra thiếu máu;
do đó dễ bị xuất huyết và dễ bị nhiễm khuẩn. Cần kiểm tra máu thƣờng xuyên
để điều chỉnh liều dùng hoặc ngừng thuốc.
 Với hệ nội tiết, thuốc có ảnh hƣởng xấu đến buồng trứng và tinh hồn, dẫn đến
vơ sinh.
 Với trẻ em, thuốc làm chậm sự tăng trƣởng và phát triển.
 Ung thƣ thứ phát: do dùng thuốc lại phát sinh ra các ung thƣ mới, xảy ra sau
nhiều tháng hoặc nhiều năm.
 Gây tổn thƣơng mạch máu và đau khi truyền thuốc đƣờng tĩnh mạch, có thể bị
ngay khi tiêm hoặc sau khi điều trị một thời gian.
 Sút cân, ngƣời yếu, khơng cịn khả năng làm việc.
 Đã thấy thuốc gây quái thai trên động vật thí nghiệm. Vì vậy những ngƣời đã
dùng thuốc chữa ung thƣ thì khơng nên có con nữa.
Những tác dụng phụ này gây sự sợ hãi và lo lắng thƣờng xuyên, thậm chí gây
rối loạn về tính cách, hành vi của bệnh nhân.
Sự kháng thuốc của tế bào ung thƣ
Trang 4

Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

Các tế bào ung thƣ có thể kháng lại các thuốc chữa ung thƣ cũng nhƣ các vi
khuẩn kháng lại các thuốc hóa trị liệu kháng khuẩn.
Cơ chế tế bào ung thƣ kháng thuốc gồm:
 Làm giảm sự thâm nhập của thuốc vào các tổ chức ung thƣ.
 Làm giảm sự tích lũy của thuốc, thải trừ thuốc ra khỏi tế bào ung thƣ bằng các
“bơm” P - glycoprotein trên màng tế bào.
 Làm giảm hoạt tính của thuốc bằng cách chuyển hóa các phân tử thuốc.
 Làm biến đổi protein mục tiêu và các yếu tố cần để thuốc tác động lên tế bào
ung thƣ.
 Tăng cƣờng sửa chữa DNA sai hỏng do tác động của thuốc.
 Tăng tổng hợp protein để vẫn đảm bảo cho việc phân chia tế bào mặc dù bị
thuốc tác động.
Sự kháng thuốc có thể đặc hiệu cho một loại thuốc nhất định nhƣng cũng nhƣ
sự kháng kháng sinh, các tế bào ung thƣ cũng có hiện tƣợng kháng thuốc chéo.
 Hiệu quả điều trị thấp
Do phần lớn thuốc trị ung thƣ ít tan trong nƣớc nên khả năng hấp thu thuốc vào
cơ thể qua đƣờng uống kém. Lƣợng thuốc đi vào tuần hoàn chung ở dạng cịn hoạt tính
thấp. Tiêm truyền là một phƣơng pháp tốt hơn, bảo đảm đƣợc lƣợng thuốc xâm nhập
vào tuần hoàn chung. Tuy nhiên, tiêm truyền trong thời gian dài gây đau và tổn thƣơng
mạch máu cho bệnh nhân.
Khi thuốc vào đƣợc tuần hồn chung thì chỉ một phần nhỏ lƣợng thuốc đến
đƣợc đích tác dụng, phần cịn lại phân bố vào các cơ quan khác hoặc bị chuyển hóa tại
gan hay bị thải trừ ở thận dẫn đến nồng độ thuốc tại cơ quan đích rất thấp, khơng phát
huy đƣợc tác dụng.

Ví dụ: đối với 5-FU, khi tiêm tĩnh mạch, nửa đời thải trừ trung bình khỏi huyết
tƣơng khoảng 16 phút (từ 8 đến 20 phút). Khơng cịn thấy thuốc ở dạng nguyên vẹn
trong huyết tƣơng sau khi tiêm tĩnh mạch đƣợc 3 h. 7-20% thuốc thải trừ ở dạng không
biến đổi qua nƣớc tiểu sau 6 h, trong số này tới hơn 90% thải trừ ngay giờ đầu. Phần
cịn lại chuyển hóa phân giải ở gan tạo ra các chất (carbon dioxide, urea,
alpha-fluoro-beta-alanine) khơng có hoạt tính. Các chất này cũng bài xuất qua nƣớc
tiểu sau 3-4 h. Trong lƣợng thuốc 5-FU xâm nhập đƣợc vào các tế bào ung thƣ thì
cũng chỉ có khoảng 20% đi theo con đƣờng đồng hóa và phát huy tác dụng. Khoảng
Trang 5


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

trên 80% bị dị hóa bởi dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) trở thành dạng bất
hoạt tính và nhanh chóng bị đào thải.
Do vậy để đạt đƣợc nồng độ thuốc có tác dụng tại đích, nếu theo cách thông
thƣờng, chúng ta phải đƣa vào cơ thể một lƣợng thuốc nhiều hơn. Nhƣng việc tăng liều
lƣợng bị giới hạn bởi liều độc cũng nhƣ các tác dụng phụ và nhiều điều bất lợi khác.
Do đó, để tăng tốc độ sinh hóa và giảm sự đề kháng thuốc thì khoảng cách giữa các
liều dùng thuốc bắt buộc phải rút ngắn. Điều này càng gây ra sự bất tiện cho bệnh nhân
trong quá trình điều trị ung thƣ và tăng chi phí điều trị.
1.1.5. Tìm hiểu về kích thƣớc mô tế bào và hệ chất mang
- Tại hầu hết các mơ khỏe mạnh, kích thƣớc các khe hở lớp nội mô thành mạch
máu thƣờng nhỏ hơn 2 nanomet (nm - là đơn vị đo bằng 1 phần tỉ mét). Các khe hở
này quá nhỏ so với kích thƣớc của hầu hết các chất mang nano.
- Cịn tại mơ ung thƣ, có sự phát triển của tế bào ung thƣ đòi hỏi sự tăng sinh
mạch máu, các vi mạch máu mới đƣợc hình thành tại các mơ ung thƣ và có kích thƣớc
lên đến vài trăm nanomet.

- Do đó, với kích thƣớc dendrimer nhỏ hơn 10nm, khi biến tính với một số
polymer tƣơng hợp sinh học sẽ nhỏ hơn 50nm, nên khả năng khuếch tán của chất
mang thuốc đến vùng mô tập trung các tế bào ung thƣ nhanh và khá dễ dàng.
- Mặt khác, với kích thƣớc nói trên, chất mang thuốc này còn tải đƣợc hầu hết
các loại thuốc đang điều trị nhiều loại ung thƣ hiện nay.
1.2. Tình hình nghiên cứu biến tính PAMAM dendrimer nhằm giảm độc tính
Dendrimer đƣợc Donald A. Tomalia và cộng sự tổng hợp lần đầu tiên vào những
năm 1980 . Nó là những polymer đa nhánh, từ tâm (lõi) ở giữa ngƣời ta phát triển các
nhánh dần ra bên ngoài. PAMAM đƣợc tổng hợp từ ethylenediamine, methylacrylate.
Sau 5 năm, năm 1985 khái niệm dendrimer đƣợc Donald A. Tomalia và cộng sự
đƣa ra đầu tiên [33].
Năm 1985, George R. Newkon, chuyên gia hoá học và trung tâm ở trƣờng Đại
Học South Floride đã xuất bản bài báo về dendrimer, ông tổng hợp dendrimer từ
polyamidoalcol. [22]
Trong những năm tám mƣơi ngƣời ta đã tổng hợp dendrimer và xác định đƣợc tính
Trang 6


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

chất vật lí và hóa học của nó [34-35].
Năm 1999, Khoa Hóa học, đại học Califonia, Mỹ đã nghiên cứu thiết kế
dendrimer ứng dụng làm tác nhân mang thuốc, mang gen, và tác nhân hình ảnh trong
cộng hƣởng từ hạt nhân. Và theo hƣớng nghiên cứu này, nhiều nhà khoa học tiếp tục
đi sâu và phát triển hơn nữa. [21]
Năm 2000, Malik và cộng sự đã phát hiện ra các dendrimer PAMAM cationic có
nhóm bên ngồi là NH2 là ngun nhân gây huyết giải và đầu độc tế bào [20]. Do bề
mặt tế bào mang điện tích âm nên khi gặp những dendrimer mang điện tích dƣơng này

sẽ có sự tƣơng tác với nhau làm phá vỡ màng tế bào, dẫn đến sự tiêu hủy tế bào [1516].
Năm 2003, D. Bhadra và các đồng nghiệp đã tiến hành lai hóa MPEG 5000 với
PAMAM core EDA thế hệ G4.0. Kết quả xác định độ độc trên chuột của nhóm nghiên
cứu cho thấy PAMAM khơng lai hóa có hiện tƣợng gây độc máu và tế bào, số lƣợng
hồng cầu giảm xuống 10 6-2  106/L và số lƣợng bạch cầu tăng lên đến 3  10 3-4 
10 3/l; cịn PAMAM lai hóa MPEG có độc tính giảm đi, số lƣợng bạch cầu tăng chỉ từ
10 3-1,5  10 3/L. Các nghiên cứu in vivo trên các loại dendrimer khác cũng cho thấy
PEG hóa làm giảm độc tính rất nhiều. Trên các con chuột nghiên cứu, liều độc của
melamine dendrimer đối với gan chỉ là ≥10 mg/kg, trong khi đó liều độc của
dendrimer lai hóa 50% PEG trên bề mặt lên đến 1 g/kg [8].
Năm 2005, Viện công nghệ nano Michigan về sinh học và thuốc, Mỹ đã nghiên
cứu động lực học phân phối thuốc của dendrimer đã biến tính nhằm làm tăng độ tan
trong nƣớc và giảm độc tính của thuốc điều trị [6].
Một loạt các báo cáo của nhóm nghiên cứu Thommey P. Thomas và James R.
Baker Jr từ năm 2004 đến 2010 về các hợp chất mang thuốc chữa trị ung thƣ hƣớng
mục tiêu đến các tế bào ung thƣ dựa trên cơ sở dendrimer PAMAM G5 với các kháng
thể đơn dòng (kháng thể anti-PSMA, kháng thể Anti-HER2). Những tổ hợp này nhắm
mục tiêu đến các dòng tế bào ung thƣ vú, ung thƣ tuyến tiền liệt, … và có độc tính tế
bào thấp hơn so với thuốc chống ung thƣ tự do methotrexate [6, 28-32].
Một số cơng trình nghiên cứu khác của nƣớc ngoài đã chỉ ra rằng các loại thuốc
chống ung thƣ (Camptothecin, 6-Mercaptopurin, Methotrexate, Adriamycin, 5Fluorouracil, Doxorubicin và Paclitaxel) khi đƣợc bao bọc trong dendrimer PAMAM
làm tăng đáng kể độ tan, khả năng lƣu trữ, và hoạt tính chống ung thƣ của thuốc.
Trang 7


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

Tại Việt Nam, bắt đầu từ năm 2007, nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Nguyễn Cửu

Khoa, Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng-Viện Khoa học Cơng nghệ thành phố Hồ Chí
Minh đƣợc xem là đơn vị đầu tiên nghiên cứu tổng hợp dendrimer với nhiều dạng khác
nhau [1-2, 4-5].
Từ năm 2010 đến 2013, nhóm tác giả Nguyễn Cửu Khoa cũng cho thấy
dendrimer ở thế hệ chẵn (với các nhóm amine trên bề mặt) có độc tính với tế bào ( in
vitro) cao hơn so với dendrimer thế hệ lẻ (với các nhóm chức ester trên bề mặt) [3, 19,
23]. Điều này có thể giải thích bởi nhóm amine tích điện dƣơng nên có thể tạo liên kết
tốt hơn với màng tế bào (tích điện âm) và gây độc cho tế bào bởi điện tích dƣơng trên
bề mặt của chúng [26]
Đối với dendrimer, những đặc tính sinh học nhƣ độc tố hay tính sinh miễn dịch
chịu sự ảnh hƣởng lớn của kích thƣớc và các nhóm chức bên ngồi. Độc tính giảm dần
đối với các nhóm chức bên ngồi theo thứ tự nhƣ sau:
NH3+> Guanidin+ >SO32- >PO32- >COO->PEG
Muốn làm giảm độ độc của dendrimer có thể biến tính các nhóm chức bề mặt với
các tác nhân ít độc hại hơn. Trong đó việc gắn nhóm PEG, pluronic, acetyl, ancolhol
mạch dài, acid mạch dài,… vừa có tác dụng giảm độ độc của dendrimer vừa kéo dài
thêm bán chu kỳ tuần hoàn trong máu (blood halflives) và giảm sự tích lũy trong cơ
thể.
1.3. Tình hình nghiên cứu tăng cƣờng hiệu quả mang thuốc của hệ PAMAM
dendrimer biến tính với PEG
Nhƣ đã đề cập ở trên, mục đích đầu tiên của việc PEG hóa là giảm tính sinh miễn
dịch của chất mang PAMAM. Ngồi ra, với tính chất đặc biệt của PEG là vừa có khả
năng tan tốt trong nƣớc vừa có thể tan đƣợc trong dầu nên khi PEG kết hợp với
PAMAM sẽ tăng khả năng hydrate hóa trên bề mặt, tạo thuận lợi cho việc dẫn các thuốc
kỵ nƣớc trong cơ thể [17].
Năm 2000, Chie Kojima và cộng sự đã tổng hợp PAMAM ở thế hệ 3.0 và 4.0
gắn kết với MPEG khối lƣợng phân tử 550 và 2000. Sau đó, nhóm nghiên cứu đã sử
dụng sản phẩm PAMAM-MPEG nang hóa và khảo sát sự giải phóng thuốc của hai loại
thuốc trị ung thƣ có tính ái dầu là adriamycin (ADR), methotrexate (MTX). Kết quả là
sản phẩm PAMAM 4.0 kết hợp với MPEG 2000 sẽ mang đƣợc 6,5% ADR và 26%

Trang 8


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

MTX. Thuốc MTX đƣợc nang hóa trong PAMAM-MPEG đƣợc phóng thích ra một
cách từ từ trong dung dịch nƣớc [16].

Hình 4. Sự kết hợp của PEG - PAMAM với adriamycin, methotrexate
Không những vậy, một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng việc lai hóa PEG cịn
kéo dài thời gian lƣu của dendrimer trong tuần hồn máu. Dendrimer khơng lai hóa
nhanh chóng bị thải trừ khỏi máu và tập trung ở các cơ quan nhƣ gan hay thận chỉ sau
vài phút hay vài giờ. Theo nghiên cứu của Kukowska - Latallo, PAMAM G5.0 đánh
dấu tritium đƣợc cơ thể nhanh chóng đào thải qua đƣờng thận chỉ trong 24 h sau khi
tiêm. Trong một nghiên cứu khác, PAMAM đƣợc đánh dấu với đồng vị

125

I và tiêm

thử nghiệm vào chuột Wistar, sau 1h chỉ còn khoảng 1% lƣợng PAMAM lƣu lại trong
máu và hơn 60% lƣợng PAMAM đã tập trung tại gan.
Nhƣng khi lai hóa với PEG, thời gian lƣu trong tuần hồn chung đƣợc tăng lên
đến 24h, dendrimer chủ yếu đƣợc phân bố trong máu hơn là ở các cơ quan khác, nhờ
đó kéo dài thời gian bán thải và giảm độ thanh thải của thuốc.
Cũng trong nghiên cứu của nhóm Bhadra năm 2003 [8], thuốc chống ung thƣ
5-fluorouracil đƣợc lần lƣợt nang hóa trong chất mang PAMAM G4.0 khơng lai hóa

và lai hóa 25% bề mặt với PEG 5000. Kết quả khảo sát in vitro cho thấy so với
PAMAM khơng lai hóa, PAMAM lai hóa có khả năng mang lƣợng thuốc gấp đến 12
lần và tốc độ giải phóng thuốc giảm đi 6 lần, thời gian phóng thích thuốc hồn tồn
kéo dài đến 6 ngày. Nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành so sánh in vivo trên chuột và
kết quả cũng tƣơng tự. Khi khơng PEG hóa, nồng độ cực đại của thuốc trong huyết
tƣơng cao, thời gian đạt nồng độ cực đại nhanh (Cmax =21-23 g/mL, tmax =3 h) và kết
quả là thời gian lƣu của thuốc trong tuần hoàn thấp (6-7 h). Cịn khi PEG hóa, nồng độ
Cmax giảm đi chỉ còn khoảng 1/3, thời gian đạt đƣợc chậm hơn t max =7 h, mang lại hiệu
quả kéo dài thời gian thuốc tồn tại trong huyết tƣơng, lên đến 12 h.
Trang 9


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

Hình 5. Mơ hình PAMAM-MPEG mang thuốc 5-Fluorouracil
Năm 2008, Shuhua Bai và

cộng sự tiếp tục tổng hợp PAMAM-MPEG với

MPEG khối lƣợng phân tử 2000 và PAMAM ở thế hệ G3.0. Sau khi tổng hợp thành
cơng PAMAM-MPEG, nhóm nghiên cứu đã tiến hành nang hóa PAMAM-MPEG với
thuốc chống đơng máu Heparin (LMWH). Nhờ nang hóa trong cấu trúc PAMAMMPEG mà độ hấp thu qua đƣờng hô hấp và sinh khả dụng của LMWH tăng 60,6% so
với LMWH tiêm dƣới da bình thƣờng. Thời gian bán thải của thuốc đƣợc nang hóa là
11,9 h; tăng gấp 2,4 lần so với LMWH trong saline thông thƣờng. Đáng chú ý là hiệu
quả phóng thích thuốc từ từ của MPEG - PAMAM cho phép giãn khoảng cách giữa
hai lần dùng thuốc lên gấp đôi, 48 h, mà vẫn bảo đảm hiệu quả nhƣ LMWH thông
thƣờng tiêm cách quãng 24 h trong việc giảm kích thƣớc huyết khối in vivo trên chuộ t
[28].

Cũng theo một nghiên cứu của nhóm G. Pasut trên PAMAM G3.0 năm 2005,
hiệu quả của sự lai hóa PEG lại rất ít hoặc hầu nhƣ khơng chịu ảnh hƣởng của mức độ
lai hóa [37]. Từ kết quả này, nhóm nghiên cứu đã đƣa ra giả thuyết là các phân tử
thuốc sẽ đƣợc nang hóa chủ yếu trong cấu trúc của dendrimer hơn là bị nhốt trong các
chuỗi PEG.
Năm 2009 và 2010, hiệu quả mang và giải phóng thuốc của sự lai hóa PEG cũng
đƣợc khẳng định trong kết quả của một số nghiên cứu khác của Arunvel Kailasan và
cộng sự [14], Chie Kojima và cộng sự [9].
Năm 2011, nhóm tác giả Dan Liu và cộng sự đã tổng hợp một copolymer nhạy
pH mang thuốc Doxorubicin thử nghiệm trên tế bào ung thƣ gan của chuột. Cấu tạo
của copolymer dựa trên tƣơng tác tĩnh điện giữa PAMAM mang thuốc Doxorubicin
(Dox) và poly(methacryloyl sulfadimethoxine) (PSD) nhạy pH. Trên PSD này đƣợc
gắn với PEG (Polyethylene glycol) để tăng tính tƣơng hợp sinh học và một dẫn xuất
của lactose để định hƣớng đến tế bào gan [10].
Trang 10


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

Năm 2011, Zhu S và cộng sự đã tổng hợp thành công hệ mang thuốc dendrimer
trên cơ sở polyester với chất tƣơng hợp sinh học PEG thông qua liên kết amide và
thuốc doxorubicin thông qua cầu nối hydrazone giữa Glu đƣợc gắn trên bề mặt
dendrimer và doxorubicin (hình 1.31). [36]

Hình 6. Cấu trúc hóa học của PEG-Dendrimer gắn với doxorubicin thơng
qua mối nối hydrazone [36]
Năm 2013, nhóm tác giả P. Dinesh Kumar và cộng sự

thực hiện biến tính

PAMAM G4 (G5) bằng MPEG. Trong đó MPEG cũng đƣợc hoạt hóa bằng NPC và cho
mang thuốc HIV, nhóm tác giả kiểm tra khả năng giải phóng thuốc in vitro của
PAMAM chƣa biến tính và đã biến tính trong mơi trƣờng đệm PBS. Kết quả cho thấy
PAMAM khi đƣợc biến tính bằng MPEG cho hiệu quả mang thuốc cao, giải phóng
thuốc chậm (hình 1.32) và giảm khả năng gây độc tế bào so với PAMAM khi chƣa biến
tính [11].
Gần đây nhất năm 2015, Luis F. Barraza và cộng sự cũng chỉ dừng lại ở mức độ
biến tính PAMAM G4 bằng PEG mang thuốc 5-FU. Trong đó, PEG đƣợc hoạt hóa
trƣớc qua một bƣớc NPC bằng hình thức khống chế tỷ lệ 1:1, điều này dễ dẫn đến khả
năng PEG bị hoạt hóa cả hai đầu bằng NPC và kết quả có thể PEG liên kết cả 2 đầu
vào PAMAM, tạo lớp màng bao phủ bề mặt PAMAM và ngăn cản một phần thuốc
không đi vào khoảng trống trong cấu trúc PAMAM. Nhóm tác giả đã thực hiện bƣớc
khảo sát ảnh hƣởng hiệu quả liên kết PEG 25%-100% lên PAMAM G4 đến hình thức
lƣu trữ thuốc. Kết quả chỉ ra rằng, hiệu quả biến tính PAMAM G4 bằng PEG đạt trên
50% thì khả năng thuốc 5-FU đƣợc mang vào sâu bên trong cấu trúc PAMAM là thấp,
Trang 11


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

thuốc 5-FU chủ yếu tập trung phía gần bên ngồi bề mặt PAMAM, cịn đối với hiệu
quả biến tính PAMAM G4 bằng PEG đạt khoảng 25% thì lƣợng thuốc 5-FU đƣợc
mang vào sâu bên trong cấu trúc PAMAM G4 và kèm theo sự hỗ trợ của các nhóm
PEG có hiện tƣợng gập chuỗi lại giúp khả năng lƣu trữ thuốc hiệu quả hơn [18].
Nhìn chung trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu về biến tính
dendrimer PAMAM bằng polymer tƣơng hợp sinh học. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên

cứu đều sử dụng phƣơng pháp hoạt hóa PEG bằng NPC và không chế bằng tỷ lệ mol
1:1 (PEG : NPC) và dều có sử dụng xúc tác hay dung mơi trong quá trình phản ứng.
Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là dễ xảy ra khả năng PEG bị hoạt hóa cả hai đầu
bằng NPC và kết quả có thể PEG liên kết cả 2 đầu vào PAMAM, tạo lớp màng bao
phủ bề mặt PAMAM và ngăn cản một phần thuốc không đi vào khoảng trống trong
cấu trúc PAMAM. Vì vậy trong cơng trình nghiên cứu này, chúng tơi tập trung biến
tính dendrimer PAMAM G4 bằng đã hoạt hóa bởi NPC và TA nhằm tăng cƣờng khả
năng liên hợp và tồn trữ thuốc của hệ chất mang nano PAMAM-PEG.
2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Tổng hợp PAMAM G4, từ đó biến tính PAMAM G4 bằng PEG (polyethylene
glycol), làm chất mang thuốc hiệu quả.
3. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI NGHIÊN CỨU, CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu: PAMAM G4.0
3.2. Phạm vi nghiên cứu
(1) Tổng hợp PAMAM dendrimer đến G= 4.0
(2) Tổng hợp hệ chất mang PAMAM G4-PEG.
(3) Ứng dụng mang thuốc 5-Fluorouracil (5-FU).

Trang 12


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

3.3. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Cách tiếp cận
Các thế hệ dendrimer sẽ đƣợc tổng hợp tại Việt Nam dựa theo quy trình nhƣ
báo cáo của Tomalia và kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Cửu Khoa, TS.

Trần Ngọc Quyển.
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu trên, trong nội dung nghiên cứu của đề tài này,
tôi sẽ tổng hợp vật liệu nanocarrier PAMAM G4-PEG mang thuốc 5-Fluorouracil (5FU) hiệu quả.
3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
(1) Phương pháp tổng hợp
Tổng hợp các PAMAM đến thế hệ G4.0 và nanocarrier PAMAM G4-PEG bằng
phƣơng pháp tổng hợp hữu cơ.
(2) Phương pháp tinh sạch và kiểm tra sản phẩm
- Các chất sau khi tổng hợp đƣợc làm sạch bằng phƣơng pháp cô đuổi dung môi
sử dụng thiết bị cô quay chân không, thẩm tách bằng túi thẩm tách Spectra Por
Regenerated Cellulose Membrane.
- Kiểm tra cấu trúc hóa học các sản phẩm thu đƣợc bằng các phƣơng pháp phổ
hiện đại nhƣ: 1H-NMR, FT-IR, GPC.
- Kiểm tra cấu trúc hình học và kích thƣớc sản phẩm thu đƣợc bằng phƣơng
pháp TEM.
(3) Phương pháp đánh khả năng mang thuốc
- Phƣơng pháp HPLC để xác định lƣợng 5-FU mang trên hệ nanocarrier
PAMAM G4-PEG.

Trang 13


Đề tài cấp trƣờng 2014

ThS. Nguyễn Thị Trâm Châu

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
4.1. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
4.1.1. Hóa chất

4.1.2. Thiết bị và dụng cụ
- Phổ hồng ngoại FT-IR đƣợc đo trên máy IR- Vector 22 BRUKER (Đức).
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân NMR đo trên máy Bruker AM 500 FT-NMR
spectrometer.
- Trọng lƣợng phân tử đƣợc đo bằng phƣơng pháp sắc ký gel (GPC) trên máy
Agilent 1100.
- HPLC đo trên máy Agilent 1200-GPC.
- TEM đƣợc chụp trên máy Gieon-1400 (JEOL, Tokyo, Nhật Bản).
- Máy đông khô
- Máy khuấy từ gia nhiệt hiệu Thermo Scientific
Trang 14