Nghiên cứu khả năng đối kháng nấm bệnh ở cây tiêu của một số vi khuẩn được phân lập từ đất trồng tiêu tại tây nguyên

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gừi lời cám ơn đến PGS. TS. Phạm Việt Cường, viện trướng

Viện nghiên cứu KH Mien Trung, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

đã tạo điều kiện cho tôi được học tập, thực hành thí nghiệm trong suốt q trình
thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tó lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kim Cúc, ThS.

Trần Thị Hồng và các anh chị Phịng Cơng nghệ sinh học, viện Hóa sinh biến và
Trung tâm sinh học phân tứ Nghĩa Đô (Viện nghiên cứu KH Miền Trung) đã tận
tình chi báo và giúp đỡ tơi trong suốt q trình nghiên cứu.
Tơi cũng xin cám ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại

Học Mớ Hà Nội, những người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong

suốt thời gian tôi học tập tại trường.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cám ơn gia đình và bạn bè đã ln động viên,
khích lệ và giúp đỡ tồi trong quci trình họe tựp vh nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 4 tháng 5 năm 2015

Sinh viên.

Nguyễn Hồng Hạnh.


DANH MỤC CÁC CHŨ VIẾT TẮT
STT

CHỦ VIẾT TÁT

TÊN DÀY DỦ

1

ADN

Axit deoxyribonucleotit

2

ARN

Axit ribonucleotit

3

Agar

Thạch

4

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

5

CN

Chết Nhanh

6

DNTP

Deoxynucleotide triphosphates

7

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

8

HTKS

Hoạt tính kháng sinh

9

I111KW- Viện Đại ikfc'hfekinhVửờng

10

NBCI

National Biological Control Institute

11

MPA

Meat-Peptone-Agar

12

PCR

Polymerase Chain Reaction

13

TAE

Tris-acetic acid-EDTA

14

TE

Tris-EDTA

15

uv

Ultraviolet


DANH MỤC BẢNG

Băng 2.1: Tên mẫu và địa điếm lấy mẫu...........................................................................17
Băng 2.2 : Trình tự và thơng số cặp mồi đế khuếch đại gen 16S rRNA cho vi khuấn . 18
Bảng 2.3 : Thành phần phản ứng PCR cho vi khuần..................................................... 22
Bảng 3.1: Khá năng kháng nam F.oxysporum cùa các chủng vi khuẩn.....................24
Bàng 3.2. Khả năng cùng sinh trưởng trên môi trường MPA của các chúng vi khuấn

tuyển chọn...............................................................................................................................27
Băng 3.3: Khả năng kháng nấm R.solani của các chúng vi khuấn.............................. 28
Bâng 3.4. Khả năng cùng sinh trường trên môi trường MPA cùa các chúng vi khuẩn

tuyến chọn..............................................................................................................................30
Bảng 3.5: Một số đặc điếm hình thái cùa các chúng đối kháng................................... 31
Bảng 3.6: Ket quá xác định tỷ lệ A260/A280 và nồng độ ADN (pg/ml) của các chủng
vi khuẩn nghiên cứu............................................................................................................. 33

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội


DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỊ THỊ
Hình 1.1:Triệu chứng cây Tiêu mắc bệnh chết nhanh..................................................... 8

Hình 1.2:Triệu chứng cây ticu mac bệnh chết chậm........................................................ 9
Hình 1.3:Triệu chứng cây cà phê bị bệnh thối rễ tơ........................................................10
Hình 1.4:Triệu chứng cây cà phê bị bệnh thối rề cọc.................................................... 11
Hình 3.1: Khă năng đối kháng F.oxyporum cúa các chúng vi khuấn phân lập........ 25

Hình 3.2: Hình thái cùa 4 chúng vi khuẩn đối kháng nấm F.oxyporum.....................26
Hình 3.3: Khá năng đối kháng nam Rhizoctonia solani của các chúng vi khuân phân
lập............................................................................................................................................ 29

Hình 3.4: Hình thái của các chùng vi khuẩn phân lập đối kháng với nấm R.solani.29

Hình 3.5: Điện di đồ ADN tống so cúa 5 chúng vi khuấn nghiên cứu......................33
Hình 3.6: Điện di đồ sán phẩm PCR cùa 5 chùng vi khuẩn VK5 CM5crk, VK10

CM4crk. VK5 CS|trk, BX 101 CS]trk.CF III EHjcd....................................................... 34
Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự 16S rADN của chùng VK10 CM4 CrK bàng
BLAST.................................................................................................................................... 35

Hình 3.9:

Kết qj-ỊSft|.sệij|i tr'mh tự 16S rApN cua chúng Ỵ^5CM5 CrK bàng

BLAST................................................. :.......... .’....... ................. ..'.......... ..............................37

Hình 3.10: Cây phát sinh chúng loại cúa VK5CM5 CrK.............................................. 37
Hình 3.11:

Kết quà so sánh trình tự 16S rADN cúa chủng Vk5CSl TrK bàng

BLAST.................................................................................................................................... 38

Hình 3.12: Cây phát sinh lồi cùa chùng VK5CS1 Trk................................................. 39
Hình 3.13:

Ket quả so sánh trình tự 16S rADN của chủng Bx-101 CS|trk bang

BLAST.................................................................................................................................... 40

Hình 3.14: Cây phát sinh chúng loại chúng Bx-101 cs,tfk ........................................ 40
Hình 3.15:

Kết quả so sánh trình tự 16S rADN cùa chúng Bx-101 CS|trk trên

BLAST.................................................................................................................................... 42

Hình 3.16: Cây phát sinh chúng loại chúng CFIII EHỵcđ........................................... 42


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẢT
DANH MỤC BÁNG
DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỊ THỊ
MỤC LỤC
MỎ ĐÀU..................................................................................................................... 1

CHNG 1. TÔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 3
1.1

Dặc điểm của một số vi nấm gây bệnh ỏ' thực vật..................................... 3

1.1.1

Khái quát về nấm bệnh.....................................................................................3

1.1.2

Đặc điểm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biếu hiện của Fusarium

oxysporum......................................................................................................................... 3

1.1.3

.

Đặc điểm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biếu hiện cúa

Rhizoctonia solani............................................................................................5

1.2

Tổng quan về cây Tiêu.................................................................................. 6

1.3

Một số bệnh chính trên cây Tiêụ\..Ị..Ị^<;...VU»'-ị'k4"\v>t....................... 7

1.3.1.

Bệnh chết nhanh............................................................................................... 7

1.3.2.

Bệnh chết chậm................................................................................................ 8

1.3.3.

Tuyến trùng....................................................................................................... 9

1.3.4.

Bệnh thối rề tơ (Tuyến trùng và nấm Fusarium spp., Rhizoctonia spp)

trên cây cà phê................................................................................................................ 10
1.3.5.

Bệnh thối rễ cọc (Tuyến trùng Pratylenchus coffea và nấm Fusarium spp)

trên cây cà phê................................................................................................................ 10

1.4 Tinh hình nghiên cứu về các loại vi sinh vật gây hại cho tiêu và biện pháp
phòng trừ trong và ngồi nước............................................................................ 11
1.4.1

Tinh hình nghiên cứu về các lồi vi sinh vật gây hại cho tiêu và biện pháp

phòng trừ ngồi nước.................................................................................................... 11

1.4.2

Tinh hình nghiên cứu về các lồi vi sinh vật gây hại cho tiêu và biện pháp

phòng trừ trong nước................................................................................................... 13

CHƯƠNG 2: VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúu...................... 17

2.1

Đối tượng, vật liệu, hóa chất và thiết bị.................................................... 17

2.1.1

Đối tượng nghiên cửu..................................................................................... 17


2.1.2

Vật liệu............................................................................................................. 18

2.1.3

Hóa chất, thiết bị và mơi trường ni cấy................................................. 18

2.2

Phưoug pháp nghiên cứu........................................................................... 20

2.2.1

. Phương pháp phân lập vi khuẩn................................................................. 20

2.2.2

Phương pháp nhuộm Gram........................................................................... 20

2.2.3

Phương pháp đục lỗ xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch ni.... 21

2.2.4

Phương pháp sinh học phân tử..................................................................... 21

2.2.4.1

Quy trình tách chiết ADN genom vi khuẩn........................................ 21

2.2.4.2

Xác định nồng độ ADN nhờ máy quang phố tử ngoại.................... 22

2.2.4.3

Kỹ thuật PCR........................................................................................... 22

2.2.4.5

Điện di ADN trên gel agaroza.............................................................. 22

2.2.4.Ĩ

Xác định trình tự nucleotit của gen...................................................... 23

2.2.4.7

Xừ lý trình tự ADN và phân tích số liệu bằng phần mềm máy tính...23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 24

3.1

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính đối kháng.......................24

3.2

Tách dịng và giải trình tụ gen mã hoá 16s rADN cùa các chúng vi khuấn
nflr . 1011 \ 1211 Đặl HOC MCH-la 1N0I
„

3.2.1

Tách ADN genome từ vi khuẩn................................................................... 33

3.2.2

Nhân gen 16S ADN riboxom....................................................................... 34

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................... 45

TÀI LIỆU THAM KHÁƠ........................................................................................ 46
LÒI CAM ĐOAN...................................................................................................... 49


MỚ ĐÀU
Hiện nay, thế giới và Việt Nam quan tâm rất nhiều đến các bệnh ờ cây do vi

sinh vật gây ra, bới bệnh cây gây ra những tốn thất rất lớn cho nền nơng nghiệp trên

tồn thế giới, đặc biệt cho các loại nông sản chú yếu. Sản lượng hồ tiêu tại Việt
Nam chiếm khoáng 12% tổng sàn lượng nơng nghiệp trên thế giới. Nấm gây hại

thực vật có tới hàng chục ngàn lồi, vi rút có tới hơn 1000 loài và 600 loài vi khuân

gây bệnh thực vật. Thiệt hại do nấm hại cây chiếm khoảng 80% tống thiệt hại mùa
màng, trong đó bệnh do Fusarium, Rhizoctonia solani gây ra chiếm tỷ lệ tương đối
lớn. Đây là các tác nhân chú yếu gây nên bệnh chết héo, tắc mạch dẫn và thoi rề

thối thân ở nhiều loại cây trồng như : lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu,

bông... [28]
Đối với nước ta nền nông nghiệp chiếm vai trò rất quan trọng trong việc phát

triển kinh tế nên bệnh cây là một vấn đề rất được quan tâm. Cây trồng không chi
cung cấp lương thực thực phẩm, duy trì đời sống cho người dân, mà cịn tạo ra hàng

hóa có giá trị xuất khấu cao, đặc biệt là các cây công nghiệp như: tiêu, bông, cà
phê...Tuy nhiên nầng suất và chất lượng .cây trồng đã và đang phải đối mặt với rất
nhiều vấn đề hết sức khó khăn, đặc biệt là bệnh do nấm gây ra.

Biện pháp được người dân chú yếu sứ dụng đế phòng, tránh và chữa các loại

bênh cây là biện pháp hóa học. Tuy nhiên, biện pháp này lại có nhiều mặt tiêu cực,
ví dụ như các loại thc hóa học dùng đê trừ nấm cho cây chứa rât nhiêu thành phân
độc hại cho môi trường, cho con người, gây ảnh hưởng đến đất trong, chất lượng

cúa cây trồng và chi phí cao. Ngồi ra, sừ dụng lâu dài hóa chất làm cho đất đai bạc

màu, ánh hưởng tiêu cực tới các sinh vật có ích, tạo ra các loại sinh vật gây hại
kháng thuốc, kết quá là việc sản xuất nông nghiệp rơi vào tình trạng khó khăn. Đặc

biệt là khu vực Miền Trung, cây tiêu và cây cà phê thường bị thối cố rễ do
Fusarium oxysporum, R. solani, Phytophthơra và một số tác nhân khác...[ 1 ].

Đế có thề khắc phụ những vẫn đề do thuốc hóa học gây ra, hiện nay các nhà
khoa học đã chú ý đen một nguồn tài nguyên lớn hơn - nguồn tài nguyên vi sinh vật
hữu ích, có tiềm năng trong bào vệ mơi trường sinh thái. Việc ứng dụng các vi sinh

vật hữu ích khơng chi giúp đem lại hiệu quá tiêu diệt nguồn bệnh cao, an toàn, sàn


phấm thu hoạch sạch, không ánh hướng tới người sử dụng, có lợi cho cân bàng sinh

thái, mà cịn giảm phẩn lớn lượng thuốc hoá học sử dụng.

Tây Nguyên là vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa. với đặc trưng là nóng ấm.

Với lợi thế về đất đai và khí hậu, Tây Ngun là vùng có thể phát triền nhiều loại
cây cơng nghiệp và cây ăn q có giá trị kinh tế cao như cà phê, ca cao. 110 tiêu, sầu

riêng. Tuy nhiên, ngoại trừ cây cà phê thì đây cũng là các cây rất mẫn cảm với
bệnh do nấm Phytophthora gây ra. Hiện người dân cùa các vùng trồng cây cơng
nghiệp chú yếu sứ dụng hóa chat đế phòng và chống bệnh cho tiêu, cà phê.. .Mặc dù

hiệu quá chữa bệnh cao, nhanh chóng nhưng cũng dề lại những tác hại không lường
cho môi trường, ánh hưởng tới chất lượng xuất khau của sàn phẩm. Vì vậy, biện

pháp sứ dụng vi sinh vật đối kháng sẽ là một trong những giải pháp tiềm năng, thiết

thực đe có một nền sán xuất nông nghiệp bền vừng [7 ].
Với ý nghĩa thực tiễn trên tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: ’’Nghiên cún khả

năng đối kháng nấm bệnh ở cây tiêu của một số vi khuấn được phân lập tù' đất

trồng Tiêu tại Tây Nguyên”.

Thư viện Viên Đại học Mớ Hà Nội

Mục tiêu nghiên cứu của Luận văn:

Có được các chúng vi khuân đối kháng nguồn bệnh nấm hại tiêu có tiềm năng
sứ dụng trong thực tế.

Nội dung nghiên cứu
Phân lập và tuyền chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính đoi kháng cao với

nam F.oxysporum, R.solani từ đất trồng cây tiêu ờ Tây Nguyên.

Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tứ (giái trình tự gen 16S

ADN riboxom); nghiên cứu quan hệ phát sinh loài cúa các chùng triển vọng.

2


CHNG 1. TĨNG QUAN TÀI LIỆU

1.1
1.1.1

Đặc điểm của một số vi nấm gây bệnh 6’ thực vật
Khái quát về nấm bệnh

Các lồi thực vật nhìn chung bị rất nhiều bệnh do các nguồn bệnh vi sinh vật

khác nhau gây nên. Ví dụ một số chi vi sinh vật gây bệnh thực vật tiêu biếu như:
Phytophthora,

Xanthoinonas,

Erwinia,

Pythium,

Pseudomonas,

Fusarium,

Aspergillus, Rhizopus, Rhizoctonia solani.....Cây trồng thường mắc bệnh trong các

giai đoạn trước và sau quá trình thu hoạch. Khi cây trồng bị bệnh, thường gây ra

dịch và đại dịch làm ánh hưởng rất lớn đến năng suất cùng như chất lượng của sân

phẩm [10].
Hiện nay có khoảng hơn 80.000 lồi nấm được biết có khá năng gây bệnh cho

cây trong, phần lớn sống theo kiều bán hoại sinh, trong đó có một vài lồi nấm có
thể gây hại nhiều loại cây trồng. Nấm là sinh vật dị dường, nguồn năng lượng cần
thiết cho hoạt động sống lấy từ các chất hữu cơ, chúng tập trung ờ các tầng đất phía

trên do các chất hữu cơ ờ đây phong phú. Nấm chịu tác động chính của các yếu tố

_____ JjHL'icnyiep Đai hoc Mọ; Ha Nv. .

u

,

môi trường như: nông độ ion H , chê độ nước, nhiệt độ, câu trúc đât...Bệnh do nam

gây ra rất khó phịng trừ vì chúng có khá năng tồn tại lâu trong đất. Hơn nữa, nhiều
loại nam có thể phát triển trong khoảng pH rất rộng, từ pH axil cho den pH kiềm
cao [4].

Trong các bệnh có nguồn gốc do nấm F.oxysporum, F.solani, Phytophthora

sp. là những loài gây thiệt hại nhất cho cây trồng. Chúng có khà năng sống hoại
sinh, chống chịu với các hoạt động đối kháng của các vi sinh vật trong đất, kết quà

đã dần đến sự gia tăng số lượng bệnh trong điều kiện địa lý, sinh thái khác nhau[7].
1.1.2

Đặc điếm hình thái, sinh lý, Cff chế gây bệnh và biểu hiện của

Fusarium oxysporum.

Đặc điếm hình thái, sinh lý cùa Fusarium oxysporum.

Chi Fusarium bao gồm trên 30 loài, trong đó lồi F.oxysporum là lồi phố
biến và cũng là loài gây bệnh nguy hiềm nhất ờ cây trồng. F.oxysporum gây ra hiện
tượng tắc mạch dẫn của cây, là nguyên nhân trực tiếp của bệnh thối thân, thối rễ ờ

3


thực vật. Bệnh ít khi xuất hiện sớm mà thường gây hại mạnh nhất vào giữa giai

đoạn sinh trường của cây.
F.oxyporum là loại nấm đa bào phân nhánh, màu sac tản nấm trắng, phớt

hồng. Trong quá trình sinh sản chúng sinh ra hai loại bào tứ khác nhau: Bào tư hậu
và bào tứ phân sinh. Bào từ hậu có màu sẫm, vó dày có hình ovan, được hình thành

từ sợi nấm hay từ bào tứ lớn. Bào tử phân sinh có 2 loại: Bào tứ loại lớn: có hình

lưỡi liềm hoặc bầu dục, ngắn thăng, hoặc cong nhẹ. thường có ba ngăn ngang, 0
màu da cam; Bào tứ loại nhó: dạng đơn bào, hình elip hoặc quà thận, hình thành bọc
giá trên cành đơn nhánh, không màu. Cành bào từ nhiều nhánh, bào tư phân sinh

mọc thành từng cụm 2 đến 3 chiếc trên đinh cành. Kích thước tán phụ thuộc vào
nhiệt độ. Ớ 25°c tàn phụ có kích thước khống 3.5cm. ờ 30° khoảng 2.8cm. Tán có

màu nhạt hoặc tím đậm. Nấm vẫn có thế mọc được ở 42°c trên các môi trường

thông thường. Dưới 20°C nấm vần mọc nhưng phát triển chậm. Nhiệt độ tối thích là
25 - 30°C, phát triển trong 4-5 ngày và ờ độ ấm rất cao 90-95% [ 17].

Cơ chế gây bệnh và biểu hiện:
F.oxysporum lằ ibặi nấm^phạm vi ký chủ rộng, có mật ộ hầu hết các vùng
trồng trọt trên the giới. Ở Hawaii, vật chú cùa nấm này là khoai tây, mía, cây họ cà

phê, hạt tiêu. bông. Chúng gây bệnh đố rạp ớ nhiều loại thực vật như cà phê, hạt

tiêu, cọ dừa, lúa, cà chua, dưa chuột...

Có the khái quát cơ chế gây bệnh cùa F.oxysporum như sau: Sau khi xâm
nhập, F.oxysporum lan tràn khắp thực vật nhờ một ống chứa đầy bào tử hoặc sợi

khuẩn ty. Sợi khuấn ty tiến đến hệ thống xylem, từ đây chúng tiếp tục lan lới hệ

thống gân lá, nhờ dòng nhựa, chúng đi tới toàn bộ hệ thống mạch cúa thực vật. Nấm

phát triển mạnh, ánh hưởng tới việc cung cấp nước và chất khoáng khiến cho lá cây
chuyến sang màu vàng, bắt đầu từ rề, thân phía dưới bị thối dan lên phía trên. Q
trình héo rũ lan nhanh ngày qua ngày cho đen khi thực vật đố rạp xuống và kết quà

là cây bị chết. Biếu hiện rõ nét trong suốt giai đoạn lừ khi cây ra hoa cho đến khi kết
trái.[17J

4


1.1.3

.

Đặc điếm hình thái, sinh lý, cơ chế gây bệnh và biếu hiện của

Rhizoctonia solani.
Dặc điêm hình thái, sinh lý của Rhizoctonia solani.
Rhizoctonia solani thuộc bộ nấm trơ (Mycelia sterilia), lớp nấm bất toàn
(Fungi imperfect!). Giai đoạn sinh sản hữu tính được gọi là Thanatephorus
cucumeris (Frank) Donk, thuộc lớp nấm đám Basidiomycetes, là nấm ký sinh khơng

chun tính, có phơ ký chủ rộng [21],

Ở giai đoạn vơ tính, nấm phát triển ờ dạng sợi, tạo hạch. Sợi nấm khi còn non

không màu. khi già chuyến sang màu nâu do sự tích lũy sắc tố nâu. Sợi nấm đa bào,
có đường kính từ 8- 13 pm, phân nhánh tương đối thắng góc, chỗ phân nhánh hơi

that lại, và hình thành vách ngăn gần vị trí phân nhánh (Vũ Triệu Mân và Lê Lương

Tề, 1998). R. solani có 3 loại sợi nấm: sợi nấm bò (runner hyphae), sợi nấm phân
nhánh (lobate hyphae), và các tế bào dạng chuồi (moniloid cells) (Nguyễn Thị Tiến

Sỹ, 2005). Lúc già, các tế bào tách ra và biến thành hạch. Đặc điếm cùa hạch rất
thay đổi. Hạch nấm khi cịn non có. màu tráng nhưng khi về già có thể có màu nâu,

"

”...

vicn./jcii! at Roc"jyf£ya Npj" _

nâu đen. nâu xám. tren VO co long. Hạch narrr co hình dạng phức tạp, co khi hình

cầu, đáy phẳng. bề mặt hạch không trơn mà lồi lõm (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005).
Đường kính hạch nam từ 1- 6 mm. Từng hạch nấm có the liên kết với nhau lại tạo

thành hạch nấm to (Ou, 1983). Hạch nấm khi còn non có thể chìm dưới nước nhưng

khi già có the nổi lên do tế bào phía ngồi hạch trờ nên rồng (Nguyễn Thị Tiến Sỹ,
2005). Bào từ hậu ít gặp, chi phát sinh khi có độ ấm rất cao. Sinh sán hữu tính tạo
đăm đơn bào, khơng màu, hình bầu dục, có từ 2- 4 bào từ đám, hình trứng hoặc hình

bầu dục dẹt. Ớ nước ta chưa thay dạng sinh sàn hữu tính (Vũ Triệu Mân và Lê
Lương Tề, 1998). Bào từ đảm khơng có khả năng tồn tại lâu nhưng có vai trị lớn
trong sự biến đổi di truyền cùa nấm (Ho Viet Thế, 2005).

Cơ chê gây bệnh và biêu hiện:
R. solani xâm nhập ký chủ và gây bệnh mạnh nhất trong điều kiện nhiệt độ

tương dối cao (25 - 30°C), ẩm độ 90% đến bão hòa, mưa liên tục. Kỹ thuật canh

tác: mật độ cây, chăm sóc, phân bón, thủy lợi... đều liên quan đến phát sinh bệnh.
Nấm xâm nhập vào mơ cây qua khí khổng hoặc có thố xuyên trực tiếp qua cutin

5


(Ou, 1983). Nấm có khả năng gây bệnh trong phạm vi nhiệt độ 23 - 31°c, nhiệt độ
tối thích 3I°C, độ ấm tương đối 70- 90% (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005). Nấm R.

solani pho biến ờ nhiều nơi và có thể gây bệnh cho trên 180 loại cây thuộc 60 họ

thực vật khác nhau [21].

1.2 Tổng quan về cây Tiêu.
Hồ tiêu ( Piper nigrum L.) thuộc họ Piperaceae, là một loại cây dây leo thân

gỗ lâu năm. Hồ tiêu có nguồn gốc từ Ấn Dộ. Indonesia. Malaysia. Nam Mỹ và Tây
Án nhưng cũng được trồng rộng rãi ờ các vùng nhiệt đới.

Cây Hồ tiêu [Piper nigrum) được trồng ớ Việt Nam từ thế kỷ 17 nhưng sân
xuất hồ tiêu chi thực sự phát triển mạnh từ sau năm 1997 khi giá hồ tiêu trên thị
trường tăng nhanh. Năm 1998 cà nước có 9.800 ha hồ tiêu, sau 7 năm (2004) đã có

52.500 ha, tốc độ tăng trên 6000 ha/năm, đưa Việt Nam trở thành nước sản xuất,

xuất khấu hồ tiêu hàng đầu thế giới (chiếm 35% sàn lượng và gần 50% thị phần thế

giới, giá trị xuất khấu niên vụ 2005 đạt 150 triệu USD. VPA). Hiện nay, diện tích
hồ tiêu vẫn tiếp tục tăng, năm 2012, cà nước dã trồng trên 58.000 ha, vượt 8000 ha

ini rV ện V lện t)ạí nọc MU Ha ĨNộĩ

so với chỉ đạo cúa Chính phủ.

Cây hồ liêu ưa điều kiện khí hậu nống ấm. Nhiệt độ thích hợp là 25-28°C,
lượng mưa hàng năm u cầu vào khống 1200-2500mm. Tiêu có thể trồng trên
nhiều loại đất khác nhau như đất sét pha. đất đõ bazan. đất xám. Đất trồng tiệu cần

có độ dày từ 80-100 cm. mạch nước ngầm 2m, kết cấu tơi xốp. thành phần cơ giới

từ nhẹ đến trung bình dề thấm và thốt nước và độ chua thích hợp từ 5-6.
So với nhiều loại cây công nghiệp, hồ tiêu là cây truyền thong và cũng vừa là

cây công nghiệp mũi nhọn của Tây Nguyên. Tuy mới phát triền cây hồ tiêu trong
vòng 15 năm trờ lại đây nhưng các tinh Tây Nguyên đã nhanh chóng trờ thành vùng
sản xuất hồ tiêu lớn thứ hai trong cà nước sau các tinh miền Đông Nam bộ. Đak

Lắk, Gia Lai, Đắk Nông đang trở thành những vùng hồ tiêu lớn cùng với Phú Quốc,

Đồng Nai. Bà Rịa-Vũng Tàu. Bình Phước ở miền Đơng Nam bộ. Đen nay, các hộ
trồng hồ tiêu ờ các tinh Tây Nguyên đã tăng diện tích cây hồ tiêu lên trên 15.300 ha.
trong đó có 70% diện tích đã dưa vào khai thác, với sản lượng mồi năm dạt trên
32.255 tấn tiêu hạt. Tận dụng lợi thế về tiềm năng đất đai, khí hậu. người dân ờ các

6


huyện Chư Sê (Gia Lai), Ea H'Leo, Cư M'Gar (Đắk Lắk), Đắc R’Lấp (Đẳk Nông) đã

chuyển vườn tạp, nương rẫy gieo trồng cây lúa cạn hiệu quà kinh tế thấp sang trồng

cây hồ tiêu mang lại hiệu quá kinh tế cao gấp nhiều lần. Tại các vùng trọng điểm
trong cây hồ tiêu của các tinh Gia Lai, Đắk Lak, Đắc Nơng có nhiều hộ gia đình

đồng bào các dân tộc đạt năng suất tiêu từ 7 đến 8 tấn tiêu den/ha. Niên vụ tiêu vừa
qua, giá tiêu hạt tăng cao, nhiều hộ gia đình thu lãi lớn, có gia đình thu trên 1 tý
đồng. Chính cây hồ tiêu đã góp phần làm thay đối cuộc song từ khó khăn trờ nên đủ

ăn và giàu có cho bao phận người trên vùng đất đó bazan Tây Nguyên |2|.

Tuy nhiên hệ lụy tất yếu của việc lạm dụng hóa chất trong sàn xuất hồ tiêu là

dịch hại phát sinh tràn lan, nguy hiếm nhất là các bệnh chết nhanh, chết chậm, tuyến
trùng, rệp sáp...thậm chí có cã bệnh “Tiêu điên” khơng thế phòng trừ nhiều vườn
tiêu đã suy kiệt trầm trọng, tuồi thọ vườn tiêu giám han, thậm chí bị mất trang, hơn

nữa tồn dư hóa chất trong sản phẩm là điều khó tránh khỏi. Nhiều nghiên cứu gần
đây đã khăng định đế bào đam sàn xuất nông nghiệp bền vững nhất là đối với các

nước nhiệt đới, cần thiết phái giảm thiểu hợp lý phân vô cơ, đặc biệt chú trọng sứ
dụng phân hữu cơ.riiư

viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

1.3 Một số bệnh chính trên cây Tiêu
Ỉ.3.Ì. Bệnh chết nhanh

Nói đến cây tiêu trước hết là nói đến bệnh hại, trong đó quan trọng nhất vẫn là
bệnh thối gốc-chết dây hay còn gọi là chết nhanh (Quick wilt, Phytophthora
footrot). Sờ dì gọi như vậy là từ khi thấy cây tiêu “buồn”, dây bị héo, xuống lá rồi

chuyến vàng, rụng ào ạt chỉ đê lại dây, cành trơ trọi (tất cà các triệu chứng trên diễn
ra trong vòng 7-10 ngày) sau đó cây chết trong vịng vài tuần lễ [16].

Quan sát cây bệnh được nhố lên thì thấy tồn bộ rề bị thối đen nhất là phan cố
rễ, thân sát mặt đất bị thối rã, vó bong ra, có mùi hơi nhẹ. Một khi xuất hiện bệnh sẽ

làm chết hàng loạt nọc tiêu do đó việc phịng trị rất khó khàn, tốn kém và ít mang

lại hiệu q vì khi triệu chứng biếu hiện ra bên ngồi thì có nghĩa là bộ rễ tiêu đã bị
nam tấn công từ 1 - 2 tháng trước.

7


Hình 1.1: Triệu chứng cây Tiêu mắc bệnh chết nhanh.

Bệnh thối gốc-chết dây do một loại nấm sống dưới đất, thích ẩm gọi là
Phytophthora parasitica var. piperana, nam bệnh này chù yếu phát sinh, phát triển
và lây lan trong mùa mưa, nhất là giai đoạn giữa và cuối mùa mưa. Thông thường

nam Phytophthora kết hợp với các loại nấm khác sống trong đất như Pythium,
Fusarium. Rhizoctonia... cùng tấn công lên tiêu làm cây tiêu chết rất nhanh. Nấm

bộnh có thể xâm nhập hầu hết các bộ phận cùa cây như lá, rể, thân, nhánh...đặc biệt

là các bộ phận nằm trong và sát mặt đất [3]

Vào mùa mưa, mầm bệnh có trong đất được nước ban tung tóe lên trên. Thơng
thường các lá phía dưới thấp bị bệnh trước sau đến các lá phía trên , lá bệnh vàng

rụng xuống và tiếp tục chu kỳ lây lan bệnh nhờ nước.

1.3.2.

Bệnh chết chậm

Ngoài bệnh Chet nhanh trên tiêu can lưu ý đến một bệnh quan trọng khác đó là

bệnh “chết chậm”, sở dĩ gọi như thế vì từ khi thấy cây sinh trường chậm, èo uột,

xuống lá, đốt rụng, rễ, gốc thối . phần mạch dẫn nhựa thân dây có màu nâu đen...

đến khi cây chết, quá trình này kéo dài vài ba tháng đến cà năm.

8


Hình 1.2: Triệu chứng cây tiêu mắc bệnh chết chậm.

Bệnh “chết chậm” do một loại nấm sống trong đất gọi là Fusarium oxysporum

gây ra, bệnh xuất hiện và gây hại nặng trên những vườn tiêu bị ngập úng, thoát thúy
kém, ít thống khí, bón thừa đạm.... Việc phịng trị bệnh chết chậm cũng tương tự
như bệnh chết nhanh [3].

1.3.3. Tuyến trùng [828] Viện

Đại học Mơ I là Nội

Tuyến trùng là đối tượng dịch hại khá pho biến và gây thiệt hại rất lớn đối
với các quốc gia trồng tiêu trên thế giới, chi tính riêng tuyến trùng Meloidogyne

spp. đã gây thiệt hại dến 16% ở các nước Đông Nam Châu Á (Sasscr, 1979). Có

đến 36 lồi tuyến trùng kí sinh gây hại đã được báo cáo, trong đó có hai đối
tượng quan trọng nhất là: Radopholus similis và Meloidogyne spp. (Koshy and
Gcctha, 1992). Loài Radopholus similis gây bệnh vàng lá được xem là phổ biến

nhất, loài này làm chết 22 triệu trụ tiêu trong suốt 22 năm tại vùng đáo Bangka
của Indonesia (Christie, 1957;1959). Ớ Ản Độ. loài tuyến trùng này được xác
định có liên quan rất chặt chẽ với bệnh héo chết chậm (slow-wilt) với mật so từ

250 cá thể/lg rề (Van der Vecht, 1950; Mohandas and Ramana, 1987b; Ramna

et al., 1987a). Theo Mai (1985), bệnh vàng lá tiêu là do phối hợp giữa loài
tuyến trùng này và nấm bệnh gây ra, bệnh này đã giết chết ngành công nghiệp

tiêu đen ớ nhiều nơi cúa Indonesia. Trên cây tiêu ờ Sumatra của Indonesia mức
độ quẩn thế 2 con/100g đất và 25 con/10g rề được ghi nhận gây bệnh vàng lá
(Koshy, 1992).

9


Theo Eng (2002) tuyến trùng Meloidogyne có sự quan hệ với bệnh do
nấm Pythium sp. và Fusarium sp., tuyến trùng chích hút tạo vết thương vùng rễ

cây tiêu gây nên các vết thương tạo cơ hội cho nấm Fusarium tấn công rề tiêu
[8]. Năng suất tiêu sẽ giám nghiêm trọng với sự kết hợp của hai tác nhân tuyến
trùng rễ Meloidogyne và virus. Các động tác làm cỏ vệ sinh vườn cũng vơ tình

tạo vết thương cho nấm xâm nhập.

1.3.4.

Bệnh thối rễ tơ (Tuyến trùng và nấm Fusarium spp., Rhizoctonia spp)

trên cây cà phê
Bệnh xuất hiện trên vườn Cà phê kinh doanh lần kiến thiết cơ băn nhưng chủ

yếu là Cà phê kinh doanh. Hệ thống rề tơ bị thối và chết dần từ phần chóp rễ làm

cây khơng hút dược nước và dinh dưỡng héo dần rồi chết. Trên Cà phê kinh doanh

do có hệ thống rễ nhiều nên cây có biếu hiện vàng lá và chết chậm hơn sơ với cây
cịn nhó thời kỳ kiến thiết cơ bàn [1,3].

Hình 1.3: Triệu chúng cây cà phê bị bệnh thối rễ tơ
1.3.5.

Bệnh thối rễ cọc (Tuyến trùng Pratyỉenchus coffea và nám Fusarium

spp) trên cây cà phê
Bệnh xuất hiện chú yếu trên Cà phê kiến thiết cơ bán trồng lại trên đất khai
hoang từ các vườn Cà phê già cỗi hay các vườn Cà phê bị bệnh thối rề tơ. Rề cọc

cúa cây bị thối và đứt ngang, bộ rễ tơ gần mặt đất phát triển mạnh. Do đó cây vàng
lá rất rõ vào cuối mùa mưa, đầu mùa khô. Cây bị bệnh rất dỗ nhổ lên bang tay, ờ
những cây bị bệnh nặng rề tơ cũng bị thối [1,3].

10


Hình 1.4: Triệu chúng cây cà phê bị bệnh thối rễ cọc

1.4 Tình hình nghiên cún về các loại vi sinh vật gây hại cho tiêu và biện
pháp phòng trừ trong và ngồi nước.
1.4.1

Tình hình nghiên cứu về các lồi vi sinh vật gây hại cho tiên và

biện pháp phòng trừ ngồi nước.

Có rất nhiều lồi vi sinh vật gây hại cho cây tiêu, trong số đó thì nấm
Fusarium spp là lồi gây bệnh điển hình nhất. Lồi này gây ra bệnh tiêu chết chậm

cho nhiều nước ớ khu vực châu Á, châu úc. Ngồi ra cịn có một số loài nam khác
như PhytophthoraĩjỊị>y
Ấiãnỉsọ'
Tại Indonesia, thối chân Phytophthora, được coi là căn bệnh tàn phá nhất cúa
hạt tiêu đen, dã dược báo cáo đố gây ra thiệt hại từ 5-10% lượng cây trồng (Kueh,

1990) và lên đến 95% thiệt hại đối với cá nhân nông dân (Manohara et al. 2004).
Nhiễm trùng đầu cho thấy các tổn thương với những đốm nâu trên lá gần mặt đất,
trờ thành fimbriate tôn thương lá cạnh cụ thề. Các bệnh thường là không bị nông

dân và kỹ thuật viên phát hiện cho đến khi phần trên của cây tiêu xuất hiện triệu

chứng lá vàng, héo. khi nhiễm trùng đã ở giai đoạn nặng, với hầu hết các rễ bị mục
nát và thân ngầm bị ton thương có màu hơi nâu đen. Đế ngăn chặn bệnh trên cây

Tiêu người ta đã trồng tiêu xem cạnh với cà phê. Lợi the cùa việc trồng xen canh
hồ tiêu, cà phê là nông dân cung cấp đù nước cho cà phê và một số ít nước cho
tiêu, vì vậy khơng xảy ra tình trạng ngập úng ở vùng rễ cùa cây, và tỳ lệ cây bị
bệnh Phytophthora giảm đáng kề [14].

Việc nghiên cứu tạo các giống tiêu chống chịu bệnh cũng đã được tiến hành.

Hai loài tiêu p. nigrum L. và p. colubrinum được lai với nhau bằng cách sừ dụng

11

phấn hoa cùa p.colubrínum đề thụ phấn cho p. nigrum , cây lai có khả năng chịu
sâu bệnh tốt hơn so với cây bố mẹ [14],

Ở Àn Độ. thành phan sâu hại trên cây hồ tiêu có khống 56 lồi tấn công lên
nhiều bộ phận như rễ, thân, lá, cánh hoa, và hạt. Côn trùng hiện diện trong đất gây

hại trên rề cây hồ tiêu gồm có sùng đất Holotrichia fissa, mối Coptotermes

curvignathus Holgmt. Sùng đất chi thinh thoáng xuất hiện gây hại rễ cây tiêu còn

non, và thường gây hại nặng trong các vườn tiêu có trồng xen với một số cây trồng

khác, vì vậy hai loại cơn trùng này được xem là loài gây hại thứ yếu
(Devassahayam, 2000) [12].

Ở Mã Lai, rệp sáp già Ferrisia virgata là tác nhân lan truyền bệnh virus

PYMV (Piper Yellow Mottle Virus), cây ớt Capsicum annuum có biểu hiện các lá
bị quăn queo khi được lây nhiễm nhân tạo với hai loài rệp Aphis gossypii và Myzus
persicae đã sống trên cây tiêu bị bệnh (Eng và ctv. 1993). Õ Srilanka, theo de Silva
(1996) lồi rệp sáp già Pianococcus citri có khá năng lan truyền bệnh PYMV. Triệu
chứng khảm vàng lá cây tiêu là một hồn hợp của PYMV và CMV (Cucumber

Mosaic Virus). PYịMỴi duyCpX^c địnhịlà^tácỊ nhân gây bệnh chính, lây truyền bời
việc cat ghép, vectơ lan truyền có thế ke thêm là bọ xít lưới Diconocoris distant!

[18,23],

Ở bang Kerala (Àn Độ), hai loại bệnh virus phát triền gây hại trên cây tiêu,

dòng virus gây khăm cây dưa leo (cucumber mosaic virus, CMV-Pn) và virus mốc
vàng (pepper yellow mottle virus, PYMV). Hai loại virus này làm cho cây sinh
trường chậm và cho năng suất kém. Bệnh có thế truyền qua dịch cây, các động tác

cắt ghép, dụng cụ, và qua côn trùng vectơ như rầy mềm (Aphis gossypii) (Govindan
và cộng tác viên, 2(X)3). Biện pháp loại bó tàn dư thực vật có thế mang trứng, sâu

non, và nhộng cùa sâu đục thân Lophobaris piperis, bọ xít lưới Dicơnocoris hewitte,
và bọ xít mép Dasynus piperis là biện pháp khá thi. mặc dù theo đánh giá, các dịch

hại này ít gây giám năng suất trực tiếp (Gumbek 2002) [25,27].

Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật đối kháng trong kiếm sốt nguồn bệnh:
Eng (2001) cho rằng có thề sử dụng biện pháp sinh học để phòng bệnh cho

tiêu, ví dụ như sử dụng nấm Verticilium chlamydosporium và Paecilomysec
lilacinus ký sinh trên trứng tuyến trùng để phòng trừ tuyến trùng rễ [18]. Biện pháp

12


phòng trừ tống hợp cũng cần được xây dựng, trong đó có biện pháp tăng cường sự
hoạt động của các tác nhân phịng trừ sinh học có sẵn trong mơi trường rễ tiêu, nhất
là các loài nấm Paecilomysec lilacinus và Pasteurìa penetrans. Theo Eng (2002)

tuyến trùng Meloidogyne có liên quan đến bệnh do nấm Pythium sp. và Fusarium
sp. gây ra. Tuyến trùng chích hút rễ, gây nên các vết thương vùng rề cây tiêu, tạo cơ

hội cho nam Fusarium tan công rễ tiêu. Năng suất tiêu sẽ giâm nghiêm trọng khi có

sự kết hợp cũa hai tác nhân gây bệnh là tuyến trùng rễ Melơidơgyne và virus. Các
động tác làm cỏ vệ sinh vườn cũng vơ tình tạo vết thương trên cây tiêu cho nấm

xâm nhập (19].

Khi nghiên cứu biện pháp phòng trừ sâu bệnh gây hại hồ tiêu. Edwin (1990)

cho thấy trong cây neem (Azadirachta indica) có hoạt chất làm giảm quần thể dịch

hại. chất này có thề thay thế hoá chất báo vệ thực vật, bào vệ sinh vật có ích. khơng
gây ơ nhiễm mơi trường đáp ứng được u cầu phịng trừ tơng hợp (Disthaporn et
al., 1996). Ớ Philippines và Nhật Bân khi sử dụng cây cúc vạn thọ (Tagetes erecta)

trồng vào các khoáng trống giữa các cây trồng có thế kiếm sốt rất tốt quần thề
tuyến trùng (Romulo. 1987). Hướng kiếm soát sâu. bệnh hại trên hồ tiêu đặc biệt là

tuyến trùng đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và áp dụng. Cho đến nay

các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện được khoảng 250 loài vi sinh vật gây hại
tuyến trùng, trong dó có 200 lồi là nấm sống xung quanh vùng đất rễ cây (Kerry,
1987)[21 ]. Một số loài cùa giống nấm Trichoderma đã được thừ nghiệm như là một

trong những tác nhân kiềm soát sinh học chống lại một số tác nhân gây bệnh và

tuyến trùng kí sinh (Chet, 1990). Năm 1989, Windham et al. đã báo cáo khâ năng
sinh sàn cùa loài tuyến trùng nốt sần M. arenaria giám xuống khi đất được xừ lý
trước bang Trichoderma harzianum và T. koningii. Bang nhiều thí nghiệm, kết quả

nghiên cứu cùa Sharon et al. (2001) xác nhận T. harzianum có khá năng kiêm sốt
tuyến trùng M. javanica rất tốt.

1.4.2

Tỉnh hình nghiên cún về các loài vi sinh vật gây hại cho tiêu và

hiện pháp phòng trừ trong nước

Vi sinh vật gây hại trên cây 110 tiêu ở Việt Nam được ghi nhận từ những năm
đầu the kỳ 20, diện tích trồng tiêu (tính bang số lượng trụ tiêu) ở Hà Tiên, Phú

Quốc. Rạch Giá, và Bà Rịa từ 930.000 trụ năm 1910 giâm xuống cịn khống

13


540.000 trụ năm 1927 do bệnh thối gốc cây tiêu. Cơng trình nghiên cứu của
Barat (1952) tập trung nhiều vào biện pháp canh tác, dù vậy ơng đã tìm thấy một
số loài nam gây bệnh cho tiêu như Phytophthora sp., Pythium complectens,

Fusarium solani var. minus, Botryodiplodia theobromae, Gloeosporium sp.,
Pestalozzia sp... [ 16],

Bệnh

rụng

lóng

tiêu

thường

do

nấm Rhizoctonia

solani Kuhn

[9],

Nấm Rhizoctonia trong mùa mưa hay ờ điều kiện ẩm độ cao, thường làm cho các lá
và đọt non bị thối, sũng đcn, bệnh lan dần vào lóng, làm cho các lóng bị rụng dần từ

trên xuống dưới. Khi lóng rụng thì hai đấu mắt lóng bị thâm đen, nhưng phần giữa
lóng cịn màu xanh [18]. Đế trị bệnh này, dùng Validacine pha ớ nồng độ 2 phần

ngàn hay Rovral 12phần ngàn đe xịt khi có bệnh. Neu khơng có hai loại thuốc này

dùng Copper zinc xịt 1 tuần/lần.
Theo đánh giá cùa Cục Báo vệ Thực vật (2007), trên cây tiêu có 17 loại bệnh

gây hại, trong đó bệnh: thán thư, cháy đen lá, mốc hồng, tuyến trùng, virus, chết
nhanh, chết chậm gây hại nặng và khá phố biến ở nhiều vùng. Các bệnh khác như
nấm mạng nhện, tầo đồ. rụng gié. chết thSn. thốỉ rễ dò vi khn. khơ vằn là những

bệnh tuy có xuất hiện nhưng tác hại khơng lớn [ 1 ].
Nhìn chung bệnh hại hồ tiêu hiện nay đang là mối lo cùa rất nhiều người kế
cả các nhà quãn lý và người sán xuất. Hàng nãm, bệnh hại thường xuất hiện khá

phố biến và chủ yếu vào giai đoạn giữa và cuối mùa mưa, gây thiệt hại rất lớn

cho người trồng tiêu. Nhiều nhà khoa học, nhiều cơng trình nghiên cứu đã tập
trung tìm hiều tác nhân gây hại và xây dựng các biện pháp phòng trừ, tuy nhiên
trong thực tế các vườn tiêu bị nhiễm bệnh và chết vần không giàm.

Nguyễn

Tăng

Tôn

(2005)

cho

ràng,

bệnh

chết

nhanh

do

nam

Phytophthora capsici là bệnh quan trọng nhất hiện nay trên cây tiêu ở Việt
Nam. Ngoài ra một số nấm gây bệnh khác như Fusarium spp., Pythium sp.,
Rhizoctonia solani cũng là các tác nhân quan trọng. Phân hữu cơ không những

giúp cho đất tơi xốp, mà còn là điều kiện cần thiết cho bộ rỗ tiêu sinh trường
tốt, ngồi ra cịn cung cấp lượng lớn vi sinh vật vào trong đất, tạo cân bang sinh

học cho vùng đất quanh cây liêu [6]. Việc sử dụng các loại phân hữu cơ như

14


phân bò, phân gà, phân rác đã hạn chế được sự phát triến cúa bệnh chết nhanh

trên cây tiêu so với khơng bón phân. Với một số loại phân hữu cơ chất lượng cao
khi bón cho hồ tiêu, khả năng khống chế quần the tuyến trùng Meloidogyne rất có
ý nghĩa so với khơng bón.
Năm 2012, đề tài “Nghiên cứu săn xuất và sứ dụng một số chế phẩm sinh học
nhằm nâng cao năng suất cây hồ tiêu ở Quàng Trị” do Th.s Phạm Thị Thúy Hoài

chù nhiệm, đã được triển khai và thu được những kết quà khá quan tại các huyện
trồng hồ tiêu chính ờ Quảng Trị. Đe tài đã xây dựng quy trình lên men săn xuất chế

phẩm vi sinh đối kháng phù hợp với cây hồ tiêu tại Quáng Trị. Sứ dụng cơ chất cám

gạo cho lên men ran các chùng vi sinh vật đối kháng bao gồm 2 loài vi khuẩn B.
subtilis và ỡ. flexus; nấm Penicilium oxalicum; xạ khuân S.diastatochromogenesơ
17J. Các chế phẩm được kháo nghiệm trên quy mô diện hẹp và diện rộng đối với

cây hồ tiêu tại Quáng Trị cho thấy công thức kết hợp xử lý chế phấm vi sinh vật và
chc phàm sinh học Chitosan đạt hiệu quà cao nhất. Hiệu lực phòng trừ của các chế
phẩm đối với tỷ lệ bệnh đạt từ 22.49% đến trên 72,45%.
Nghiên cứu ừng dụng vi khuân đối kháng trong kiểm soát nguồn bệnh:
Hiện nay, biện pháp hóa học được sứ dụng phố biến và xem như hìru hiệu

nhất trong phịng trừ bệnh cho cây trồng. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học

trong nơng nghiệp trong đó có thuốc trừ nấm ngày càng nhiều gây ảnh hướng xấu
đến môi trường và làm giảm chất lượng sản phẩm khi dư lượng thuốc cao, chi phí
phịng trị bệnh cao.

Ngồi ra, hóa chất sữ dụng lâu dài làm cho đất đai bạc màu, làm chết các sinh

vật có ích, làm tăng khà năng kháng thuốc cùa sinh vật gây hại, kết quá là việc sán

xuất nông nghiệp rơi vào tình trạng khó khàn. Đặc biệt là khu vực Miền Trung, cây
tiêu và cây cà phê thường bị thối co rề do Fusarium oxysporum, F. solani ,
Phytophthora và một số tác nhân khác [3,4]. Năm 2012, các nhà Khoa học tại Đại

học Nông lâm Huế dã nghiên cứu (hành cơng giái pháp phịng trị bệnh chết nhanh

trên cây hồ tiêu bang che phẩm sinh học Pseudomonas. Giải pháp trên đã được áp
dụng thứ nghiệm tại nhiều vườn tiêu ờ Quáng Trị, Đak Lak... và cho kết quâ
phòng bệnh rất cao. Qua nghiên cứu, tìm hiếu, phân lập, các nhà Khoa học đã phát

hiện trong rễ cây hồ tiêu có vi khuan Pseudomonas, là vi khuấn có khá năng ức chế
15


nấm gây bệnh chết nhanh Phytophthora capsici trên cây hồ tiêu.
Đây được xem là một phát hiện mang tính đột phá. mang đến sự thành công
sau này. Thực tế cho thay có nhiều che phẩm sinh học đã được bà con nông dân áp

dụng, tuy nhiên do một số lý do kết quá không được cao.

Theo TS. Trần Thị Thu Hà, chế phẩm pseudomonas dùng đế phòng bệnh hơn

là chữa bệnh, thực hiện phòng bệnh trước mùa mưa (mùa mưa là thời điếm cao
nhất cùa bệnh chết nhanh), dùng đế tưới vào thân, gốc và bón lót giống như sử

dụng các loại phân hóa học nên rất dễ sứ dụng. Nếu áp dụng đúng kỹ thuật có thề
giảm tì lệ cây chết do bệnh xuống từ 15 - 35%. Bên cạnh đó vi khuẩn
Pseudomonas cịn tiết ra chất kích thích sinh trường idole acetic acid, kích thích
cây trồng sinh trường phát triển mạnh, tăng sức đề kháng chống bệnh [26]. Chế

phẩm này giúp người nông dân chủ động sán xuất với ưu điếm giá thành rất thấp,

thấp hơn 2 - 3 lần so với các phương pháp khác, lại không gây ô nhiễm môi
trường, không độc. Tuy nhiên chế phẩm này mới chi được nghiên cứu và sàn xuất

theo điều kiện khí hậu. cùng như mơi trường đất và vi sinh vật gây hại trên địa bạn
tỉnh Quàng Trị.

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

16


CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHUONG PHÁP NGHIÊN cúu

2.1 Đối tưọTig, vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1

Đối tượng nghiên cún

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn được phân lập từ đất trồng tiêu tại

Tây Nguyên.

Các mẫu đất đtrợc lấy vào ngày 12 tháng 01 năm 2014 ờ Tây Nguyên. Đất được lấy
ờ tang mặt, độ sâu từ 5 - 30cm. Lượng đất lấy mồi lần từ 40 - 50g. Mầu đất được đựng
trong túi nilon polypropylen vô trùng. Các mẫu sau khi lấy được ghi nhãn nơi lấy, ngày

lấy và người thu mầu. Mầu đất sau khi thu được gửi ngay tới phịng thí nghiệm đê tiến

hành phân lập.Trong phịng thí nghiệm, mẫu được chia nhị cho vào các túi nilon sạch

(khoảng 10g/ túi). Một số mầu giữ ờ 4°c sẽ được phân lập ngay, còn lại được giữ ờ -20°C.
Tên mầu và địa điểm lấy mầu trên bâng 2.1:

Bảng 2.1: Tên mẫu và địa điểm lấy mẫu
SI 1

Tên mẫu

Địa điếm lấy mẫu

1

CMjCd

CưM’gar-ĐăkLăk

2

CM3 |Cđ

Cư M'gar - DăkLăk

SI 1

Tên mẫu

Địa điềm lấy mẫu

HrÝ I1A 1
CALcr
CưM'gar-ĐăkLăk

1
17

CMjjcr

Cư M’gar - DăkLăk

3

CM2|Cđ

Cư M’gar - ĐăkLăk

18

CMiicr

Cư M’gar - ĐăkLăk

4

CM|C'đ

Cư M'gar - ĐăkLăk

19

CM|Cr

Cư M’gar - ĐăkLăk

5

CSitđk

Chư Sê-Gia Lai

20

CS|trk

Chư Sê - Gia Lai

6

cs2tđk

Chư Sê - Gia Lai

21

cs2ưk

Chư Sô - Gia Lai

7

cs.,tđk

Chư Sê - Gia Lai

22

CS.M

Chư Sê - Gia Lai

8

CM4cđk

Cư M'gar - ĐãkLăk

23

CMjcrk

Cư M'gar - ĐăkLăk

9

CMjcdk

Cư M'gar - ĐãkLăk

24

CMscrk

Cư M'gar - ĐăkLăk

10

CM6cđk

Cư M'gar - ĐăkLăk

25

CMfiCrk

Cư M’gar - ĐăkLăk

11

EH3.|tđ

Ea H'Leo, ĐăkLảk

26

EHj|tr

Ea H'Leo, ĐăkLăk

12

EH|tđ

Ea H’Leo, DăkLăk

27

EHợcđ

Ea H’Lco. ĐăkLãk

13

CM^cdk

Cư M’gar - DăkLăk

28

EH,ư

Ea H’Leo, DăkLăk

14

CS3jtr

Chư Sê - Gia Lai

29

cs.,.2tđ

Chư Sê-Gia Lai

15

CM|tl

CưM'gar-ĐăkLăk

30

EH,tđ

Ea H'Leo. ĐăkLăk

17

2.1.2

Vật liệu

Các chùng nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani gây bệnh hại cây

trồng từ bộ sưu tập giống cùa Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quáng Trị - Viện
nghiên cứu KH Miền Trung
Các cặp mồi để khuếch đại gen 16s rADN ( cặp mồi 16sF, 16sR dùng cho vi

khuẩn) [221.

Bảng 2.2 : Trình tụ- và thơng số cặp mồi đe khuếch đại gen 16S rRNA

cho vi khuẩn
Mã hiệu

Trình tự

Tm(°C)

%GC

16SF

AGA GTT TGA TCA TGG CTC A

51

42

16SR

AAG GAG GTG ATC CAG cc

56

59

2.1.3

Hóa chất, thiết bị và mơi trường ni cấy.

Các loại hóa chất: Yeast Extract (DISCO-Mỹ); EDTA; SDS; Tris (SigmaTbu viân„ WiiDaiJioc Mod-la Noj. L
Ai.
Mỹ); Acid acetic. Ampicillin (Méck-Đức); Agar (Sigma, Mỹ); Con tuyệt đôi;

Ethidium bromide, tryptone, X-gal; Meat Extract, nước cất, chloroform, TAE,
isoamylalcohol, EDTA, ethanol, parafil lòng, NaCl 0.85%...

Vật liệu và hóa chất cho phương pháp nhuộm Gram:
+

Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet): 2g tím kết tinh hồ tan trong 20

ml etanol 95% + 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất. Trộn hai dịch
nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bào quán trong lọ tối, sứ dụng vài tháng.
+

Dung dịch lod: Hoà tan 1 g lod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI

(Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đù 300ml. Bào quân trong lọ

tối.
+

Dung dịch tay màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với

30ml aceton.

+

Dung dịch nhuộm bố sung: Chuấn bị sẵn dung dịch Safranin o 2,5%, trước

khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) đề có dung dịch 0,5%.

18


- Các dung dịch để tách chiết ADN tống số:
+ Dung dịch Chloroform: Isoamylalcohol =24:1
+ Dung dịch TE.

Tris-HCl :10mM
EDTA

pH=8.0

:lmM

+ Dung dịch đệm dành cho điện di:

Dung dịch đệm điện di TAE IX được lấy từ dung dịch TAE 50X gốc có thành
phần:

Tris base

:121 g

Axit acetic glacial

:28,6 ml

EDTA 0.5M (pH =8) :50 ml

Nước khứ ion vừa đú —> 500ml
+ Gel agarose 0.8%: 100ml

.

Agarose

ThựoYÌện
Viện Đại học Mớ Hà Nội
:0.8g

ĐệmTAElX :100ml

+ Dung dịch nhuộm gel: Ethidium bromide (EtBr)
Dung dịch gốc: 10mg/ml. Pha Ig EtBr với 100ml nước cất, khuấy từ cho tan

đều, giữ trong lọ tối màu ở nhiệt độ phòng.
Khi sừ dụng pha 20pl dung dịch gốc trong 100ml đệm TAE IX.

+ Đệm tra mầu (loading buffer) 5X:
Tris-HCl IM. pH=8,0

:lml

EDTA 0.5M , pH=8,0

:(),2ml

Glycerol

:2ml

Bromophenol Blue 1%

:2ml

Trang thiết bị : máy lắc ồn nhiệt 30°C, 37°C; máy khuấy từ (Rotolab, OSI),

máy ly tâm (Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ), tủ lạnh sâu -20°C, sâu -80°C (Sanyo-

19