Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nuôi cấy tạo quả thể của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps Militaris

LỜI CẢM ƠN
Để nâng cao kỹ thuật của sinh viên ngành Cơng Nghệ sinh học Lâm Nghiệp
nói riêng và sinh viên đại học Lâm Nghiệp nói chung. Được sự đồng ý của lãnh
đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp và giáo viên hướng dẫn em xin tiến
hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tối ưu hóa q trình ni cấy tạo quả thể
của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps Militaris”.
Có được kết quả hiện tại trước hết em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới
thầy giáo Th.S Nguyễn Trọng Trí và cơ giáo T.S Nguyễn Thị Thu Hằng đã tận
tâm hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình
nghiên cứu để em có thể hồn thành được đề tài này.
Em xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện CNSH Lâm Nghiệp và Bộ mơn Vi sinh –
Hóa sinh. Em cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo giảng dạy trong Viện Công nghệ
sinh học Lâm nghiệp đã dạy bảo, trang bị cho em những kiến thức quý báu trong
suốt những năm học vừa qua.
Bên cạnh đó em cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của tồn
bộ cán bộ viên chức tại Cty TNHH MTV Tinh hoa Việt đã tạo điều kiện, giúp đỡ
cho em để quá trình nghiên cứu được thuận lợi hơn.
Với những kết quả khả quan em cũng xin tiếp tục được nghiên cứu tiếp để
đề tài đạt được kết quả tốt nhất. Với tinh thần luôn cố gắng, chăm chỉ cũng như
ham học hỏi tuy nhiên với kinh nghiệm còn hạn chế nên trong quá trình nghiên
cứu khơng tránh khỏi những thiếu sót, em mong nhận được những lời nhận xét,
đóng góp ý kiến của các thầy, cô giáo để đề tài nghiên cứu của em được hoàn
thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2022
Sinh viên thực hiện

1


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ
PHẦN 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1. 1. Giới thiệu về nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
1.1.1. Phân loại
1.1.2. Lịch sử phát hiện
1.1.3. Đặc điểm sinh học và sinh thái
1.1.4. Giá trị dược liệu
1.1.5. Tình trạng phân bố và khai thác.
1.2. Nghiên cứu nuôi nhân tạo nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps military
1.2.1. Trong nước.
1.2.2.Trên thế giới
PHẦN 2: NỘI DUNG, MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Mục tiêu:
2.1.1. Mục tiêu chung
2.1.2. Mục tiêu cụ thể
2.2. Nội dung
2.3. Vật liệu nghiên cứu, địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm.
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu:
2.3.2. Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm:
2.4. Dụng cụ thí nghiệm:
2.5. Phương pháp nghiên cứu:
2.5.1. Phương pháp xác định ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng tạo khuẩn
lạc của Đông trùng hạ thảo.
2.5.2. Phương pháp xác định loại cơ chất tối ưu.
2.5.3. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian ủ tối kích thích sợi nấm.
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả về ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng tạo bào tử của Đông trùng
hạ thảo.
3.2. Kết quả nghiên cứu xác định hàm lượng cơ chất tối ưu.
2


3.3. Kết quả nghiên sự ảnh hưởng của thời gian ủ tối tới sự phát triển quả thể.
Tài liệu tham khảo
Phần 4: Kết luận - tồn tại - kiến nghị
4.1. Kết luận
4.2. Tồn tại
4.3. Kiến nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

3


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
CT
C. militaris
C. sinensis
cs
g
NC
v/p

Chữ viết đầy đủ
Cơng thức

Cordyceps militaris
Cordyceps sinensis
Cộng sự
Gam
Nghiên cứu
Vịng/phút

4


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1: Ảnh hưởng của các tốc độ lắc khác nhau đến khả năng tạo cầu nấm
sau 7 ngày ni cấy
Hình 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất đến sự phát triển quả thể
Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian ủ tối đến sự phát triển của hệ sợi nấm sau 12
ngày chuyển từ nấm trong tối ra ni ngồi sáng
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian ủ tối đến sự phát triển của quả thể nấm sau
65 ngày chuyển từ nấm trong tối ra ni ngồi sáng

5


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Tốc độ lắc và thành phần môi trường nuôi cấy nấm Cordyceps
militaris
Bảng 2.2: Công thức phối trộn hàm lượng cơ chất
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng tạo cầu nấm
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất đến sự phát triển quả thể
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời gian ủ tối tới sự phát triển quả thể

6


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) từ lâu đã xuất hiện trong các tài liệu
dược cổ, các bài thuốc của Trung Quốc. Đông trùng hạ thảo là một loài nấm
dược liệu quý hiếm và hiện nay đã được cả thế giới biết đến. Trong số các loài
nấm thuộc chi Cordyceps, lồi Cordycep militaris chứa các thành phần hóa học
có giá trị dinh dưỡng và dược tính như: cordycepin, adenosine, cordycepic acid,
polysaccharides, superoxide dismutase (SOD), acid béo, các sterol và các hoạt
chất có tác dụng sinh học khác như acid amin, protein, vitamin (A, B1, B3, B6,
B12, ...) và nguyên tố vi lượng (Zn, Se, Cu, ...). Có nhiều bằng chứng khoa học
xác nhận hiệu quả của Đông trùng hạ thảo Cordycep militaris như: cải thiện hệ
miễn dịch, hạ đường huyết, chống lão hóa, chống viêm, hoạt động chống khối u,
chống tế bào ung thư, hỗ trợ hệ tim mạch, cải thiện và phục hồi chức sinh sản,
làm mỹ phẩm...
Hiện nay, do bị khai thác quá mức nên Đông trùng hạ thảo khai thác từ tự
nhiên (chủ yếu thuộc loài Cordyceps sinensis) dần trở nên khan hiếm và điều
này đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu hướng đến việc nuôi trồng Đông trùng hạ thảo
nhân tạo quy mô lớn. Trong đó, lồi Cordyceps militaris đã được nghiên cứu
ni cấy nhân tạo thành cơng và tạo ra quả thể có hàm lượng các chất hóa học
có dược tính quan trọng tương đương lồi Cordyceps sinensis - Đơng trùng hạ
thảo tự nhiên.
Ở Việt Nam, việc nuôi cấy nhân tạo nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps
militaris đã khá phổ biến, nhưng để tìm được quy trình ni cấy tối ưu cho năng
suất quả thể cao, chất lượng quả thể tốt thì vẫn cịn là một bài tốn khó. Vì vậy,
đề tài “Nghiên cứu tối ưu hóa q trình ni cấy tạo quả thể của nấm Đông
trùng hạ thảo Cordyceps militaris” được thực hiện với mục tiêu xác định được
một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy nhân tạo nấm Cordyceps militaris đạt
năng suất quả thể cao, góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất của qui trình ni

cấy nấm Cordyceps militaris tại Công ty TNHH MTV Tinh hoa Việt cũng như ở
Việt Nam.
7


Phần 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu về nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris
1.1.1. Phân loại
Theo hệ thống phân loại, chi Cordyceps thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota,
lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae, gồm trên 400 loài
khác nhau (Sung J.H. và cs, 2007).
Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris thuộc:
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Phân ngành: Ascomycotina
Lớp: Sordariomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Clavicipataceae
Chi: Cordyceps
Loài: Cordyceps militaris.
1.1.2. Lịch sử phát hiện
Những nghiên cứu đầu tiên về nấm Cordyceps được công bố bởi các nhà
khoa học Trung Quốc cho thấy: trên vùng núi ở cao nguyên Tây Tạng có sự
phân bố của một lồi nấm thuộc chi Cordyceps là C. sinensis ký sinh vào ấu
trùng của loài bướm, sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số lồi cơn
trùng. Mùa đơng giống nấm C. sinensis ký sinh trên một số loài sâu để sinh
trưởng và phát triển, khi tới mùa hè nấm mọc thành quả thể. Quả thể nấm
Cordyceps thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam (Zheng và cs, 2011).
Năm 1878, các nhà khoa học phát hiện loài C. militaris cũng ký sinh trên ấu

trùng của các lồi cơn trùng thuộc chi Thitarodes (Shih và cs, 2007; John và
Matt, 2008).
1.1.3. Đặc điểm sinh học và sinh thái

8


Nẩm Cordyceps militaris ký sinh trên bướm và ấu trùng (sâu bướm), có màu
cam, chiều dài 8 - 10 cm. Đầu quả thế nấm có hình dạng giọt nước (đầu chùy),
trên phần đầu có các đốm màu cam sáng. Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng
hoặc nhộng. Nang bào tử dài 300 - 510 µm, rộng 4 µm. Các bào tử nang hình
sợi, khơng màu và phân đoạn, kích thước 3,5 - 6 x 1 – 1,5 µm. Bào tử nang
trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chổi tạo các bào tử thứ cấp.
Vào mùa Đơng nấm xâm nhiễm, kí sinh vào cơ thể cơn trùng và làm cơn
trùng chết, sau đó nấm tiếp tục tồn tại trong cơ thể côn trùng dưới dạng hệ sợi
dược gọi là giai đoạn vơ tính. Đến mùa Hè, nhiệt độ và ẩm độ khơng khí cao, hệ
sợi nấm vơ tính tiến hành giao phối và chuyển sang giai đoạn hữu tính, từ đây
bắt đầu hình thành cây nấm (chất đệm) - là cơ quan chứa bào tử vơ tính - dần
nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc nấm vẫn dính liền vào thân cơn trùng. Chính vì
vậy mà nấm được đặt tên là nấm Đông trùng hạ thảo (Phạm Quang Thu và cs,
2013).
1.1.4. Giá trị dược liệu
Hai lồi Đơng trùng hạ thảo trong chi Cordyceps được nghiên cứu và sử
dụng làm dược liệu nhiều nhất là C. sinensis và C. militaris. Đông trùng hạ thảo
C. militaris là một lồi nấm ký sinh trên cơn trùng có giá trị dược liệu quan
trọng tự như nấm Cordyceps sinensis và được sử dụng nhiều trong y học cổ
truyền.
Các hợp chất dược liệu của loại nấm Cordyceps militaris được ứng dụng
trong điều trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó lồi nấm này có giá
trị kinh tế cao. Nhiều bằng chứng nghiên cứu chỉ ra nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris có nhiều các hoạt chất hóa học cho dược tính cao như:
Cordycepin, dẫn xuất adenosine, cordycepic acid, polysaccharides, superoxide
dismutase (SOD), các acid béo, các sterol và các hoạt chất có tác dụng sinh học
khác như acid amin, protein, vitamin (A, B1, B3, B6, B12, ...) và nguyên tố vi
lượng (Zn, Se, Cu, ...).

9


Cordyceps militaris cũng cho thấy những kết quả khả quan trong việc làm
giảm tác dụng phụ của thuốc khi áp dụng phương pháp hóa trị liệu để điều trị
ung thư.
Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc dù nấm
Cordyceps sinensis được sử dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên
các ứng dụng lâm sàng của hai loài nấm này tương tự nhau. Các chiết xuất từ
nấm Cordyceps militaris có thể được sử dụng trong các trường hợp suy giảm
chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt (Mizuno, 1999; Daset và cs, 2010).
1.1.5. Tình trạng phân bố và khai thác
Nấm Đông trùng hạ thảo tự nhiên thường được phát hiện vào mùa hè ở một
số cao nguyên có độ cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt biển, ở các vùng Tây
Tạng, Tứ Xuyên, Cam Túc, Vân Nam... (Nguyễn Mậu Tuấn và cs, 2013). Ngoài
ra, nấm còn phân bố ở các vùng núi cao thuộc Ấn Độ, Nepal, Bhutan.
Hiện nay, khoảng hơn 400 loài thuộc chi Cordyceps đã được phát hiện, trong
đó, có khoảng 90 lồi được phát hiện ở Trung Quốc (Zhou X. và cs, 2009).
Tại Việt Nam, Đông trùng hạ thảo cũng đã được phát hiện tại nhiều địa điểm
khác nhau. Năm 2009, Phạm Quang Thu và cộng sự đã phát hiện 3 loài là
Cordyceps nutans Pat. tại khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động – Bắc
Giang, Cordyceps gunni Berk tại vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc,
Cordyceps militaris Link tại vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai. Năm 2009,
Đái Duy Ban và cộng sự cũng công bố phát hiện mới của mình về lồi đơng

trùng hạ thảo lần đầu tiên được tìm thấy ở Việt Nam đó là lồi đơng trùng hạ
thảo có tên là Isaria cerambycidae.
Mặc dù nấm Cordyceps militaris phân bố rộng: ở Bắc Mỹ, châu Âu và châu
Á (Paul và cs, 2008), tuy nhiên, do bị khai thác quá mức nên nấm Cordyceps
militaris rất khan hiếm trong tự nhiên. Do đó, việc sản xuất ở quy mơ lớn để có
thể chiết xuất các dược liệu từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ
Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đề rất được quan tâm.
1.2. Nghiên cứu nuôi nhân tạo nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps military
1.2.1. Trong nước
10


Ở Việt Nam, việc nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo nấm Đông trùng hạ thảo
Cordyceps military được công bố trong các cơng trình nghiên cứu như:
Năm 2009, Phạm Quang Thu và cộng sự (Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt
Nam) công bố phát hiện 2 chủng Cordyceps là Cordyceps gunni tại Vườn Quốc
gia Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và Cordyceps militaris tại vườn quốc gia Hoàng Liên
(Lào Cai).
Đái Duy Ban và cộng sự (2009) cơng bố phát hiện lồi Đơng trùng hạ thảo
Isaria cerambycidae trên ấu trùng Xén tóc, châu chấu. Bên cạnh đó, nhóm tác
giả cũng cơng bố đã ni cấy nhân tạo thành công nấm Isaria cerambycidae.
Năm 2013, Nguyễn Mậu Tuấn và các cộng sự thuộc Trung tâm Nghiên cứu
Thực nghiệm Lâm nghiệp Lâm Đồng đã nghiên cứu và sản xuất thành công
Đông trùng hạ thảo tằm dâu (Paecilomyces tenuipes).
Năm 2015, Phạm Quang Thu (Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) đã
thành cơng trong nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi trồng nấm Đông trùng hạ
thảo Cordyceps militaris (L: Fr.) Link có giá trị dược liệu và thương mại cao.
1.2.2. Trên thế giới
Trên thế giới, đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về nấm Đơng trùng hạ thảo.
Các cơng trình tập trung vào các nội dung: nghiên cứu nuôi trồng nhân tạo,

nghiên cứu về tác dụng dược liệu.... Những năm gần đây, rất nhiều tính chất
dược lý của lồi nấm này được nghiên cứu và công bố trên các tạp chí chun
ngành.
Các nghiên cứu về ni trồng nhân tạo và tác dụng dược lý của Đông trùng
hạ thảo đã được công bố trong khoảng 20 năm trở lại đây gồm:
Năm 2004, Yoo H.S và cs công bố: Dịch chiết từ thể quả Cordyceps
militaris có tác dụng chống ung thư, hiệu quả đối với hai loại tế bào màng trong
tĩnh mạch rốn là HT1080 và B16-F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các
mạch máu mới bằng cách giảm sự biểu hiện của bFGF, một trong những nhân tố
kích thích q trình này. Do có vai trị kìm hãm q trình tạo thành các mạch
máu mà có thể ngăn chặn được quá trình di căn và sự phát trin của tế bào ung
thư. Ngồi ra, dịch chiết nấm Đơng trùng hạ thảo cịn có tác dụng kìm hãm sự
11


phát triển của tế bào ung thư vú, ung thư phổi (Ahn Y.J. và cs, 2001). Mặt khác,
dịch chiết bằng nước ấm nấm Cordyceps militaris có tác dụng kìm hãm sự phát
triển của dòng tế bào ung thư máu ở người bằng cách gây ra hiện tượng tự chết
của các tế bào thơng qua sự hoạt hố enzym caspase-3 (Lee H. Và cs, 2006).
Năm 2005, cơng trình nghiên cứu của Won S.Y và Park E.H. cho thấy
Cordyceps militaris có tác dụng chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy. Ahn
Y.J. và cs (2000) cho rằng nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng chống viêm
nhiễm kìm hãm sự phát triển của một số vi rút, vi khuẩn và nấm. Ngoài ra nấm
Đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris cịn có tác dụng kìm hãm sự oxy hố
của lipit, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis
L.M., 2004).
Jae Sung Kim và cs (2006) đã sử dụng nhộng tằm để nuôi trồng thể quả
nấm Cordyceps militaris. Nhộng tằm được đựng trong các lọ nuôi cấy, khử trùng
ở 121ºC trong thời gian 90 phút, để nguội, cấy giống nấm, sau 20 ngày sợi nấm
ăn kín tồn bộ giá thể trong điều kiện nhiệt độ 20-25 0C, cường độ ánh sáng 500700 lux đã hình thành mầm thể quả. Ni cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được

các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau:
40 g/l t đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH 2PO4, 0.5 g/lít
K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O. Hai loài Cordyceps sinensis (Berk.)
Sacc. và Cordyceps militaris (L. ex Fr.) Link. được tập trung nghiên cứu nuôi
trồng thể quả và nuôi cấy sinh khối hệ sợi nhiều nhất (Russell R., Paterson M.,
2008).
Trung Quốc có các trang trại lớn chun ni trồng loài nấm này ở các tỉnh
như: Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tơ... Chỉ tính riêng
một trang trại ni trồng lồi nấm này tại Kaiping, Quảng Châu, sản lượng một
năm đã thu được 100000 kg sản phẩm. Sản phẩm nấm đông trùng hạ thảo từ
nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới kể cả các nước phương
Tây và mang lại lợi nhuận cao cho các doanh nghiệp và người nuôi trồng nấm.
(Li Cui và cs., 2008).

12


Tại Thái lan, Patcharaporn Wongsa (2005) đã nghiên cứu phân lập và sự sinh
trưởng của hệ sợi, hình thành bào tử chồi của nấm Cordyceps unilateralis ký
sinh trên kiến. Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast
Extract Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA (Malt
Extract Agar) được dùng để phân lập và nuôi cấy hệ sợi.
Tại Hàn Quốc, Duck-Hyun Cho và cs (2003), đã tiến hành nghiên cứu sự
sinh trưởng của hệ sợi của 3 chủng ký hiệu là CHO-7208; CHO-7845; CHO7846 của loài Cordyceps militaris trên mơi trường dinh dưỡng và q trình hình
thành quả thể nấm Cordyceps militaris với giá thể là sâu non loài Allomyrina
dichotoma Linnaeus. Kết quả cho thấy sự sinh trưởng của hệ sợi của các chủng
khác nhau là khác nhau trong ni cấy thuần khiết. Chỉ có 2 chủng CHO-7208
và CHO-7846 hình thành quả thể khi sử dụng sâu non Allomyrina dichotoma
Linnaeus làm giá thể. Chiều dài của quả thể đạt 51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy.
Tại thành phố Hayward, bang California, Mỹ, Công ty Công nghệ sinh học

BIOKEN đã ni trồng quy mơ cơng nghiệp lồi nấm Cordyceps militaris. Sản
phẩm được tiêu thụ trong nước và thị trường quốc tế.
Như vậy, nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps militaris đã được các nhà
khoa học trên thế giới thực hiện từ quy mơ phịng thí nghiệm thu sinh khối sợi
nấm, tới quy mô lớn hơn là thu quả thể nấm, và được tiến hành ở nhiều nước
trên thế giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ...

13


PHẦN 2
NỘI DUNG, MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Mục tiêu nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu chung
Góp phần hồn thiện quy trình kỹ thuật ni trồng nấm Đơng trùng hạ thảo
(Cordyceps militaris).
2.1.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định được tốc độ lắc thích hợp cho mật độ cầu nấm cao, kích thước
đồng đều, trịn, màu sáng.
- Xác định được hàm lượng cơ chất thích hợp cho tạo quả thể đẹp, năng
suất cao.
- Xác định được chế độ ủ tối thích hợp cho hệ sợi nấm phát triển đều, kín,
mọc dày và xốp.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng tạo cầu nấm (spherical fungal
pellets) và chất lượng cầu nấm.
- Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất đến sự phát triển và năng suất quả thể.
- Ảnh hưởng của thời gian ủ tối đến sự phát triển hệ sợi nấm.
2.3. Vật liệu nghiên cứu, địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu

Chủng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris THV 05 do Cty TNHH
MTV Tinh hoa Việt cung cấp.
Hóa chất:
- Các loại muối khoáng đa lượng KH2PO4, Mg2SO4.
- Các chất hữu cơ Pepton, cao nấm men, glucose và Vitamin B1.
Thiết bị:
Sử dụng trang thiết bị, máy móc tại Phịng thí nghiệm nuôi trồng nấm Đông
trùng hạ thảo của Công ty TNHH MTV Tinh hoa Việt, địa chỉ K5 – Trường Đại
học Lâm nghiệp. Bao gồm: Nồi hấp khử trùng, Box cấy vô trùng, máy lắc, máy
14


tạo ẩm, tủ lạnh, cân điện tử, thiết bị đo nhiệt độ, độ ẩm, chai lọ, bình thủy tinh,
hộp nhựa ni cấy, v.v. Phịng ni tối, phịng ni sáng tự động điều khiển
nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm khơng khí trong phịng.
2.3.2. Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm
- Địa điểm: phịng ni Cơng ty TNHH MTV Tinh hoa Việt
- Điều kiện bố trí thí nghiệm:
+ Ánh sáng: thời gian chiếu sáng 18h/ngày.
+ Cường độ ánh sáng: 600 lux.
+ Nhiệt độ phịng ni cấy: 18 - 22ºC
+ Độ ẩm trung bình: 90 - 95%.
- Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Xác định ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng tạo sinh khối nấm
Cordyceps militaris
Chuẩn bị 36 bình dung dịch để cấy giống nấm ni cấy với thành phần mơi
trường trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1: Tốc độ lắc và thành phần môi trường ni cấy nấm Cordyceps
militaris

Cơng thức
CT1

Tốc độ lắc
(vịng/phút)

Thành phần mơi trường
20g/l Glucose; 0,1g/l

100

MgSO4.7H2O; 0,1g/l
CT2

150

KH2PO4; 5g/l cao nấm
men; 5g/l Pepton; 0,1g

CT3

200

Vitamin B1

Các bình mơi trường được bọc kín sau đó đưa đi hấp khử trùng trong nồi hấp
với nhiệt độ 126oC trong 45 phút sau đó để nguội và tiến hành cấy giống.
Dùng que cấy lấy giống cấp I trên môi trường thạch nghiêng trong ống
nghiệm, kích thước miếng thạch chứa sợi nấm (5 x 5 mm) chuyển sang môi
15

trường lỏng nhân giống cấp 2. (Thành phần môi trường: 20g/l Glucose + 0,1g/l
MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 5g/l Pepton + 0.1g
Vitamin B1, pH = 6.5).
Bố trí thí nghiệm với 3 cơng thức được ni lắc trên 3 tốc độ khác nhau.
Bình giống CT1 được ni trên máy lắc tốc độ 100 vịng/phút: Bình giống CT2
được ni trên máy lắc với tốc độ 150 vịng/phút và bình giống CT3 là 200
vịng/phút. Cả 3 CT trên đều được nuôi lắc ở điều kiện 28oC trong nhiều ngày để
theo dõi sinh khối. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.4.2. Xác định ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất đến sự phát triển và năng
suất quả thể
Thí nghiệm được bố trí trên 3 cơng thức (GT1 - GT3). Mỗi công thức được
tiến hành với 36 hộp môi trường chứa giá thể nuôi cấy với hàm lượng cơ chất
khác nhau và được lặp lại 3 lần, các điều kiện trong nuôi cấy đảm bảo ổn định
và giống nhau. Cấp lượng dịch dinh dưỡng bằng hàm lượng cơ chất cho mỗi
bình, sau đó bọc kín đem đi hấp khử trùng nhiệt độ 126ºC trong 30 phút, để
nguội tự nhiên và cấy lượng giống như nhau (20 ml).
Tiến hành ủ tối để hệ sợi nấm phát triển ăn lan kín hộp mơi trường. Tiếp theo
chuyển các bình sang giai đoạn chiếu sáng kích bật mầm quả thể và chăm sóc
quả thể với điều kiện chiếu sáng 600 lux, độ ẩm 90-95%, nhiệt độ 18-22ºC.
Theo dõi và thống kê sự sinh trưởng của nấm ở các ở các công thức vào các
thời điểm: hệ sợi ăn lan kín bình mơi trường, bắt đầu xuất hiện quả thể, số
lượng và kích thước quả thể ở mỗi bình trong các cơng thức ni cấy.
Quan sát, so sánh và ghi lại kết quả sự sinh trưởng và phát triển của quả thể
nấm C. militaris nhằm xác định hàm lượng cơ chất thích hợp cho quá trình sinh
trưởng và phát triển của quả thể.
Đánh giá đặc điểm hình thái quả thể, tiến hành đo kích thước quả thể ở mỗi
công thức.
Bảng 2.2: Công thức phối trộn hàm lượng cơ chất

GT1
GT2
GT3
Gạo lức khô: 20g
Gạo lức khô: 40g
Gạo lức khô: 60g
20ml dịch dinh dưỡng 40ml dịch dinh dưỡng 60ml dịch dinh dưỡng
16


gồm (20g/l Glucose + gồm (20g/l Glucose + gồm (20g/l Glucose +
0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l

MgSO4.7H2O

+

0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao
nấm men + 5g/l Pepton + nấm men + 5g/l Pepton + nấm men + 5g/l Pepton +
0,1g Vitamin B1)

0,1g Vitamin B1)

0,1g Vitamin B1)

2.4.3. Xác định ảnh hưởng của thời gian ủ tối kích thích sợi nấm
Thời gian ủ tối là một trong các điều kiện môi trường quan trọng ảnh hưởng
đến sinh trưởng của vi sinh vật.
Bố trí thí nghiệm tiến hành tiến hành với 36 hộp ni cấy cho mỗi cơng
thức, thí nghiệm lặp lại 3 lần. Đem các hộp nuôi cấy nấm ủ tối trong các thang

thời gian khác nhau lần lượt từ 3 ngày, 7 ngày và 9 ngày. Tiến hành quan sát sự
ăn lan của hệ sợi nấm ở các thang thời gian khác nhau, các hộp đảm bảo được
nuôi trồng ở cùng điều kiện độ ẩm và nhiệt độ như nhau. Xác định sự sinh
trưởng của hệ sợi thông qua màu sắc của hệ sợi nấm sau 3 ngày, 7 ngày và 9
ngày tương đương với 3 công thức là UT1-UT3 .
Quan sát, so sánh và ghi lại kết quả sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi
nấm C. militaris nhằm xác định thời gian ủ tối thích hợp cho q trình sinh
trưởng và phát triển của quả thể.
Đánh giá đặc điểm hình thái quả thể sau ủ tối, tiến hành đo kích thước quả
thể và số lượng quả thể /hộp ở mỗi công thức.
2.4.4. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Sử dụng các dụng cụ như thước đo để xác định kích thước, đếm số lượng
quả thể. Mỗi cơng thức được nhắc lại 3 lần.

17


Phần 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng tạo cầu nấm
Trong nghiên cứu này sử dụng môi trường nuôi cấy giống cấp II (mơi trường
lỏng) có thành phần gồm pepton, cao nấm nem, glucose, vitamin B1 với hàm
lượng: 20g/l glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm
men + 5g/l pepton, 0,1g vitamin B1, pH = 6,5. Bình mơi trường 500 (ml) được
bọc kín, hấp khử trùng ở nhiệt độ 126ºC trong 45 phút, để nguội và tiến hành
dùng que cấy lấy giống cấp I trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm,
kích thước miếng thạch chứa sợi nấm (5 x 5 mm) chuyển sang mơi trường lỏng
đã chuẩn bị. Thí nghiệm được bố trí trong cùng điều kiện nhiệt độ, độ ẩm và tốc
độ lắc thay đổi là 100, 150 và 200 vịng/phút tương ứng với 3 cơng thức CT1,
CT2 và CT3. Theo dõi sự hình thành và phát triển của cầu nấm ở các cơng thức

thí nghiệm, ghi lại đặc điểm của cầu nấm, kết quả nghiên cứu thể hiện ở Bảng
3.1 và Hình 3.1.
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng tạo cầu nấm
Thời gian
Công
thức

Tốc

Đường kính

bắt đầu

Mật độ

độ lắc

cầu nấm

xuất hiện

cầu

(v/p)

(mm)

cầu nấm

nấm

Hình thái cầu
nấm

(giờ)
Cầu nấm kích
CT1

100

3,0 ± 0,1

36 ± 2,0

Trung

thước khơng đồng

bình

đều, có hiện tượng
kết dính
Cầu nấm có kích

CT2

150

1,5 ± 0,5

24 ± 1,5

Cao

thước đồng đều,
màu sáng

CT3

200

1,0 ± 0,2

24 ± 0,5
18

Cao

Cầu nấm có kích


thước nhỏ đồng
đều, có màu sáng
Kết quả ở Bảng 3.1 chỉ ra: Trong số 3 mẫu công thức đều cho thấy đặc điểm
chung là cầu nấm đều sinh trưởng phát triển tốt nhất ở tốc độ lắc 150 vòng/phút.
Ở tốc độ lắc 100 vịng/phút mật độ cầu nấm trung bình và cầu nấm phát triển
chậm, kích thước cầu nấm khá lớn. Ngun nhân này có thể giải thích rằng vì
tốc độ lắc chậm nên cầu nấm dễ bị kết dính lại với nhau và chỉ tập trung ở đáy
bình. Với tốc độ lắc 200 vịng/phút cầu nấm có màu trắng phát triển nhanh, mật
độ cầu nấm cao, nhưng có kích thước tương đối nhỏ. Ngun nhân cầu nấm có

kích thước nhỏ là vì tốc độ lắc quá nhanh nên cầu nấm khó phát triển sợi nấm
trong cầu nấm. Tốc độ lắc 150 vịng/phút cầu nấm có màu trắng phát triển nhanh
và có mật độ cầu nấm cao, kích thước cầu nấm đồng đều nhau.
Từ kết quả Bảng 3.1 và Hình 3.1 có thể kết luận rằng tốc độ lắc thích hợp
nhất cho ra cầu nấm trắng, đồng đều nhau thích hợp cho ni cấy là tốc độ lắc
150 vịng/phút. Thực tế trong sản xuất nếu sử dụng dịch giống chứa mật độ cầu
nấm cao, có cầu nấm quá to sẽ gây khó khăn trong việc cấy giống ni trồng.

100 vịng/phút

150 vịng/phút

200 vịng/phút

Hình 3.1: Ảnh hưởng của các tốc độ lắc khác nhau đến khả năng tạo
cầu nấm sau 7 ngày nuôi cấy
3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất tới khả năng tạo quả thể
19


Lượng cơ chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy có khả năng ảnh hưởng đến
năng suất, chất lượng hình dạng quả thể cũng như hàm lượng dược tính của quả
thể. Do vậy, việc xác định được hàm lượng cơ chất phù hợp sẽ mang lại hiệu
suất cao trong thu hoạch quả thể và là cơ sở cho tính tốn để tiết kiệm chi phí
sản xuất.
Nghiên cứu được tiến hành trên 1 loại cơ chất gạo lức nhưng tương ứng với
các công thức khác nhau sẽ bổ sung hàm lượng cơ chất khác nhau và thể tích
dịch dinh dưỡng phối trộn cùng cơ chất gạo lức là khác nhau. Các yếu tố khác
như lượng giống (20ml) được bơm cho các cơng thức là như nhau, điều kiện
chăm sóc là như nhau. Mục tiêu của nghiên cứu là chọn được hàm lượng cơ chất

thích hợp cho sự phát triển quả thể mà lại tiết kiệm chi phí nguyên liệu cho sản
xuất.
Sau khi được nuôi cấy trên 3 công thức môi trường tương ứng với 3 loại
hàm lượng cơ chất khác nhau, đặc điểm sinh trưởng, phát triển và tạo quả thể
của nấm C. militaris được thống kê trong Bảng 3.2 và hình ảnh thu thập trong
quá trình nghiên cứu trình bày trong Hình 3.2.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất đến sự phát triển quả thể
Thời

Cơng
thức
mơi
trường

gian

Thời

Kích thước

hệ sợi

gian

quả thể trung

nấm

xuất

ăn lan

hiện

kín

quả

giá

thể

thể

(ngày)

(ngày)

Sinh

Đặc điểm quả thể

bình

khối
quả thể
(g/hộp)

Chiều Đường
dài

kính

(mm)

(mm)

20

Sau 30

Sau 45

ngày

ngày


Quả
GT1

GT2

5

8

15

20

25 ±

35 ±

1,0 ±

0,3

3,0

0,3

40 ±

40 ±

1,5 ±

0,3

1,5

0,3

nấm

9

20

thể

phát nấm mảnh,

triển nhanh cao

vừa

mọc thưa, phải,

màu

màu vàng vàng
Quả
thể
Quả
thể
nấm mọc
nấm khá to,
thưa,
cao
vừa
tương đối
phải, mọc
chậm phát
dày, màu
triển, màu
vàng cam
vàng cam

Quả
thể Quả
thể
mọc

GT3

thể Quả

dày, nấm to vừa

41 ±

45 ±

1,8 ±

tương đối phải,

mọc

0,2

2,0

0,2

chậm phát khá

dày,

triển, màu màu

vàng

vàng cam

cam

Dựa vào Hình 3.2 và kết quả nghiên cứu Bảng 3.2 cho thấy cơng thức tối ưu
nhất ở thí nghiệm này là công thứ GT3 với 60g gạo lức cho sinh khối quả thể
tươi đạt 41,2g/hộp, tiếp theo đó là cơng thức GT2 với 40g gạo lức cho sinh khối
quả thể tươi 40,3g/hộp. Cuối cùng là công thức GT1 với hàm lượng 20g gạo lức
cho ra quả thể phát triển kém nhất với 25,3g/hộp. Giải thích cho điều này là bởi
vì hàm lượng cơ chất và dịch dinh dưỡng ít nên chỉ đủ cho quả thể phát triển
nhanh vào thời gian đầu (Hình 3.2 A) bởi hệ sợi dễ dàng ăn lan kín bề mặt giá
thể với thời gian ngắn nhất, nhưng sau đó vì hàm lượng cơ chất và dinh dưỡng ít
nên tốc độ phát triển quả thể chậm lại và chỉ phát triển thêm về chiều cao nên
quả thể của cơng thức GT1 có chiều cao và đường kính lại kém phát triển hơn 2
công thức GT2 và GT3.

21


Cơng thức GT2 và GT3 có thời gian hệ sợi ăn lan kín hộp mơi trường và
xuất hiện quả thể, năng suất khá gần nhau. Thời gian đầu cả 2 cơng thức GT2 và
GT3 đều có thời gian hệ sợi ăn lan kín mơi trường khá muộn, bởi hàm lượng cơ
chất cao khiến hệ sợi mất thời gian ăn lan kín khơng được nhanh như cơng thức
GT1, nhưng ngược lại quả thể của cả 2 công thức đều phát triển dày, quả thể có
kích thước lớn tương đối lớn và màu đẹp. Nguyên nhân là vì hàm lượng cơ chất

và dịch dinh dưỡng bổ sung vào môi trường ảnh hưởng tới kích thước quả thể và
năng suất. Quả thể phát triển hơn so với cơng thức GT1 là vì hàm lượng cơ chất
và dịch dinh dưỡng nhiều hơn nên đủ cung cấp cho quả thể phát triển đến khi
thu hoạch.
Vì vậy cần lựa chọn công thức hàm lượng cơ chất thích hợp cho ra quả thể
đẹp, năng suất tốt, mà lại có thể giảm chi phí ngun liệu đầu vào. Từ 3 công
thức trên, nhận thấy công thức GT2 là thích hợp nhất khi đưa vào sản xuất thực
tế sẽ thích hợp nhất vì sẽ tiết kiệm được chi phí nguyên liệu mà sản lượng lại
không kém hơn công thức GT3.

A

B

22


C

D

E
F
Hình 3.2: Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất đến sự phát triển quả thể
A, B: Sự phát triển của quả thể nấm nuôi cấy trên môi trường GT1 sau 25 ngày
(A) và 45 ngày (B)
C, D: Sự phát triển của quả thể nấm nuôi cấy trên môi trường GT2 sau 25 ngày
(C) và 45 ngày (D)
E, F: Sự phát triển của quả thể nấm nuôi cấy trên môi trường GT3 sau 25 ngày (E)
và 45 ngày (F)

3.3. Ảnh hưởng của thời gian ủ tối tới sự phát triển quả thể
Nghiên cứu sử dụng loại cơ chất chủ yếu là 40g gạo lức + 40 ml dịch dinh
dưỡng (gồm 5g pepton, 5g cao nấm men, 0,1g Vitamin B1, 1g MgSO4, 0,5g
KH2PO4, 30g glucose) là tỷ lệ tối ưu đã nghiên cứu ở thí nghiệm xác định ảnh
hưởng của hàm lượng cơ chất. Sau đó bọc kín hộp rồi đưa đi tiến hành hấp khử
trùng trong 45 phút với 121ºC, để nguội tự nhiên và tiến hành cấy 15ml dịch
23


giống. Đưa đi tiến hành ủ tối trong các khoảng thời gian khác nhau ở cùng điều
kiện nhiệt độ 20ºC, độ ẩm khoảng 75-80%, từ đó xác định được thời gian ủ tối
thích hợp kích thích sợi nấm phát triển, ăn lan trên bề mặt giá thể tốt nhất.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời gian ủ tối tới sự phát triển quả thể
Công thức
Thời gian bắt đầu xuất
hiện hệ sợi (ngày)
Thời gian bắt đầu xuất
hiện quả thể (ngày)
Sinh khối quả thể
(g/hộp)

UT1

UT2

UT3

0

5

7

20

15

12

30 ± 26

50 ± 3

51 ± 2

Hệ sợi phát triển
mảnh, ăn lan
Sau 12 ngày

kín bề mặt có
màu vàng, bề
mặt hệ sợi

Đặc

không bông xốp

Hệ sợi ngừng
Hệ sợi ngừng

phát triển, bề

phát triển có

mặt hệ sợi

màu vàng, bề

bơng xốp có

mặt hệ sợi

màu vàng, bắt

bơng xốp nhẹ

đầu hình thành
quả thể

điểm
hệ sợi
và quả

Sau 24 ngày

Quả thể bắt đầu

Quả thể bắt

Quả thể bắt đầu

hình thành

đầu phát triển

phát triển

Quả thể nấm

Quả thể nấm

Quả thể nấm to

mảnh, thấp, màu

mảnh, cao,

vừa phải , cao,

vàng cam

màu vàng cam

màu vàng cam

thể

Sau 65 ngày

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.3 và Hình 3.3, Hình 3.4 cho
thấy: Thời gian ủ tối thích hợp nhất là 9 ngày (cơng thức UT3) bởi đây là thời
gian hệ sợi ăn lan kín, có màu trắng và hệ sợi có độ xốp khi quan sát bẳng cảm
quan của mắt có thể hệ sợi nấm phát triển khỏe nhất (Hình 3.3). Bằng chứng là

24


sau 65 ngày kể từ khi đưa hộp nuôi cấy ra kích sáng thì quả thể nấm mọc dày, có
chiều dài, kích thước tương đối nhau (Hình 3.4)
Ủ tối 3 ngày sau đó chuyển sang kích sáng (cơng thức UT1) thì quả thể nấm
có kích thước ngắn và quả thể mảnh; có thể giải thích cho lý do quả thể kém
phát triển này là khi ủ tối 3 ngày thì hệ sợi nấm còn kém và yếu, hệ sợi chưa bắt
đầu ăn lan kín bề mặt vậy nên nếu chuyển hộp ni cấy ra kích sáng thì sẽ xảy
ra hiện tượng quả thể kém phát triển.
Đối với thời gian ủ tối 7 ngày (cơng thức UT2) thì hệ sợi đã có sự ăn lan kín
song hệ sợi chưa ăn lan kín hết trên bề mặt giá thể, bề mặt hệ sợi mới bắt đầu có
độ xốp, thời gian này chưa phù hợp chuyển sang giai đoạn kích sáng, nên sau 65
ngày quả thể của cơng thức UT2 có phần kém phát triển hơn của cơng thức
UT3.
Vì vậy cơng thức ủ tối thích hợp nhất cho sản xuất là cơng thức UT3 với thời
gian ủ tối là 9 ngày cho ra quả thể mọc dày, màu đẹp, năng suất tốt trung bình
50,3g/hộp.

Ủ tối 9 ngày

Ủ tối 7 ngày

Ủ tối 3 ngày

Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian ủ tối đến sự phát triển của hệ sợi
nấm sau 12 ngày chuyển từ nấm trong tối ra ni ngồi sáng

25