Nghiên cứu biểu hiện, tối ưu lên men và tinh chế interleukin 2 người tái tổ hợp dạng cải biến trong escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUN SINH VẬT
-------***------Lê Phƣơng Hồng Anh

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN, TỐI ƢU LÊN MEN VÀ TINH
CHẾ INTERLEUKIN-2 NGƢỜI TÁI TỔ HỢP DẠNG CẢI
BIẾN TRONG ESCHERICHIA COLI
Chun ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
GS. TS. Trƣơng Nam Hải

Hà Nội 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

LỜI CẢM ƠN
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới GS. TS. Trương Nam
Hải – Trưởng phòng Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh
học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tơi trong suốt thời gian tơi hồn thành khóa
luận.
Tiếp đến tơi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cơ của trường
Đại học Thái Ngun, Viện Sinh thái và Tài Ngun sinh vật, các thầy, cơ của Viện
Cơng nghệ sinh học đã nhiệt tình giảng dạy cho tơi trong suốt thời gian tham gia
khóa học.
Tơi xin chân thành cảm ơn tồn thể các cán bộ nghiên cứu, nhân viên của
phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Cơng nghệ sinh học và Cơng ty TNHH Vắc xin và

Sinh phẩm số 1(Vabiotech) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam đã tận tình chỉ bảo động
viên và cho tơi những lời khun q giá trong cơng việc cũng như cuộc sống.
Và sau cùng, bằng tình cảm chân thành tơi xin được gửi lời cảm ơn tới người
thân và gia đình, những người đã hết lòng ủng hộ và động viên tơi trong suốt thời
gian tơi học tập và cơng tác.

Hà Nội, ngày 02 tháng 12 năm 2013
Học viên cao học

Lê Phƣơng Hồng Anh

ii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3
1.1

Tổng quan về ung thƣ ....................................................................................3

1.1.1

Ung thƣ ...................................................................................................3

1.1.2

Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới. .....................................7

1.1.3

Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ ........................................................10

1.1.4

Liệu pháp chữa trị ung thƣ bằng miễn dịch. .........................................11

1.2

Interleukin 2 .................................................................................................12

1.2.1

Cấu trúc gene và protein của Interleukin 2 ...........................................12

1.2.2

Hoạt tính sinh học. ................................................................................13

1.2.3

Interleukin trong chữa trị ung thƣ. ........................................................15

1.3

Hệ biểu hiện E. coli .....................................................................................16

1.3.1

Hệ biểu hiện E. coli BL21. ...................................................................17

1.3.2

Vector biểu hiện pET22b(+). ................................................................18

1.4

Sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .............................................20

1.5 Tối ƣu hóa ni cấy tăng sản lƣợng IL-2 bằng phần mềm thiết kế thí
nghiệm Design Expert 7.0. ....................................................................................23
Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .........................................................25
2.1

Vật liệu ........................................................................................................25

2.1.1

Các chủng vi sinh vật, plasmid .............................................................25

2.1.2

Hóa chất, enzyme, phần mềm. .............................................................25

2.1.3

Máy móc ...............................................................................................25

2.2

Phƣơng pháp ................................................................................................25

2.2.1

Tách chiết DNA plasmid từ E. coli.......................................................26

2.2.2

Điện di DNA trên gel agarose. .............................................................27

2.2.3 Lên men tạo sản phẩm IL-2 với dòng tế bào vi khuẩn tái tổ hợp E. coli
BL21. 27
2.2.4

Phƣơng pháp giải trình tự gene .............................................................28

iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

2.2.5

Tối ƣu hóa điều kiện lên men bằng phần mềm Design expert 7.0. ......28

2.2.6

Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide. .........................30

2.2.7 Phƣơng pháp kiểm tra protein bằng phản ứng đặc hiệu kháng ngun
kháng thể Western Blot. .....................................................................................31
2.2.8 Phá tế bào bằng phƣơng pháp siêu âm và xử lý mẫu protein IL-2 trƣớc
khi tinh chế. ........................................................................................................32
2.2.9

Tinh chế protein bằng hệ sắc ký đảo pha RP-HPLC. ...........................33

2.2.10 Xác định độ tinh khiết của sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau khi tinh sạch.
33
2.2.11 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng IL-2 bằng ELISA. ..........................34
Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................36
3.1

Giải trình tự gene mã hóa cho IL-2 đã đƣợc cải biến ..................................36

3.2

Biểu hiện gene il2 trong chủng vi khuẩn tái tổ hợp E. coli BL21. ..............38

3.3 Tối ƣu điều kiện lên men E. coli sản xuất IL-2 tái tổ hợp dạng cải biến bằng
phần mềm design expert. .......................................................................................39
a.

Khảo sát các yếu tố .........................................................................................40

b. Tối ƣu bằng phần mềm ...................................................................................41
3.4

Tinh sạch IL-2 từ dòng tế bào E. coli. .........................................................46

3.5 Xác định độ sạch của mẫu IL-2 sau tinh chế bằng phần mềm Quantity
One… .....................................................................................................................48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................51

iv
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

base pair (cặp bazơ)

IARC

International Agency for Research on Cancer (Cơ quan nghiên
cứu Quốc tế về Ung thƣ)

IFN

interferon

TNF

tumor neucrosis factor (là một cytokine tham gia vào q trình
làm chết tế bào ung thƣ).

Amp

Ampicilin

DNA

Deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

IPTG

Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside

LB

Luria-betani medium

MCS

Multiple cloning site

PCR

Polymerase Chain Reaction

TAE

Tris Acetate EDTA

SDS

Sodium dodecyl sulphate

BSA

Bovine serum albumin (Huyết thanh bò)

dH2O

distilled water (nƣớc khử trùng)

v/p

vòng trên phút.

M

mol/L

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay
v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1. 1 Hình ảnh hiển vi biểu thị tế bào ung thƣ vú và tế bào vú thƣờng ...............6
Hình 1. 2 Mẫu ung thƣ tế bào thận RCC giải phẫu. Nhiều tế bào thận bị thay thế bởi
tế bào ung thƣ ..............................................................................................................8
Hình 1. 3: Ung thƣ hắc tố da .......................................................................................8
Hình 1. 4 Hai mƣơi loại ung thƣ phổ biến ..................................................................9
Hình 1. 5 Cấu trúc khơng gian của Interleukin 2 ......................................................12
Hình 1. 6: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của IL-2 lên tế bào T .......................14
Hình 1. 7: Cơ chế hoạt động của Interleukin 2 .........................................................15
Hình 1. 8: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+ ...............................................................19
Hình 1. 9: Cơ chế kiểm sốt biểu hiện gene nhờ chất cảm ứng IPTG ......................20
Hình 1. 10: Mơ hình một hệ thống HPLC.................................................................21
Hình 1. 11: Mơ hình mơ tả sự hấp thụ và thơi một đoạn peptide ở pha tĩnh của sắc
ký đảo pha. . ..............................................................................................................22
Hình 2. 1: Cơng cụ RSM-CCD của phần mềm thiết kế thí nghiệm Design Expert
7.0…………………………………………………………………………………. 29
Hình 3. 1: Kết quả điện di kiểm tra plasmid trên gel

Agarose……………………………………………………………………………. 37
Hình 3. 2: Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện IL-2 của một số dòng tế bào vi
khuẩn tái tổ hợp mang plasmid pET22-IL-2. ............................................................39
Hình 3. 3: Sơ đồ tối ƣu lên men vi khuẩn tái E. coli tái tổ hợp sản xuất IL-2. .........40
Hình 3.4: Sơ đồ biểu thị kết quả khảo sát ảnh hƣởng của từng nhân tố riêng rẽ (nhiệt
độ biểu hiện, thời gian biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng IPTG) của dòng tế bào tái
tổ hợp E. coli Bl21 mang vector biểu hiện pET22b-IL-2. ........................................41
Hình 3. 5: Chi tiết thiết kế và hàm lƣợng IL-2 của sau khi thực hiện 20 thí nghiệm.
...................................................................................................................................42
Hình 3. 6: Kết quả tiến hành 20 thí nghiệm đánh giá bằng phƣơng pháp ELISA và
điện di SDS– PAGE. .................................................................................................43
Hình 3. 7: Đồ thị mơ hình 20 thí nghiệm của phần mềm Design Expert 7.0............44
Hình 3. 8: Kết quả biểu hiện các dự đốn mà phầm mềm đƣa ra .............................45
Hình 3. 9: Kết quả tiền xử lý tinh chế phá tế bào thu dịch thơ IL-2 .........................47
Hình 3. 10: Kết quả tinh chế IL-2 bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp HPLC............48
Hình 3. 11: Xác định thành phần độ tinh khiết của protein ......................................49

vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1 Một số oncogene và tumor suppressor genes liên quan đến ung thƣ ở
ngƣời ...........................................................................................................................4
Bảng 2.1 Cơng thức chế 1 bản gel acrylamide………………………..………… 30
Bảng 3. 1: Điều kiện biểu hiện của các giải pháp mà phần mềm đƣa ra nhằm tìm ra
điều kiện tối ƣu cho lên men.................................................................................. 45
Bảng 3. 2: Thơng số phân tích băng protein xác định độ tinh khiết của sản phẩm
bằng phần mềm Quantity One ..................................................................................49

vii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

MỞ ĐẦU
Cytokine là một sản phẩm trong hệ miễn dịch, đƣợc nhiều loại tế bào tiết ra.
Về chức năng chúng có tác dụng đa hƣớng, đa năng và tác dụng ngƣợc trở lại chính
tế bào tiết ra chúng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng cytokine có sự liên quan khơng
chỉ với ngun nhân gây ra ung thƣ mà còn liên quan tới khả năng chữa trị các bệnh
ung thƣ này. Việc lựa chọn đúng các yếu tố liên quan đến q trình hình thành và
phát triển ung thƣ mang tính quyết định đến việc sử dụng cytokine trong điều trị
bệnh. Hiện nay có nhiều loại cytokine đƣợc phát triển thành các dƣợc phẩm thƣơng
mại. Trong số đó Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp là một trong những loại cytokine
đƣợc thƣơng mại hóa sớm nhất và đƣợc cấp phép sử dụng bởi cơ quan quản lý
thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (US Food and Drug Administration-FDA) cấp phép sử
dụng trong điều trị (1992). IL-2 có khả năng chữa trị ung thƣ vú, ung thƣ phổi,… và
đặc biệt là hai loại ung thƣ hắc tố da và ung thƣ biểu mơ tế bào thận.
Trƣớc đây để có đƣợc IL-2 tinh khiết sử dụng trong điệu trị, sản phẩm này
thƣờng đƣợc tách chiết từ các dòng tế bào T tự nhiên hay bằng việc ni cấy các tế
bào động vật, ví dụ nhƣ tế bào ung thƣ hạc bạch huyết dòng Daudi. Mặc dù vậy IL2 sản xuất theo con đƣờng này có một số hạn chế đó là lƣợng IL-2 tách chiết ra thấp
khơng đáp ứng đủ nhu cầu, hoạt tính sinh học riêng khá thấp (105 đến 106 U/mg), và
thƣờng tạo thành sản phẩm có dạng glycosyl hóa cao, tạo hiệu ứng khơng mong
muốn tới sản phẩm khi sử dụng trong điều trị. Do vậy hƣớng tạo IL-2 ngƣời bằng
cơng nghệ mới hơn là Cơng nghệ DNA tái tổ hợp đã đƣợc mở ra nhằm tạo ra đƣợc
lƣợng lớn IL-2.
Trên thế giới, sản phẩm IL-2 thƣơng mại chủ yếu đƣợc sản xuất dựa trên cơng
nghệ DNA tái tổ hợp. Sản phẩm thƣơng mại Proleukin (Aldesleukin) của cơng ty
Chiron (Hoa Kỳ) sản xuất nhờ biểu hiện trong vi khuẩn Escherichia coli là một ví

dụ. Trong q trình sản xuất nhằm tăng hoạt tính và tăng tính an tồn cho sản phẩm
trình tự amino acid của IL-2 đã đƣợc cải biến. Tên hóa học của sản phẩm là desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 mang ý nghĩa đột biến mất alanine ở vị trí
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

amino acid số 1, thay thế Cysteine ở vị trí 125 bằng Serine. Hiện nay cơng ty
Chiron đang bán IL-2 tái tổ hợp với giá 680 USD/mg.
Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp nói riêng và sản phẩm protein tái tổ
hợp sử dụng trong điều trị nói chung vẫn còn đang bị bỏ ngỏ. Mặc dù việc nghiên
cứu về DNA tái tổ hợp đã đƣợc phát triển từ hơn 10 năm trở lại đây song vẫn chƣa
có sản phẩm tái tổ hợp nào đƣợc triển khai áp dụng hồn tồn q trình nghiên cứu
đến q trình sản xuất. Ngồi ra sản phẩm Proleukin đã hết hạn bảo hộ độc quyền,
do đó đây là một cơ hội để chúng tơi có thể nghiên cứu và tạo đƣợc sản phẩm
Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp của Việt Nam, dùng trong điều trị ung thƣ với hi
vọng sản phẩm đạt chất lƣợng tốt và giá thành rẻ hơn so với sản phẩm nhập khẩu.
Chính vì vậy trong nghiên cứu của mình chúng tơi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
biểu hiện, tối ƣu lên men và tinh chế IL-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến trong
E. coli” nhằm tạo ra đƣợc một sản phẩm Interleukin-2 có trình tự amino acid giống
với sản phẩm Proleukin đã đƣợc FDA Hoa Kỳ cơng nhận, có khả năng chữa ung
thƣ. Mục tiêu của đề tài là nâng cao năng suất tổng hợp cũng nhƣ tinh sạch IL-2
dạng cải biến với chi phí thấp để có thể đƣa sản phẩm IL-2 ngƣời tái tổ hợp tiêu thụ
trên thị. Nghiên cứu này đƣợc thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Dự án: “Hồn
thiện quy trình cơng nghệ sản xuất Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp trên dòng tế
bào E. coli” Mã số KC.04.DA02/11-15, và đƣợc ứng dụng kết quả thu đƣợc từ
nghiên cứu và triển khai của các đề tài:
(1) Đề tài khoa học cơng nghệ cấp Nhà nƣớc: “Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái
tổ hợp dùng cho điều trị ung thư” (Mã số: KC.04.33) do Viện Cơng nghệ
sinh học chủ trì, giai đoạn 2005-2007.

(2) Đề tài khoa học cơng nghệ cấp Nhà nƣớc: “Nghiên cứu đánh giá hiệu lực
của Interleukin-2 tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị
ung thư” (Mã số: KC.04.21/06-10) do Viện Cơng nghệ sinh học chủ trì, giai
đoạn 2009-2010.

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về ung thƣ
1.1.1 Ung thư
Ung thƣ từ lúc bắt đầu hình thành đến lúc xuất hiện trải qua nhiều bƣớc, nhiều
chu trình trao đổi chất và hoạt động bất thƣờng. Các khối u ác tính hay còn gọi là
ung thƣ đƣợc biểu thị bởi các đặc tính: phát triển khơng ngừng, khơng theo mục
đích, khơng theo mong muốn, khơng kiểm sốt và phá hoại, ức chế q trình sinh
trƣởng của các tế bào thƣờng17[17].
Tất cả sinh vật đều đƣợc tạo ra từ các tế bào sống, các tế bào này cần phải
đƣợc phân chia và tăng sinh về số lƣợng trong thời kỳ sinh trƣởng và phát triển
cũng nhƣ để thay thế các tế bào đã chết hoặc bị phá hủy. Q trình đó ngƣời ta gọi
là chu trình tế bào (hay còn gọi là sự phân chia tế bào và sự sinh trƣởng của tế bào).
Q trình này thƣờng đƣợc điểu khiển bởi các gene nằm trong DNA trong nhân tế
bào. Những gene này đƣợc di truyền từ bố mẹ và tế bào đƣợc thừa hƣởng những
đặc tính riêng biệt bao gồm kích thƣớc, màu sắc, trọng lƣợng và những kiểu hình.
Khi ở trạng thái bình thƣờng các q trình phát triển của tế bào trong mơ đƣợc kiểm
sốt rất cân bằng. Dạng ung thƣ sẽ đƣợc tạo thành khi sự kiểm sốt bằng di truyền
bị mất hoặc bị phá hủy trong một hoặc nhiều tế bào, từ đó các tế bào dạng ung thƣ
tiếp tục phân chia nhiều lần và phát triển. Lƣợng lớn các tế bào phân chia khơng
theo chu trình đó sẽ gây hại đến các tế bào và mơ bình thƣờng của cơ thể, mất kiểm

sốt dừng phân chia, đó chính là ung thƣ. Ngun nhân gây ra ung thƣ mà chúng ta
biết đến bây giờ bao gồm ngun nhân trực tiếp hoặc gián tiếp ảnh hƣởng đến các
gene điểu khiển q trình phân chia tế bào37[37]. Những tế bào bình thƣờng có cơ
chế giúp dừng q trình phân chia. Tế bào ở những mơ nhƣ mơ da, máu hoặc dòng
tế bào ở miệng, cổ họng hay ở dạ dày có thời gian sống ngắn nên việc phân chia xảy
ra thƣờng xun và ln ln phải đƣợc thay thế mới. Tƣơng tự nhƣ vậy, sau khi bị
chấn thƣơng, hay bệnh tật thì có một số tế bào bị chết, các tế bào xung quanh chỗ bị

3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

thƣơng sẽ phân chia sản xuất ra tế bào mới thay thế cho tế bào hỏng, tuy nhiên q
trình phân chia đó nằm trong kiểm sốt.
Bảng 1. 1 Một số oncogene và tumor suppressor genes liên quan đến ung thƣ ở
ngƣời42[42]
ONCOGENES
PDGF Mã hóa cho nhân tố sinh trƣởng của tiểu cầu não, liên quan đến ung thƣ não
EGFR Mã cho thụ thể của nhân tố sinh trƣởng biểu bì. Liên quan đến ung thƣ não,
ung thƣ vú.
HER-2 hoặc ERBB2 Liên quan đến ung thƣ vú, tuyến nƣớc bọt và buồng trứng.
RET Đột biến gene này gây ra ung thƣ tuyến giáp.
KRAS Liên quan đến ung thƣ phổi, buồng trứng, ruột, tuyến tụy.
NRAS Liên quan đến ung thƣ máu.
MYC1 Liên quan đến ung thƣ vú, máu, dạ dày và phổi
BCL2 Mã hóa cho protein bất hoạt q trình tự chết của tế bào, liên quan đến ung
thƣ lympho
CTNB1 Mã hóa cho beta-catenin, liên quan đến ung thƣ gan.
TUMOUR SUPPRESSOR GENES

APC Liên quan đến ung thƣ ruột và ung thƣ dạ dày
DPC4 Mã cho phân tử tín hiệu kích hoạt q trình ức chế phân chia tế bào, liên
quan đến ung thƣ tuyến tụy
P53 Mã hóa cho protein p53, là gene điều khiển q trình dừng phân chia và kích
thích tế bào bất thƣờng tự chết. Liên quan đến rất nhiều loại ung thƣ.
BRCA1 Liên quan đến ung thƣ vú và ung thƣ tử cung
BRCA2 Liên quan đến ung thƣ vú
VHL Liên quan đến ung thƣ thận
WT1 Liên quan đến ung thƣ thận Wilms’ tumor

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

Q trình “bật” và “tắt” chế độ phân chia là nhờ hai loại gene, có chức năng
đẩy mạnh hoặc ngăn chặn q trình phân chia tế bào. Ngày nay ngƣời ta đã nghiên
cứu và phân loại đƣợc 2 loại gene đó, đặt tên là Proto-oncogenes và Tumour
suppressor genes. Proto-oncogenes đảm trách nhận các tín hiệu u cầu phân chia,
phát triển, từ đó kích thích điều hòa dƣơng trong chu trình tế bào. Tumor suppressor
genes có chức năng ngƣợc lại, đây là một gene điều hòa âm của sự sinh trƣởng tế
bào, chúng sẽ hoạt động khi khơng có tín hiệu sinh trƣởng đặc biệt. Nhƣ vậy tế bào
bình thƣờng có cả hai cơ chế là điều hòa âm và điều hòa dƣơng. Cơ chế “tắt” sinh
trƣởng vẫn chƣa hồn tồn đƣợc hiểu rõ tuy nhiên có thể khẳng định đây là một q
trình quan trọng và đƣợc điều khiển dƣới sự chỉ đạo của các nhân tố di truyền, mà
cụ thể ở đây là các gene trong DNA22[22].
Trong trƣờng hợp ung thƣ, khơng có cơ chế “tắt” nghĩa là một số Protooncogenes bị đột biến gọi là Oncogene, làm tế bào phát triển khi chƣa nhận đƣợc tín
hiệu u cầu phân chia, một vài gene tumor suppressor bị bất hoạt vì vậy việc phân
chia khơng theo u cầu khơng bị ức chế. Các tế bào này đƣợc nhân lên và mang
đột biến sẽ tiếp tục phát triển lan ra và đi vào máu hoặc mạch bạch huyết từ đó di

căn ra khắp nơi trên cơ thể10[10].
Đặc tính của ung thư:
Các tế bào ung thƣ rất khác nhau về tính chất có kiểu hình rất khác biệt so với
các tế bào mà chúng tồn tại ở xung quanh. Tế bào ung thƣ có thể có hình dạng rất
qi dị, kích thƣớc lớn. Nhân tế bào ung thƣ bất thƣờng, chúng to và sẫm mầu hơn,
tế bào chất nhỏ hơn tế bào thƣờng ví dụ nhƣ tế bào ung thƣ vú và tế bào vú bình
thƣờng (Hình 1. 1).

5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

b

a

Hình 1. 1 Hình ảnh hiển vi biểu thị tế bào ung thƣ vú và tế bào vú thƣờng
a) tế bào vú bình thƣờng và b) cụm tế bào bao gồm cả tế bào thƣờng và tế bào ung
thƣ vú lây từ bệnh nhân ung thƣ vú giai đoạn cuối (độ phóng đại 400 lần)37[37].
Ngun nhân gây ung thư:
Các nhà nghiên cứu về ung thu đang cố gắng tìm kiếm ngun nhân cho các
bệnh ung thƣ và giải quyết từng ngun nhân một. Q trình chuyển từ tế bào bình
thƣờng sang tế bào ác tính (yếu tố ung thƣ) có thể diễn ra trong thời gian từ một vài
tuần đến vài năm. Sự biến đổi đó có thể do di truyền hoặc do ngun nhân bên
ngồi. Dù là ngun nhân nào thì hầu hết các trƣờng hợp ung thƣ đều là do sự đột
biến từ tế bào soma, do đột biến các oncogene và tumor suppressor, hoặc đột biến
với gene sửa sai DNA trong chu trình tế bào. Ngày nay ngƣời ta tin rằng ung thƣ
xảy ra trong một tế bào bình thƣờng khi xuất hiện khoảng 6-12 đột biến ở các gene
quan trọng nói trên. Các tác nhân gây ung thƣ có thể đƣơc phân loại nhƣ: sai hỏng

q trình chết tự nhiên apotosis, sử dụng nhiều thuốc lá rƣợu bia, ảnh hƣởng từ các
chất hóa học gây ung thƣ, hấp thụ q nhiều tia UV, bị nhiễm phóng xạ, hoặc liên
quan đến hormones4[4].
Ung thƣ có thể đƣợc phân loại dựa trên dạng tế bào khởi nguồn. Ví dụ nhƣ:
ung thƣ bắt nguồn từ máu thì gọi là ung thƣ máu, bắt nguồn từ mạch bạch huyết gọi
là ung thƣ mạch bạch huyết,… Ngồi ra, ung thƣ cũng có thể phân loại dựa trên
dạng khối u, ví dụ nhƣ ung thƣ thể rắn (ung thƣ phổi, ung thu vú) hoặc dạng bệnh
máu ác tính nhƣ ung thƣ bạch huyết, ung thƣ tủy xƣơng38[38].

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

1.1.2 Tình hình ung thư ở Việt Nam và trên thế giới.
Tình hình ung thƣ trên thế giới
Theo điều tra của Tổ chức Y tế thế giới WHO, trong năm 2008 có khoảng 12,7
triệu ca ung thƣ mới. Khoảng 7,6 triệu ngƣời đã tử vong vì ung thƣ (cùng với các
bệnh lý về tim mạch, ung thƣ là ngun nhân hang đầu chiếm khoảng 13% tổng số
tử vong trên tồn thế giới). Hiện nay dân số thế giới vào khoảng 7 tỷ ngƣời, ƣớc
tính đến năm 2030 sẽ tăng lên thành 8,3 tỷ, khả năng mắc ung thƣ mới mỗi năm
khoảng 27 triệu ngƣời, 17 triệu ngƣời chết vì ung thƣ38[38].
Theo tổ chức nghiên cứu thế giới về ung thƣ IARC, trong các trƣờng hợp mắc
bệnh và tử vong vì ung thƣ trên thế giới, ƣớc tính khoảng hơn một nửa số ca có liên
quan và hơn hai phần ba trƣờng hợp ung thƣ sẽ gia tăng ở những nƣớc có thu nhập
thấp và trung bình. Ung thƣ chủ yếu tập trung vào các dạng nhƣ: ung thƣ phổi, ung
thƣ vú, ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ gan, ung thƣ máu, ung
thƣ thận, ung thƣ da,…. Trong đó ung thƣ da và ung thƣ tế bào thận chiếm tỷ lệ
khoảng 2% tổng số ca ung thƣ8[8].
Ung thư tế bào thận (Renal Cell Carcinoma) và ung thư hắc tố da (melanoma):

Theo tổ chức Y tế Thế giới WHO, ung thƣ thận đứng thứ 14 trong bảng xếp
hạng những loại ung thƣ thƣờng gặp nhất trên thế giới, với khoảng 274.000 ca mắc
mới đƣợc phát hiện vào năm 2008, Ung thƣ tế bào thận (renal cell carcinoma-RCC)
là dạng phổ biến nhất của ung thƣ thận. Cứ khoảng 10 ngƣời mắc ung thƣ thận thì
trong đó 9 ngƣời là ung thƣ tế bào thận RCC28[28].

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

Hình 1. 2 Mẫu ung thƣ tế bào thận RCC giải phẫu. Nhiều tế bào thận bị thay thế bởi
tế bào ung thƣ8[8]
Ung thƣ da bao gồm non-melanoma và melanoma ngày càng gia tăng về số
lƣợng ngƣời mắc trong một thập kỷ trở lại đây. Cụ thể có từ 2 đến 3 triệu ngƣời mắc
chứng ung thƣ da non-melanoma và khoảng 132.000 ngƣời mắc chứng ung thƣ da
melanoma mỗi năm. Tầng ozone bị thủng là mơt trong những ngun nhân chính
gia tăng số lƣợng bệnh này, ƣớc tính cứ mỗi 10% mức ozone bị mất đi sẽ làm xuất
hiện 300.000 bệnh ung thƣ da253[3][25]. Trong nhiều trƣờng hợp ngun nhân gây
ung thƣ tế bào thận và hắc tố da khơng xác định đƣợc. Trong một số trƣờng hợp
khác ví dụ nhƣ ung thƣ do yếu tố di truyền), thì ngun nhân gây ung thƣ là xác
định đƣợc và có thể phòng ngừa, chữa trị.

Hình 1. 3: Ung thƣ hắc tố da8[8]
Cũng nhƣ các loại ung thƣ khác, ung thƣ tế bào thận và ung thƣ da chủ yếu
đƣợc chữa trị dựa vào các phƣơng pháp, phẫu-hóa-xạ trị, và liệu pháp sinh học.
Mục tiêu của liệu pháp sinh học là giúp hệ miễn dịch chiến đấu và phá hủy tế bào
ung thƣ hiệu quả và mạnh mẽ hơn. Loại thuốc đƣợc sử dụng hiệu quả nhất cho ung
thƣ thận và ung thƣ hắc tố da là một loại cytokine (protein hoạt hóa hệ miễn dịch

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

chủ) có tên là Aldesleukin của hãng Chiron Mỹ, bản chất là interleukin-2 của ngƣời
dƣới dạng tái tổ hợp. Khả năng chữa trị cho hai loại ung thƣ này có thể lên đến 18%
đối với ung thƣ hắc tố ác tính và 37% đối với ung thƣ tế bào thận20[20].

Hình 1. 4 Hai mƣơi loại ung thƣ phổ biến40[40]
Tình hình ung thƣ ở Việt Nam
Việt Nam là một nƣớc đang phát triển, thu nhập bình qn đầu ngƣời thấp, có
đời sống chƣa cao, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, chủ yếu bệnh tật là các bệnh truyền
nhiễm và suy dinh dƣỡng. Xã hội ngày càng phát triển kéo theo đó là sự thay đổi về
kinh tế, đời sống đƣợc nâng cao, các bệnh truyền nhiễm và suy dinh dƣỡng giảm
mạnh thay vào đó các bệnh nhƣ ung thƣ, tim mạch, tiểu đƣờng tăng nhanh. Kinh tế
phát triển nhanh đồng nghĩa với vấn đề ơ nhiễm mơi trƣờng, chất lƣợng thức ăn,…

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

Chính vì vậy tỷ lệ ung thƣ ngày càng gia tăng. Theo bác sỹ Mai Trọng Khoa giám
đốc bệnh viện Bạch Mai Hà Nội khẳng định khi trả lời phỏng vấn tờ báo Tuổi Trẻ,
hiện nay tại Việt Nam có khoảng 110.000 ngƣời mắc ung thƣ mới trong đó khoảng
82.000 ngƣời tử vong do ung thƣ mỗi năm, chiếm tới 73,5% tổng số bệnh nhân ung
thƣ. Đây là tỷ lệ tử vong thuộc hàng cao nhất thế giới, so với tỷ lệ tử vong trên tổng
số bệnh nhân ung thƣ tồn cầu là 59,7% (đối với các nƣớc đang phát triển là 67,8%
và nƣớc phát triển là 49,4%). Theo số liệu thống kê của bệnh viện K-Hà Nội và

Trung tâm U bƣớu Thành phố Hồ Chí Minh, hằng năm số lƣợng bệnh nhân mắc
ung thƣ tăng thêm khoảng 20-30% (Tiến sỹ Trần Văn Thuận, giám đốc bệnh viện K
Hà Nội). Mƣời loại ung thƣ phổ biến nhất là phổi, dạ dày, gan, đại tràng, vòm họng,
thận, da, vú, tiền liệt tuyến, cổ tử cung27[27].
1.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư
Mặc dù ung thƣ là một căn bệnh nan y nhƣng nếu đƣợc phát hiện ở giai đoạn
sớm và chữa trị kịp thời, bệnh hồn tồn có thể đƣợc chữa khỏi. Hiện nay, phẫu trị,
xạ trị và hóa trị là ba liệu pháp chuẩn trong điều trị bệnh ung thƣ. Phẫu trị ung thƣ
đƣợc Halsted hệ thống vào cuối thế kỷ 19, là phƣơng pháp cắt bỏ khối u và một số
mơ, một số hạch bạch huyết xung quanh. Tuy nhiên phƣơng pháp này phụ thuộc
vào nhiều yếu tố, bao gồm kích thƣớc khối u, vị trí khối u, cách phẫu thuật và tình
trạng của bệnh nhân.
Phƣơng pháp xạ trị bắt đầu với Henri Becquerel, Marie Curie vào đầu thế kỷ
20, phƣơng pháp này sử dụng một dạng năng lƣợng là phóng xạ ion hóa để làm teo
nhỏ và tiêu diệt khối u bằng cách làm tổn thƣơng tế bào, khiến chúng khơng thể
phát triển và phân chia. Ngồi việc tiêu diệt tế bào thƣờng thì phƣơng pháp này còn
làm tổn thƣơng cả tế bào bình thƣờng.
Phƣơng pháp hóa trị mới bắt đầu sau Thế chiến thứ II, là phƣơng pháp điều trị
dựa vào hóa chất có khả năng tiêu diệt tế bào ung thƣ. Chúng can thiệp vào q
trình phân bào theo các con đƣờng nhƣ q trình phân chia nhiễm sắc thể tạo thành.

10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

Phƣơng pháp này ngồi tác động đến tế bào ung thƣ còn ảnh hƣởng đến tế bào
thƣờng. Ba liệu pháp này đƣợc sử dụng chủ yếu cho ngƣời bệnh ung thƣ. Ngun lý
kết hợp nhuần nhuyễn phẫu-xạ-hóa trị liệu là liệu pháp đa mơ thức đƣợc vận dụng
cho kết quả tối ƣu1[1]. Để khắc phục nhƣợc điểm của các phƣơng pháp nói trên, liệu

pháp sinh học nhƣ hormone trị liệu hay liệu pháp miễn dịch, đƣợc áp dụng để phối
hợp điều trị một số loại ung thƣ. Điểm nổi trội của liệu pháp điều trị mới này là khả
năng điều trị ngăn chặn chính xác ung thƣ mà khơng cần phá hủy (ví dụ các vaccine
phòng ung thƣ), có thể giúp đƣa tế bào trở lại bình thƣờng (liệu pháp gene, gene
therapy), hay có thể điều trị ức chế ung thƣ mà khơng gây nhiều phản ứng phụ nhƣ
sử dụng các protein hòa tan kích thích miễn dịch.
1.1.4 Liệu pháp chữa trị ung thư bằng miễn dịch.
Trên thế giới liệu pháp cytokine từ hơn 30 năm trƣớc và đƣợc coi là hƣớng
điều trị tích cực với bệnh nhân ung thƣ14[14]. Ở Việt Nam việc sử dụng cytokine
vẫn còn khá mới mẻ. Rất nhiều cytokine đang đƣợc nghiên cứu cũng nhƣ thử
nghiệm trong điều trị lâm sàng, tuy nhiên hiện tại chỉ có một số loại cytokine đƣợc
cơng nhận để điều trị ung thƣ chỉ gồm: IL-2, IFN-α, IL-11, G-CSF, GM-CSF. Một
số cytokine khác cũng đƣợc phép sử dụng nhƣng vẫn còn hạn chế do chƣa kiểm
sốt đƣợc khả năng loại thải cũng nhƣ các hiệu ứng phụ khác nhƣ TNF-α, IL-12.
Ƣu điểm của cytokine trong điều trị ung thƣ so với các phƣơng pháp khác là
việc kiểm sốt ung thƣ và các ảnh hƣởng của ung thƣ. Bệnh thiếu máu liên quan
đến ung thƣ có thể đƣợc hỗ trợ bằng cách sử dụng EPO (erythropoietin)24[24]. IL11 và IL-3 kích thích sự tạo thành tiểu cầu, sử dụng để chữa bệnh thrombocytopenia
sau khi đã đƣợc hóa trị liệu35[35]. IL-2 đƣợc cơng nhận và cấp phép để điều trị một
số bệnh ung thƣ nhƣ ung thƣ biểu mơ, ung thƣ mạch bạch huyết, đặc biệt là ung thƣ
tế bào thận và ung thƣ da. Việc sử dụng GM-CSF và G-CSF tiếp sau hóa trị liệu và
cấy ghép tủy xƣơng có thể thúc đẩy nhau q trình phục hồi của các tế bào myeloid,
giảm rủi ro lây nhiễm.

11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

Hiệu quả sử dụng cytokine để điều trị bệnh ung thƣ là chƣa vƣợt trội, tuy
nhiên có sự kết hợp và bổ trợ với các phƣơng pháp khác thì hiệu quả sẽ tăng gấp

nhiều lần. Ngồi ra các cytokine có thể kết hợp với kháng thể đơn dòng để tạo hiệu
quả miễn dịch cao sử dụng cho mục đích khác, nhƣ làm tá dƣợc cho các loại
vaccine44[44].
1.2 Interleukin 2
Interleukin-2 của ngƣời là một loại cytokine quan trọng trong hệ thống miễn
dịch, gene mã hóa cho IL-2 đƣợc tách từ tế bào lách ngƣời, tế bào lympho
T,…29[29].
1.2.1 Cấu trúc gene và protein của Interleukin 2
Gene mã hóa cho IL-2 nằm trên nhiễm sắc thể số 4. Khung đọc mở suy diễn từ
trình tự cDNA mã hóa cho phân tử IL-2 hồn chỉnh gồm 153 amino acid, trong đó
20 amino acid mở đầu là tín hiệu tiết. Trong cấu trúc DNA, gene mã hóa cho IL-2
cũng bao gồm hộp TATA, vị trí khởi đầu sao mã, phiên mã, bốn vị trí exon và ba vị
trí intron. Protein hIL-2 sau q trình biến đổi hậu dịch mã sẽ bị cắt đi 20 amino
acid tín hiệu tiết và tạo thành IL-2 hồn chỉnh gồm 133 amino acid.

Hình 1. 5 Cấu trúc khơng gian của Interleukin 2

12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

Các kết quả nghiên cứu trƣớc đây cho thấy phân tử IL-2 có 3 vùng đóng vai
trò quan trọng trong hoạt tính sinh học của IL-2 đó là: <i> Tận cùng đầu N (từ
amino acid 1 đến amino acid 20). <ii> Vùng tận cùng đầu C (từ amino acid 121 đến
133) và <iii> cầu disulfide giữa các gốc Cys58 và Cys105. Đột biến mất 20 amino
acid ở đầu N và 10 amino acid ở đầu C làm mất 99% hoạt tính của IL-2 và khả năng
bám vào các thụ thể của IL-2. Trình tự amino acid của IL-2 ngƣời tự nhiên chứa 3
gốc Cystein ở các vị trí 58, 105, 125. Đột biến Cys105 làm giảm 8-10 lần hoạt tính,
đột biến Cys58 làm giảm hoạt tính 250 lần. Đột biến Cys125 ảnh hƣởng rất ít tới hoạt

tính IL-221[21], đặc biệt nếu thay Cys125 bằng Ser125 thì hoạt tính của IL-2 khơng bị
ảnh hƣởng. Nhờ đó nếu thay đổi Cys125 bằng Ser125 thì sẽ ngăn cản việc tạo thành
cầu disulfide khơng mong muốn. Tại đầu N của protein IL-2 có điểm glycosyl hóa
đƣợc nhận biết bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở vị trí 3 amino acid đầu tiên. Trong tự
nhiên IL-2 tồn tại ở trạng thái glycosyl hóa có tính thấm cao với màng tế bào do
vây, nếu sử dụng IL-2 liều lƣợng lớn IL-2 sẽ gây nên tạo thành tính độc trong cơ
thể. Vì vậy IL-2 dạng thƣơng phẩm dùng làm thuốc tiêm khơng đƣợc mang các gốc
đƣờng ở đầu N. IL-2 thƣơng phẩm đã đƣợc FDA cơng nhận để chữa ung thƣ là
Proleukin (Aldesleukin) của Chiron Hoa kỳ có trình tự amino acid loại bỏ alanine ở
đầu N, thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine12[12].
1.2.2 Hoạt tính sinh học.
Trong tự nhiên , IL-2 là một glycoprotein, có khả năng hoạt hóa tế bào giết tự
nhiên (natural killer-NK) và tế bào gây độc (Cytoxic T lymphocyte - CTL), biệt
hóa tế bào lympho giết tự nhiên (Lymphokine activated killer-LAK cells). Có rất
nhiều nghiên cứu về IL-2 trên thế giới và các nghiên cứu đó tập trung nhiều nhất
vào chức năng quan trọng của IL-2 trong hệ miễn dịch. IL-2 chủ yếu đƣợc sinh ra từ
tế bào T CD4+ (tế bào trợ giúp T helper TH) ngồi ra IL-2 còn đƣợc sinh ra bởi tế
bào T CD8+ và tế bào T giết tự nhiên (natural killer T-NKT cells), ở một số điều
kiện đặc biệt, lƣợng nhỏ IL-2 cũng có thể đƣợc tạo ra từ các tế bào dendritic hoạt
hóa (activated dendritic cells)9[9].

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

Hình 1. 6: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của IL-2 lên tế bào T
Tế bào T hoạt hóa biểu hiện thụ thể bề mặt cùng với sự tiết IL-2, IL-2 bám vào
thụ thể trên tế bào và kích thích sự phân chia tế bào. Khi tế bào T khơng còn đƣợc
kích thích bởi kháng ngun thì thụ thể IL-2 sẽ tự tiêu biến.

Nhờ khả năng kích thích làm tăng các loại tế bào có khả năng diệt khối u, khi
chạm trán tế bào bất thƣờng, tế bào NKT đã hoạt hóa tấn cơng và tiêm những hạt tế
bào chất làm phân hủy tế bào đích. Cho dù nhỏ hơn tế bào ung thƣ hay thể virus, tế
bào NKT thƣờng có thể tiêu diệt cùng lúc 2 hoặc nhiều tế bào ung thƣ. Ngồi ra IL2 còn kích thích tăng sinh một số tế bào khác nhƣ tế bào T gây độc CTL, NK và
LAK,… Điều này giúp cho cơ thể chống lại bệnh ung thƣ.

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

Hình 1. 7: Cơ chế hoạt động của Interleukin 2
IL-2 có thể gây độc, gây sốt và sốc trong điều trị. Ngun nhân gây độc đƣợc
xác định là do 2 ngun nhân. Thứ nhất, IL-2 có điểm glycosyl hóa đƣơc nhận biết
bởi trình tự Ala-Pro-Thr ở 3 vị trí amino acid đầu tiên. Do vậy IL-2 tự nhiên có tính
thấm cao với màng tế bào gây đọc với cơ thể bệnh nhân điều trị bằng IL-2. Thứ hai,
độc tính của protein này là do IL-2 gián tiếp tác động lên các tế bào làm tăng q
trình tiết TNF, INFγ và chất độc lymphotoxin. Chính vì vậy, nhờ kỹ thuật di truyền,
IL-2 có thể đƣợc cải biến theo hƣớng giảm độc tính bằng cách mất vị trí glycosyl
hóa mà vẫn giữ ngun đƣợc hoạt tính sinh học vốn có.
1.2.3 Interleukin trong chữa trị ung thư.
Cho đến nay, IL-2 đã đƣợc cơng nhận là có hiệu quả trong việc điều trị ung
thƣ, nhƣ ung thƣ bạch cầu, ung thƣ phổi, ung thu buồng trứng, ung thƣ vú,… đặc
biệt là ung thƣ hắc tố và ung thƣ tế bào thận39[39]. Từ năm 1992, tổ chức FDA của
Hoa kỳ đã chính thức cho phép sử dụng IL-2 cho việc chữa trị ung thƣ tế bào thận
(renal cell carcinoma) và ung thƣ hắc tố da ác tính (malignant melanoma)32[32].
Tuy nhiên điều trị ung thƣ sử dụng liệu pháp IL-2 liều cao gây độc với cơ thể
bệnh nhân. Hiệu ứng này gây nên những tác dụng phụ khơng mong muốn nhƣ chảy
máu trong, phát ban, phù nề, thậm chí tử vong. Chính vì vậy sản phẩm IL-2 sản xuất
bằng cơng nghệ tái tổ hợp thƣơng phẩm đã đƣợc phân chia vào danh mục thuốc độc

bảng A19[19]. Mặc dù vậy trong q trình điều trị, các tác dụng phụ đƣợc khắc phục
bằng nhiều biện pháp khác nhau. Nhiều cơng trình nghiên cứu, thử nghiệm đã đƣợc
15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

cơng bố trên nhiều tạp chí khoa học, trong đó có Viện Ung thƣ quốc gia Hoa Kỳ, đã
tiến hành thử nghiệm IL-2 liều cao với hơn một ngàn bệnh nhân trong vòng hơn
mƣời năm và xác định phƣơng pháp giảm bớt độc tính của cytokine này với ngƣời
bệnh34[34]. Nhƣ vậy việc sử dụng IL-2 liều cao một cách an tồn trong điều trị là
hồn tồn khả thi.
Hiện nay ở Việt Nam, phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Cơng nghệ sinh học,
Viện Hàn Lâm khoa học và cơng nghệ Việt Nam là đơn vị duy nhất nghiên cứu và
chế tạo thành cơng sinh phẩm Interleukin -2 tái tổ hợp của ngƣời nhằm điều trị ung
thƣ.
1.3 Hệ biểu hiện E. coli
E. coli là một hệ biểu hiện lý tƣởng, dễ thao tác, có thể sản xuất dạng protein
tái tổ hợp từ nhiều nguồn gốc khác nhau cũng nhƣ có khả năng thu nhận các vector
bản chất là plasmid. Vi khuẩn E. coli đáp ứng đƣợc hầu hết các u cầu của một hệ
biểu hiện, thực tế trên thế giới rất nhiều phòng thí nghiệm sử dụng vi khuẩn E. coli
làm tế bào chủ để biểu hiện protein tái tổ hợp.
E. coli là vi khuẩn gram âm, mỗi tế bào chỉ tồn tại một nhiễm sắc thể duy nhất
hay còn gọi là nucleoid. Kích thƣớc genome của E. coli khoảng 4,6 x 106 base pairs.
Hệ biểu hiện vi khuẩn là sự lựa chọn hàng đầu để sản xuất các protein tái tổ hợp. Lý
do là chi phí để biểu hiện protein bằng hệ vi khuẩn thƣờng khá rẻ. Đặc biệt là với hệ
biểu hiện E. coli, đây là hệ biểu hiện phổ biến nhất để sản xuất protein tái tổ hợp do
có thời gian sinh trƣởng nhanh, có khả năng duy trì lên men và tạo sinh khối lớn
bằng việc cung cấp thêm dinh dƣỡng vào những thời điểm nhất định. Ngun liệu
sử dụng để ni E. coli rẻ tiền và có hiệu suất biểu hiện cao43[43]. Q trình biểu

hiện gene (bao gồm phiên mã và dịch mã) ln tạo ra phân tử mRNA và protein
nhanh chóng. Tồn bộ trình tự của vi khuẩn này đã đƣợc giải mã bằng máy giải
trình tự thế hệ mới36[36]. Hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng, với nhiều

16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

chủng khác nhau dùng cho các mục đích riêng biệt, nhƣ tách dòng (E. coli DH10B,
E. Coli DH5α,…) chủng biểu hiện ( E. coli BL21 DE3, E. coli rossetta, …).
Hạn chế lớn nhất của hệ biểu hiện E. coli chính là việc thiếu các q trình cải
biến sau dịch mã nhƣ glycosyl hóa, phosphoryl hóa,… do đó các protein tái tổ hợp
có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn khơng cuộn xoắn đúng cấu trúc, protein tái tổ
hợp thƣờng tạo thành dạng khơng tan inclusion body, theo đó là hoạt tính sinh học
cũng bị giảm đi đáng kể. Tuy nhiên đã có nhiều giải pháp để khắc phục những
những nhƣợc điểm trên1613[13][16], do vậy cùng với những ƣu điểm vƣợt trội E.
coli vẫn là một trong những chủng biểu hiện rộng rãi nhất trong cơng nghệ DNA tái
tổ hợp.
1.3.1 Hệ biểu hiện E. coli BL21.
E. coli BL21 là chủng thƣơng mại đƣợc sử dụng nhiều làm vật chủ biểu hiện.
Hệ gene của chủng E. coli BL21 đã đƣợc cải biến một số gene là ompT, hsdS, gal,
dcm,λDE3. Ý nghĩa của việc đột biến các gene đó nhƣ sau:
-

Gene ompT: là một gene mã cho protease nằm trên màng ngồi tế bào, chủng
khuyết gene ompT giúp tránh việc các protein tái tổ hợp bị phá hủy ngay
trong tế bào15[15].

-

Gene hsdS: là một gene có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm nhập
tế bào chủ23[23], chủng BL21 khuyết hsdS để q trình biến nạp vector tái tổ
hợp đƣợc hiệu quả hơn.

-

Gene gal: chủng BL21 (DE3) khuyết gene gal giúp tránh việc tế bào sử dụng
galactose làm nguồn carbon cho sinh trƣởng33[33].

-

Gen dcm: là gene methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng khuyết
gene dcm tránh việc trình tự gene ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến sai khác
trong việc biểu hiện protein tái tổ hợp5[5].

17
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>

-

T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter
lacUV5 dùng để điều khiển q trình biểu hiện, đây là một promoter đã đƣợc
đột biến và đƣợc tạo ra từ phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter
của hệ biểu hiện vi khuẩn tự nhiên nào26[26].
Ngồi ra chủng E. coli BL21 (DE3) còn một dạng thƣơng mại nữa là dạng có

tích hợp thêm plasmis pLysS, plasmid này mang gene mã cho T7 lysozyme làm một

loại protein có 2 chức năng: (i) phân giải thành tế bào vi khuẩn, (ii) là khóa sự hoạt
động của T7 RNA polymerase, sự có mặt của protein này giúp q trình biểu hiện
nhờ promoter T7 (hay còn gọi là promoter lacUV5) khơng đƣợc kích hoạt cho đến
khi cảm ứng IPTG, lúc đó số lƣợng T7 RNA Polymerase tăng nhanh chóng, vƣợt
q khả năng ức chế của T7 lysozyme.
1.3.2 Vector biểu hiện pET22b(+).
Để biểu hiện gene trong E. coli BL21 vector đƣợc sử dụng có thể là các
plasmid, phage, cosmid. Vector là một plasmid đƣợc thiết kế nhằm mục đích giúp
sản xuất lƣợng lớn protein khi đƣợc kích thích bằng chất cảm ứng (lactose hoặc
IPTG). Cấu trúc của vector pET22b(+) đƣợc biểu thị trên Hình 1. 8. Plasmid này
chứa một vài yếu tố quan trọng nhƣ gene lacI mã hóa cho protein ức chế biểu hiện
gene ngoại lai, promoter T7 đặc hiệu với RNA polymerase, operator, vị trí đa điểm
cắt multicloning site, điểm khởi đầu tái bản f1, gene chọn lọc (gene kháng kháng
sinh ampicillin).
Gene của protein tái tổ hợp cần sản xuất đƣợc chèn vào vị trí đa điểm cắt trong
vector. Promoter T7 và lac operator đều nằm ở đầu 5’ của gene. Bình thƣờng T7
RNA polymerase bị ức chế bởi sự kiểm sốt của sản phẩm gene lacI là lac
repressor, khi có mặt chất cảm ứng IPTG, chất này sẽ làm thay đổi cấu trúc của lac
repressor và T7 RNA polymerase đƣợc tạo thành từ genome của chủng E. coli DE3,
nhờ đó gene ngoại lai đƣợc phiên mã và dịch mã để tổng hợp protein. Cơ chế kiểm
sốt biểu hiện gene bằng chất cảm ứng IPTG đƣợc thể hiện ở sơ đồ Hình 1. 9.

18
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu –ĐHTN

/>