LUẬN văn THẠC sĩ HAY nghiên cứu sản xuất interleukin 2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào escherichia coli trong điều kiện GMP​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------

Nguyễn Thị Minh Thu

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT INTERLEUKIN-2 NGƢỜI TÁI TỔ HỢP
DẠNG CẢI BIẾN TRÊN DÒNG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI
TRONG ĐIỀU KIỆN GMP

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
GS. TS. Trƣơng Nam Hải

Hà Nội, 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan tồn bộ kết quả trong khóa luận là do chính tơi trực
tiếp thực hiện.
Các số liệu và kết quả đƣợc cơng bố trong khóa luận là hồn tồn trung
thực, chính xác và chƣa đƣợc cơng bố ở bất kỳ cơng trình nào khác.
Hà Nội, ngày

tháng 12 năm 2015

Học viên cao học

Nguyễn Thị Minh Thu

i
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới GS. TS. Trƣơng Nam Hải
và TS. Phùng Thu Nguyệt, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Cơng nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và dìu dắt tơi trong suốt thời gian tôi
học tập và nghiên cứu.
Tiếp đến tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của trƣờng
Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật, các thầy, cô của Viện
Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giảng dạy cho tơi trong suốt thời gian tham gia
khóa học.
Tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể các cán bộ nghiên cứu, nhân viên của
phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học và Công ty TNHH Vắc xin và
Sinh phẩm số 1(VABIOTECH) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam đã tận tình chỉ bảo
động viên và cho tôi những lời khuyên quý giá trong cơng việc cũng nhƣ cuộc sống.
Và sau cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới gia
đình và bạn bè, những ngƣời đã hết lịng ủng hộ và động viên tôi trong suốt thời
gian tôi học tập và công tác.
Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Học viên cao học

Nguyễn Thị Minh Thu

ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................v
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................4
1.1. Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới ....................................................4
1.2. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ ........................................................................5
1.3. Tổng quan về Interleukin-2 ..................................................................................6
1.3.1. Cấu trúc của Interleukin-2 ................................................................................6
1.3.2. Cơ chế hoạt động và chức năng sinh học của Interleukin-2 ............................8
1.3.3. Vai trò của Interleukin-2 trong điều trị ung thư ...............................................9
1.4. Hệ biểu hiện E. coli ............................................................................................12
1.4.1. Hệ biểu hiện E. coli BL21 ...............................................................................13
1.4.2. Vector biểu hiện pET22b(+) ...........................................................................14
1.4. Lên men sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống lên men Bioreactor .............16
1.4. Tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao .............................17
1.5. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dịng tế bào CTLL2 .........................19

1.6. Phịng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP ..............................................................20
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................22
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................22
2.1.1. Chủng giống và plasmid..................................................................................22
2.1.2. Hóa chất ..........................................................................................................22
2.1.3. Máy móc và thiết bị .........................................................................................22
2.1.4. Các môi trường và dung dịch ..........................................................................24
2.1.4.1. Môi trường sử dụng trong biểu hiện protein ...............................................24
2.1.4.2. Dung dịch sử dụng trong tiền tinh chế protein Interleukin-2 ......................24
2.1.4.3. Dung dịch sử dụng trong chạy hệ thống sắc ký HPLC ................................24
iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


2.1.4.4. Dung dịch sử dụng trong điện di SDS - PAGE ............................................24
2.1.4.5. Dung dịch sử dụng để hiện kết quả điện di SDS – PAGE ............................25
2.1.4.6. Dung dịch sử dụng trong phản ứng Western blot ........................................26
2.1.4.7. Dung dịch sử dụng trong phương pháp ELISA ............................................26
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................27
2.2.1. Biểu hiện protein Interleukin-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli ở các hệ thống
lên men 5 và 10 lít .....................................................................................................27
2.2.2. Phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế) .........................................27
2.2.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ....................................28
2.2.4. Xác định hoạt tính sinh học protein Interleukin-2 trên dịng tế bào CTLL2 ..29
2.2.5. Kiểm tra tính đặc hiệu của protein bằng phương pháp Western blot.............32
2.2.6. Kiểm tra độ sạch bằng phần mềm Quantity One ............................................33
2.2.7. Kiểm tra nội độc tố bằng LAL kit ....................................................................33
2.2.8. Xác định hàm lượng protein trong mẫu tinh chế bằng phương pháp ELISA .34

2.2.9. Điện di SDS-PAGE .........................................................................................35
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................37
3.1. Tối ƣu lên men chủng E. coli BL21 IL-2 trên quy mô nồi lên men 5 và 10 lít .38
3.1.1. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 5 lít .......................38
3.1.2. Khảo sát thành phần dinh dưỡng và nồng độ chất cảm ứng ..........................39
3.1.3. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở quy mơ hệ thống lên men 10 lít đợt 1 .....42
3.1.4. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở hệ thống lên men 10 lít đợt 2 ..................46
3.2. Xử lý tiền tinh chế thu hồi IL-2 từ sinh khối tế bào lên men .............................49
3.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .......................................50
3.4. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dịng tế bào CTLL2 .........................53
3.5. Xác định độ tinh sạch của protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằngphần mềm
Quantity One .............................................................................................................55
3.6. Xác định hàm lƣợng nội độc tố trong sản phẩm IL-2 sau tinh chế ....................57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................58
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................59
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN .............................65
iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


PHỤ LỤC ..................................................................................................................66
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp
APS

Ampicillin
Ammoniumpersulfate

AU

Absorbance unit

BSA

Bovine serum albumin (Albumin huyết thanhbò)

CSE

Control standard endotoxin (Nội độc tốchuẩn)

CTL

Cytoxic T lymphocyte (Tế bào gây độc)

dH2O

Distilled water (nƣớc khử trùng)

DMSO

Dimethylsulfoxide

DNA

Deoxyribonucleicacid

dOT

Dissolved oxygene tension

E. coli

Escherichia coli

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay (Kĩ thuật chất hấp phụ

FBS

miễn dịch gắnenzym)
Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò)

HIV

Human Immunodeficiency Virus

IPTG

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

IL-2R

Interleukin-2 Receptor (Thụ thể củaIL-2)

kDa

KiloDalton

LAL

Limulus AmebocyteLysate

MTT

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium

PBS
PVDF

Phosphate
Bromide bufferedsaline
PolyvinylidineDifloride

PMSF

Phenylmethylsulfonyl fluoride

rhIL-2

Recombinant human Interleukin-2 (IL-2 ngƣời tái tổhợp)

SDS

Sodium dodecylsulfate

SDS –PAGE

Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gelelectrophoresis

TBS

Tris buffersaline

TEMED

N, N, N’, N’ – TetramethylEthylenediamin

TFA

Trifluoroacetic acid

TMB

Tetramethylbenzidine
v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


TTBS
VABIOTECH

TweenTris buffer saline
Công ty TNHH Một thành viên Vắc xin và Sinh phẩm số 1
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. 1: Tế bào NK tiêu diệt tế bào ung thƣ ..............................................................6
Hình 1. 2: Cấu trúc khơng gian của Interleukin-2 .........................................................7
Hình 1. 3: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của Interleukin-2 lên tế bào T [38] ......9
Hình 1. 4: Cơ chế hoạt động của Interleukin-2 .............................................................9
Hình 1. 5: Sự phát triển của tế bào ung thƣ biểu mơ thận ...........................................10
Hình 1. 6: Ung thƣ hắc tố ác tính ................................................................................11
Hình 1. 7: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+..................................................................15
Hình 1. 8: Cơ chế kiểm soát biểu hiện gene nhờ chất cảm ứng IPTG ........................16
Hình 1. 9: Lên men trên hệ thống Bioreactor tại phịng đạt tiêu chuẩn GMP ............17
Hình 1. 10: Hệ thống tinh sạch protein HPLC ............................................................18
Hình 3. 1: Sự biểu hiện protein IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống lên men 5 lít .............38
Hình 3. 2: Khảo sát bổ sung thành phần chất dinh dƣỡng và nồng độ IPTG trong quá
trình lên men ................................................................................................................42
Hình 3. 3: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21-IL2 đợt 1 .....43
Hình 3. 4: Điện di Protein tổng số khi biểu hiện chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ
thống lên men 10 lít đợt 1............................................................................................45
Hình 3. 5: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21-IL2 đợt 2 .....47
Hình 3. 6: Điện di Protein tổng số khi biểu hiện chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ
thống lên men 10 lít đợt 2............................................................................................48
Hình 3. 7: Kiểm tra sản phẩm tiền tinh chế của 2 đợt lên men trong hệ thống 10 lít .49
Hình 3. 8: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC .............................................51
Hình 3. 9: Kết quả kiểm tra protein IL-2 sau khi tinh sạch bằng hệ thống HPLC ......52
Hình 3. 10: Biểu đồ thể hiện sự kích thích tăng sinh tế bào CTLL-2 của các mẫu IL-2
tái tổ hợp ......................................................................................................................53
Hình 3. 11: So sánh hoạt tính sinh học riêng của các mẫu IL-2 .................................55
Hình 3. 12: Kiểm tra độ tinh sạch của protein IL-2 bằng Quantity One .....................56
Hình 3. 13: Kết quả độ tinh sạch của IL-2 xác định bằng phần mềm Quantity One ..56
vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Hình 3. 14: Hình ảnh kết quả sau khi dừng phản ứng đông gel ..................................57

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3. 1: Giá trị OD mẫu thu đƣợc sau quá trình lên men ........................................40
Bảng 3. 2: Giá trị EC50 và hoạt tính riêng của các mẫu IL-2 .....................................54

vii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


MỞ ĐẦU
Sức khỏe cộng đồng và ung thƣ là những vấn đề ngày càng đƣợc quan tâmở
hầu hết các quốc gia trên thế giới. Trong đó, ung thƣ là nguyên nhân chủ yếu gây tử
vong cho ngƣời bệnh và đang có xu hƣớng ngày càng gia tăng. Theo ghi nhận của
tổ chức Y tế Thế giới (năm 2012), trên thế giới có 14,1 triệu ca ung thƣ mớiđƣợc
phát hiện và 8,2 triệu ngƣời chết vì ung thƣ. Ƣớc tính tới năm 2030, mỗi năm sẽ có
thêm 25 triệu ca mới mắc bệnh. Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, trong
năm 2010 số ca mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307, ƣớc tính đến năm 2020 số ca
mắc ung thƣ mới là 190.000 ca. Nguyên nhân chính gây ung thƣ là do mơi trƣờng
bên ngồi cùng với chế độ sinh hoạt hằng ngày chiếm tới 90%.
Hiện nay các phƣơng pháp nhƣ phẫu thuật, hóa trị, xạ trị…vẫn là những
phƣơng pháp phổ biến nhất trong điều trị ung thƣ trên thế giới. Tuy nhiên, chúng
còn một số nhƣợc điểm nhƣ là có thể gây tổn thƣơng cho các tế bào lành, ảnh
hƣởng không tốt tới sức khỏe ngƣời bệnh. Ngồi các phƣơng pháp điều trị trên thì

liệu pháp miễn dịch là phƣơng pháp chữa trị hứa hẹn mang lại hiệu quả cao. Liệu
pháp này có thể tiêu diệt tế bào ung thƣ, khống chế khả năng phát triển nhanh chóng
của khối u và khơng làm tổn thƣơng các tế bào khỏe mạnh, tăng cƣờng khả năng
miễn dịch cho bệnh nhân, kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lƣợng sống. Do đó,liệu
pháp miễn dịch đƣợc coi là liệu pháp xanh vì có hiệu quả điều trị rõ rệt, khơng có
tác dụng phụ, an tồn và dung nạp tốt, mở ra một hình thức điều trị hồn tồn mới
cho bệnh nhân ung thƣ.
Liệu pháp miễn dịch sử dụng cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch nhằm
nhận biết và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh.Interleukin-2 (IL-2) là một
cytokineđƣợc tiết bởi tế bào lympho T đóng vai trị quan trọng trong đáp ứng miễn
dịch của cơ thể. Cytokine này tham gia vào q trình kích thích hệ thống miễn dịch
sản sinh ra các dòng tế bào T, đồng thời kích thích sự tăng sinh và biệt hóa các dịng
tế bào NK và các đại thực bào nhằm tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể. IL2 đã đƣợc sử dụng điều trị hiệu quả hai loại ung thƣ biểu mơ thận và ung thƣ da.
Ngồi ra, IL-2 cịn đƣợc sử dụng hỗ trợ điều trị các bệnh ung thƣ khác nhƣ ung thƣ

1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


phổi, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ buồng trứng,… và có khả năng kích hoạt hệ thống
miễn dịch để chống bệnh nhiễm HIV.
Năm 1992, Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã cho
phép sử dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị ung thƣ. Hiện nay, chế phẩm IL-2 với
tên thƣơng phẩm Proleukin® (Aldesleukin) đã đƣợc sản xuất bởi hãng Chiron và
thƣơng mại hóa trên tồn thế giới, tuy nhiên giá thành của Proleukin® cịn khá cao
(khoảng 2,5 nghìn USD/ống 1,3 mg). Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp
nói riêng và sản phẩm protein tái tổ hợp trong điều trị nói chung vẫn cịn bị bỏ ngỏ
và chƣa có sản phẩm protein tái tổ hợp đƣợc triển khai áp dụng hoàn toàn từ quá

trình nghiên cứu đến quá trình sản xuất . Để chủ động việc sản xuất IL -2 tái tổ hợp
trong nƣớc và giảm giá thành sản xuất với chi phí thấp phục vụ cho việc điều trị
bệnh ung thƣ ta ̣i Viê ̣t Nam , việc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất IL-2 tái
tổ hợp và chuyển giao sang công ty để sản xuất thử nghiệm là rất cần thiết.
Trong quá trình nghiên cứusản xuất IL-2 ngƣời tái tổ hợp, trình tự amino acid
của IL-2 đã đƣợc cải biến nhằm tạo ra đƣợc sản phẩm Interleukin-2 có trình tự
giống với sản phẩm Proleukin đã đƣợc FDA công nhận. Ngồi ra, việc cải biến trình
tự amino acid sẽlàm tăng hoạt tính và tăng tính an tồn cho sản phẩm. Sản phẩm
Proleukin cịn có tên hóa học là desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 tƣơng
ứng đột biến mất alanine ở vị trí amino acid số 1, thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng
serine. Để chuyển giao công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp từ quy mơ phịng thí
nghiệm sang phịng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP, chúng tôi đã tiến hành tối ƣu biểu
hiện protein IL-2 trong hệ thống lên men 5 và 10 lít tại Viện Cơng nghệ sinh học và
cơng ty VABIOTECH. Sau đó, sản phẩm lên men đƣợc tiến hành tiền xử lý và tinh
chế bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sản phẩm Interleukin-2 sau tinh
chế đƣợc tiến hành xác định hoạt tính sinh học và kiểm tra một số chỉ tiêu về độ
sạch và độ an toàn, để đáp ứng yêu cầu của sản phẩm tái tổ hợp sử dụng trong điều
trị trên ngƣời với giá thành thấp hơn thƣơng phẩm Proleukin.
Trên cơ sở đó chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất
Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli
trong điều kiện GMP”. Đề tài đƣợc thực hiện tại Công ty Vacxin và Sinh phẩm số
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


1, Bộ Y tế và phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới
Ung thƣ đang là một căn bệnh hết sức nguy hiểm khiến số lƣợng ngƣời tử
vong cao nhất thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health
Organization, WHO), trong năm 2008 có khoảng 12,7 triệu ca ung thƣ mới (trong
đó 6.672.000 nam giới, 5.779.000 nữ giới) và 7,6 triệu ngƣời đã tử vong do ung thƣ
(4.293.000 nam giới, 3.300.000 nữ giới)[31]. Đến năm 2012, có khoảng 14,1 triệu
ca ung thƣ mới (trong đó 7.410.000 nam giới, 6.658.000 nữ giới) và có 8,2 triệu
ngƣời tử vong (4.653.000 nam giới, 3.548.000 nữ giới) [13], số ngƣời mặc bệnh ung
thƣ tăng 11% so với 4 năm trƣớc. Ƣớc tính đến năm 2030 số ca mắc bệnh ung thƣ
trên thế giới tăng 70% tƣơng đƣơng với 25 triệu ca mới. Số liệu mới nhất theo
thống kê của Hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ (American Cancer Society) cho thấy số ca
ung thƣ mới tại Mỹ năm 2015 là 1.658.370 và có 589.430 ngƣời tử vong, số lƣợng
này đã giảm 0,43% so với năm 2014 số ca ung thƣ mới là 1.665.540 và số ngƣời tử
vong là 589.430 ngƣời.
Theo tổ chức nghiên cứu ung thƣ quốc tế (International Agency for Research
on Cancer) ƣớc tính trên tổng số ca ung thƣ tồn cầu, có khoảng hơn một nửa số ca
ung thƣ và hơn hai phần ba ca ung thƣ sẽ gia tăng và tập trung ở những nƣớc đang
phát triển. Những bệnh ung thƣ chủ yếu nhƣ: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ tiền
liệt tuyến, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ gan, ung thƣ máu, ung thƣ thận, ung thƣ
da,… Trong đó ung thƣ thận và ung thƣ da chiếm tỷ lệ khoảng 2 - 3% trên tổng số
ca ung thƣ [31].
Việt Nam là một trong những nƣớc đang phát triển, theo đó là sự thay đổi về
kinh tế, đời sống đƣợc nâng cao, các bệnh gây tử vong trƣớc đây nhƣ bệnh truyền

nhiễm và suy dinh dƣỡng đã giảm mạnh. Vấn đề không dừng lại ở đó, khi kinh tế
phát triển nhanh đồng nghĩa với nhiều vấn đề xảy ra nhƣ: ô nhiễm mơi trƣờng, chất
lƣợng thức ăn, béo phì,… Dẫn đến việc gia tăng các bệnh tật nhƣ tiểu đƣờng, tim
mạch và đặc biệt là ung thƣ. Theo nhƣ TS. BS. Bùi Xuân Trƣờng, Bệnh viện Đa
khoa Quốc tế VinMec cho biết, so với tỷ lệ chung trên thế giới thì Việt Nam thuộc
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


nhóm nƣớc có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất đối với: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ dạ
dày, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ gan, ung thƣ đại-trực tràng [62]. Bên cạnh đó tỷ lệ
ung thƣ gan tại Việt nam cũng thuộc mức cao nhất thế giới, đặc biệt ở nam giới
[62]. Hầu hết các bệnh ung thƣ phổ biến thƣờng gặp tại Việt Nam đều chƣa có xu
hƣớng giảm xuống và vẫn đang tiếp tục tăng lên [62]. Ƣớc tính khoảng 85% số
bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam đƣợc phát hiện khi đã ở độ tuổi trên 40 [62]. Theo
số liệu thống kê của bệnh viện K-Hà Nội và Trung tâm U bƣớu Thành phố Hồ Chí
Minh, mỗi năm có 150.000 ngƣời mắc ung thƣ mớitrong đó có 75.000 ngƣời tử
vong và tại bệnh viện K, tỷ lệ bệnh nhân mắc ung thƣ hằng năm tăng thêm khoảng
20-30% (PGS. TS. Trần Văn Thuấn, Phó giám đốc bệnh viện K, Viện trƣởng Viện
nghiên cứu phòng chống ung thƣ) [63]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới
năm 2008, dân số Việt Nam có khoảng 87 triệu ngƣời, số ca ung thƣ mới là 111.600
ngƣời (trong đó 55.000 nam giới, 56.500 nữ giới), có 82.000 ca tử vong (43.700
nam giới, 38.300 nữ giới) chiếm tới 73,5% tổng số bệnh nhân ung thƣ [14].Đặc biệt,
theo thống kê mới nhất của Bộ Y tế, trong hội thảo “Phối hợp đa ngành trong phòng
chống ung thƣ quốc gia” tổ chức ngày 8-12-2015, tại Hà Nội, trong năm 2010 số ca
mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307 và ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ
mới là 190.000 ca [64]. Nhƣ vậy, việc tìm ra các phƣơng pháp phòng và điều trị ung
thƣ nhằm giảm thiểu số ca mắc bệnh ung thƣ và tỉ lệ tử vong là rất cấp bách.

1.2. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ
Ung thƣ là một căn bệnh nguy hiểm và chiếm tỉ lệ tử vong rất cao, tuy nhiên
nó có thể đƣợc chữa khỏi hoàn toàn nếu phát hiện và điều trị sớm bằng các phƣơng
pháp khác nhau nhƣ: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp miễn dịch và liệu pháp
gen. Các phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau để đem lại
hiệu quả điều trị tốt nhất với mục tiêu là chữa khỏi và giúp kiểm soát hoặc làm giảm
nhẹ ung thƣ.Việc chọn lựa phƣơng pháp điều trị phụ thuộc vào từng dạng ung thƣ,
vị trí khối u, giai đoạn của bệnh cũng nhƣ thể trạng của bệnh nhân.
Các phƣơng pháp điều trị truyền thống nhƣ phẫu thuật, xạ trị và hóa trị đều
nhằm mục đích loại bỏ các tế bào ung thƣ, phá hủy chúng bằng thuốc hoặc các tác
nhân khác. Tuy nhiên, việc điều trị bằng ba phƣơng pháp này thƣờng gây ra các tác
5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


dụng phụ không mong muốn nhƣ làm tổn thƣơng các mơ bình thƣờng và các bộ
phận khác của cơ thể ngƣời bệnh.
Nhiều năm gần đây, những nghiên cứu về hệ thống miễn dịch ngày càng phát
triển mạnh. Điều trị ung thƣ bằng liệu pháp miễn dịch là phƣơng pháp kích thích hệ
miễn dịch của cơ thể gia tăng số lƣợng các tế bào miễn dịch, đặc biệt là các đại thực
bào và tế bào giết tự nhiên (NK) nhằm tăng cƣờng khả năng tiêu diệt tế bào ung thƣ
và khống chế khả năng phát triển, di căn của khối u. So với các phƣơng pháp điều
trị ung thƣ truyền thống thì liệu pháp miễn dịch có rất nhiều ƣu điểm hơn nhƣ là: (i)
an tồn, khơng gây hại cho cơ thể, không tiêu diệt tế bào khỏe mạnh, không tác
dụng phụ, không biến chứng; (ii) tiêu diệt một cách tự nhiên các tế bào ung thƣ di
căn, giúp dự phòng ung thƣ, ngăn chặn sự hình thành khối u; (iii) giúp bệnh nhân
đang điều trị bằng các liệu pháp khác nhanh chóng hồi phục nhờ có hệ miễn dịch
khỏe mạnh [54]. Trong các loại ung thƣ đƣợc điều trị bằng liệu pháp miễn dịch, ung

thƣ hắc tố da và ung thƣ thận ác tính đã đƣợc điều trị có kết quả nhờ IL-2 [20].

Hình 1. 1: Tế bào NK tiêu diệt tế bào ung thƣ
1.3. Tổng quan về Interleukin-2
Interleukin-2 (IL-2) ngƣời là một cytokine quan trọng trong hệ thống miễn
dịch, đƣợc tiết ra chủ yếu từ tế bào lympho T. IL-2 đƣợc Morgan và cộng sự phát
hiện năm 1975 nhƣ là một nhân tố có tác dụng kích thích sự tăng sinh của tế bào T
[29]. Năm 1983, gene il-2 đƣợc xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 4 ở ngƣời và
đƣợc nhân dòng lần đầu tiên [10], sau đó cấu trúc của nó đã đƣợc Taniguchi và
cộng sự làm sáng tỏ vào năm 1992 [39].
1.3.1. Cấu trúc của Interleukin-2

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Interleukin-2 ngƣời là một glycoprotein có khối lƣợng phân tử khoảng 15 kDa.
Sản phẩm dịch mã ban đầu của IL-2 gồm 153 amino acid và phải trải qua quá trình
biến đổi để tạo protein trƣởng thành. Một đoạn peptide tín hiệu tiết đầu N của
protein IL-2 gồm 20 amino acid đã đƣợc cắt bỏ và tạo thành rhIL-2 hoàn chỉnh chứa
133 amino acid [11]. Cụ thể, cấu trúc không gian có 4 chuỗi α – helix đƣợc cuộn
theo cấu trúc điển hình của họ cytokine loại 1. Các chuỗi xoắn nối với nhau tạo
thành cấu trúc liên kết “up – up – down – down”. Trong đó hai chuỗi xoắn đầu (A,
B) đƣợc định hƣớng vị trí “up” (nhìn từ đầu N) và hai chuỗi xoắn sau (C, D) đƣợc
định hƣớng ở vị trí “down”. Đoạn nối giữa hai chuỗi xoắn A và B có chứa một
chuỗi xoắn α nhỏ. Prolin ở vị trí 65 (Pro65) chia chuỗi xoắn B thành hai phần B và
B’. Chuỗi xoắn B nối với đoạn nối C – D bằng việc hình thành cầu nối disulfide
giữa 2 amino acid Cys58 và Cys105 tạo cấu trúc ổn định cho IL-2 [16].

Hình 1. 2: Cấu trúc không gian của Interleukin-2
Năm 1987, nghiên cứu của Grace Ju và cộng sự cho thấy có 3 vùng trên phân
tử IL-2 có vai trị quyết định hoạt tính sinh học của protein này đó là: (i) vùng tận
cùng đầu N (các gốc amino acid 1-20), (ii) vùng tận cùng đầu C (các gốc amino
acid 121 -133) và (iii) cầu disulfide giữa hai gốc Cys58 và Cys105. Nếu có đột biến
làm mất 20 amino acid ở đầu N và 10 amino acid ở đầu C có thể làm mất 99% hoạt
tính sinh học của IL-2 và khả năng liên kết của IL-2 với các thụ thể chúng [21].
Trình tự amino acid của IL-2 ngƣời tự nhiên có chứa 3 gốc Cystein tại các vị trí 58,
105, 125 trong đó hai gốc Cys58 và Cys105 tạo cầu disulfide. Việc hình thành chính
xác cầu disulfide này sẽ quyết định hoạt tính sinh học của IL-2 [24]. Sự thay đổi
hoặc đột biến ở gốc Cys105 làm phá hủy cầu disulfide và làm giảm 8-10 lần hoạt tính
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


của IL-2, bên cạnh đó sự thay thế hoặc đột biến Cys58 làm hoạt tính của IL-2 giảm
mạnh tới 250 lần [24]. Tuy nhiên, đột biến mất gốc Cys tại vị trí 125 chỉ ảnh hƣởng
rất ít đến hoạt tính sinh học của IL-2 do nó khơng tham gia vào việc nhận diện thụ
thể của IL-2 và đặc biệt khi thay đổi gốc Cys tại vị trí đó thành Ser khơng làm ảnh
hƣởng tới hoạt tính sinh học của cytokine này [24]. Do vậy, để có thể ngăn cản sự
tạo thành cầu disulfide không mong muốn giữa gốc Cys125 với hai gốc Cys58 hoặc
Cys105 mà vẫn giữ nguyên hoạt tính của protein thì IL-2 dạng cải biến đƣợc biến đổi
gốc Cys125 thành Ser125 [2]. Thêm vào đó, tại đầu N của protein IL-2 có điểm
glycosyl hóa đƣợc nhận biết bởi trình tự Ala – Pro – Thr ở 3 vị trí amino acid đầu
tiên. Trong tự nhiên IL-2 tồn tại ở trạng thái glycosyl hóa có tính thấm cao với
màng tế bào, nếu sử dụng IL-2 liều lƣợng lớn sẽ gây nên độc tính của protein này
trong cơ thể bệnh nhân [2]. Vì vậy IL-2 dạng thƣơng phẩm dùng làm thuốc tiêm sẽ

có các đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa. Proleukin (Aldesleukin) là một
dạng IL-2 thƣơng phẩm đƣợc sản xuất bởi công ty Chiron Hoa Kỳ, và đã đƣợc FDA
cơng nhận có khả năng chữa ung thƣ hắc tố da và ung thƣ thƣ biểu mô thận ác tính
vào năm 1992. Sản phẩm thƣơng mại này có trình tự amino acid cải biến bằng cách
loại bỏ amino acid alanine ở đầu N và thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine
[46]. Một nghiên cứu trƣớc đây cũng đã chứng minh sự thay đổi của 2 yếu tố trên
khơng làm thay đổi hoạt tính sinh học của protein IL-2 [32].
1.3.2. Cơ chế hoạt động và chức năng sinh học của Interleukin-2
Trong tự nhiên, IL-2 là một glycoprotein đóng vai trị quan trọng trong hệ
thống miễn dịch. IL-2 kích hoạt hệ miễn dịch nhận biết và loại bỏ các tế bào ung
thƣ, cụ thể IL-2 có khả năng hoạt hóa các tế bào bảo vệ đặc hiệu nhƣ tế bào T, tế
bào giết tự nhiên (natural killer-NK) và tế bào gây độc (Cytoxic T lymphocyte CTL), biệt hóa tế bào lympho giết tự nhiên (Lymphokine activated killer-LAK
cells). Nhiều nghiên cứu về IL-2 trên thế giới tập trung vào chức năng quan trọng
của IL-2 trong hệ miễn dịch cho thấy IL-2 chủ yếu đƣợc sinh ra từ tế bào T CD4+
(tế bào trợ giúp T helper TH), tế bào T CD8+ và tế bào T giết tự nhiên (Natural
killer T-NKT cells), ở một số điều kiện đặc biệt, lƣợng nhỏ IL-2 cũng có thể đƣợc
tạo ra từ các tế bào dendritic hoạt hóa (activated dendritic cells) [6]. Tế bào T hoạt
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


hóa biểu hiện các thụ thể ở bề mặt của tế bào cùng với sự tiết IL-2, sau đó IL-2 bám
vào thụ thể trên tế bào và kích thích sự phân chia tế bào. Khi tế bào T khơng cịn
đƣợc kích thích bởi IL-2 thì các thụ thể sẽ phân rã và quá trình tăng sinh kết thúc
[44].

Hình 1. 3: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của Interleukin-2 lên tế bào T [44]
Nhờ có sự kích thích tăng sinh các tế bào có khả năng diệt khối u của IL-2, khi

cơ thể xuất hiện tế bào bất thƣờng, lƣợng lớn tế bào NKT đã hoạt hóa để tấn cơng
và tiêm những chất làm phân hủy tế bào đích. Cho dù nhỏ hơn tế bào ung thƣ hay
thể virus, tế bào NKT thƣờng có thể tiêu diệt cùng lúc 2 hoặc nhiều tế bào ung thƣ.
Ngoài ra IL- 2 cịn kích thích tăng sinh một số tế bào khác nhƣ tế bào T gây độc
CTL, NK và LAK,… Các tế bào này tấn công và phá hủy các mầm bệnh, bao gồm
cả ung thƣ [42].

Hình 1. 4: Cơ chế hoạt động của Interleukin-2
1.3.3. Vai trò của Interleukin-2 trong điều trị ung thư
9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Interleukin-2 đóng vai trị rất quan trọng trong việc hỗ trợ và điều trị các bệnh
ung thƣ. Cho đến nay, IL-2 đã đƣợc cơng nhận là có hiệu quả trong việc điều trị các
bệnh ung thƣ nhƣ: ung thƣ bạch cầu, ung thƣ phổi, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ
vú,... đặc biệt là ung thƣ hắc tố ác tính (Malignant melanoma) và ung thƣ biểu mô
thận (Renal cell carcinoma, RCC) [41]. Bên cạnh đó, IL-2 đã đƣợc chứng minh khi
sử dụng với liều lƣợng thấp có khả năng ngăn ngừa chứng rối loạn tăng sinh các tế
bào lympho [7]. Năm 1992, IL-2 đã chính thức đƣợc FDA cho phép sử dụng trong
điều trị hai loại ung thƣ biểu mô thận và u hắc tố ác tính [35].
Ung thƣ biểu mơ tế bào thận là một dạng ung thƣ niêm mạc “ống lƣợn gần”
trong thận [47]. RCC chiếm khoảng 90 – 95% các trƣờng hợp ung thƣ thận, bệnh
thƣờng xuất hiện nhiều nhất trong độ tuổi 50 – 70 và điển hình là nam giới [23].
Nguyên nhân của ung thƣ thận là do đột biến gen, sử dụng thuốc lá, béo phì, sự phơi
nhiễm trong nghề nghiệp, tia xạ,… Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, mỗi
năm ở Mỹ có khoảng 31.200 trƣờng hợp ung thƣ thận đƣợc phát hiện, trong đó
11.900 trƣờng hợp tử vong (năm 2006). Mặc dù ở Việt Nam chƣa có số liệu thống

kê đầy đủ nhƣng ung thƣ thận đƣợc xếp hàng thứ 3 trong các loại ung thƣ của hệ
tiết niệu[55]. Nó có thể di căn trực tiếp sang mơ mỡ quanh thận hay dây chằng bao
quanh thận, di căn sang các cơ quan khác qua máu hay mạch bạch huyết đến phổi,
xƣơng hoặc não.

Hình 1. 5: Sự phát triển của tế bào ung thƣ biểu mô thận [56]
Ung thƣ thận không phải là một bệnh không thể điều trị, tuy nhiên nếu khơng
đƣợc phát hiện và chẩn đốn sớm bệnh sẽ để lại những hậu quả nghiêm trọng. Từ
năm 1994, nghiên cứu của Rosenberg đã sử dụng Interleukin-2 liều cao (High-Dose
Interleukin-2, HD IL-2) truyền tĩnh mạch (mỗi liều 720.000 IU/kg, các liều tiêm
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


cách nhau 8 giờ) trong điều trị ung thƣ biểu mơ thận trên 283 bệnh nhân. Trong đó,
một liệu trình gồm tối đa 15 liều, kết thúc liệu trình nếu bệnh nhân đáp ứng đƣợc sẽ
tiếp tục đƣợc điều trị liệu trình thứ hai, kết quả cho thấy 7% bệnh nhân đáp ứng
hoàn toàn với IL-2 và tế bào ung thƣ đƣợc kiểm sốt và biến mất tồn bộ, 13% số
bệnh nhân có đáp ứng một phần, 76% trong số các bệnh nhân có đáp ứng hết ung
thƣ với thời gian trên 7 năm [34]. Hiện nay, liệu pháp điều trị ung thƣ thận bằng IL2 vẫn đƣợc áp dụng rộng rãi trên thế giới.
Ung thƣ hắc tố ác tính là một loại ung thƣ da xảy ra khi các tế bào da đặc biệt
đƣợc gọi là melanocytes (tế bào biểu bì tạo hắc tố) bị thƣơng tổn do các yếu tố nhƣ
mẫn cảm với ánh nắng mặt trời, cháy nắng, từ các vết bỏng rộp, từ các nốt dị
thƣờng trên cơ thể hoặc do tiền sử gia đình [48][49]. Nếu các thƣơng tổn này không
đƣợc loại bỏ sớm, các tế bào này sẽ phát triển trên bề mặt da và lan sang các mô
khỏe (di căn), lúc này việc điều trị sẽ trở nên khó khăn hơn.

Hình 1. 6: Ung thƣ hắc tố ác tính [66]

Ở Việt Nam, tỷ lệ ngƣời mắc ung thƣ da rất thấp, tuy nhiên trên thế giới tỷ lệ
này là khơng nhỏ. Trong đó, New Zealand là nƣớc có tỷ lệ ung thƣ da cao nhất và là
loại ung thƣ phổ biến thứ 4 ở Australia [50]. Năm 2010, Viện ung thƣ Quốc gia đã
thống kê ở Mỹ có 68.130 ca mắc ung thƣ mới và có 8.700 ngƣời tử vong vì ung thƣ
này; ở Anh, mỗi năm có khoảng 10.000 ngƣời phát hiện mắc ung thƣ da và có 2.000
ngƣời tử vong. Mặc dù, tỷ lệ số ngƣời mắc ung thƣ da là khơng cao, nhƣng nó lại là
bệnh ung thƣ có tỷ lệ tử vong rất cao tới 79% [57]. Vì vậy, việc tìm ra một loại
thuốc và liệu pháp điều trị phù hợp là vơ cùng cần thiết.

11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Với hầu hết các loại ung thƣ nếu đƣợc phát hiện kịp thời thì dễ dàng đƣợc loại
bỏ bằng phẫu thuật, xạ trị và hóa trị. Đối với u hắc tố, cắt bỏ khối u là lựa chọn tốt
nhất, sau khi phẫu thuật bệnh nhân đƣợc chỉ định dùng các chất hỗ trợ điều trị nhƣ
interferon-α, Interleukin-2 nhằm ngăn ngừa hiện tƣợng di căn. Đối với ung thƣ da
ác tính nếu bệnh nhân có đáp ứng với IL-2 thì bệnh nhân kéo dài thời gian sống ít
nhất 10 tháng, trong đó tỷ lệ sống trên 5 năm là hơn 10% [22]. Tuy nhiên, với ung
thƣ da ở giai đoạn cuối thì việc điều trị là vơ cùng khó khăn. Theo trung tâm kiểm
sốt và phịng chống dịch bệnh (Centers for Disease Control and Prevention, CDC),
tại Mỹ, ung thƣ hắc tố ác tính là bệnh nguy hiểm đứng thứ 3 trong số các bệnh ung
thƣ di căn đến não. Nghiên cứu gần đây của Melinda B. Chu đã sử dụng HD IL-2
điều trị các bệnh nhân ung thƣ và theo dõi tại Đại học Saint Louis. Trong quá trình
điều trị, bệnh nhân đƣợc truyền IL-2 để kích thích hệ thống miễn dịch nhận diện và
tiêu diệt tế bào ung thƣ. Các bệnh nhân đƣợc điều trị từ 2 đến 4 liệu trình là tối đa,
mỗi liệu trình gồm có 14 liều HD IL-2. Kết quả cho thấy khơng có trƣờng hợp nào
tử vong khi điều trị, tỷ lệ sống trung bình của các bệnh nhận bị di căn não là khoảng

4 tháng và của bệnh nhân chƣa di căn là 8,7 tháng. Những phát hiện của nghiên cứu
mở ra một lựa chọn điều trị mới, sử dụng HD IL-2 cho những bệnh nhân ung thƣ
hắc tố di căn não [8].
Ngoài hai ứng dụng chính của IL-2 trong điều trị ung thƣ thận và u hắc tố da,
nhờ khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch, IL-2 còn đƣợc nghiên cứu để chống
bệnh HIV. Kết quả ban đầu cho thấy đây là dƣợc phẩm an tồn và có hiệu quả khi
phối hợp với các liệu pháp khác trong điều trị chống HIV. Cơ chế của IL-2 trong
điều trị bệnh nhân nhiễm HIV có thể theo hai hƣớng: (i) giúp bảo vệ hệ miễn dịch
khỏi sự tấn công của virus HIV, (ii) giúp cho hệ miễn dịch ức chế sự nhân lên của
HIV. Bên cạnh đó, IL-2 cịn giúp tăng sinh dịng tế bào CD4+ không bị nhiễm HIV,
kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân [40].
1.4. Hệ biểu hiện E. coli
E. coli là một hệ biểu hiện lý tƣởng, dễ thao tác, có thể sản xuất dạng protein
tái tổ hợp từ nhiều nguồn gốc khác nhau đồng thời có khả năng thu nhận các vector
bản chất là plasmid. Vi khuẩn E. coliđáp ứng đƣợc hầu hết các yêu cầu của một hệ
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


biểu hiện, thực tế trên thế giới rất nhiều phòng thí nghiệm sử dụng vi khuẩn E. coli
làm tế bào chủ để biểu hiện protein tái tổ hợp.
E. coli là vi khuẩn gram âm, mỗi tế bào chỉ tồn tại một nhiễm sắc thể duy nhất
hay còn gọi là nucleoid. Kích thƣớc genome của E. coli khoảng 4,6 x 106 base pairs.
Hệ biểu hiện vi khuẩn là sự lựa chọn hàng đầu để sản xuất các protein tái tổ hợp. Lý
do là chi phí để biểu hiện protein bằng hệ vi khuẩn thƣờng khá rẻ. Đặc biệt là với hệ
biểu hiện E. coli, đây là hệ biểu hiện phổ biến nhất để sản xuất protein tái tổ hợp do
có thời gian sinh trƣởng nhanh, có khả năng duy trì lên men và tạo sinh khối lớn
bằng việc cung cấp thêm dinh dƣỡng vào những thời điểm nhất định. Nguyên liệu

sử dụng để ni E. coli rẻ tiền và có hiệu suất biểu hiện cao[45]. Quá trình biểu hiện
gene (bao gồm phiên mã và dịch mã) luôn tạo ra phân tử mRNA và proteinnhanh
chóng. Tồn bộ trình tự của vi khuẩn này đã đƣợc giải mã bằng máy giải trình tự thế
hệ[37]. Hầu hết các phịng thí nghiệm đều sử dụng, với nhiều chủng khác nhau
dùng cho các mục đích riêng biệt, nhƣ tách dòng (E. coli DH10B, Coli DH5α,…) và
chủng biểu hiện ( E. coli BL21 DE3, E. coli rossetta, …).
Hạn chế lớn nhất của hệ biểu hiện E. coli chính là việc thiếu các q trình cải
biến sau dịch mã nhƣ q trình glycosyl hóa, phosphoryl hóa,… do đó các protein
tái tổ hợp có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn không cuộn xoắn đúng cấu trúc,
protein tái tổ hợp thƣờng tạo thành dạng không tan inclusion body, theo đó là hoạt
tính sinh học cũng bị giảm đi đáng kể. Tuy nhiên, đã có nhiều giải pháp để khắc
phục những những nhƣợc điểm trên [15][18], do vậy cùng với những ƣu điểm vƣợt
trội E.coli vẫn là một trong những chủng biểu hiện rộng rãi nhất trong công nghệ
DNA tái tổ hợp.
1.4.1. Hệ biểu hiện E. coli BL21
E. coliBL21 là chủng thƣơng mại đƣợc sử dụng nhiều làm vật chủ biểu hiện.
Hệ gene của chủng E. coliBL21 đã đƣợc cải biến một số gene là ompT, hsdS, gal,
dcm,λDE3. Ý nghĩa của việc đột biến các gene đó nhƣ sau:
-

Gene ompT: là một gene mã cho protease nằm trên màng ngoài tế bào,
chủng khuyết gene ompT giúp tránh việc các protein tái tổ hợp bị phá hủy
ngay trong tế bào [17].
13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


-

Gene hsdS: là một gene có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm nhập
tế bào chủ [26], chủng BL21 khuyết hsdS để quá trình biến nạp vector tái tổ
hợp đƣợc hiệu quả hơn.

-

Gene gal: chủng BL21 (DE3) khuyết gene gal giúp tránh việc tế bào sử
dụng galactose làm nguồn carbon cho sinh trƣởng [36].

-

Gen dcm: là gene methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng khuyết
gene dcm tránh việc trình tự gene ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến sai khác
trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp [5].

-

T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter
lacUV5 dùng để điều khiển quá trình biểu hiện, đây là một promoter đãđƣợc
đột biến và đƣợc tạo ra từ phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter
của hệ biểu hiện vi khuẩn tự nhiên nào[27].
Ngoài ra, chủng E. coli BL21 (DE3) còn một dạng thƣơng mại nữa là dạng có

tích hợp thêm plasmis pLysS, plasmid này mang gene mã cho T7 lysozyme làm
một loại protein có 2 chức năng: (i) phân giải thành tế bào vi khuẩn, (ii) là khóa sự
hoạt động của T7 RNA polymerase, sự có mặt của protein này giúp quá trình biểu
hiện nhờ promoter T7 (hay cịn gọi là promoter lacUV5) khơng đƣợc kích hoạt cho
đến khi cảm ứng IPTG, lúc đó số lƣợng T7 RNA Polymerase tăng nhanh chóng,
vƣợt quá khả năng ức chế của T7lysozyme.

1.4.2. Vector biểu hiện pET22b(+)
Để biểu hiện gene trong E. coli BL21 vector đƣợc sử dụng có thể là các
plasmid, phage, cosmid. Vector là một plasmid đƣợc thiết kế nhằm mục đích giúp
sản xuất lƣợng lớn protein khi đƣợc kích thích bằng chất cảm ứng (lactose hoặc
IPTG). Cấu trúc của vector pET22b(+) đƣợc biểu thị trên Hình 1. 8. Plasmid này
chứa một vài yếu tố quan trọng nhƣ gene lacI mã hóa cho protein ức chế biểu hiện
gene ngoại lai, promoter T7 đặc hiệu với RNA polymerase, operator, vị trí đa điểm
cắt multicloning site, điểm khởi đầu tái bản f1, gene chọn lọc (gene kháng kháng
sinh ampicillin).

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Hình 1. 7: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+
Gene của protein tái tổ hợp cần sản xuất đƣợc chèn vào vị trí đa điểm cắt
trong vector. Promoter T7 và lac operator đều nằm ở đầu 5’ của gene. Bình thƣờng
T7 RNA polymerase bị ức chế bởi sự kiểm soát của sản phẩm gene lacI là lac
repressor, khi có mặt chất cảm ứng IPTG, chất này sẽ làm thay đổi cấu trúc của lac
repressor và T7 RNA polymerase đƣợc tạo thành từ genome của chủng E. coli
DE3, nhờ đó gene ngoại lai đƣợc phiên mã và dịch mã để tổng hợp protein. Cơ chế
kiểm soát biểu hiện gene bằng chất cảm ứng IPTG đƣợc thể hiện ở sơ đồ Hình
1.8.Trong vector pET22b+ cịn có trình tự tiết pelB giúp protein ngoại lai tiết ra
khoang chu chất. Sau khi đi vào khoang chu chất thì đoạn peptide tín hiệu này sẽ bị
cắt bởi một protease xác định.

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Hình 1. 8: Cơ chế kiểm sốt biểu hiện gene nhờ chất cảm ứng IPTG
1.4. Lên men sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống lên men Bioreactor
Việc sản xuất protein bằng con đƣờng tái tổ hợp ngày càng phát triển mạnh
đối với rất nhiều protein khác nhau, trong đó có IL-2. Chủng vi sinh vật chủ đƣợc
lựa chọn phụ thuộc vào mỗi loại protein và mục đích nghiên cứu, có rất nhiều chủng
vi sinh vật đƣợc lựa chọn cho sản xuất protein tái tổ hợp nhƣ E. coli, nấm men
Pichia pastoris, Saccharomyces, Bacilus subtilis, tế bào động vật,...Trong đó, chủng
E. coli là chủng đƣợc lựa chọn rộng rãi vì rất nhiều ƣu điểm nhƣ: sinh trƣởng nhanh
trong mơi trƣờng nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền, cho sinh khối cao,... Tuy nhiên, với
bất kỳ một chủng nuôi cấy nào, để tạo đƣợc sản phẩm protein mong muốn với hiệu
suất cao cần phải có q trình tối ƣu điều kiện nuôi cấy trƣớc khi đƣa vào sản xuất
thử nghiệm ở quy mơ lớn. Trong q trình lên men, có rất nhiều yếu tố quyết định
đến hiệu suất lên men và chất lƣợng sản phẩm lên men nhƣ: môi trƣờng dinh
dƣỡng, lƣợng oxy hịa tan trong mơi trƣờng, nhiệt độ và pH trong q trình ni
cấy, thời gian ni cấy,... [25]. Vì vậy, để tối ƣu đƣợc các điều kiện chuẩn trên cần
có một hệ thống lên men trong đó các thơng số và diễn biến của q trình lên men
đƣợc kiểm sốt chặt chẽ.

16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add


Hình 1. 9: Lên men trên hệ thống Bioreactor tại phòng đạt tiêu chuẩn GMP
Hệ thống lên men bioreactor đƣợc sử dụng để tiến hành một q trình hóa sinh

học mà trong đó các vi sinh vật hoặc các tế bào và mơ động thực vật có thể phát
triển và sinh trƣởng nhờ sử dụng các nguyên vật liệu thô trong môi trƣờng, đồng
thời tạo ra các sản phẩm trao đổi chất. Với hệ thống lên men này chúng ta hồn tồn
có thể dễ dàng theo dõi và điều chỉnh mọi diễn biến của quá trình lên men nhƣ:
nhiệt độ, pH, lƣợng oxy hịa tan, tốc độ khuấy, lƣợng khí sục vào mơi trƣờng,... đều
đƣợc kiểm sốt chặt chẽ qua hệ thống máy tính, từ đó giúp tăng hiệu quả của q
trình lên men. Bên cạnh đó, hệ thống bioreactor rất đa dạng cho các quy mô khác
nhau tùy vào mục đích lên men từ 5 lít, 10 lít, 30 lít và 100 lít.
1.4. Tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography, HPLC), ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ
phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phƣơng pháp phân tách trong đó pha
động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới
dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang
đã đƣợc cải biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ [30]. HPLC là
một phƣơng pháp tách và phân tích các hợp chất đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến
nhất hiện nay vì nhiều lí do nhƣ: (i) độ nhạy cao, (ii) khả năng định lƣợng tốt, (iii)
thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, (iv)
17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

LUAN VAN CHAT LUONG download : add