Chương 6: SỰ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT pptx

Chương 6:
SỰ CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

GENOM Ở THỰC VẬT BẬC CAO

ĐẶC ĐIỂM BỘ MÁY DI TRUYỀN CỦA
TẾ BÀO THỰC VẬT
Tế bào thực vật là một tế bào hữu nhân điển
hình, được bao bọc bên ngoài bởi lớp vách cenllulose.
Tế bào thực vật chứa nhiều lạp thể, đặc biệt là các
lục lạp. Lục lạp chứa bộ máy di truyền riêng có liên hệ
chặt với bộ máy di truyền của nhân bào.
Tế bào thực vật có tính toàn thế
Tính toàn thế ở tế bào thực vật được ứng dụng
nhằm mục đích tái sinh, nhân nhanh các giống cây
chuyển gen.

ĐẶC ĐIỂM BỘ MÁY DI TRUYỀN CỦA
TẾ BÀO THỰC VẬT
Tế bào thực vật có bộ máy di truyền phức tạp
- ADN thực vật chứa cả những đoạn mã hóa và
những đoạn không mã hóa.
- Có sự lặp đi lặp lại nhiều lần của một đoạn.
- Cơ chế biểu hiện gen đa dạng phức tạp, đóng vai
trò rất quan trọng trong công nghệ gen thực vật.
- Có sự hiện diện của các gen nhảy trong quá trình
phát triển.

SINH TRƯỞNG VÀ SINH SẢN CỦA
TẾ BÀO THỰC VẬT

Sinh trưởng
Nguyên phân
Giảm phân
Sinh sản
Hữu tính: đa dạng sinh học
Vô tính: tạo dòng thuần

DNA Ở THỰC VẬT BẬC CAO
-
Sự tái bản của ADN dựa trên
nguyên tắc khuôn và bổ sung.
- Sự tái bản ADN mang tính
nửa bảo tồn.
-
Sự tái bản ADN mang tính
định hướng
- Có sự tham gia của các phức
hệ enzyme: helicaza, Primosome,
các enzym ADN polimeraza I và
II, ATPaza, topoisomeraza

SỰ THỂ HIỆN CỦA GEN – PHIÊN MÃ
VÀ DỊCH MÃ
Nhân tố tham gia phiên mã:
Các ARN- polimeraza:
ARN - polimeraza I có vai
trò tổng hợp các rARN, trừ
rARN 5S.
ARN - polimeraza II có vai
trò phiên mã các mARN.

ARN - polimeraza III có vai
trò tổng hợp các tARN và
rARN 5S.
Các nhân tố điều chỉnh:
Protein và các acid.

TÍNH BẢO THỦ CỦA GEN VỀ DI TRUYỀN
VÀ NHỮNG BIẾN DỊ
- Sự xâm nhập của các DNA ngoại lai.
- Sự chuyển dịch các gen.
- Sự chuyển dịch của lục lạp và ty thể
vào nhân bào.
Các tính trạng thực vật là biểu
hiện của các gen di truyền
Cơ chế sinh tổng hợp
DNA đảm bảo tính bảo thủ
của gen, ổn định di truyền
qua các thế hệ.
Nguyên nhân biến
dị ở thực vật

KỸ THUẬT GEN
Ở THỰC VẬT BẬC CAO

KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH VÀ DÒNG HÓA GEN
Nhận diện tế bào chủ chứa đoạn DNA tái tổ hợp
Chiết xuất và tinh sạch DNA
Cắt DNA
Nối các đoạn DNA
Chuyển DNA vào tế bào chủ

Phân tích các phân đoạn DNA
Phân tích các phân đoạn DNA

1. CHIẾT XUẤT VÀ TINH SẠCH DNA
Kiểm tra và lưu trữ DNA
Chuẩn bị mẫu
Phá vỡ tế bào
Hòa tan ADN
Loại bỏ các thành phần không phải là ADN
Tủa ADN
Rửa DNA
Làm khô

1. Vật liệu:
Lá chanh
2. Hóa chất:
Nitơ lỏng; Cồn 70
0
; Nước cất;
EDTA; Agarose; Cồn 96
0
;
Ethidium bromide; Isopropanol; SDS 10%;
Extraction buffer: 0.1M Tris.HCl (pH 8); 0.5M NaCl;
0.05M EDTA (pH 8); 0.01% β-mercaptho ethanol;
CTAB buffer: 0.02M Tris.HCl (pH 7.5); 2M NaCl;
0.05M EDTA;
TE 0.1 buffer: 10mM Tris (pH 8); 0.1mM EDTA (pH 8);
Chloroform/Isoamylalcohol (24:1);
ARNase (10 mg/ml).

Ví dụ: Chiết xuất và tinh sạch DNA từ lá chanh

3. Dụng cụ – Thiết bị:
- Micropipet.
- Máy li tâm.
- Bộ điện di minisub gel.
- Agarose.
- Eppendorf 1,5 ml, 2,0 ml.
- Kéo cắt mẫu, chày và cối nghiền mẫu.
Ví dụ: Chiết xuất và tinh sạch DNA từ lá chanh

4. Phương pháp thực hiên:
- Chuẩn bị mẫu: Mẫu lá sau khi được lau cồn, cắt bỏ
gân lá, thịt lá (1g) được nghiền trong nitơ lỏng.
- Trích DNA:
Bột lá được nghiền với 1ml extraction buffer, sau
đó, thêm 50ml SDS 10%, lắc nhẹ, ủ ở 65
0
C, 30 phút.
Sau thời gian ủ, mẫu được li tâm 13000rpm, 10
phút, thu 40ml dịch trong, bổ sung 40ml isopropanol,
ủ ở 20
0
C, 30 phút, sau đó, li tâm 13000rpm, 10 phút,
thu tủa, hòa tan tủa trong 20ml TE, thêm 20ml CTAB
và ủ ở 65
0
C, 15 phút.
Ví dụ: Chiết xuất và tinh sạch DNA từ lá chanh

Thêm 40ml Chloroform, lắc đều, li tâm
13000rpm, 5 phút, hút 20ml dịch trong lớp trên,
thêm 0.5ml ethanol 96
0
ủ ở nhiệt độ phòng, 15 phút.
Sau thời gian ủ, dịch ủ được li tâm 13000rpm, 10
phút, thu tủa, li tâm 13000rpm, 5 phút với ethanol
70
0
2 lần, sau đó, loại bỏ ethanol và phơi khô DNA
qua đêm ở nhiệt độ phòng.
DNA sau khi phơi khô, được hòa tan trong 50ml
nước và tiến hành kiểm tra độ tinh sạch DNA.
Ví dụ: Chiết xuất và tinh sạch DNA từ lá chanh

KIỂM TRA CÁC PHÂN ĐOẠN DNA
ĐIỆN DI
ĐO OD
Polyacrylamide
Agarose
Các đoạn DNA có khối lượng
phân tử khác nhau sẽ có tốc độ
dịch chuyển hay định vị ở những
vị trí khác nhau trên các bản gel
khi ở trong điện trường.
OD
260nm
= 1.8 – 2 : dung dịch DNA sạch
OD
280nm

- Chuẩn bị bản gel agarose và
dung dịch điện di.
- Lắp đặt bản gel.
- Pha mẫu DNA cần điện di với
dung dịch màu tải mẫu (30%
glycerol, 0,25% bromophenol
blue và 0,25% xylencyanol).
- Tiêm dịch DNA.
- Thực hiện điện di.
- Kiểm tra band DNA.
- Kết thúc điện di khi band DNA
cách mép dưới bản gel 0,5 cm.
- Thu hồi DNA.
Ví dụ: Điện di agarose

2. CẮT DNA
Enzyme giới hạn (restriction
enzyme – RE) là enzyme cắt DNA,
có thể phân huỷ liên kết
phosphodieste của bộ khung DNA
mạch đôi mà không gây tổn hại đến
bases ở các vị trí đặc hiệu.
Đặc tính của các RE:
- Không cắt ở đầu tận cùng
- Chỉ cắt khi nhận ra các trình
tự đặc thù (4 – 12 nucleotit), tạo ra
các đoạn DNA có đầu dính hay
đầu bằng.

2. CẮT DNA
- Enzyme cắt giới hạn hoạt động tối ưu trong
những điều kiện khác nhau.
- Các phản ứng cắt chỉ thực hiện với một lượng
DNA tối thiểu trong một thể tích tối thiểu.
-
Kết quả cắt phụ thuộc độ tinh sạch DNA
-
Enzyme cắt giới hạn được lưu trữ ở -20
0
C.

Hòa 1mg DNA trong 17ml nước cất 2 lần và 2ml
đệm phản ứng, vortex, bổ sung 1đơn vị RE, lắc đều, ủ
ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
VD: EcoRi : 60 phút, 37
0
C
BstXI : 120 phút, 50
0
C
Bổ sung từ từ 10ml EDTA 0.5M (pH 7.5) để kết
thúc phản ứng.
Ví dụ: Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn

PHÂN TÍCH CÁC PHÂN ĐOẠN DNA
Phương pháp hóa học
giải trình tự DNA
- Đánh dấu
32

P
- Sử dụng hóa chất làm biến
tính A-T-G-C.
- Tách đoạn DNA và điện di
so sánh với bản nguyên thủy.
Phương pháp enzyme
giải trình tự DNA
Chèn dNTP tương ứng A-T-
G-C vào đoạn DNA.
Phương pháp dùng
máy tự động giải trình
tự DNA
Sử dụng mắt cảm quang và tia
laser phát hiện.

3. NỐI CÁC PHÂN ĐOẠN DNA
DNA ligase
- Xúc tác quá trình hình thành liên
kết photphodiester, nối 02 đoạn DNA.
- E.Coli DNA ligase - nối 02 trình tự
DNA có đầu so le và đầu bằng.
- T
4
DNA ligase - nối 02 trình tự DNA
có đầu bằng.

- Agrobacterium
- Virus
- Hấp thu DNA
- Siêu âm

- Xung điện
- Bắn gen
- Vi tiêm
- Qua ống phấn
- Silicon carbide
4. CHUYỂN DNA VÀO TẾ BÀO CHỦ
TRỰC TIẾP
GIÁN TIẾP

- Nuôi cấy tái sinh tế bào mang gen chuyển trên môi
trường chọn lọc
- Sử dụng các phương pháp xác định cá thể chuyển gen
nhận biết cây chuyển gen (nhuộm, PCR, Southern
blot,…)
- Theo dỏi sự biểu hiện và di truyền của gen chuyển
5. NHẬN DIỆN TẾ BÀO CHỦ CHỨA DNA TÁI TỔ HỢP