BÀI GIẢNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT doc

1









BÀI GIẢNG
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT












2




MỤC LỤC

Bài 1. Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật 2
Bài 2. Phương pháp khử trùng mô thực vật 8
Bài 3. Khử trùng nuôi cấy chồi ngủ cúc và hạt cam 12
Bài 4. Vi nhân giống dứa bằng nuôi cấy chồi ngủ 15
Bài 5. Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo ở thực vật 20
Bài 6. Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo 25
Bài 7. Phương pháp tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 30
Bài 8. Phương pháp vi ghép ở thực vật 34
Bài 9. Phương pháp thuần hoá cây ra vườn ươm 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
3

BÀI I

PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
1 - NGUYÊN TẮC
1.1 - Nguyên tắc pha chế môi trường
Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi sinh là
có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hoá chất với hàm lượng rất
nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc),
người ta không cân hoá chất mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng nhiều
loại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước
vô khoáng khi sử dụng. Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock). Dung dịch mẹ
được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Thông thường pha các
dung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinh
trưởng, và các stock cần thiết khác.
1.2 - Phân loại môi trường nuôi cấy mô thực vật
Tùy theo thành phần các chất có trong môi trường, có thể phân thành 3 loại môi
trường:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: như môi trường White, Knop. Môi trường này
thích hợp vào các giai đoạn cuối của quy trình nuôi cấy mô thực vật khi chuẩn bị chuyển
cây từ ống nghiệm ra vườn ươm. Môi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng có thể sử dụng
trong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến dưỡng của mô thực vật.
- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: môi trường B5, Gamborg.
Loại môi trường này được sử dụng đối với một số loại cây có nhu cầu các chất dinh
dưỡng trong môi trường vừa phải hoặc cũng có thể sử dụng khi nuôi cấy mô thực vật dài
ngày.
- Môi trường giàu chất dinh dường: môi trường MS (Murashige – Skoog). Đây là
môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy. Môi
trường MS là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân bằng về chất
dinh dưỡng.
2 - NGUYÊN LIỆU - HOÁ CHẤT - DỤNG CỤ
2.1 - Hoá chất
- Saccharose (sucrose)
- Agar
- NH
4
NO
3

- KNO
3

- MgSO
4
.7H
2
O
- KH

2
PO
4

- CaCl
2
.5H
2
O
4

- KI
- Na
2
MoO
4
.2H
2
O
- CoCl
2
.6H
2
O
- H
3
PO
3

- MnSO

4
.4H
2
O
- ZnSO
4
.7H
2
O
- CuSO
4
.5H
2
O
- Thiamine HCl
- Myo-inositol
- Glycine
- NAA
- BA (6-Benzyl aminopurin)
- Na
2
-Ethylen diamin tetraacetat (Na
2
EDTA
-Fe
2
(SO
4
)
3

2.2 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Bình định mức: 100 ml cái 10
2 - Bình định mức: 500 ml cái 3
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Bình màu 200 ml cái 5
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Bể ổn nhiệt cái 1 Dùng để pha Fe-EDTA
9 - Cốc 100 ml cái 30
10 - Cốc 200 ml cái 15
11 - Pipett: 1 ml cái 15
12 - Pipett: 5 ml cái 15
13 - Pipett: 10 ml cái 15
14 - Bình định mức 250 ml cái 15
15 - Ống nghiệm Þ 25 ống 100
16 - Bông mỡ g 200
17 - Bình màu: 1000 ml cái 2 Bảo quản các stock
5


3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH
Học sinh chia nhóm thực hành pha chế các dung dịch mẹ (stock) của môi trường
MS (Murashige – Skoog) như sau: dung dịch mẹ khoáng đa lượng (Skoog I), dung dịch

mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung dịch mẹ khoáng vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chất
điều hoà sinh trưởng
4 - THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MÔI TRƯỜNG MS
(Murashige – Skoog)
4.1. Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20)
Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khoáng đa lượng. Dùng ống đong, đong
khoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lượt các muối đa lượng vào
theo trình tự nhất định sau:

Tên hoá chất
Nồng độ môi trường
nuôi cấy (mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x20) (mg/lít)

- MgSO
4
.7H
2
O 370 7.400
- KH
2
PO
4
170 3.400
- KNO
3
1.900 38.000
- NH
4

NO
3
1.650 33.000
- CaCl
2
.2H
2
O 440 8.800
Mỗi lần cho một loại khoáng vào phải khuấy tan hoàn toàn và bổ sung thêm
100 ml nước cất hai lần trước khi bổ sung các khoáng khác vào (phương pháp pha thể
tích tăng dần). Do CaCl
2
.2H
2
O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO
4
.7H
2
O nên hai chất
này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl
2
.2H
2
O vào sau cùng.
Cho tất cả vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000
ml. Như vậy ta có 1000 ml dung dịch mẹ khoáng đa lượng đậm đặc 20 lần. Dung dịch
này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10
oC
, dùng 50 ml cho một
1000 ml môi trường nuôi cấy.

4.2. Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000)
Do hàm lượng một số loại khoáng vi lượng trong stock khoáng vi lượng rất
nhỏ, khó có thể cân đong chính xác như một số các khoáng vi lượng khác. Vì vậy ở đây,
ta phải tiến hành pha riêng dung dịch các khoáng này (CuSO
4
.5H
2
O, CoCl
2
.6H
2
O) có
nồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “bà ngoại”.
Sau khi pha song các dung dịch “bà ngoại”, tiến hành pha 100 ml stock
khoáng vi lượng X1000 tương tự như ở phần trên. Thành phần các khoáng như sau:

Tên hoá chất
Nồng độ môi
trường nuôi cấy
(mg/lít)
Nồng độ dung dịch
stock (x1000)
(mg/lít)
Nồng độ dung dịch
“bà ngoại “(x100)
(mg/lít)
H
3
PO
3

6,2 6200
MnSO
4
.4H
2
O 22,3 22300
ZnSO
4
.4H
2
O 8,6 8600
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 250
6

KI 0,83 830
CuSO
4
.5H
2
O 0,025 25 2500
CoCl
2
.6H
2

O 0,025 25 2500
4.3. Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần (x200)
Sắt là yếu tố rất cần thiết cho thực vật. Tuy nhiên, nhu cầu của thực vật đối
với sắt rất nhỏ và lượng liên tục. Vì vậy, để cung cấp đủ lượng sắt cho thực vật ta thường
dùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA. Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm
Fe của EDTA dưới tác dụng của nhiệt độ. Ở dưới dạng hợp chất này, sắt sẽ được phóng
thích ra môi trường tuỳ theo nhu cầu của thực vật. Phương pháp pha như sau:

Tên hoá chất
Nồng độ môi trường
nuôi cấy (mg/lít)
Nồng độ dung dịch stock
(x200) (mg/lít)
FeSO
4
.7H
2
O 27,8 5560
Na
2
EDTA 37,3 7460
Chuẩn bị hai becher 500 và 1000 ml. Cho vào mỗi becher 400 ml nước cất
hai lần. Đun nóng hai becher trong bể ổn nhiệt khoảng 80
oC
. Cân chính xác 5,56 g
FeSO
4
.7H
2
O cho vào becher 500 ml có 400 ml nước trên, khuấy tan hoàn toàn. Cân chính

xác 7,46 g Na
2
EDTA cho vào becher 1000 ml trên, khuấy tan hoàn toàn.
Cho từ từ dung dịch FeSO
4
.7H
2
O vào dung dịch Na
2
EDTA, vừa đổ vừa
khuấy đều. Cuối cùng bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Như vậy, ta có 1000 ml dung dịch
stock Fe-EDTA đậm đặc 200 lần có màu vàng nhạt, trong suốt. Dung dịch này được bảo
quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10
oC
, dùng 5ml cho một 1000 ml môi
trường nuôi cấy.
4.4. Pha stock hormon
Các hormon khác nhau sẽ tan trong các dung môi khác nhau. IAA, NAA,
BA pha trong NaOH 1N (thêm 2-3 ml NaOH 1N và lắc cho đến khi tan hết, sau đó thêm
nước đến thể tích cần). GA
3
,

2,4-D pha trong cồn 50
o
cho đủ thể tích.
Để pha các chất sinh trưởng, có hai cách khác nhau:
+ Cách 1: pha theo hệ mol
Ví dụ: Pha 100 ml dung dịch stock IAA (M=176,19) có nồng độ 1 mmol
(milimol) từ IAA tinh khiết.

176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước 1000 ml dung dịch có nồng độ 1
mol/lít. Để pha dung dịch có nồng độ 1 mmol/lít cần 0,17619 g IAA. Như vậy, muốn có
100 ml dung dịch IAA nồng độ 1 mmol/lít cần 0,017619 g IAA. (MNAA: 186,2; M
2,4-D
:
221,04; MBA: 225,2)
+ Cách 2: pha theo hệ mg/lít: làm tương tự như cách pha khoáng.
Các dung dịch stock hormon sau khi pha song được bảo quản trong các
chai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10
oC
.
4.5. Pha stock vitamin môi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500)
Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml. Bổ
sung các vitamin vào theo trình tự sau:

Tên hoá chất Nồng độ môi trường Nồng độ dung dịch stock
7

nuôi cấy (mg/lít) (x500) (mg/lít)
Acid nicotinic 0,5 250
Thiamin HCl 0,1 50
Pyridoxin HCl 0,5 250
Myo-inositol 100 50.000
Glycine 2 1.000
Cho tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất bổ sung cho đủ 100 ml.
Như vậy, ta có 100 ml stock vitamin MS x500. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần
trong chai màu ở nhiệt độ dưới 0
oC
, dùng 2ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy.
4.6. Pha môi trường làm việc (môi trường nuôi cấy)

Pha 1 lít môi trường MS cơ bản:
- Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher.
- Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn
- Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều.
- Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều.
- Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khuấy đều.
- Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500.
- Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích nuôi cấy.
- Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ
1000 ml
- Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH=5,8.
- Bổ sung 6-8 g agar.
- Đun sôi cho tan agar, quấy đều. Chia hỗn hợp môi trường vào các bình nuôi
cấy, cần chia xong trước khi dung dịch môi trường MS nguội xuống 50
oC
. Hấp khử trùng
(đối với các thành phần bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ được lọc vô trùng và bổ sung vào
môi trường sau khi hấp). Môi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25
oC
.
5 - BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Trình bày cách pha Skoog I, Skoog II và Skoog III.
2. Quan sát hiện tượng phản ứng khi pha stock Fe-EDTA. Giải thích.
3. Từ BA tinh khiết, trình bày cách pha 100 ml stock BA có nồng độ 100 mol/lít.
Biết MBA =225,2.
4. Cần bao nhiêu ml dung dịch stock IAA có nồng độ 150 mol/lít để pha môi
trường làm việc có nồng độ IAA là 0,1 mol/lít.
8

BÀI 2

PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MÔ THỰC VẬT
1 - NGUYÊN TẮC
Một thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật khác với một thí nghiệm nuôi cấy vi sinh
thường tiến hành trong một thời gian rất lâu dài. Với một thí nghiệm trường diễn như thế,
chỉ cần một tế bào vi khuẩn, một bào tử nấm mốc rơi vào môi trường nuôi cấy, sau một
thời gian ngắn sẽ sinh sôi làm hỏng môi trường, làm hỏng thí nghiệm và phải tiến hành
làm lại từ đầu. Do đó việc vô trùng tức loại bỏ hết nấm khuẩn trong nuôi cấy mô thực vật
vô cùng quan trọng.
Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi,
noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ… tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ
phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự
nhiên vào môi trường nuôi cấy in vitro, mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để
loại bỏ hết các mầm vi sinh vật. Tuy nhiên quá trình này phải đảm bảo là mô thực vật còn
sống, có khả năng tăng trưởng, phát triển tốt.
Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học
có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào
thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên
bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh
động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta lắc mô cấy với
cồn 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn.
Bảng 1. Một số tác nhân khử trùng dùng cho thực vật
Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả
Canxi hypoclorid 9 – 10 5 – 30 Rất tốt
Natri hypoclorid 2 5 – 30 Rất tốt
Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Tốt
Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt
HgCl
2
0,1 – 1 2 – 10 Trung bình

Chất kháng sinh 4 – 50 30 – 60 Khá tốt

Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối
với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng bột và rửa
sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý song, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô
trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra
cần phải cắt bỏ trứơc khi đặt mô cấy lên mô trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các
tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung
dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên
môi trường.
9

Như vậy, để có thể đạt được mục đích khử trùng (loại bỏ hết mầm vi sinh vật, mô
thực vật có thể tăng trưởng, phát triển), thì việc khử trùng là phải tìm ra được ba yếu tố
liên quan chặt chẽ với nhau và liên quan tới mô thực vật đem khử trùng đó là:
- Chất khử trùng
- Nồng độ chất khử trùng
- Thời gian khử trùng.
Vô trùng mẫu là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu
kiên trì tìm nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt
kết quả.
2 - VẬT LIỆU - HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
- Cây Trầu bà
- Hạt thuốc lá
2.2 - Hoá chất
- Xà phòng bột
- Cồn 70
o
, 90

o
- Javel
- Ca(OCl)
2
(Caxi hypoclorid)
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Cốc 1000 ml cái 5
9 - Cốc 100 ml cái 30
10 - Cốc 200 ml cái 15
11 - Pipett: 1 ml cái 5
12 - Pipett: 5 ml cái 5
13 - Pipett: 10 ml cái 5
14 - Erlen 250ml cái 60
10

STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị

tính
Số
lượng
Ghi chú
15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15
16 - Bông mỡ g 200
17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15
18 - Tủ cấy vô trùng cái 1
Tủ cấy có quạt thổi vô
trùng

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH
Học sinh thực hành khử trùng đốt thân cây Trầu bà, hạt thuốc lá. Sau khi vô trùng
tiến hành gieo hạt thuốc lá, cấy đốt thân cây Trầu bà lên môi trường MS.
4 - THỰC HÀNH
4.1 - Khử trùng cây Trầu bà
a. Thực hiện trong phòng thí nghiệm
- Cây Trầu bà được cắt thành những đoạn nhỏ 30cm. Rửa các đoạn này dưới vòi
nước máy cho sạch bụi đất.
- Cắt thành những đoạn Trầu bà này thành những đốt khoảng 3cm, mỗi đốt mang
một chồi ngủ. Cắt bỏ lá, rễ.
- Rửa các đốt với nước có pha một ít xà phòng trong các erlen.
- Rửa lại bằng nước máy nhiều lần cho sạch xà phòng.
b. Thực hiện trong tủ cấy
- Lắc các đốt thân với cồn 70
o
trong 1 phút
- Chiết bỏ cồn. Ngâm các mẫu trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 10 phút
(hay dung dịch javel được pha loãng với tỷ lệ 1:9 trong 5 phút).
- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần

- Gạn bỏ nước.
4.2 - Khử trùng hạt thuốc lá
- Thực hiện trong phòng thí nghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vòi nước máy.
- Lắc hạt với nước có pha một ít xà phòng.
- Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phòng
- Thực hiện trong tủ cấy, lắc hạt với cồn 70
o
trong 1 phút.
- Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 5 phút.
- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần.
- Gạn bỏ nước.
4.3 - Cách cấy mẫu
a. Mẫu cây Trầu bà
11

- Trong tủ cấy vô trùng, những đốt cây Trầu bà đã khử trùng, được đặt trên giấy cấy
vô trùng. Dùng dao mổ và kẹp tách các lá.
- Ở mỗi nách lá có mang một mầm ngủ. Dùng dao mổ cắt một đoạn mẫu có kích
thước khoảng 1x1 cm cấy vào môi trường MS đã hấp khử trùng trong các ống nghiệm.
- Khi cấy mẫu cần chú ý cấy đúng chiều của thân. Các ống nghiệm được đặt trong
phòng lạnh nhiệt độ 25
oC
, cường độ ánh sáng 2500-3000 lux.
b. Mẫu hạt thuốc lá
- Hạt thuốc lá sau khi khử trùng, dùng kẹp đặt đều trên bề mặt môi trường MS trong
các erlen. Khoảng cách giữa các hạt là 1cm.
- Các erlen được đặt ở nơi tối hoàn toàn.
5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Trình bày phương pháp khử trùng đốt thân Trầu bà, hạt thuốc lá.
2. Vai trò và tác dụng của tác nhân khử trùng cồn, canxi hypoclorid.

3. Ghi nhận kết quả nuôi cấy.
12

BÀI 3

KHỬ TRÙNG, NUÔI CẤY CHỒI NGỦ CÚC

HẠT CAM
1 - NGUYÊN TẮC
Trong các phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây trồng, bên cạnh những
phương pháp đòi hỏi người làm việc phải có kỹ thuật cao như tách và nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng, vi ghép…, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy chồi ngủ (chồi nách) là
phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và mang lại hiệu quả cao nhất.
Ở đa số các loài thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi ngủ. Các chồi ngủ này có
đặc tính hoàn toàn giống với các đỉnh sinh trưởng (là một đỉnh sinh trưởng ở trạng thái
tiềm sinh), có khả năng tăng trưởng phát triển thành một cơ thể thực vật toàn vẹn. Các
chồi ngủ này đa số bị ức chế sự phát triển bởi các chồi đỉnh (tính ưu thế ngọn). Nếu tách
riêng một đoạn thân có mang chồi nách này ra khỏi cơ thể thực vật, dưới tác động bởi
những yếu tố kích thích sinh trưởng ngoại sinh như cytokinin, auxin thì từ một chồi nách
này có thể cho ra một cụm chồi với rất nhiều chồi mới (từ hàng chục tới hàng trăm chồi).
Với những chồi mới tạo thành, tiếp tục cấy chuyền sang những môi trường tạo chồi mới
thì hệ số nhân giống rất đáng kể.
Với những loài thực vật có đỉnh sinh trưởng nhỏ (đỉnh sinh trưởng dấu hoa thị) thì
việc tách lấy đỉnh sinh trưởng rất khó thực hiện. Vì vậy, với những loại thực vật này,
phương pháp nhân giống vô tính hiệu quả nhất là nuôi cấy chồi nách. Chồi nách đem
nuôi cấy thường gắn liền với một đoạn thân, do đó sức sống của chồi nách thường tốt hơn
rất nhiều lần so với đỉnh sinh trưởng tách rời, hiệu quả tạo cụm chồi cũng thường tốt hơn
so với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Việc tách chồi nách thường thực hiện với những đoạn nhánh có mang chồi của thực
vật. Những đoạn nhánh này được khử trùng trước khi cắt nhỏ thành những đoạn có mang

chồi nách. Bên cạnh đó, việc tách chồi nách cũng có thể thực hiện từ những cây vô trùng
trong ống nghiệm được tạo ra do việc nuôi cấy hạt giống.
Trong bài thực hành này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vô tính thực vật qua
nuôi cấy chồi nách và tạo nguồn cây cho phương pháp nuôi cấy chồi nách từ hạt giống.
2- VẬT LIỆU –HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
- Cây hoa cúc
- Hạt cam
2.2 - Hoá chất
- Cồn 70
o
, 90
o
- Môi trường MS bổ sung 2,4 – D
- Xà phòng bột
- Cồn 70
o
, 90
o
- Javel
13

- NAA
- BA
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng

Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Cốc 1000 ml cái 5
9 - Cốc 100 ml cái 30
10 - Cốc 200 ml cái 15
11 - Pipett: 1 ml cái 5
12 - Pipett: 5 ml cái 5
13 - Pipett: 10 ml cái 5
14 - Erlen 250ml cái 60
15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15
16 - Bông mỡ g 200
17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15
18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15
19 - Đèn cồn cái 15
20 - Tủ cấy vô trùng cái 1
Tủ cấy có quạt thổi khí vô
trùng

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH
- Sinh viên tiến hành cắt đốt thân cúc, thực hiện xác định công thức khử trùng. Nuôi
cấy thân cúc trên môi trường MS bổ sung.
- Sinh viên tiến hành khử trùng, tách vỏ và nuôi cấy hạt cam trên môi trường MS.
4 - THỰC HÀNH
4.1 - Khử trùng và nuôi cấy thân cúc cắt đốt

a. Khử trùng
14

- Lựa cây cúc còn tươi, non, lá ít bị dập. Dùng dao cắt bỏ hoa và gốc. Cắt lấy một
đoạn cách gốc 1015 cm.
- Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vòi nước máy.
- Cắt thành những đoạn nhỏ. Cắt ở giữa hai chồi ngủ. Mỗi đoạn có một chồi ngủ.
- Lắc các đoạn trong nước xà phòng từ 1015 phút.
- Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước máy.
- Lắc với cồn 70
o
trong 1 phút.
- Lắc với dung dịch javel/nước ở các tỷ lệ 1/9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1.
- Rửa sạch javel bằng nước cất vô trùng 56 lần.
b. Nuôi cấy
- Thân cúc sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA và
NAA với tỷ lệ NAA/BA <1.
- Cắm thân cúc vào môi trường sao cho chồi ngủ vẫn nằm trên bề mặt môi trường .
4.2 - Khử trùng và nuôi cấy hạt cam
a. Khử trùng hạt
- Rửa hạt cam dưới vòi nước máy.
- Lắc hạt với nước xà phòng 1015 phút.
- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy.
- Lắc với cồn 70
o
trong 30 giây.
- Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 56 lần.
b. Tách vỏ hạt
- Đặt hạt cam lên trên giấy cấy. Dùng kẹp giữ hạt.
- Dùng dao mổ cắt hai đường dọc theo chiều dài hạt. Hai đường này đối diện nhau.

Lưỡi dao chỉ vừa đủ cắt rách lớp vỏ, không chạm vào phần thịt hạt.
- Dùng dao và kẹp tách bỏ lớp vỏ cứng (vỏ trấu) và vỏ lụa bên ngoài.
- Hạt cam là hạt đa phôi, khi tách các phôi có thể tách rời nhau. Ta vẫn có thể dùng
những mảnh phôi để nuôi cấy, mỗi mảnh phôi sẽ phát triển thành một cây cam.
c. Nuôi cấy
- Đặt ngang hạt cam trên môi trường MS.
- Dùng kẹp đè nhẹ hạt lên bề mặt môi trường sao cho ½ hạt nhập vào môi trường
- Đặt bình nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25
oC
.
5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Phương pháp lựa chọn công thức khử trùng.
2. Tại sao phải tách vỏ ngoài (vỏ trấu), vỏ lụa hạt cam trước khi nuôi cấy?
3. Nếu để bình nuôi cấy hạt cam trong điều kiện không có ánh sáng, phôi có nảy
mầm phát triển được không? Giải thích?
15

BÀI 4

VI NHÂN GIỐNG DỨA BẰNG NUÔI CẤY CHỒI NGỦ
1 - NGUYÊN TẮC
Đối với một số cây như tre, mía, dứa, phương pháp nhân giống vẫn thường được sử
dụng hiện nay trong nông nghiệp là nhân giống truyền thống bằng chồi nách, chồi ngầm,
thân ngầm, giâm hom… Tuy nhiên đặc điểm chung của các phương pháp này là hệ số
nhân giống thấp, không đáp ứng được nhu cầu về cây giống để mở rộng sản xuất.
Trước nhu cầu của việc mở rộng sản xuất, trong một số năm gần nay để nhân giống
dứa thường tiến hành bằng nuôi cấy chồi ngủ (phương pháp nhân cụm chồi). Ưu điểm
của phương pháp này là tốc độ nhân giống cao, hệ số nhân giống lớn.
Đặc điểm của phương pháp này là chồi ngủ được tách từ cụm chồi ngủ ở ngọn dứa,
sau đó được nuôi cấy tạo cụm chồi trên môi trường in vitro. Các chồi có hình dạng giống

như vảy cá hoặc hạt gạo nằm ép sát vào thân (lõi), có màu trắng. Mỗi chồi được tách
riêng để nuôi cấy để tạo thành cụm chồi.
2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
Chồi ngủ được tách từ ngọn dứa dùng làm vật liệu nuôi cấy.
2.2 - Hoá chất
- Cồn 70
o
, 90
o

- Môi trường MS bổ sung NAA, BA
- Javel
- Xà phòng bột
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Cốc 1000 ml cái 5
9 - Cốc 100 ml cái 30

10 - Cốc 200 ml cái 15
16

STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
11 - Pipett: 1 ml cái 5
12 - Pipett: 5 ml cái 5
13 - Pipett: 10 ml cái 5
14 - Erlen 250ml cái 60
15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15
16 - Bông mỡ g 200
17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15
18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15
19 - Đèn cồn cái 15
20 - Tủ cấy vô trùng cái 1
Tủ cấy có quạt thổi khí vô
trùng

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH
- Học sinh tiến hành tách bỏ lá ở các ngọn dứa để thu chồi ngủ.
- Các chồi ngủ được tách rời, nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA và BA.
4 - THỰC HÀNH
4.1 - Phương pháp khử trùng chồi ngủ dứa
- Tách bỏ toàn bộ các lá ở phần ngọn dứa. Tách lần lượt các lá từ dưới lên trên, từ
ngoài vào trong để trách làm tổn thương các chồi ngủ.
- Tách rời phần cùi (lõi) có mang chồi ngủ.

- Rửa nhẹ nhàng cùi dứa dưới vòi nước máy, tránh làm tổ thương các chồi ngủ.
- Dùng dao cắt lấy bốn mặt của cùi dứa có mang chồi ngủ.
- Lắc nhẹ nhàng các mảnh có mang chồi ngủ này trong nước xà phòng trong 10
phút.
- Rửa sạch nước xà phòng dưới vòi nước máy.
- Lắc các mảnh mô dứa trong cồn 70
0
trong 2 phút.
- Khử trùng với nước javel (tỷ lệ 3:7) trong 7 phút.
- Rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 5÷6 lần.





17










Hình 1. Cắt các mặt có mang chồi ngủ từ cùi dứa
4.2 - Phương pháp nuôi cấy
- Dùng dao mổ cắt những đường dọc, ngang tách rời từng chồi ngủ muốn lấy.
- Cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ tạo thành hình tháp.

- Cắm phần đầu hình tháp ngập vào môi trường nuôi cấy.
- Đặt các bình nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng 3000 lux, ở nhiệt độ 25
oC
.
4.3 - Phương pháp tạo cụm chồi
Sau thời gian nuôi cấy từ 20-30 ngày các chồi được cấy chuyền sang môi trường
nuôi cấy để tạo cụm chồi. Môi trường nuôi cấy có nồng độ chất điều hoà sinh trưởng
NAA 1mg/lít, BA 0,1mg/lít. Sau 30-40 ngày, các chồi nhỏ xuất hiện ở phía gốc chồi. Số
lượng các chồi nhỏ tăng dần lên, sắp xếp chồng chất lên nhau thành một cụm chồi
(thường là sau 3-4 tháng nuôi cấy). Các chồi nhỏ được tách và chuyển sang môi trường
tái sinh cây hoàn chỉnh. Điều kiện nuôi cấy để tạo cụm chồi dứa: cường độ ánh sáng 4000
lux, thời gian chiếu sáng 10-14 giờ/ngày, nhiệt độ 25-27
0
C.







Hình 2. Cách cắt rời chồi ngủ dứa
5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH
1. Trình bày những điểm cần lưu ý khi tách chồi ngủ dứa
2. Trình bày quy trình nhân giống dứa bằng chồi ngủ.
3. Tại sao phải cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ?

18

19

BÀI 5

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO THỰC VẬT
1 - NGUYÊN TẮC
Trong đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật lý
(những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực vật có khả năng
hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn thương đó. Những tế bào mới
được hình thành đó là tế bào mô sẹo.
Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các giai
đoạn hoá lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng tượng tầng
(vùng phân sinh) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành.
Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt. Khối mô sẹo có khả
năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích
sinh trưởng tạo mô sẹo.
Nuôi cấy tạo mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả năng
nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Những mô của thực vật có thể dùng
nuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp nhục,
lá, trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm
tế bào mô sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng.

A B
Hình 3. Sự tái sinh chồi từ mô sẹo. A: Mô sẹo, B: Chồi tái sinh.
Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là
trong sự tạo rễ. Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo mô
sẹo. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo. Sự tạo
mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi trường nuôi cấy được bổ sung một lượng auxin (2,4-D)
thích hợp.
Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình:
- Sự phản phân hoá của tế bào nhu mô: xảy ra ở các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu
mô vỏ hay lõi.
20

- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào bào tượng tầng của phần lớn
cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin.
- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ).
2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Vật liệu
Hạt thuốc lá (Nicotiana tabacum) được gieo trên môi trường MS. Sử dụng các cây
con làm vật liệu thí nghiệm.
2.2 - Hoá chất
- Cồn 70
o
, 90
o
- Môi trường MS bổ sung 2,4 - D
2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành
STT Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị

tính
Số
lượng
Ghi chú
1 - Dao mổ cái 15
2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn
3 - Ống đong: 100 ml cái 12
4 - Ống đong 500 ml cái 3
5 - Đũa khuấy cái 15
6 - Cốc 500 ml cái 15
7 - Quả bóp cao su cái 15
8 - Cốc 1000 ml cái 5
9 - Cốc 100 ml cái 30
10 - Cốc 200 ml cái 15
11 - Pipett: 1 ml cái 5
12 - Pipett: 5 ml cái 5
13 - Pipett: 10 ml cái 5
14 - Erlen 250ml cái 60
15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15
16 - Bông mỡ g 200
17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15
18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15
19 - Đèn cồn cái 15
20 - Tủ cấy vô trùng cái 1
Tủ cấy có quạt thổi khí vô
trùng

21

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

- Học sinh tiến hành cắt đốt thân, mảnh lá, đoạn rễ cây thuốc lá để nuôi cấy tạo mô
sẹo, những đoạn có mang chồi ngủ được nuôi cấy tái sinh cây.
- Các thành phần này được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4 – D.
4 - THỰC HÀNH
4.1 - Vật liệu nuôi cấy
a. Mô cấy từ cây thuốc lá tạo ra qua nuôi cấy hạt
- Tiến hành khử trùng hạt thuốc lá.
- Nuôi cấy hạt thuốc lá trong môi trường MS.
- Bình nuôi cấy được đặc trong điều kiện tối, nhiệt độ 25
0
C cho nảy mầm.
- Cây con được nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng.
- Sau 15-20 ngày nuôi cấy, khi cây có từ 6-8 lá, cao khoảng 10-15cm, có thể sử
dụng là nguyên liệu cho nuôi cấy mô sẹo
b. Mô cấy từ cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên
Cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên có sức tăng trưởng mạnh, khả năng hình thành mô
sẹo rất lớn. Những mô đặt cấy lấy từ cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên phải trải qua giai
đoạn vô trùng mẫu để loại bỏ hết nấm, khuẩn tồn tại trong và trên mẫu cấy.
4.2 - Chuẩn bị mẫu cấy
a. Cắt đốt thân
- Dùng kẹp gắp một cây thuốc lá trong bình nuôi cấy đặt lên giấy cấy.
- Dùng dao mổ cắt rời tất cả lá, rễ ra khỏi thân.
- Cắt thân thuốc lá thành những đoạn nhỏ, mỗi đoạn là một đốt thân. Từ các đốt này,
tiếp tục chia nhỏ thành các đoạn, mỗi đoạn có kích thước khoảng 0,2 – 0,4 cm. Các đoạn
nhỏ này được nuôi cấy tạo mô sẹo.
- Điều lưu ý khi cắt các đoạn thân là phải bỏ tất cả các phần mắt của đốt. Các phần
này không có khả năng tạo sẹo, chỉ có thể được sử dụng để nuôi cấy tạo chồi.
b. Cắt mảnh lá
- Từ các lá ở phần trên, sử dụng dao mổ cắt bỏ gân chính và rìa lá.
- Các phần lá này được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước 0,2 x 1 cm.

- Các mảnh lá này được nuôi cấy tạo mô sẹo.
c. Cắt đoạn rễ
- Sau khi cắt các đoạn thân, lá, phần rễ còn lại được rửa sạch agar trong nước cất vô
trùng.
- Dùng dao cắt rễ thành các đoạn nhỏ có kích thước 0,2 - 0,4 cm. Các đoạn này được
nuôi cấy tạo mô sẹo.
22
















Hình 4. Phương pháp cắt mảnh lá (A), đốt thân (B), đoạn rễ (C)
4.3 - Nuôi cấy tạo mô sẹo
a. Nuôi cấy thân, lá
- Dùng kẹp gắp các đoạn thân mảnh lá cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D.
- Khoảng cách giữa các đoạn thân, mảnh lá là 1cm. Tránh cấy quá dày.
- Sử dụng môi trường MS bổ sung 2,4-D có nồng độ là 1µmol/lít môi trường.
b. Nuôi cấy đoạn rễ

- Các đoạn rễ được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D có nồng độ 0,1
µmol/lít môi trường.
Những khối mô sẹo hình thành qua quá trình nuôi cấy có thể được tách ra và chuyển
sang nuôi cấy có nồng độ 2,4-D giảm (0,05µmol/lít môi trường) để tiếp tục phân chia tạo
thành những khối mô sẹo mới. Thời gian cấy chuyền giữa các lần nuôi cấy là 4-6 tuần.
Khối mô sẹo cũng có thể được cho tái sinh thành cây nếu môi trường nuôi cấy loại bỏ
2,4-D và bổ sung BA vào.
5. BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH
1. Khái niệm mô sẹo? Nguyên nhân của việc hình thành mô sẹo ở thực vật?
2. Vai trò của auxin đối với việc hình thành mô sẹo ở thực vật. Nồng độ thích hợp
nhất kích thích tạo mô sẹo từ thân, lá, rễ cây thuốc lá.
3. Phương pháp cắt đốt thân, đoạn rễ, mảnh lá để tạo mô sẹo ở cây thuốc lá.


A

B
C
23

BÀI 6

KỸ THUẬT TẠO ÁO BAO HẠTGIỐNG NHÂN TẠO
1 - Ý NGHĨA
Ở một số loại thực vật như mía, khoai tây, khoai mìm dâu tây đều không có khả
năng nhân giống bằng hạt. Bên cạnh đó có nhiều loại thực vật tạo được hạt giống nhưng
hạt giống kém chất lượng hay hạt giống rất đắt. Để giải quyết tất cả các vấn đề trên, một
phương pháp nhân giống mới được nghiên cứu và ứng dụng đó là phương pháp tạo hạt
nhân tạo.
Hạt giống nhân tạo về cơ bản giống như hạt giống tự nhiên. Chỉ có sự khác nhau

là hạt giống nhân tạo có cấu tạo là phôi được bao bọc bởi lớp áo bên ngoài thay cho nội
nhũ, vỏ và phôi ở hạt nhân tạo là phôi vô tính (phôi soma) (hình 1). Hạt giống nhân tạo
gồm 3 phần (hình 2):
- Phôi vô tính
- Vỏ bọc polymer như alginat
- Màng ngoài: được cấu tạo từ alginat canxi
Phôi soma ở hạt nhân tạo giống như phôi hợp tử ở hạt tự nhiên là có hai cực (đỉnh
chồi và đỉnh rễ), như thế có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh tương tự như hạt nảy
mầm. Cấu trúc phôi soma giống như phôi hợp tử nhưng phôi soma của hạt giống nhân
tạo không có vỏ bao hạt cũng như mô dự trữ.











Hình 5 - So sánh cấu trúc hạt tự nhiên và hạt nhân tạo

24

Hình 6 - Cấu tạo hạt nhân tạo
Hạt nhân tạo thườmg có vỏ làm bằng alginat Na và alginat Ca hay B-hydrogel.
Alginat Na là một chất cao phân tử được chiết suất từ rong biển (rong Mơ
Sargassum sp là một loại rong nâu). Trong rong Mơ alginat Na tồn tại dưới dạng alginit
khơng tan là hợp chất của các axid manuronic. Để chiết tách alginat , thường tiến hành
nấu rong với Na
2
CO
3
.
[(C
5
H
7
O
4
COO)
2
Ca]
n
+ nNa
2
CO
3
2[C

5
H
7
O
4
COONa]
n
+ nCaCO
3
Alginat Ca Alginat Na
Alginat Na là dạng tan trong nước. Khi Alginat Na tiếp xúc với dung dịch CaCl
2
,
xảy ra phản ứng trao đổi ion giữa hai dung dịch này theo phản ứng:
2[C
5
H
7
O
4
COONa]
n
+ nCaCl
2
[(C
5
H
7
O
4

COO)
2
Ca]
n
+ 2nNaCl
Alginat Na Alginat Ca
Ở dạng này, alginat Ca kết tủa, trở thành dạng khơng tan, tạo thành màng khơng thấm
nước. Tồn bộ bề mặt của gịot hỗn hợp trên sẽ được bao bọc bằng một lớp áo alginat Ca
khơng thấm nước và tạo thành một hạt. Phần alginat Na bên trong vẫn ở trạng thái tan.
Vỏ hạt nhân tạo được tạo ra theo ngun tắc này.
Hạt nhân tạo có thể bảo quản, tồn trữ và trồng trọt bằng những kỹ thuật canh tác
truyền thống. Và đặc biệt là có thể chủ động trong sản xuất, trồng trọt, canh tác khơng
phụ thuộc vào các điều kiện thời tiết, mùa vụ.
Trong bài thực hành này, chúng ta sẽ tìm hiểu kỹ thuật tạo áo bao cho phơi vơ tính
để cấu thành một hạt giống nhân tạo hồn chỉnh.
2 - NGUN LIỆU - HỐ CHẤT – DỤNG CỤ
2.1 - Ngun liệu, hố chất
STT Tên hố chất, phụ liệu
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 Alginat Na 4% ml 100
2 Mơi trường MS ml 1000
Phôi
soma
Nội
nhũ
nhân

tạo
Vỏ
nhân
tạo
25

STT Tên hoá chất, phụ liệu
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
3 CaCl
2
2,5% ml 300
4 Nước cất ml 500
5 Giấy lọc gói 1
6 Phôi vô tính

2.2 - Dụng cụ, thiết bị cần cho một nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT
Tên dụng cụ, thiết bị
Đơn vị
tính
Số
lượng
Ghi chú
1 Bình chiết 500ml cái 2 Tạo giọt nhỏ
2 Pipette 10 ml cái 2 Hút và chuyển phôi

3 Kẹp gắp 25cm cái 2 Gắp hạt
4 Phễu lớn cái 2
5 Erlen 500ml cái 2
6 Erlen 250 cái 2
7 Quả bóp cao su cái 2
8 Đồng hồ cá nhân cái 2
9 Đĩa petri cái 2
10 Cốc 1000 ml cái 2
11 Cốc 250ml cái 2

3. NỘI DUNG THỰC HÀNH
- Học sinh tiến hành nhỏ giọt và chuyển phôi tạo hạt
- Học sinh thực hiện ngâm hạt trong dung dịch CaCl
2
và nước để tạo hạt hoàn chỉnh
4 – THỰC HÀNH
4.1 – Tạo giọt nhỏ
- Hoà tan 100 ml Alginat Na 4% vào 1 lít môi trường MS có chứa các muôi khoáng,
đường, vitamin, các chất sinh trưởng. Cho hỗn hợp này vào bình chiết.
- Mở khoá nhỏ giọt của bình chiết, nhỏ từng giọt nhẹ nhàng hỗn hợp này vào một
cốc dung dịch CaCl
2
2,5%. Mỗi lần nhỏ, khi giọt dung dịch vừa ló ra ở đầu ống nhỏ giọt
của bình chiết, vặn khoá lại để dừng giọt dung dịch ở đầu ống nhỏ giọt
4.2 – Chuyển phôi và tạo hạt
- Dùng pipette hút một phôi trong dung dịch MS chuyển vào trong giọt nhỏ đang
dừng ở đầu bình chiết.