Các phương pháp chuyển gen ở thực vật và ứng dụng

Các phương pháp
Các phương pháp
Chuyển gen ở thực vật
Chuyển gen ở thực vật
và ứng dụng
và ứng dụng
Chuyên đề
chuyển gen ở thực vật
chuyển gen ở thực vật


Hệ thống
Hệ thống
nuôi cấy
nuôi cấy và
tái sinh
tái sinh
in vitro
in vitro


Vectơ chuyển gen
Vectơ chuyển gen
Phương pháp chuyển DNA vào mô, tế bào
Phương pháp chuyển DNA vào mô, tế bào


thực vật
thực vật
Chọn lọc và xác định các thể biến nạp
Chọn lọc và xác định các thể biến nạp

Phân tích và mô tả cây chuyển gen
Phân tích và mô tả cây chuyển gen


Hệ thống tái sinh hiệu quả
Hệ thống tái sinh hiệu quả




Tính toàn
Tính toàn
nng
nng
của tế bào thực vật
của tế bào thực vật

Một số tế bào có khả
Một số tế bào có khả
n ng
n ng
tái sinh và biến nạp;
tái sinh và biến nạp;

Một số khác
Một số khác + có khả nng hoặc
+ hoàn toàn không có khả nng tái sinh và biến nạp

Khả
Khả
nng
nng
tái sinh phụ thuộc:
tái sinh phụ thuộc:
* Dạng vật liệu ban đầu
- Phôi non, mô sẹo tạo thành từ phôi non
- Chồi tái sinh trực tiếp hay thông qua phôi soma tạo thành từ
cuống lá, lá mầm, mẩu lá, thân mầm
* iều kiện nuôi cấy, kiểu gen, tuổi mô, các chất HST
Vectơ chuyển gen
Vectơ chuyển gen





oạn
oạn
khởi động gen:
khởi động gen:


- Không đặc hiệu (đoạn khởi động cơ định): Ubi-P; CaMV35S-P;
- Không đặc hiệu (đoạn khởi động cơ định): Ubi-P; CaMV35S-P;


Act-P, NOS-P; Adh-P
Act-P, NOS-P; Adh-P

- Đặc hiệu với các yếu tố
- Đặc hiệu với các yếu tố
cis
cis
chuyên biệt
chuyên biệt


oạn kết thúc gen:
oạn kết thúc gen:


- Chứa đuôi polyA như AATTAA (AACCAA)
- Chứa đuôi polyA như AATTAA (AACCAA)


- CaMV35S;
- CaMV35S;
NOS
NOS


Gen thỉ thị:
Gen thỉ thị:


+ Chỉ thị chọn lọc:
+ Chỉ thị chọn lọc:

hpt; npt II; pat, pmi; xylA
hpt; npt II; pat, pmi; xylA


+ Chỉ thị sàng lọc:
+ Chỉ thị sàng lọc:
cat; lacZ, gus; lux, gfp
cat; lacZ, gus; lux, gfp
Chuyển gen gián tiếp
Chuyển gen gián tiếp
Chuyển gen trực tiếp
Chuyển gen trực tiếp

Các phương pháp chuyển gen ở thực vật
Chuyển gen thông
Chuyển gen thông
qua
qua
Agrobacterium
Agrobacterium


in vitro
in vitro
Chuyển gen thông
Chuyển gen thông
qua
qua

Agrobacterium
Agrobacterium


in vivo
in vivo
-


Súng bắn gen
Súng bắn gen
-


Bằng hoá chất
Bằng hoá chất
-


Xung điện
Xung điện
Phương pháp khác
Phương pháp khác
Vi tiêm; Vĩ tiêm
Chuyển gen qua ống phấn
ủ hạt khô với dung dịch DNA
Kỹ thuật siêu âm; Silicon carbide
Phương pháp Agrolistic

Chọn lọc các tế bào chuyển gen
Chọn lọc các tế bào chuyển gen


Mô tả cây chuyển gen
Mô tả cây chuyển gen


Thử nghiệm đồng ruộng cây chuyển gen
Thử nghiệm đồng ruộng cây chuyển gen
-
PCR: xác định sự có mặt của gen được chuyển nạp
-
Southern: xác định số bản sao của gen được chuyển nạp
- Nothern và Western: xác định biểu hiện gen và sinh tổng hợp protein
- ánh giá về kiểu hinh và kiểu gen
- ánh giá rủi ro, ảnh hưởng của cây chuyển gen đến môi trường, con người
-
oạn trinh tự lặp lại 25bp (đoạn biên): dấu hiệu nhận biết cho quá trinh chuyển và
xâm nhập của T-DNA vào TBTV
-
oạn biên phải có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T-DNA;
-
oạn biên trái gián tiếp tham gia vào quá trỡnh chuyển T-DNA và là dấu hiệu để
quá trinh này kết thúc binh thường
Phương pháp chuyển gen thông qua
Phương pháp chuyển gen thông qua
A. tumefaciens
A. tumefaciens

Cấu trúc và chức n ng của Ti-plasmid
Cấu trúc và chức n ng của Ti-plasmid


Cấu trúc và chức n ng của đoạn T-DNA
Cấu trúc và chức n ng của đoạn T-DNA
-
DNA mạch vòng, sợi kép
-
4 vùng tương đồng:
+ T-DNA và vùng VIR: hinh thành khối u ở thực vật
+ vùng chứa gen mã hoá cho việc sao chép plasmid
và chuyển nạp


C¬ chÕ ph©n tö cña chuyÓn gen th«ng qua
C¬ chÕ ph©n tö cña chuyÓn gen th«ng qua
A. tumefaciens
A. tumefaciens